JP2010511390A - 予め規定されたマスター検量線の調整を使用する定量方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2006年11月30日に出願された、米国仮出願第60/868,004号の利益を主張する。この先行出願の全体の開示は、参考として本明細書に援用される。
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳しくは、本発明は、核酸増幅を用いる分析物ポリヌクレオチドの定量化に関し、さらにより詳しくは、リアルタイム核酸増幅反応の結果を解析するためのファクトリー供給型検量線および調整検量物質の使用に関する。
インビトロ核酸増幅の動態解析を含む方法は、分析物ポリヌクレオチドを定量するための重要なツールとなっている。「リアルタイム」増幅手順と称されることもあるこのような手順では、核酸増幅反応混合物中に存在するアンプリコンの量を増幅手順の過程にわたって時間の関数としてモニタリングする。完全に自動化されたリアルタイム核酸アッセイには、その反応中に得られた時間依存性データを解析することが可能な、機械で実行可能なアルゴリズムが必要となる。この点に関して、観察される増幅結果をもたらし得る核酸の量または濃度を正確に出力するデータ処理アルゴリズムが必要である。
本発明の第1の態様は、調整後の検量線についての方程式を確立する方法に関する。該方法によれば、まず、各々が一定の出発量の内部検量物質および既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を得る工程がある。次に、複数の標準試料の各々における内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程がある。次に、複数の標準試料の各々において同時に増幅された内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程がある。その結果、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、内部検量物質の決定された一群の増幅兆候、および既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、分析物ポリヌクレオチド標準について決定された一群の増幅兆候が得られる。次に、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として内部検量物質について決定された一群の増幅兆候に第1の曲線を適合するため、第1の方程式を最適化し、それにより適合した第1の方程式を得る工程がある。さらに、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として分析物ポリヌクレオチド標準について決定された一群の増幅兆候に第2の曲線を適合するため、第2の方程式を最適化し、それにより適合した第2の方程式を得る工程がある。次に、所定量の分析物ポリヌクレオチド標準および一定の出発量の内部検量物質を含む調整検量物質を得る工程がある。次に、調整検量物質の内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程がある。この後、調整検量物質について、同時に増幅された内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程が続く。次に、調整検量物質の内部検量物質について決定された増幅兆候を用いて適合した第1の方程式を修正し、これにより、内部検量物質について適合された増幅兆候に対する調整後の第1の適合した方程式を、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として得る工程がある。また、調整検量物質の分析物ポリヌクレオチドで決定された増幅兆候を用いて適合した第2の方程式を修正し、これにより、分析物ポリヌクレオチド標準について適合された増幅兆候に対する調整後の第2の適合した方程式を、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として得る工程がある。最後に、調整後の第1の適合した方程式および調整後の第2の適合した方程式を互いに数学的に関係付けることにより、調整後の検量線についての方程式を確立する工程がある。本発明との関連において、「数学的に関係付ける」とは、加算、減算、乗算または除算などの演算を行なうことを意味する。比の計算をもたらす除算プロセスが非常に好ましい。一般的に好ましい一実施形態において、同時に増幅する工程は等温での同時増幅を含む。これには、RNAポリメラーゼを含む転写関連増幅反応で等温での同時増幅が含まれ得る。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程は、各々、異なる機器で行なわれる。別の一般的に好ましい実施形態では、最初の同時に増幅する工程は、第1の機器で行なわれる核酸増幅反応での同時増幅を含み、2番目の同時に増幅する工程は、第2の機器で行なわれる核酸増幅反応での同時増幅を含む。この場合のとき、最適化する工程の適合した第1および第2の方程式は、第2の機器に接続したコンピュータのメモリデバイスに保存してもよい。より好ましくは、該確立する工程は、第2の機器での使用のため、調整後の検量線についての方程式を確立する工程を含む。