JP2000312600A

JP2000312600A - 被験体の定量方法

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Publication number: JP2000312600A
Application number: JP2000094395A
Authority: JP
Inventors: Martin Gutekunst; グーテクンストマルティン; Sabine Lohmann; ローマンザビーネ; Carl T Wittwer; ティー．ウィットワーカール
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-03-30
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2000-11-14
Anticipated expiration: 2020-03-30
Also published as: CA2302881A1; AU733255B2; US6303305B1; ATE306561T1; US20020028452A1; AU2257300A; EP1041158A3; ES2250039T3; EP1041158A2; DE60023056D1; CA2302881C; US6503720B2; EP1041158B1; DE60023056T2; JP4443717B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、増幅可能または複製可能な分析物
の濃度を、異なる蛍光バックグラウンドに対して補正を
行なうことなく、ユーザー定義の対数期とユーザー定義
の閾値レベルから独立して決定できる、被験体の定量方
法を提供することを目的とする。【解決手段】ａ）被験体を増幅剤と接触させる工程、ｂ）前記被験体の少なくとも一つの所定の位置を増幅す
る工程、ｃ）増副産物の量を反応時間の関数として決定する工
程、ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工
程、ｅ）前記導関数の極大、０値又は極小を決定する工程、
並びにｆ）前記極大、０値又は極小から前記被験体の初期濃度
を計算する工程、を含む、被験体の定量方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、低濃度で存在する
が適当な条件下に増幅または複製できる被験体の定量に
関する。具体的には、本発明は、複数のポリヌクレオチ
ドを含有する試料内の特定のポリヌクレオチド配列の定
量に関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸配列を検出し定量する様々な分析法
のなかでもポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は最も強力
で広く普及した技術になっており、その原理は米国特許
第４，６８３，１９５号公報と米国特許第４，６８３，
１０２号公報〔ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら〕に開示され
ている。しかし典型的なＰＣＲ反応はそれだけでは定性
的データしか与えない。というのは、指数的または累進
的増幅期の後、増幅された核酸の量は横ばい状態に達
し、生成する反応産物の量はテンプレートＤＮＡの初期
濃度に比例しないからである。

【０００３】それゆえ、信頼でき再現性のある定量的デ
ータを得るために、ＰＣＲに基づく多種多様なプロトコ
ルが開発されてきた。一般に、その基本原理は次の２種
類に区別することができる：ｉ）内部標準を利用する競争的ＰＣＲ、ｉｉ）最初に検量線を作成することによる標的ＤＮＡの
定量〔これらはシーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）によって
「感染症の分子診断法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇ
ｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａ
ｓｅ）」（Ｒｅｉｓｃｂｌ編，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓ
ｓ（ニュージャージー州トトワ），ｐ．５５〜７９（１
９９８））に概説されている〕。

【０００４】定量的データの取得は、オンライン検出に
よってＰＣＲ反応の速度論を測定できる可能性により大
きく改善される。これは、蛍光モニタリングによってア
ンプリコンを検出することにより、最近可能になった。
このような技術の例は国際公開第９７／４６７０７号パ
ンフレット、国際公開第９７／４６７１２号パンフレッ
トおよび国際公開第９７／４６７１４号パンフレット
〔ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）ら〕に詳細に開示さ
れており、それらの開示は参照により本明細書に組み込
まれる。

【０００５】オンラインＰＣＲ検出が利用できるように
なる前に、ウィズナー（Ｗｉｅｓｎｅｒ）ら〔Ｎｕｃ
ｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０，ｐ．５８６３−５８６
４（１９９２）〕はＰＣＲ反応の多数のサイクルから得
られるデータを始めて利用し、各サイクル後に、産物濃
度を、放射活性の組込みとその後のシンチレーション計
数によってアッセイした。各曲線について、初期テンプ
レート濃度（Ｎ₀）と増幅効率（ｅｆｆ）が、次の式に
よって定義される、産物濃度（Ｎｎ）対サイクル数グラ
フ上のデータ点の線形回帰によって決定された：ｌｏｇＮｎ＝（ｌｏｇｅｆｆ）ｎ＋ｌｏｇＮ₀

【０００６】ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら〔ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ１１，ｐ．１０２６−２０３０（１
９９３）〕は、各サイクルでの蛍光モニタリングを用い
た初期テンプレート定量のより簡単な方法を初めて開示
した。蛍光閾値レベルを用いて初期テンプレート濃度に
関係するフラクショナルサイクル数（ｆｒａｃｔｉｏｎ
ａｌｃｙｃｌｅｎｕｍｂｅｒ）が定義された。具体
的に述べると、初期テンプレート濃度の対数は、蛍光対
サイクル数曲線の蛍光閾値との交点と定義されるフラク
ショナルサイクル数（ＣＴ）に逆比例する。蛍光閾値法
のさらに改善が進んだ態様では、閾値レベルは、手作業
でまたは恣意的に選択されるのではなく、蛍光バックグ
ラウンドノイズとして得られるシグナルの変動係数の３
倍に設定される。

