ES2250039T3 - Metodo para la cuantificacion de un analito. - Google Patents

Abstract

Un método para la cuantificación de un analito, que comprenda a) contactar dicho analito con un agente amplificador; b) amplificar al menos un lugar predeterminado del analito, c) determinar la cantidad de producto de amplificación en función del tiempo de reacción, de manera que durante una fase de la reacción de amplificación la cantidad de producto de amplificación aumenta progresivamente y donde después de dicha fase progresiva, la velocidad de amplificación disminuye. d) Calcular la derivada de primer, segundo o tercer orden de dicha función, donde n es un número natural e) Determinar el valor máximo, cero o mínimo de dicha derivada, y f) Calcular a partir de dicho máximo, del valor cero o del valor mínimo la concentración inicial del analito.

Description

Método para la cuantificación de un analito.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la cuantificación de los analitos que se encuentran presentes en concentraciones bajas pero se pueden amplificar o replicar en las condiciones adecuadas. En particular, se refiere a la cuantificación de una secuencia específica de polinucleótidos en una muestra que contiene polinucleótidos.

Fundamento de la invención

Entre la serie de diferentes métodos analíticos que detecta y cuantifica las secuencias de ácidos nucleicos, la Reacción de la Cadena de Polimerasa (RCP) ha llegado a ser la tecnología más poderosa y ampliamente extendida, cuyos principios se revelan en la US 4.683.195 y US 4.683.202 (Mullis y cols.). Sin embargo, una reacción RCP típica únicamente proporciona datos cualitativos, puesto que, después de una fase de amplificación exponencial o progresiva, la cantidad de ácido nucleico amplificada llega a un nivel tal que la cantidad de producto de reacción generado no es proporcional a la concentración inicial del ADN modelo o patrón.

Como consecuencia de ello, se han desarrollado muchos protocolos distintos a base de RCP con el fin de obtener unos datos cuantitativos seguros y reproducibles. En general, se pueden discriminar dos principios básicos distintos:

i) RCP competitivo usando modelos internos

ii) Cuantificación del mediante la generación inicial de una curva de calibración, revisada

Por Siebert, en: Molecular Diagnosis of infectious diseases (ed. Reiscbl, Humana Press, Totowa, New Jersey, p. 55-79 (1998).

Una mejoría importante en la generación de datos cuantitativos deriva de la posibilidad de medir la cinética de una reacción RCP mediante la detección on-line. Esto ha sido recientemente posible a través del control de la fluorescencia. Ejemplos de dichas técnicas se explican con detalle en WO 97/46707, WO 97/46712 y WO 97/46714 (Wittwer y cols.).

Previamente a la disponibilidad de la detección on-line RCP, Wiesner y cols.(Nucl.Acids Res.20, 5863-5864 (1992) utilizaron por primera vez datos de múltiples ciclos de una reacción RCP, en los cuales después de cada ciclo, la concentración del producto se analizaba mediante incorporación radiactiva y posterior recuento de escintilaciones. Para cada curva, la concentración inicial patrón (N_{0}) y la eficacia de amplificación (eff) se determinaban mediante la regresión lineal de puntos de datos en una concentración del producto (N_{n}) frente a la gráfica de números de ciclos tal como se define en la fórmula siguiente:

Log \ N_{n} = (log \ eff)n + log \ N_{0}

Higuchi y cols. (Biotechnology 11, 1026-2030) (1993) fueron los primeros en revelar un método más simple para la cuantificación inicial del patrón usando el control de la fluorescencia en cada ciclo. Se empleaba un nivel umbral de fluorescencia para definir un número fraccional de ciclos relacionado con la concentración inicial del patrón. Específicamente, el log de la concentración inicial del patrón es inversamente proporcional al número fraccional de ciclos (CT), definido como la intersección de la fluorescencia frente a la curva del número de ciclos con el umbral de fluorescencia.

En una configuración más sofisticada del método umbral de fluorescencia, el nivel umbral no se elige manualmente o arbitrariamente, pero se fija en tres veces el coeficiente de variación de las señales que se obtienen como ruido de fondo fluorescente.

Sin embargo, existen varios inconvenientes importantes del tipo mencionado con anterioridad. En primer lugar, los métodos del tipo anterior requieren unas correcciones para las diferentes señales de fondo fluorescentes con el fin de compensar las variaciones muestra a muestra debidas a las diferencias en las eficacias de excitación o emisión. En segundo lugar, debido a que la cuantificación de la amplificación dependiente del patrón siempre tiene que realizarse durante la fase log lineal de la reacción (Köhler y cols.,``Quantitation of mRNA by RCP: Nonradiactive methods, p.6 Springer Berlin 1995, ed. Köhler), se tiene que determinar una ventana log lineal de la reacción previa al actual experimento de cuantificación. Además, el ajuste de un nivel umbral tampoco requiere una persona experimentada en el tema, ya que se elige manualmente sin tener en cuenta unas condiciones previas específicas del experimento.