また別の一般的に好ましい実施形態では、最初の同時に増幅する工程が、第1の機器で行なわれる等温核酸増幅反応での同時増幅を含み、2番目の同時に増幅する工程は、第2の機器で行なわれる等温核酸増幅反応での同時増幅を含み、最適化する工程の適合した第1および第2の方程式を、第2の機器に接続したコンピュータのメモリデバイスに保存する。この一般的に好ましい実施形態の変形型の一例では、最適化する工程の適合した第1および第2の方程式は、各々、複数の係数を含み、調整検量物質を得る工程は、さらに、適合した第1および第2の方程式それぞれに対する複数の係数を得ることを含む。この一般的に好ましい実施形態の別の変形型では、最適化する工程の第1および第2の方程式が非線形方程式であり、各々が複数の係数を有する。非常に好ましい一実施形態において、該確立する工程において互いに数学的に関係付けるプロセスは、調整後の適合した第2の方程式を用いて計算された数値結果と、調整後の適合した第1の方程式を用いて計算された数値結果とを数学的に関係付けることを含む。これは除算プロセスを伴うものでもよく、それにより比を計算する。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の等温核酸増幅反応は、各々、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の等温核酸増幅反応は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準または内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の等温核酸増幅反応は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンが異なるパーセンテージのG+C塩基を有する。別の一般的に好ましい実施形態では、最初の最適化工程の適合した第1の方程式は、適合した第1の方程式の複数の係数を含み、2番目の最適化工程の適合した第2の方程式は、適合した第2の方程式の複数の係数を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、最後の確立する工程において互いに数学的に関係付けるプロセスが、調整後の適合した第2の方程式を用いて計算された数値結果および調整後の適合した第1の方程式を用いて計算された数値結果を数学的に関係付けることを含む。これは除算プロセスを伴うものであり得、それにより比を計算することができる。別の一般的に好ましい実施形態では、最後の確立する工程において互いに数学的に関係付けるプロセスが、調整後の適合した第2の方程式を用いて計算された数値結果および調整後の適合した第1の方程式を用いて計算された数値結果を数学的に関係付けることを含む。これは減算プロセスを伴うものであり得、それにより差を計算することができる。別の一般的に好ましい実施形態では、最初の修正工程が、調整検量物質の内部検量物質について決定された増幅兆候、および調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の所定量に等しい分析物ポリヌクレオチドの出発量での適合した第1の方程式を解くことにより計算された値を用いて、内部検量物質に対する調整因子を決定することを含む。この後に、該内部検量物質に対する調整因子を、適合した第1の方程式の係数の1つに加算する工程を続けてもよい。同様に、2番目の修正工程は、調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準について決定された増幅兆候、および調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の所定量に等しい分析物ポリヌクレオチドの出発量での適合した第2の方程式を解くことにより計算された値を用いて、分析物ポリヌクレオチドに対する調整因子を決定することを含むものであり得る。この後に、分析物ポリヌクレオチドに対する調整因子を、適合した第2の方程式の係数の1つに加算する工程を続けてもよい。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程は、各々、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む核酸増幅反応での同時増幅を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程は、各々、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準または内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない核酸増幅反応での同時増幅を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程は、各々、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない核酸増幅反応での同時増幅を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、さらにいくつかの工程がある。より具体的には、さらに、第2の所定量の分析物ポリヌクレオチド標準および一定量の内部検量物質を含む第2の調整検量物質を得る工程があり得る。