【０００７】しかし、ここに言及した先行技術には重大
な欠点がいくつかある。先ず第一に、先行技術の方法
は、励起効率または発光効率の相違による試料間変動を
補償するために、異なる蛍光バックグランドシグナルに
対する補正を必要とする。第二に、テンプレート依存的
増幅の定量は常に反応の対数線形期中に行なわれる必要
があるので〔ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら「ＰＣＲによ
るｍＲＮＡの定量：非放射性法（Ｑｕｎａｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎｏｆｍＲＮＡｂｙＰＣＲ：Ｎｏｎｒａ
ｄｉｏ−ａｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓ）」（ケーラー
編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（ベルリン），ｐ．６（１９９
５）〕、実際の定量実験に先立ってユーザーが反応の対
数線形ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を決定する必要があ
る。また閾値レベルは行おうとする実験に固有の前提条
件を考慮することなく手作業で選択されるので、閾値レ
ベルの設定にも経験を積んだ実験者である当業者が必要
とされる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、増幅可能ま
たは複製可能な被験体の濃度を、異なる蛍光バックグラ
ウンドに対して補正を行なうことなく、ユーザー定義の
対数期とユーザー定義の閾値レベルから独立して決定で
き、また同時に、決定される濃度が反応の平坦期に生成
されるシグナルの絶対レベルとは無関係であり、さら
に、そのような絶対シグナルレベルからの独立性のた
め、異なるウィンドウ範囲を持つ複数のチャンネルで検
出される複数の蛍光シグナルを比較しうるシステムにと
っても有利である、被験体の定量方法を提供することを
目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、増幅または自
己複製産物の量が連続的に測定されるような方法で増幅
可能系または自己複製系を定量的に分析する方法に関す
る。本発明の一態様に従い、被験体を定量する方法が提
供される。この方法は、被験体を増幅剤と接触させ、被
験体の少なくとも一つの所定の位置（座）を増幅すると
いう各工程を含む。次に増幅産物の量が反応時間の関数
として決定され、該関数の一次、二次またはｎ次導関数
が計算される（ここにｎは自然数である）。次に前記導
関数の極大、０値または極小が決定され、被験体の初期
濃度が前記極大、０値または極小から計算される。ここ
に開示する方法は、微生物の増殖速度を定量的に分析し
て、変更された環境条件の微生物の増殖に対する影響を
測定するためにも使用できる。

【００１０】即ち、本発明は、（１）ａ）被験体を増幅剤と接触させる工程、ｂ）前記被験体の少なくとも一つの所定の位置を増幅す
る工程、ｃ）増副産物の量を反応時間の関数として決定する工
程、ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工
程、ここでｎは自然数である、ｅ）前記導関数の極大、０値又は極小を決定する工程、
並びにｆ）前記極大、０値又は極小から前記被験体の初期濃度
を計算する工程、を含む、被験体の定量方法、（２）
増幅反応の一時期に増幅産物の量が累進的に増加する前
記（１）記載の方法、（３）前記累進期後に増幅速度
が減少する前記（２）記載の方法、（４）前記導関数
を数学的フィットにより計算する前記（３）記載の方
法、（５）増幅産物を蛍光を使って検出する前記
（１）〜（４）いずれか記載の方法、（６）前記被験
体が核酸である前記（１）〜（５）いずれか記載の方
法、（７）増幅をポリメラーゼ連鎖反応により得る前
記（１）〜（６）いずれか記載の方法、（８）増幅を
ポリメラーゼ連鎖反応により得、かつ増副産物を二本鎖
ＤＮＡ結合体により検出する前記（４）記載の方法、
（９）少なくとも１０個の連続残基の範囲にわたって
被験体の配列と同一又は相補的な配列を有する、少なく
とも１つのポリヌクレオチドプローブにより増幅産物を
検出する、前記（７）記載の方法、（１０）２つのポ
リヌクレオチドプローブを各々蛍光体で標識し、両プロ
ーブが増幅産物にハイブリッド形成したときに蛍光共鳴
エネルギー移動をそれら２つの蛍光体間で生じさせる、
前記（９）記載の方法、（１１）ｂ）微生物又は細胞個体群を化合物の存在下
に増殖させる工程、ｃ）前記微生物又は細胞個体群の細胞数を反応時間の関
数として決定する工程、ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工
程、ここでｎは自然数である、並びにｅ）前記化合物の影響の尺度として、前記導関数の極
大、０値又は極小を決定する工程、を含む、微生物又は
細胞個体群の増殖速度に対する化合物の影響の分析方
法、並びに（１２）ｂ）被験体をシグナル生成結合体と、前記被
験体と前記結合体との間に複合体が形成される条件下で
接触させる工程、ｃ）複合体の量を時間の関数として決定する工程、ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工
程、ここでｎは自然数である、ｅ）前記導関数の極大、０値又は極小を決定する工程、
並びにｆ）前記極大、０値又は極小から被験体の初期濃度を計
算する工程、を含む、被験体の定量方法、に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、増幅可能系または自己
複製系を、増幅または自己複製産物の量が連続的に測定
されるような方法で、定量的に分析する方法を含む。Ｐ
ＣＲ反応における連続的測定とは、例えば、測定が各サ
イクルに１回行なわれることを意味してもよい。本発明
の方法は、増幅反応または自己複製の一時期（通常、最
初から始まり、または他方、初期誘導期後に始まる）に
標的産物の量が累進的に増加する態様にとりわけ適して
いる。さらに、本方法は前記指数期後に増幅速度が減少
する態様に適している。