Por consiguiente, se requieren métodos en los que la concentración de un analito amplificable o replicable pueda ser determinada sin una corrección por un ruido de fondo fluorescente distinto, independientemente de una fase log definida por un usuario y un nivel umbral definido por un usuario, y donde al mismo tiempo la concentración determinada sea independiente del nivel absoluto de señal que se va a generar en la fase plató de la reacción. Además, dicha independencia del nivel absoluto de la señal es también ventajosa para los sistemas, en los cuales se pueden comparar múltiples señales fluorescentes que están siendo detectadas a través de múltiples canales con unos márgenes de ventana diferentes.

Resumen de la invención

La presente invención describe los métodos para analizar de un modo cuantitativo un sistema tanto amplificable como de replicación automática de manera que se mida de forma continuada la cantidad de producto de amplificación o de autorreplicación. De acuerdo con una versión de la presente invención se dispone de un método para cuantificar un analito. El método comprende las etapas de poner en contacto el analito con un agente amplificador, y la amplificación de al menos un lugar predeterminado del analito. La cantidad de producto de amplificación se determina luego como una función del tiempo de reacción y la derivada de primer, segundo o tercer orden de dicha función se calcula siendo n un número natural. El valor máximo, el valor cero o el valor mínimo de dicha derivada se determina luego y se calcula la concentración inicial del analito a partir de dicho valor máximo, valor cero o valor mínimo. El método revelado puede ser utilizado para analizar de forma cuantitativa la velocidad de crecimiento de los organismos y así medir el efecto de una condición ambiental modificada en el crecimiento de un organismo.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1a: Medición de la señal de fluorescencia con FRET-HybProbes

Fig. 1b: Curva de regresión lineal calculada con el método umbral según el ejemplo 1.

Fig. 2a: Medición de la señal de fluorescencia con FRET-HybProbes

Fig. 2b: Curva de regresión lineal calculada con el método del máximo de la segunda derivada conforme al ejemplo 1.

Figs. 3a-3j: Gráficos que muestran los números fraccionales de ciclo calculados en replicados seis veces determinando la primera derivada máxima, la segunda derivada mínima, y la segunda derivada máxima frente al log en base 10 del número de copias patrón en un experimento SYBR Green conforme al ejemplo 2. Parámetros de ventana vertical del filtro Savizky Golay se establecían tal como sigue Fig. 3a, 2/3/2; Fig. 3b, 2/4/2; Fig. 3c, 3/3/3; Fig. 3d, 3/4/3; Fig. 3e, 4/3/2; Fig. 3f, 4/4/2; Fig. 3g, 6/3/2; Fig. 3h, 6/4/2; Fig. 3i, 6/5/2; Fig. 3j, 6/6/2.

Fig. 4: Representación gráfica del número fraccional de ciclos mediante estimación cuadrática del máximo de la segunda derivada

Fig. 5: Representación gráfica de un representante logístico de la curva de crecimiento del crecimiento de una población de células.

Fig. 6: Representación gráfica de las curvas de crecimiento generadas para una población de células bacterianas cultivadas que representan el crecimiento de una población de células cultivadas en presencia de una sustancia A(A), sustancia B(B) sustancia C(C) y el control (T).

Descripción detallada de la invención

La invención comprende los métodos para analizar cuantitativamente un sistema amplificable o bien de replicación automática de manera que se mida continuamente la cantidad de producto de amplificación o de autorreplicación. La medición continua en una reacción RCP, por ejemplo, puede significar también que las mediciones se realizan una vez cada ciclo. El método de la presente invención es especialmente aplicable a configuraciones, en las que durante una fase de la reacción de amplificación o de autorreplicación (generalmente empezando desde el principio o alternativamente después de una fase inicial de demora), la cantidad de producto de referencia aumenta progresivamente. Además, el método es aplicable a las configuraciones en las cuales después de dicha fase exponencial, la velocidad de amplificación disminuye.

Utilizando los algoritmos matemáticos apropiados, los datos generados se pueden utilizar luego para ajustar una función matemática, lo que revela la cinética suavizada de los datos en bruto medidos originalmente. Se ha demostrado que resulta ventajoso para el presente método, si el ajuste polinomial se calcula mediante un filtro Savitzky Golay (Press y cols., en: Numerical Recipes inC, the art of scientific Computing, Cambridge University Press, second edition, p. 650 ff). A partir de dicha función se pueden calcular derivadas de primer, segundo o incluso órdenes superiores y los valores máximos, mínimos o cero de dichas funciones. Los datos obtenidos son parámetros característicos para cada amplificación o autorreplicación y se pueden utilizar para cuantificar la cantidad original de la entidad amplificada o bien la influencia de los compuestos o de los factores ambientales (como la temperatura, el pH, la radiación electromagnética o la composición de nutriente) que están presentes durante la amplificación o autorreplicación de la muestra.