この後に、内部検量物質および第2の調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程を続けてもよい。次に、第2の調整検量物質について、同時に増幅された内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程がある。この後、第2の調整検量物質の内部検量物質および第2の調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候をそれぞれ用いて、適合した第1および第2の方程式を修正する工程が続く。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンが異なるパーセンテージのG+C塩基を有する。別の一般的に好ましい実施形態では、最適化する工程の第1および第2の方程式が非線形方程式であり、各々が複数の係数を有する。また別の一般的に好ましい実施形態では、最適化する工程の適合した第1および第2の方程式が、各々、複数の係数を有し、調整検量物質を得る工程が、さらに、適合した第1および第2の方程式に対する複数の係数のそれぞれを得ることを含む。
以下の用語は、本明細書においてそうでないと明白に述べていない限り、本開示の目的のため、以下の意味を有する。
序論および概説
本明細書では、リアルタイム核酸増幅手法を用いて、分析物ポリヌクレオチドの定量化を単純化するための方法を開示する。より詳しくは、本発明は、1つ以上の機器において得られたリアルタイム増幅結果を用いてマスター検量線を作成し、次いで該マスター検量線を用いて、異なる機器において得られたリアルタイム増幅結果を評価することにより分析物ポリヌクレオチドを定量する方法に関する。これは、好ましくは、1つ以上のマスター検量線を調整することにより行なわれる。該手順により、異なるアッセイを行なうたびに完全な検量線を作成する広範な一連の核酸増幅反応を行なう必要性が少なくなる。これにより、試験試料の処理量が効果的に増加し、アッセイの製造が単純化され、材料コストが削減される。
マスター検量線の作成は、各々が一定量の核酸検量物質(すなわち、内部検量物質)と、異なる既知量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を形成する工程から始める。例えば、該複数の標準試料の各々は、30,000コピーの内部検量物質ポリヌクレオチドを含むものであり得る。また、異なる試料が、既知量の分析物ポリヌクレオチド標準を含むものであってもよく、例えば、該標準の量は、試料の1つと次のものとで10倍異なる。
含む。この係数は、本明細書において「ベースライン調整係数」または適合された係数と称し、これは、保存マスター曲線を、増幅兆候を特定する軸においてのみ調整し、y軸上の曲線(すなわち、従属変数に相当)の位置に影響を及ぼすが、これ以外に曲線の形状には影響を及ぼさない。他の方程式が該曲線適合手順に使用され得るが、後述する方法では、以下の式:
リアルタイム核酸増幅反応を実施およびモニタリングするための2つの機器が、全く同じ増幅効率調節能力を有することはないため、ならびに2つの蛍光光度計が、同じレベルの光子入力に対して全く同じシグナル出力をもたらすことはないため、各ユーザーのシステムの出力は、ソフトウェアによって、マスター検量線を得るために使用されたシステムの較正濃度出力と同じ較正濃度出力が得られるように調整されなければならない。この調整は、エンドユーザーが、既知量の分析物ポリヌクレオチド標準と、マスター検量線を作成するために使用された反応の場合と同じ一定量の内部検量物質とを含む調整検量物質を用いて1回、またはより好ましくは2回の増幅反応を行ない、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方の増幅兆候を決定し、次いで、これらの結果に基づいて保存マスター検量線を調整することによってなされ得る。ユーザーが行なった反応によるデータ点(1つまたは複数)の結果を、保存マスター検量線を示すグラフ上にプロットすると、ユーザーによって決定された時間依存性増幅兆候と、保存マスター検量線を特定する方程式を用いた計算から予想される時間依存性増幅兆候との間に、ある低度の量の差がみられることが予測される。
二点調整を用いて保存マスター曲線を調整するための手順は、上記の一点調整方法に非常に類似している。まず、異なる調整検量物質を用いて2つの核酸増幅反応を行なう。各反応は、異なる既知量の分析物ポリヌクレオチドまたはその断片(すなわち、分析物ポリヌクレオチド標準)を、保存マスター検量線を作成するために使用されたものと同じ一定量の核酸検量物質とともに含む。検量反応に使用される調整検量物質を、「第1」および「第2」調整検量物質、あるいは、それぞれ「Cal_1」および「Cal_2」と称する。
上記の手順によって得られるマスター検量線を特定する方程式を、マスター検量線を作成するために使用されたもの(1つまたは複数)とは異なるプロセッサまたは機械にプログラムまたは保存することができる。未知の量の分析物ポリヌクレオチドおよび同じ量の内部検量物質ポリヌクレオチドを含む試験試料を用いて増幅反応を行ない、増幅の特定の特色を決定し、次いで、決定された特色を用いて保存マスター検量線についての方程式を解くことにより、試験試料中に存在する分析物ポリヌクレオチドの量に対する数値出力が得られ得る。これは、以下の手順工程を用いて行なわれ得る。