【００１２】次に、適当な数学的アルゴリズムを使用す
ることにより、得られたデータを使って、様々な時点で
得られたシグナルが平滑化された速度論を明示する数学
的関数を設定できる。そこから導関数を計算できる関数
を得るために、例えば多項式フィットを行なうことによ
り、元々測定された生データの平滑化された速度論を反
映するデータの組を得ることができる。多項式フィット
をサビツキーゴーレイ（ＳａｖｉｔｚｋｙＧｏｌａ
ｙ）フィルターによって計算すると、本方法に有利であ
ることが判明している〔プレス（Ｐｒｅｓｓ）ら「Ｎｕ
ｍｅｒｉｃａｌＲｅｃｉｐｅｓｉｎＣ，ｔｈｅａ
ｒｔｏｆｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｍｐｕｔｉｎ
ｇ」（ケンブリッジ大学出版，第２版）のｐ．６５０以
降〕。このような関数から、一次、二次またはさらに高
次の導関数を計算し、前記関数の極大、極小または０値
を決定できる。得られたデータは、各増幅または自己複
製に関する特徴的パラメーターであり、それを使って増
幅体の元の量、またはその試料の増幅または自己複製中
に存在する化合物または環境因子（温度、ｐＨ、電磁放
射、若しくは栄養組成など）の影響を定量できる。

【００１３】増幅可能系または自己複製系の大半は、特
定の期間にわたって増幅または自己複製が指数的に達成
されるように働き、その反応のまさに初期では通常そう
である。しかし、微生物または細胞個体群の増殖曲線の
場合は、例えば、最初に誘導期が存在して、その後の時
点で指数期に入ることもある。しかしこのことは、その
ような態様への本発明の適用可能性に影響を及ぼすもの
ではない。

【００１４】上に概論したように、本発明の一態様は、
分析すべき試料中に少量で存在し、適当な増幅法を使っ
て増幅または自己複製させうる特定核酸配列の定量に関
する。核酸被験体の最も一般的な増幅方法は、当業者に
周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。基本的
応用例は、シーベルト「感染症の分子診断法（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ）」〔Ｒｅｉｓｃｂｌ編，
ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（ニュージャージー州トト
ワ），ｐ．５５〜７９（１９９８）〕に要約されてい
る。しかし、例えばＮＡＳＢＡ〔マレック（Ｍａｌｅ
ｋ）ら，国際公開第９１１０２８１４号パンフレット〕
など、異なる核酸増幅方法も本発明の範囲に含まれる。
標的核酸は二本鎖ＤＮＡでも一本鎖ＤＮＡでもよく、ま
たどのタイプのＲＮＡでもよい。後者の場合はＰＣＲの
前に標準的プロトコルを用いたｃＤＮＡ合成を行いう
る。

【００１５】一態様として、被験体がポリ核酸である場
合の被験体の定量方法を述べる。この方法は、被験体を
増幅剤（および被験体の少なくとも一部を増幅するため
に必要な全ての化合物）と接触させ、被験体の少なくと
も一部を増幅するという各工程を含む。通例、被験体の
限られた領域だけが増幅され、核酸配列の場合は、２つ
のプライマーによってフランキングされた配列だけが増
幅されるだろう。次に増幅産物の量が反応時間の関数と
して決定され、前記関数の一次、二次またはｎ次導関数
が計算されるだろう（ここにｎは自然数である）。次に
前記導関数の極大、０値または極小が決定され、前記極
大、０値または極小から被験体の初期濃度が計算される
だろう。好ましい一態様では、増幅産物が蛍光を使って
検出され、増幅産物がポリメラーゼ連鎖反応によって得
られる。

【００１６】本発明との関連では、時間の関数としての
増幅産物の量の決定とは、増幅産物の絶対量を測定する
必要があることを意味しない。むしろ、相対シグナルを
決定するだけで十分である。というのは、相対的決定を
するだけで導関数の計算が可能であり、本発明によれば
次にその導関数を使って初期標的濃度の絶対量を決定し
うるからである。

【００１７】本発明の一態様では、被験体の増幅がポリ
メラーゼ連鎖反応によって達成され、定量される被験体
が核酸である。本発明の一態様によれば、増幅産物は通
例、蛍光を使って検出される。被験体が核酸である場
合、増幅産物は二本鎖ＤＮＡ結合体によって（例えば二
本鎖ＤＮＡ結合性蛍光色素を使って）検出できる。他
方、少なくとも１０個の連続残基の範囲にわたって、定
量すべき被験体の配列と同一またはそれに相補的な配列
を有する特別に設計されたポリヌクレオチドハイブリッ
ド形成プローブを使って、増幅産物を検出できる。この
別法の特定の態様では、２つのポリヌクレオチドプロー
ブを、両プローブが増幅産物にハイブリッド形成した時
に蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ＲｅｓｏｎａｎｃｅＥｎｅｒｇｙＴｒａｎｓｆｅ
ｒ）（ＦＲＥＴ）がそれら２つの蛍光体間で起こりうる
ように、それぞれ蛍光体で標識する。