La mayoría de sistemas amplificables o de autorreplicación trabajan de tal forma que la amplificación o autorreplicación se obtiene exponencialmente durante un cierto periodo de tiempo, lo que suele suceder muy al principio de la reacción. Sin embargo, en caso de curvas de crecimiento de microorganismos o poblaciones celulares, por ejemplo, puede existir una fase de demora al principio, que en un momento posterior puede dar lugar a una fase exponencial. Sin embargo, esto no afecta a la aplicabilidad de la invención para dichas configuraciones.

Tal como se ha subrayado antes, una configuración de la invención implica la cuantificación de las secuencias específicas de ácido nucleico que se encuentran presentes en cantidades mínimas en una muestra que va a ser analizada y se pueden amplificar o bien replicar automáticamente usando los métodos de amplificación apropiados. El método de amplificación más frecuente para los analizados de ácido nucleico es la reacción de la cadena de polimerasa (RCP), que es bien conocida por los expertos en este campo. Un resumen de las aplicaciones básicas se encuentra en Siebert, Molecular Diagnosis of infectious diseases (ed. Reiscbl, Humana Press, Towota, New Jersey, p. 55-79 (1998)): En el ámbito de la invención, no obstante, existen métodos diferentes para amplificar los ácidos nucleicos, por ejemplo, NASBA (Malek y cols., WO 91102814). El ácido nucleico de referencia puede ser un ADN de dos ramas, de una sola rama o cualquier tipo de ARN. En este último caso, previamente a la RCP, puede efectuarse una síntesis de ADNc usando protocolos estándar.

De acuerdo con una configuración, se ha descrito un método para cuantificar un analito, en el que el analito es un ácido polinucleico. El método comprende las etapas de contactar el analito con un agente amplificador (y todos los compuestos que son necesarios para amplificar al menos una parte del analito) y amplificar al menos una parte del analito. Típicamente solamente se amplifica una región limitada del analito y en el caso de una secuencia de ácido nucleico solamente se amplificará la secuencia flanqueada por los dos cebadores. La cantidad de producto de amplificación será determinada luego como una función del tiempo de reacción, y se calculará la derivada de primer, segundo o tercer orden de dicha función, donde n es un número natural. El valor máximo, cero o mínimo de dicha derivada se determinará luego y la concentración inicial del analito se calculará a partir del valor máximo, cero o mínimo. En una configuración preferida, el producto de amplificación se detecta por medio de la fluorescencia y el producto de amplificación se obtiene por una reacción en cadena de la polimerasa.

En el contexto de esta invención, la determinación de la cantidad de producto de amplificación en función del tiempo no significa que se precise medir la cantidad absoluta de producto de amplificación. En lugar de ello, es suficiente con determinar las señales relativas, puesto que la determinación relativa ya permite el cálculo de las derivadas, lo que de acuerdo con la invención puede ser utilizado luego para determinar la cantidad absoluta de la concentración de referencia inicial.

En una configuración de la invención, la amplificación del analito se obtiene por una reacción de la cadena de polimerasa y el analito que se va a cuantificar es un ácido nucleico. De acuerdo con la presente invención, el producto de amplificación se detecta típicamente por medio de la fluorescencia. Cuando el analito es un ácido nucleico, el producto de amplificación puede ser detectado por una entidad de enlace del ADN de doble ramificación, por ejemplo, usando un colorante fluorescente de enlace del ADN de doble ramificación. Alternativamente, se puede detectar el producto de amplificación con unas muestras de hibridación de polinucleótidos especialmente diseñadas, que tengan unas secuencias idénticas con o complementarias a la secuencia del analito que va a ser cuantificado sobre una gama de cómo mínimo 10 residuos continuos. En una versión específica de esta alternativa, dos muestras de polinucleótidos se etiquetan ambas con una entidad fluorescente, de manera que cuando ambas muestras se hibridizan al producto de amplificación, puede tener lugar la (TERF) Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia entre las dos entidades fluorescentes.

En otro aspecto de la invención, la señal que indica una interacción entre el analito y la mitad detectora puede ser generada también exponencialmente usando una cascada de aumento de la señal. Por lo tanto, un aspecto de la invención consiste también en realizar un método para cuantificar un analito que comprenda

a)

poner dicho analito en contacto con una señal que genera una entidad de enlace en unas condiciones donde se forma un complejo entre dicho analito y dicha entidad de enlace

b)

determinar la cantidad de complejo en función del tiempo

c)

calcular la derivada de primer, segundo o tercer orden de dicha función, donde n es un número natural,

d)

determinar el valor máximo, cero o mínimo de dicha derivada, y

e)

calcular a partir de dicho máximo, cero o mínimo la concentración inicial de analito.