【００１８】本発明の他の一つの態様として、被験体と
検出成分との間の相互作用を示すシグナルを、シグナル
強化カスケードを使って指数的に生成させてもよい。し
たがって本発明の一態様は、ａ）前記被験体をシグナル生成結合体と、前記被験体と
前記結合体との間に複合体が形成される条件下で接触さ
せ、ｂ）複合体の量を時間の関数として決定し、ｃ）前記関数の一次、二次またはｎ次導関数を計算し
（ここにｎは自然数である）、ｄ）前記導関数の極大、０値または極小を決定し、ｅ）前記極大、０値または極小から、被験体の初期濃度
を計算する、ことからなる、被験体の定量方法を行なうことである。

【００１９】本発明のさらに他の一つの態様として、定
量的データを得るために導関数を計算する原理は、微生
物または細胞個体群の増殖速度の分析に応用できる（実
施例３参照）。したがって、本発明はまた、ある化合物
の、微生物または細胞個体群の増殖速度に対する影響を
分析する方法であって、ａ）前記微生物または細胞個体群をかかる化合物の存在
下に増殖させ、ｂ）前記微生物または細胞個体群の細胞数を増殖時間の
関数として決定し、ｃ）前記関数の一次、二次またはｎ次導関数を計算し
（ここにｎは自然数である）、ｄ）前記化合物の影響の尺度として、前記導関数の極
大、０値または極小を決定する、ことからなる方法に関する。

【００２０】これらの態様についても、導関数を計算で
きる限り、細胞数または複合体形成の量を反映する相対
シグナルを決定すれば十分である。

【００２１】系の指数的または累進的増幅は、限られた
濃度でしか提供されえないいくつかの化合物の利用可能
性によって制限されうる。その結果、増幅または自己複
製の速度は低下し始め、指数期から、もはや増幅または
自己複製産物が生成しない平坦期への移行が起こる。こ
のタイプの速度論に関する典型的な例はＰＣＲによるＤ
ＮＡの増幅である。この場合、反応はＤＮＡポリメラー
ゼの量、増幅プライマーの濃度、またはヌクレオシド三
リン酸の濃度によって制限されうる。他方、累進的増幅
は産物阻害によって、例えばＰＣＲの場合であれば一本
鎖ＰＣＲ産物が再アニーリングして、プライマーにハイ
ブリッド形成できない二本鎖産物を形成することによっ
て制限される場合もある。

【００２２】本発明によれば、データ駆動型アルゴリズ
ムを使って、さらなる分析のためのデータを選択する。
適切に平滑化された速度論を得るには、数学的フィルタ
ーアルゴリズムを使用できる。核酸増幅の場合、好まし
くは、サビツキーゴーレイフィルターを適用できる
（「ＮｕｍｅｒｉｃａｌＲｅｃｉｐｅｓｉｎＣ，
ｔｈｅａｒｔｏｆｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｍ
ｐｕｔｉｎｇ」ケンブリッジ大学出版，第二版，ｐ．６
５０以降）。

【００２３】サビツキーゴーレイフィルターを適用する
と、測定された各速度論点は、左側と右側にある近傍の
点を含むウィンドウから計算される平滑化された点に置
き換えられる。これらの点から、あらゆる測定値につい
てｎ次の多項式が計算される。ただし、左側または右側
に点がないのでそのような計算が不可能な、反応のまさ
に最初とまさに最後で決定された値は除く。したがっ
て、垂直ウィンドウパラメーター（ｖｅｒｔｉｃａｌ
ｗｉｎｄｏｗｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）はａ／ｎ／ｂと
定義され、ここにａは左側から取った点の数、ｎは多項
式の次数、ｂは右側からとった点の数である。

【００２４】平滑化した速度論値から、一次、二次また
はｎ次導関数の極大、極小または０値を計算する。この
ような極値の決定は、被験体の初期濃度を反映する各速
度論に特有な一意的で信頼できるフラクショナルサイク
ル数の定義に適した設定点を与える。

【００２５】最も信頼できるデータを得るには、一次導
関数の計算された極大には垂直ウィンドウパラメーター
３／３／４を持つサビツキーゴーレイフィルター、また
は二次導関数の計算された極大には垂直ウィンドウパラ
メーター６／２／４のサビツキーゴーレイフィルターを
使用することが、とりわけ有利であることが判明してい
る。

【００２６】平滑化した速度論点のそれぞれについて、
当技術分野で知られている方法によって導関数が計算さ
れる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の所定のサイクル
数ｘに関する平滑化された値ｙのそれぞれについての一
次導関数はρ（ｘ）＝ｙ（ｘ）−ｙ（ｘ−１）として計
算しうる。次に二次導関数はその一次導関数から同じ方
法で計算できる。他方、所定のサイクルｘで、サビツキ
ーゴーレイフィルターからの多項式フィットを、ｘとｙ
の一次および二次導関数について容易に評価できる。

【００２７】次に、前記導関数から極値を決定するため
に、仮定した極値の周りに位置する３〜５点の数を考慮
して、さらなる多項式フィットを適用できる。例えば図
１５は、５点への二次フィットを用いた二次導関数極大
のフラクショナルサイクル数決定を示す。二次導関数値
はスライディングウィンドウ（ｓｌｉｄｉｎｇｗｉｎ
ｄｏｗ）多項式フィット（一つのサビツキーゴーレイフ
ィルター）によって決定した。

【００２８】増幅反応の速度論を測定できる可能性は本
発明の前提条件であるが、増幅産物の生成を分光学的検
出原理によって、例えば蛍光を使って連続的に測定でき
る装置と方法を利用できるので、これは非常に容易にな
っている。好適な装置の例は、ウィットワー（Ｗｉｔｔ
ｗｅｒ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２，Ｎ
ｏ．１，ｐ．１７６〜１８１（１９９７）に詳述されて
いる。

【００２９】増幅産物の生成の連続的モニタリングを可
能にする、標的依存的蛍光シグナリングに基づく検出形
式がいくつか開示されている〔ウィットワー（Ｗｉｔｔ
ｗｅｒ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．２
２，Ｎｏ．１，ｐ．１３０〜１３８，１９９７に概説さ
れている〕。これらの検出形式には次に挙げるものがあ
るが、これらに限定されるものではない。

【００３０】１．蛍光二本鎖ＤＮＡ認識化合物の使用通常、二本鎖増幅産物の量は分析される試料中に元々存
在していた核酸の量を超えるので、適当な波長で励起す
ると、二本鎖ＤＮＡに結合した場合にのみ強化された蛍
光を示す二本鎖ＤＮＡ特異的色素を使用できる。好まし
くは、例えばＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｉのよう
にＰＣＲ反応の効率に影響を及ぼさない色素だけを使用
しうる。

【００３１】２．ハイブリッド形成時の増加した蛍光共
鳴エネルギー移動この検出形式には、増幅産物の一つの鎖の、近接しては
いるが重複していない領域にハイブリッド形成できる、
それぞれが蛍光部分で標識された２つのオリゴヌクレオ
チドハイブリッド形成プローブを使用する。好ましく
は、一方のヌクレオチドはその５’末端で標識され、他
方のオリゴヌクレオチドはその３’末端で標識される。
標的ＤＮＡにハイブリッド形成させると、これら２つの
蛍光標識は、２つの蛍光部分の間の蛍光共鳴エネルギー
移動が起こりうるように、密接に接触する。その結果、
ハイブリッド形成は、供与部分の励起とそれに続く他方
の受容部分の蛍光発光の測定によってモニターできる。

【００３２】類似する一態様では、一つの適当に標識さ
れたプライマーと共にやはり特異的ＦＲＥＴ対として役
立ちうるただ一つの蛍光標識プローブを使用する〔ベル
ナルド（Ｂｅｒｎａｒｄ）ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２３５，ｐ．１０１〜１０７
（１９９８）〕。

【００３３】３．タックマン（ＴａｑＭａｎ）原理増幅産物を検出するために、蛍光体で標識された一本鎖
ハイブリッド形成プローブを使用する。かかる蛍光体の
蛍光発光は、消光化合物として作用できる同じプローブ
上の第二の標識によって消光される。ＰＣＲ反応のアニ
ーリング工程でそのプローブはその標的配列にハイブリ
ッド形成し、その後、プライマーの伸長中に、５’−
３’エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ
がそのハイブリッド形成プローブを、前記蛍光体が前記
消光化合物から分離されるように、より小さい断片に消
化する。適当な励起後に、蓄積しつつある増幅産物の指
標として、蛍光発光をモニターできる。

【００３４】４．分子ビーコンタックマンプローブと同様に、分子ビーコンオリゴヌク
レオチドは、その分子の二次構造ゆえに互いに密接に近
接する蛍光化合物と消光化合物で標識される。標的ＤＮ
Ａに結合すると分子内水素結合が壊れ、プローブの一端
に配置された蛍光化合物は、そのプローブの他端に配置
された消光化合物から隔てられる〔リザルディ（Ｌｉｚ
ａｒｄｉ）ら，米国特許第５，１１８，８０１号公
報〕。

【００３５】通常、開示されるハイブリッド形成プロー
ブは、被験体の配列と全く同一または厳密に相補的な配
列を有する。しかし、そのプローブが１または複数のミ
スマッチを含有している場合も、それが適当なハイブリ
ッド形成条件で被験体にハイブリッド形成できる限り
は、本発明の範囲に含まれる。いずれの場合も、配列の
同一性または相補性が少なくとも１０個の連続残基の範
囲にわたって１００％であれば、とりわけ有利であるこ
とがわかっている。また、プローブの長さが１００ヌク
レオチドを超えなければ、好ましくは４０ヌクレオチド
以下であれば、有利であることもわかっている。

【００３６】外部標準を利用する原理に従った被験体の
定量の場合は、検量線を作成する必要がある。定量しよ
うとする被験体がＰＣＲによって増幅される核酸である
場合は、既知量の被験体を増幅し、蛍光シグナルの強度
をサイクル数の関数として決定する。数学的フィットに
よる速度論の平滑化後に、一次、二次またはｎ次導関数
の１以上の極値を計算する。これは、元の標的濃度と決
定された極値のフラクショナルサイクル数との間の相関
を可能にする。その後に未知被験体濃度の決定を行なう
ことができる。