En otro aspecto de la invención, el principio de cálculo de las derivadas para generar datos cuantitativos se puede aplicar al análisis de velocidades de crecimiento de los microorganismos o de las poblaciones celulares (ver ejemplo 3). De acuerdo con ello, la presente invención se dirige también a un método para analizar el efecto de un compuesto en la velocidad de crecimiento de un microorganismo o de una población celular, que comprende

a)

crecimiento de dicho microorganismo o población celular en presencia del compuesto

b)

determinación del número de células de dicho microorganismo o población celular en función del tiempo de crecimiento

c)

cálculo de la derivada de primer, segundo o tercer orden de dicha función, donde n es un número natural, y

d)

determinar el máximo, valor cero o mínimo de dicha derivada como una medida del efecto de dicho compuesto.

También para estas configuraciones, es suficiente con determinar las señales relativas que reflejan el número de células o la cantidad de formación de complejos, así como se pueden calcular derivadas.

La amplificación exponencial o progresiva de los sistemas puede verse limitada por la disponibilidad de algunos compuestos, que únicamente se encuentran disponibles en unas concentraciones limitadas. Como consecuencia de ello, la velocidad de amplificación o bien la autorreplicación empieza a descender y tiene lugar una transición desde la fase exponencial a una fase plató, en la que ya no se genera producto de amplificación o de autorreplicación. Un ejemplo típico de este tipo de cinética es la amplificación del ADN por la RCP. En este caso, la reacción puede verse limitada por la cantidad de ADN polimerasa, la concentración de cebadores de amplificación o bien la concentración de trifosfatos de nucleósido. Alternativamente, la amplificación progresiva puede verse limitada por la inhibición del producto; por ejemplo, en el caso de la RCP por la hibridación de los productos de la RCP de una sola rama para formar productos de doble rama que no pueden ser hibridizados a los cebadores.

De acuerdo con la nueva invención, se utiliza un algoritmo guiado de datos para seleccionar los datos para un análisis posterior. Con el fin de obtener una cinética suavizada de forma apropiada, puede utilizarse un algoritmo de filtro matemático. En caso de una amplificación del ácido nucleico, se puede aplicar preferiblemente un filtro Savitzky Golay (Numercal Recipes inC, the art of scientific Computing, Cambridge University Press, second edition, p. 650 ff).

Al aplicar un filtro Savitzky Golay, cada punto cinético medido es sustituido por un punto suavizado, calculado a partir de una ventana que incluye los puntos a la izquierda y a la derecha del entorno. A partir de estos puntos, se calcula un polinomial de orden n para cada valor medido, a excepción de aquellos valores determinados muy al principio y muy al final de la reacción, donde debido a la falta de puntos a la izquierda o a la derecha, dicho cálculo es imposible. De acuerdo con ello, se definen los parámetros de la ventana vertical como a/n/b, donde a es el número de puntos contados a partir de la izquierda, n es el orden del polinomial y b es el número de puntos contados a partir de la derecha.

A partir de los valores cinéticos suavizados, se calcula el máximo, el mínimo o el valor cero de la derivada de primero, segundo o tercer orden. La determinación de dichos extremos proporciona los puntos adecuados para la definición de un único y fiable número de ciclos fraccional característico de cada cinética, que refleja la concentración inicial del analito. Se ha demostrado que es particularmente favorable utilizar un filtro Savitzky Golay que tenga los parámetros de ventana vertical 3/3/4 en combinación con el valor máximo calculado de la primera derivada, o bien alternativamente, un filtro Savitzky Golay con los parámetros de ventana vertical 6/2/4 en combinación con el máximo calculado de la segunda derivada para obtener los datos más fiables.

Para cada punto cinético suavizado, se calculan las derivadas mediante métodos bien conocidos. Por ejemplo, la primera derivada para cada valor suavizado y para un número x de ciclos dado de una reacción en cadena de la polimerasa se puede calcular como f(x)=y(x)-y(x-1). La segunda derivada se puede calcular luego a partir de la primera derivada siguiendo el mismo método. Alternativamente, para un ciclo x dado el ajuste polinomial del filtro Savitzky Golay puede ser evaluado fácilmente para la primera y segunda derivadas de x y de y.

Posteriormente, con el fin de determinar los extremos de dichas derivadas, puede aplicarse otro ajuste polinomial para el cual se tienen en cuenta una serie de tres a cinco puntos, que se localizan alrededor del posible extremo. Por ejemplo, la figura 4 muestra la determinación del número de fraccional de ciclos del máximo de la segunda derivada usando un ajuste cuadrático a cinco puntos. Los valores de la segunda derivada se determinaban mediante un ajuste polinomial de la ventana deslizante (un filtro Savitzky Golay).

La posibilidad de medir la cinética de una reacción de amplificación, que es un prerrequisito para la nueva invención, se ha facilitado enormemente puesto que se dispone de instrumentos y métodos en los que la generación del producto de amplificación se puede medir de forma continuada por principios de detección espectroscópicos, por ejemplo, por medio de fluorescencia. Un ejemplo de un instrumento adecuado se ha descrito con detalle en Wittwer y cols., Biotechniques 22, nº1, 176-181 (1997).

Han aparecido varios formatos de detección basados en la señalización fluorescente dependiente del objetivo, que permiten el control continuado de la generación de productos de amplificación (revisado en Wittwer y cols., Biotechniques, Vol.22, nº 1,130-138, 1997). Estos formatos de detección incluyen pero no se limitan a:

1. Uso de compuestos que reconocen el ADN fluorescente de rama doble

Puesto que la cantidad de producto de amplificación doblemente ramificado generalmente excede la cantidad de ácido nucleico originalmente presente en la muestra que va a ser analizada, pueden usarse colorantes específicos de ADN de doble rama, los cuales al ser excitados con una longitud de onda apropiada muestran una fluorescencia elevada únicamente si están unidos al ADN de doble ramificación. Preferiblemente, solo se podrán utilizar aquellos colorantes los cuales al igual que el SYBR Green 1, por ejemplo, no influyan en la eficacia de la reacción RCP.

1. Elevada transferencia de la energía de resonancia de la fluorescencia con la hibridación

Para este formato de detección, se emplean dos muestras de hibridación de oligonucleótidos etiquetadas con una mitad fluorescente que son capaces de producir híbridos de las regiones solapantes de una ramificación del producto de amplificación. Preferiblemente, un nucleótido se marca en el extremo 5' y el segundo nucleótido se marca en el extremo 3'. Cuando forman el híbrido al ADN de referencia, las dos marcas fluorescentes se ponen en contacto, de manera que la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia entre las dos mitades fluorescentes puede llevarse a cabo. Como consecuencia de ello, la hibridación puede ser controlada por la excitación de la mitad donante y la medición posterior de la emisión de fluorescencia de la segunda mitad aceptor.

En una configuración similar, únicamente se utiliza una muestra marcada fluorescentemente, que junto a un cebador marcado de forma apropiada puede servir también como un par específico FRET (Bernard y cols., Analytical Biochemistry 225, p.101-107 (1998)).

2. Principio de Taq Man®

Para detectar el producto de amplificación, se usa una muestra de hibridación de una rama, que se marca con una entidad fluorescente. La emisión de fluorescencia de dicha entidad es extinguida por una segunda marca en la misma muestra que puede actuar como compuesto de extinción. Durante la etapa de hibridación de la reacción RCP, la muestra forma híbridos de su secuencia de referencia y posteriormente, durante la extensión del cebador, la cadena de polimerasa que tiene una actividad de la 5'-3'-exonucleasa compendia la muestra de hibridación en piezas más pequeñas, de tal forma que la entidad fluorescente se separa del compuesto de extinción. Después de la excitación apropiada, la emisión de fluorescencia puede ser controlada como un indicador del producto de amplificación que se acumula.

3. Guías moleculares

Al igual que las muestras Taq Man®, se marca un oligonucleótido guía molecular con un compuesto fluorescente y un compuestos extintor, los cuales debido a la estructura secundaria de la molécula presentan dosis similares. Al enlazarse al ADN de referencia, el enlace de hidrógeno intramolecular se rompe, y el compuesto fluorescente localizado en un extremo de la muestra se separa del compuesto extintor, que está situado en el extremo opuesto de la muestra (Lizardi y cols., US 5.118.801).

En general, las muestras de hibridación tienen secuencias que son completamente idénticas o bien exactamente complementarias a la secuencia del analito. Sin embargo, está también dentro del alcance de la invención, si las muestras contienen uno o varios desajustes, mientras sean capaces de formar híbridos para el analito en unas condiciones de hibridación apropiadas. En cualquier caso, se ha demostrado que es una ventaja si la identidad de la secuencia o su complementariedad está 100% por encima de una gama de al menos 10 residuos contiguos. También se ha demostrado que resulta ventajoso que la longitud de la muestra no exceda los 100 nucleótidos, preferiblemente no más de 40 nucleótidos.

En caso de cuantificación de un analito conforme al principio que utiliza estándares externos, se ha generado una curva de calibración. Si el analito a cuantificar es un ácido nucleico que es amplificado por la RCP, se amplifican cantidades conocidas de analito y la intensidad de la señal fluorescente se determina como una función del número de ciclos. Después de suavizar la cinética mediante un ajuste matemático, se calculan uno o más extremos de la derivada de primer, segundo o tercer orden. Esto permite una correlación entre la concentración original de referencia y el número fraccional de ciclos de un extremo determinado. Posteriormente, se puede llevar a cabo la determinación de las concentraciones de analito desconocidas.