【００３７】

【実施例】実施例１ＰＣＲによるシクロフィリンＡ配列の増幅とそれに続く
ハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅｓ）を用いた検出：
先に開示されたアルゴリズムとの比較シクロフィリンＡ配列を保持する線状化プラスミドか
ら、連続希釈を行なって２μｌあたり１０⁷、１０⁵、
１０³および１０²コピーの濃度にした。信頼できる統
計データを得るために、これら希釈液は、複製を６つ調
製した。合計２０μｌの容量で、各試料について、ＰＣ
Ｒ反応の準備をした：

【００３８】

【表１】

【００３９】表示したプライマーとプローブのヌクレオ
チド位置は、ヘンドラー（Ｈａｅｎｄｌｅｒ）ら〔Ｅｍ
ｂｏＪｏｕｒｎａｌ６，ｐ．９４７〜９５０（１９
８７）〕に記載のヌクレオチド位置に相当する。

【００４０】製造者のプロトコルに従って、試料を１．
５ｍｍ毛細管（ＲｏｃｈｅＭｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．社，カタログ番号１９０９３３９）に充填した。
次に、その毛細管をＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓＧｍｂＨ社製のライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙ
ｃｌｅｒ）ＬＣ３２に挿入し、次のサーマルサイクリン
グプロトコルに従うＰＣＲ反応にかけた：

【００４１】

【表２】

【００４２】各サイクル後に、製造者のプロトコルに従
って、各試料について２種類のチャンネルで蛍光を分析
した。チャンネル１は５２０±２０ｎｍのバイパスに相
当し、チャンネル２は６４５±２０ｎｍのバイパスに相
当した。次に、ピペッティング誤差による容量差を正規
化し、アラインメント誤差と検出誤差を排除するため
に、チャンネル１に対してチャンネル２から得られた値
の比を計算した。

【００４３】実施例１で得た生データを２種類の方法で
処理した：

【００４４】Ａ）先に開示された方法に従って、生蛍光
データの適当なバックグランド除去後に、手作業で選択
した閾値レベルを設定した。各試料について、閾値線と
蛍光シグナル対時間の関数との間の交点を、以下のアル
ゴリズムで計算した：回帰計算に基づき、先に設定され
たノイズバンドを上回る２つの測定点を使って、線形回
帰により対数線形期を定めた。その対数線形領域内で、
閾値線を手作業で設定し、その閾値線と試験した各コピ
ー数に対応する回帰線との間の交点を計算した。その方
法の妥当性に関する情報を得るために、計算された交点
を使って、標的ＤＮＡの初期濃度のｌｏｇ１０計算値に
対してサイクル数を示すプロットを作成した（図１およ
び２参照）。このプロットから、この方法の正確度と精
度に関する指標としての平均値、標準偏差および変動係
数の計算を可能にする線形回帰を決定した。結果を表３
に示す。ここに濃度と交点は実施例１に従って蛍光閾値
法で計算したものであり、略号は次の通りである：平均
値（Ｍｉｔｔｅｌｗｅｒｔ）、標準偏差（ＳＴＤＷＮ）
および変動係数〔ＣＶ（％）〕。

【００４５】

【表３】

【００４６】Ｂ）本発明に従い、前もってバックグラウ
ンド除去を行うことなく、垂直ウィンドウパラメーター
６／２／４を有するサビツキーゴーレイフィルターを使
った多項式フィットによって、同じ生データを平滑化し
た。得られた関数から、二次導関数の極大を計算し、初
期テンプレート濃度の指標として使用した。ここでも、
得られたデータから、標的ＤＮＡの初期濃度に対してフ
ラクショナルサイクル数を示すプロットを作成した（図
３および４参照）。平均値、標準偏差および変動係数を
上述のように計算した。その結果を表４に示す。ここで
濃度と交点は実施例１に従って二次導関数極大法で計算
したものであり、略号は次の通りである：平均値（Ｍｉ
ｔｔｅｌｗｅｒｔ）、標準偏差（ＳＴＤＷＮ）および変
動係数〔ＣＶ（％）〕。

【００４７】

【表４】

【００４８】表３と表４の結果を比較することによって
わかるように、先行技術に従って方法Ａ）によって得ら
れる統計値も、本発明に従って方法Ｂ）によって得られ
る統計値も、ほぼ同じ程度の正確度と精度を与えた。し
かし、本発明に従った方法は、生成した蛍光シグナルの
実際の量からは独立しており、データ処理はユーザー主
導型ではないので、先に開示された定量法に優る利点が
ある。

【００４９】実施例２ＰＣＲによるＴＮＦα配列の増幅と続くＳＹＢＲグリー
ンを用いた検出：一次導関数極大、二次導関数極大およ
び二次導関数極小からの初期濃度の計算の比較実験は、
実施例１に従い、次の変更を加えて行なった。

【００５０】ＴＮＦαゲノム配列〔シライ（Ｓｈｉｒａ
ｉ）ら，Ｎａｔｕｒｅ３１３，ｐ．８０３，１９８
５〕を保持するプラスミドを連続希釈にかけて、２μｌ
あたり１０⁷、１０⁵、１０³、１０²および１０¹コ
ピーの試料濃度にした。各試料濃度につき、複製を６つ
調製した。