Ejemplo 1

Amplificación de una secuencia de ciclofilina A por la RCP y posterior detección con muestras Hyb: Comparación con un algoritmo revelado previamente

A partir de un plásmido linearizado que lleva la secuencia de ciclofilina A, se sometía a diluciones en serie para producir concentraciones de 10^{7}, 10^{5}, 10^{3} y 10^{2} y se preparaban copias de 2 \mul. Para obtener datos estadísticos fiables, estas diluciones se preparaban en replicados de 6 veces. En un volumen total de 20 \mul, se establecía para cada muestra una reacción de RCP:

1x LCDNA mezcla patrón de muestras de hibridación (Roche Mol.biochem.Catalogue nº 2015102) 4 mM MgCl_{2}

Cebador directo 1 \muM CycA1 (pos. 52-69)

Cebador inverso 1 \muM CycA1 (pos. 52-69)

200 nM 3'fluoresceína CycA muestra de hibridación (pos.420-439)

200 nM 5' LC RED640 CycA muestra de hibridación (Pos. 444-470)

10^{7}, 10^{5}, 10^{3} y 10^{2} copias de plásmido CycA.

Las posiciones de nucleótidos de cebadores y muestras indicadas corresponden a las posiciones de los nucleótidos tal como se indican en Haendier y colss. (Embo Journal 6,p.947-950 (1987)).

De acuerdo con el protocolo del fabricante, las muestras llenaban capilares de 1,5 mm (Roche Mol. Biochem.Cat.Nº 1909 339). Posteriormente, los capilares se insertaban en un Roche Diagnostics GMBH LightCycler LC 32 y se sometían a una reacción RCP según el protocolo siguiente de termociclado:

\vskip1.000000\baselineskip

	Temp. (C)	Tiempo (seg)	Velocidad (C/s)	Acq.	Ciclos
Desnaturalización	95	120	20,0	Ninguna	X 1
Desnaturalización	95	0	20,0	Ninguna	X 45
Hibridación	55	10	10,0	Única	X 45
Elongación	72	15	3,0	Ninguna	X 45

\vskip1.000000\baselineskip

Después de cada ciclo, según el protocolo del fabricante, se analizaba la fluorescencia para cada muestra en dos canales distintos, donde el canal 1 correspondía a un bypass de 520+/-20 nm y el canal 2 correspondía a un bypass de 645+/-20 nm. Posteriormente, se calculaba el ratio de los valores obtenidos del canal 2 frente al canal 1, para normalizar las diferencias de volumen debido a errores de pipeteo y excluir la alineación y los errores de
detección.

Los datos en bruto obtenidos en el ejemplo 1 se procesaban en dos vías distintos:

A)

De acuerdo con el método anteriormente descrito, se fijaba un nivel umbral elegido manualmente después de la sustracción apropiada del ruido de fondo de los datos fluorescentes en bruto. Para cada ejemplo, se calculaba la intersección entre la línea umbral y la función de la señal fluorescente frente al tiempo con el siguiente algoritmo: En base a un cálculo de la regresión se utilizaban dos puntos medidos sobre una banda de ruido previamente definida para definir una fase lineal logarítmica por medio de la regresión lineal. Dentro del área lineal logarítmica, se fijaba manualmente una línea umbral, y se calculaban la intersección entre la línea umbral y las líneas de regresión correspondientes a cada número de copias analizado. Para conseguir información sobre la validez del método, los puntos de cruce calculados se usaban para crear un gráfico que indicara el número de ciclos frente al log en base 10 calculado de las concentraciones iniciales del ADN de referencia (ver figs. 1a y 1b). A partir de este gráfico, se determinaba una regresión lineal, que permitía el cálculo de los valores medios, las desviaciones estándar y los coeficientes de variación como indicadores de la exactitud y precisión del método. Las concentraciones y los puntos de cruce se calculaban con el método umbral de fluorescencia.

B)

De acuerdo con la nueva invención, los mismos datos en bruto se suavizaban mediante un ajuste polinomial usando un filtro Savitzky Golay que tenía los parámetros de ventana vertical 6/2/4 sin una sustracción previa del ruido de fondo. A partir de la función obtenida, se calculaba el valor máximo de la segunda derivada y se usaba como indicador de la concentración inicial del patrón. De nuevo, a partir de los datos obtenidos, se creaba un gráfico que indicara el número fraccional de ciclos frente a las concentraciones iniciales de ADN de referencia (ver figs. 2a y 2b). Los valores medios, las desviaciones estándar y los coeficientes de variación se calculaban tal como se ha descrito antes, de manera que las concentraciones y los puntos de cruce se calculaban con el método del máximo de la segunda derivada.