【００５１】各ＰＣＲ反応は２０μｌの総体積に下記の
成分を含む：

【００５２】

【表５】

【００５３】適用したサーモサイクリングプロトコルは
実施例１と同じである。各増幅サイクル後に、ＳＹＢＲ
グリーンの蛍光を製造者のプロトコルに従って、５２０
±２０ｎｍのバイパスに相当するライトサイクラーチャ
ンネル１で測定した。

【００５４】本発明に従って、生データを、垂直ウィン
ドウパラメーター２／３／２、２／４／２、３／３／
３、３／４／３、４／３／２、４／４／２、６／３／
２、６／４／２、６／５／２および６／６／２を有する
サビツキーゴーレイフィルターを用いた異なる多項式フ
ィットによって平滑化した。得られた速度論から、一次
導関数と二次導関数の極大、二次導関数の極小を、所定
の被験体濃度の６つの複製すべてについて計算し、それ
らを初期テンプレート濃度の指標として使用した。

【００５５】これらのデータにもとづき、サイクル数を
テンプレートＤＮＡの様々なコピー数のｌｏｇ１０に対
してプロットした。次に、回帰線を計算した。図５〜１
４から推定できるように、これらの較正作業プロットの
結果は、計算されたサイクル数と被験体濃度のｌｏｇ１
０との間の直線関係を示しており、原理的に、異なるタ
イプの垂直ウィンドウパラメーターを用いた異なる極値
の決定を、初期被験体濃度を決定するために使用できる
ことを立証している。

【００５６】一次および二次極大に関して、サビツキー
ゴーレイフィルターの選択に関する好ましい態様を決定
するために、異なるプロット由来のデータを、主として
次の３つの基準を考慮に入れて比較した：ａ）１００コピーの被験体に相当する６つの複製につい
て決定される変動係数ＣＶ（％）ｂ）分解能の指標としての回帰直線の傾きｃ）ロバスト統計ウィルコクソン検定によって計算され
る被験体１０¹コピーと１０²コピーの間の識別に関す
る分解能。ここではｐ値を決定し、それに関して０．０
５未満の数字を有意とみなす。

【００５７】この分析の結果を表６に要約する。

【００５８】

【表６】

【００５９】分解能に関して、このデータは、一次導関
数極大の計算に先立って、また二次導関数極大の計算に
先立って、異なるフィルターを使用することにより、基
準ｂ）に関して同等の分解能があり、また基準ｃ）に関
して試験した全てのフィルターについて十分な分解能が
あることを示している。

【００６０】一次導関数の極大の決定については、比較
的低いＣＶ（％）値が、試験した全てのフィルターパラ
メーターから得られた。二次導関数の極大の決定につい
ては、６／２／ｂの垂直ウィンドウパラメーター（ここ
にｂは３、４または５）が好ましいと認められる。

【００６１】実施例３対数増殖曲線は個体群増殖のモデル化に使用できる（図
１６）。このような曲線は初期誘導期、指数増殖期およ
び平坦期を持つ。細菌の成長はこの種の曲線に従う。増
殖速度に対する刺激性または阻害性化合物の影響は、生
物の相対数を経時的に追跡することによって決定でき
る。この曲線が左側にシフトすればその化合物は阻害物
質であり、右側にシフトすればその化合物は増殖を刺激
する。阻害または刺激の強さは曲線がどのくらいシフト
するかに関係する。

【００６２】例えば、分光光度計キュベット中の増殖培
地（ＬＢブロス）に細菌（大腸菌）を接種し、撹拌し、
３７℃に維持する。細菌の増殖は、キュベットを通した
光散乱により５００ｎｍで５分毎にモニターされる。細
菌数が増加するにつれて吸光度は増加し、細菌数の相対
的尺度を与える。二次導関数極大を計算して対照試料
（Ｔ）のフラクショナルサイクル数を得る。

【００６３】並行反応として、物質Ａ、ＢおよびＣを培
地の入った別々のキュベットに加え、先と同様に接種す
る。それらの増殖を上と同様に経時的にモニターする。
図１７に示すような曲線が得られるだろう。図１７の例
証的データに示すように、物質Ａは物質Ｂより強力な阻
害物質であり、一方、物質Ｃは刺激物質である。阻害の
強さは、フラクショナルサイクル数のシフトの大きさと
方向によって定量できる：Ｃ_T−Ｃ_B＝物質Ｂの阻害の大きさＣ_T−Ｃ_A＝物質Ａの阻害の大きさＣ_T−Ｃ_C＝物質Ｃの阻害の大きさ

【００６４】増殖を評価するために培地の濁度（５００
ｎｍで測定される）を測定することに加えて、例えば培
地のｐＨシフトや栄養素の消費など、数多くの他の増殖
モニターを使用できることは明らかだろう。唯一の要件
は、導関数を計算するのに足りる個体群サイズの相対尺
度を得ることである。