Los valores estadísticos obtenidos por el método A) conforme al esquema anterior o bien por el método B) conforme a la invención daban aproximadamente el mismo grado de exactitud y precisión. Sin embargo, debido a que el método conforme a la nueva invención es independiente de la cantidad real de señal fluorescente generada y el tratamiento de datos no es accionado por el usuario, tiene una ventaja con respecto a los métodos de cuantificación anteriormente revelados.

Ejemplo 2

Amplificación de una secuencia TFN-alfa por la RCP y posterior detección con SYBR Green: Comparación de las concentraciones de cálculo iniciales del máximo de la primera derivada, del máximo de la segunda derivada y del mínimo de la segunda derivada.

El experimento se llevaba a cabo según el ejemplo 1 con las modificaciones siguientes:

Un plásmido que lleva una secuencia genómica TNF-alfa (Shiral y cols., Nature 313 p. 803, 1985) se sometía a diluciones en serie para dar unas concentraciones de muestra de 10^{7}, 10^{5}, 10^{3}, 10^{2} y 10^{1} copias por 2 \mul. Se preparaban replicados de 6 veces para cada concentración de muestra.

En un volumen total de 20 \mul, cada reacción RCP contenía:

1x LCDNA mezcla patrón de muestras de hibridación (Roche Mol.biochem. Catalogue nº 2015099) 3 mM MgCl_{2}

Cebador directo TNF-alfa 1 \muM (Roche Mol.Biochem. Cat.nº 1 989 626)

Cebador inverso TNF-alfa 1 \muM (Roche Mol.Biochem. Cat.nº 1 989 626)

10^{7}, 10^{5}, 10^{3}, 10^{2} y 10^{1} copias de plásmido que contiene TNF-alfa cDNA.

El protocolo de termociclado aplicado era idéntico al del ejemplo 1. Después de cada ciclo de amplificación, se medía la fluorescencia SYBR Green de acuerdo con el protocolo del fabricante en un canal 1 LightCycler, correspondiente a un bypass de 520 +/-20 nm.

De acuerdo con la nueva invención, los datos en bruto se suavizaban mediante distintos ajustes polinomiales usando un filtro Savitzky Golay que tenía los parámetros de ventana vertical 2/3/2, 2/4/2, 3/3/3, 3/4/3, 4/3/2, 4/4/2, 6/3/2, 6/4/2, 6/5/2 y 6/6/2. A partir de la cinética obtenida, se calculaban los máximos de las primeras derivadas, segundas derivadas y los mínimos de las segundas derivadas para los seis replicados de una concentración de analito dada y se usaban como un indicador de la concentración inicial del patrón.

En base a estos datos, los números de los ciclos se representaban gráficamente frente al logaritmo en base 10 de los diferentes números de copias de ADN. Posteriormente se calculaba una línea de regresión. Tal como deducirse de la fig. 3a-3j, los resultados de estos gráficos de calibración demuestran la relación lineal entre el número de ciclos calculado y el logaritmo en base 10 de la concentración de analito, siempre que pueda emplearse principalmente la determinación de los distintos valores extremos usando distintos tipos de parámetros de ventana vertical para determinar las concentraciones iniciales de analito.

Con el fin de determinar las configuraciones preferidas con respecto a la selección de los filtros apropiados de Savitzky-Golay con respecto a las máximas de primer y segundo orden, los datos de las distintas gráficas se comparaban teniendo en cuenta los 3 criterios siguientes:

a)

coeficiente de variación CV(%) determinado para los 6 replicados que representan 100 copias del analito

b)

pendiente de la línea de regresión lineal, como indicador del potencial de separación

c)

potencial de separación para discriminaciones entre 10^{1} y 10^{2} copias de analito, calculadas mediante el test estadístico de Wilcoxon donde se determinan los valores p, para los cuales un número menor a 0,05 se considera como significativo.

Los resultados de este análisis se resumen en la tabla 3.

Derivada	Parámetro de filtro	Pendiente	Potencial de separación	CV% en 100 copias
			10<>100 copias
1ª	2/3/2	-3,29	.0042	1
1ª	2/4/2	-3,33	.0038	1
1ª	3/3/3	-3,29	.0040	0,85
1ª	3/4/3	-3,29	.0041	0,85
1ª	4/3/2	-3,30	.0040	0,76
1ª	4/4/2	-3,29	.0043	0,93
1ª	6/3/2	-3,29	.0041	0,85
1ª	6/4/2	-3,30	.0037	0,81
1ª	6/5/2	-3,29	.0039	0,9

(Continuación)

Derivada	Parámetro de filtro	Pendiente	Potencial de separación	CV% en 100 copias
			10<>100 copias
2ª	2/3/2	-3,42	.0042	1,26
2ª	2/4/2	-3,27	.0036	7,69
2ª	3/3/3	-3,37	.0035	0,67
2ª	3/4/3	-3,43	.0038	1,32
2ª	4/3/2	-3,40	.0037	1,18
2ª	4/4/2	-3,41	.0037	1,78
2ª	6/3/2	-3,39	.0043	0,96
2ª	6/4/2	-3,39	.0044	1,09
2ª	6/5/2	-3,40	.0040	1,09
2ª	6/6/2	-3,32	.0041	1,69

Respecto a los potenciales de separación, los datos demuestran que al usar distintos filtros previamente al cálculo del máximo de la primera derivada, así como previamente al cálculo del máximo de la segunda derivada, existen potenciales similares con respecto al criterio b) y suficientes potenciales de separación para todos los filtros analizados con respecto al criterio c).

Ejemplo 3

Las curvas de crecimiento logístico se pueden usar para el crecimiento modelo de la población (fig. 5). Dichas curvas tienen una fase inicial de demora, una fase de crecimiento exponencial y una fase plató. El crecimiento bacteriano sigue este tipo de curva. El efecto de un compuesto estimulante o inhibidor en la velocidad de crecimiento se puede determinar siguiendo el número relativo de organismos con el tiempo. Si la curva cambia a la izquierda, el compuesto es un inhibidor, si varía a la derecha, el compuesto estimula el crecimiento. La potencia de inhibición o estimulación está relacionada con la lejanía de la variación de la curva.

Por ejemplo, un medio de crecimiento (caldo LB) en una cubeta de espectrofotómetro es inoculado con una bacteria (E. coli) agitada y que se mantiene a 37ºC. Cada 5 minutos, el crecimiento bacteriano es controlado por el dispersor luminoso a través de la cubeta a 500 nm. A medida que aumenta el número de bacterias, la absorbancia aumenta, dando una media relativa del número de bacterias. El máximo de la segunda derivada se calcula para obtener un número fraccional de ciclos de la muestra de control (T).

En las reacciones en paralelo, las sustancias A,B y V se añaden a las distintas cubetas con un medio y se inoculan como antes. Su crecimiento es controlado con el tiempo como antes. Se obtienen curvas como las de la fig. 6. Tal como se indica en los datos demostrativos de la figura 6, la sustancia A es un inhibidor más potente que la sustancia B, mientras que la sustancia C es un estimulador. La potencia de inhibición puede cuantificarse por la magnitud y dirección del cambio en el número fraccional de ciclos:

C_{T}-C_{B} = magnitud de inhibición de la sustancia B

C_{T}-C_{A} = magnitud de inhibición de la sustancia A

C_{T}-C_{C} = magnitud de inhibición de la sustancia C

Además de medir la turbidez de los medios (tal como se mide a 500 nm) para evaluar el crecimiento, debería quedar claro que se pueden usar otros monitores de crecimiento, incluyendo cambios de pH de los medios o consumo de un nutriente. El único requisito es que se obtenga una medida relativa del tamaño de la población para calcular las derivadas.

Claims (10)

1. Un método para la cuantificación de un analito, que comprenda

a)

contactar dicho analito con un agente amplificador;

b)

amplificar al menos un lugar predeterminado del analito,

c)

determinar la cantidad de producto de amplificación en función del tiempo de reacción, de manera que durante una fase de la reacción de amplificación la cantidad de producto de amplificación aumenta progresivamente y donde después de dicha fase progresiva, la velocidad de amplificación disminuye.

d)

Calcular la derivada de primer, segundo o tercer orden de dicha función, donde n es un número natural

e)

Determinar el valor máximo, cero o mínimo de dicha derivada, y

f)

Calcular a partir de dicho máximo, del valor cero o del valor mínimo la concentración inicial del analito.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha derivada se calcula mediante un ajuste matemático.

3. El método de la reivindicación 1, donde el producto de amplificación se detecta por medio de la fluorescencia.

4. El método de la reivindicación 2, donde el producto de amplificación se detecta por medio de la fluorescencia.

5. El método de la reivindicación 1, donde el analito es un ácido nucleico.

6. El método de la reivindicación 4, donde el analito es un ácido nucleico.

7. El método de la reivindicación 6, donde la amplificación se obtiene por una reacción en cadena de la polimerasa.

8. El método de la reivindicación 2, donde la amplificación se obtiene por una reacción en cadena de la polimerasa y el producto de amplificación se detecta por una entidad de enlace del ADN de doble ramificación.

9. El método de la reivindicación 7, donde el producto de amplificación se detecta por medio de al menos una muestra de polinucleótido, la secuencia de la cual es idéntica o complementaria a la secuencia del analito en una gama de al menos 10 residuos contiguos y donde dicha muestra de polinucleótido se selecciona de un grupo formado por un par FRET, una muestra Taqman y un oligonucleótido guía molecular.

10. El método de la reivindicación 9, donde 2 muestras de polinucleótido se marcan cada una de ellas con una entidad fluorescente, de manera que cuando ambas muestras se hibridan al producto de amplificación, se produce la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia entre las dos entidades fluorescentes.