【００６５】

【発明の効果】本発明の被験体の定量方法によれば、増
幅可能または複製可能な被験体の濃度を、異なる蛍光バ
ックグラウンドに対して補正を行なうことなく、ユーザ
ー定義の対数期とユーザー定義の閾値レベルから独立し
て決定でき、また同時に、反応の平坦期に生成されるシ
グナルの絶対レベルとは無関係に濃度を決定することが
できる。そのような絶対シグナルレベルからの独立性ゆ
え、異なるウィンドウ範囲を持つ複数のチャンネルで検
出される複数の蛍光シグナルを比較しうるシステムにと
っても有利である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＲＥＴハイブプローブを用いた蛍光シグナル
の測定結果を示す図である。

【図２】実施例１に従った閾値法で計算した線形回帰曲
線を示す図である。

【図３】ＦＲＥＴハイブプローブを用いた蛍光シグナル
の測定結果を示す図である。

【図４】実施例１に従った二次導関数極大法で計算した
線形回帰曲線を示す図である。

【図５】実施例２に従ったＳＹＢＲグリーン実験で、極
大一次導関数、極小二次導関数および極大二次導関数
を、テンプレートコピー数のｌｏｇ１０に対して決定す
ることにより、６回反復して計算されたフラクショナル
サイクル数を示すプロットを示す図である。サビツキー
ゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを２／
３／２に設定した。

【図６】図５と同様のプロットを示す図である。サビツ
キーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを
２／４／２に設定した。

【図７】図５と同様のプロットを示す図である。サビツ
キーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを
３／３／３に設定した。

【図８】図５と同様のプロットを示す図である。サビツ
キーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを
３／４／３に設定した。

【図９】図５と同様のプロットを示す図である。サビツ
キーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを
４／３／２に設定した。

【図１０】図５と同様のプロットを示す図である。サビ
ツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーター
を４／４／２に設定した。

【図１１】図５と同様のプロットを示す図である。サビ
ツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーター
を６／３／２に設定した。

【図１２】図５と同様のプロットを示す図である。サビ
ツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーター
を６／４／２に設定した。

【図１３】図５と同様のプロットを示す図である。サビ
ツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーター
を６／５／２に設定した。

【図１４】図５と同様のプロットを示す図である。サビ
ツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーター
を６／６／２に設定した。

【図１５】二次導関数極大の二次推定によるフラクショ
ナルサイクル数決定のグラフを示す図である。

【図１６】細胞個体群の増殖を示す対数増殖曲線のグラ
フを示す図である。

【図１７】物質Ａ（Ａ）、物質Ｂ（Ｂ）、物質Ｃ（Ｃ）
および対照（Ｔ）の存在下に培養された細胞個体群の増
殖を示す、培養細菌細胞の個体群について得られた増殖
曲線のグラフを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ザビーネローマンドイツ連邦共和国イッフェルドルフデー−82393 シュタルトアッヒャーシュトラーセ 76 (72)発明者カールティー．ウィットワーアメリカ合衆国ユタ 84108 ソルトレイクシティー，イースト 1700 サウス 2568

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）被験体を増幅剤と接触させる工程、ｂ）前記被験体の少なくとも一つの所定の位置を増幅す
る工程、ｃ）増副産物の量を反応時間の関数として決定する工
程、ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工
程、ここでｎは自然数である、ｅ）前記導関数の極大、０値又は極小を決定する工程、
並びにｆ）前記極大、０値又は極小から前記被験体の初期濃度
を計算する工程、を含む、被験体の定量方法。
【請求項２】増幅反応の一時期に増幅産物の量が累進
的に増加する請求項１記載の方法。
【請求項３】前記累進期後に増幅速度が減少する請求
項２記載の方法。
【請求項４】前記導関数を数学的フィットにより計算
する請求項３記載の方法。
【請求項５】増幅産物を蛍光を使って検出する請求項
１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】前記被験体が核酸である請求項１〜５い
ずれか記載の方法。
【請求項７】増幅をポリメラーゼ連鎖反応により得る
請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】増幅をポリメラーゼ連鎖反応により得、
かつ増副産物を二本鎖ＤＮＡ結合体により検出する請求
項４記載の方法。
【請求項９】少なくとも１０個の連続残基の範囲にわ
たって被験体の配列と同一又は相補的な配列を有する、
少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブにより増幅
産物を検出する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】２つのポリヌクレオチドプローブを各
々蛍光体で標識し、両プローブが増幅産物にハイブリッ
ド形成したときに蛍光共鳴エネルギー移動をそれら２つ
の蛍光体間で生じさせる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】ｂ）微生物又は細胞個体群を化合物の
存在下に増殖させる工程、ｃ）前記微生物又は細胞個体群の細胞数を反応時間の関
数として決定する工程、ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工
程、ここでｎは自然数である、並びにｅ）前記化合物の影響の尺度として、前記導関数の極
大、０値又は極小を決定する工程、を含む、微生物又は細胞個体群の増殖速度に対する化合
物の影響の分析方法。
【請求項１２】ｂ）被験体をシグナル生成結合体と、
前記被験体と前記結合体との間に複合体が形成される条
件下で接触させる工程、ｃ）複合体の量を時間の関数として決定する工程、ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工
程、ここでｎは自然数である、ｅ）前記導関数の極大、０値又は極小を決定する工程、
並びにｆ）前記極大、０値又は極小から被験体の初期濃度を計
算する工程、を含む、被験体の定量方法。