先のセクションでは、分析物ポリヌクレオチドおよび同時に増幅された核酸検量物質の増幅兆候に対するマスター曲線の独立した調整後、別々に調整された曲線の結果を用いる数学演算を伴う手順において、別々に調整された曲線を使用することを記載した。この手順を「独立した調整」方法と称する。上記の特定の例では、別々に調整されたマスター曲線の結果を用いて、IOA(分析物)/IOA(IC)比を計算した。
増幅兆候の結果の予備演算処理に基づいたマスター検量線を調整するための手順は、検量線の独立した調整に使用される手順に実質的に類似している。より詳しくは、1種類または2種類の調整検量物質を用いて増幅反応を行ない、分析物ポリヌクレオチドと核酸検量物質の増幅兆候を測定する。次いで、この2種類の標的について得られた増幅兆候を、演算処理後の兆候のマスター検量線を作成するために使用されたものと同じ数学演算によって互いに関係付ける。例えば、演算処理後の兆候の検量線を、反応に使用された既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチドと核酸検量物質の増幅兆候の比を用いて作成した場合、検量標準について測定された増幅兆候は、比として同様に互いに関係付けされ得る。あるいは、演算処理後の兆候の検量線を、反応に使用された既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチドと核酸検量物質の増幅兆候の差を用いて作成した場合、調整検量物質について測定された増幅兆候は、減算によって同様に互いに関係付けされ得る。マスター検量線の一点調整を行なう場合、必要なのは、演算処理後の兆候に対応する次元において検量標準データ点が重ね合う(すなわち、分析物ポリヌクレオチドおよび核酸検量物質の増幅兆候の比を表す)ように曲線を調整することだけであり、反応に使用された既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準に対応する次元における調整は行なわない。これは、演算処理後の兆候に対応する次元における検量標準データ点と保存マスター曲線の差を計算し、次いで、この差の平均を用いて上記の手順に従って曲線を調整することにより行なわれ得る。同様に、演算処理後の兆候の保存マスター検量線の二点調整は、演算処理後の増幅兆候に対応する次元における適合された曲線と検量標準データ点の差の平均を計算し、次いで、この差の平均を用いて本質的に上記の手順に従って曲線を調整することにより行なわれ得る。
本発明との関連において有用な増幅方法の例としては、限定されないが、転写媒介型増幅(TMA)、単一プライマー核酸増幅、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、自己持続性配列複製(3SR)、DNAリガーゼ連鎖反応(LCR)ならびに自己複製ポリヌクレオチド分子および複製酵素(MDV−1 RNAおよびQ−β酵素など)を使用する増幅方法が挙げられる。これらの種々の増幅手法を行なうための方法は、それぞれ、米国特許第5,399,491号、米国特許出願第11/213,519号、欧州特許出願公開公報EP 0 525 882、米国特許第4,965,188号、米国特許第5,455,166号、Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:1874−1878 (1990)、国際特許出願番号WO 89/09835、米国特許第5,472,840号およびLizardiら、Trends Biotechnol. 9:53−58 (1991)をみるとよい。どのようにして核酸増幅反応を行なうかが記載されたこれらの文献の開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
さまざまな増幅兆候が、開示した方法との関連において使用され得る。例えば、当業者に熟知された 数学的計算手法およびコンピュータ計算手法を用いて、リアルタイム実施曲線の一次導関数の極大の出現時間、または二次導関数の極大の出現時間が特定され得る。増殖曲線のこのような特色を規定するためのアプローチは、Wittwerらによって、米国特許第6,503,720号(その開示は、引用により本明細書に組み込まれる)に詳述されている。他の有用なアプローチは、増殖曲線の導関数の計算、増殖曲線の特徴の特定、次いで、該導関数の特徴に対応する閾値時間またはサイクル数の決定を含むものである。かかる手法は、米国特許第6,783,934号(その開示は、引用により本明細書に組み込まれる)に開示されている。さらに他の有用な増幅兆候としては、「TTime」および「TArc」が挙げられる。注目すべきことに、TArc値を決定するための種々のアプローチで、方向性が類似したベクター (すなわち、単純に「Tarc」で特定される値が得られる)と、方向性が反対のベクター(すなわち、「OTArc」で特定される値が得られる)が使用される。このような方法の一般的記載は、以下に後述する。
簡単に記載すると、TTime値により、リアルタイム増幅反応においてアンプリコン生成の表示が特定の閾値を超えた時間が推測される。TTime値を計算および使用するためのアルゴリズムは、出願番号60/659,874で特定される米国特許出願(その開示は、引用により本明細書に組み込まれる)に記載されている。このアルゴリズムによれば、標準化およびバックグラウンド調整されたデータに対して、曲線適合手順が適用される。任意のよく知られた曲線適合方法論が使用され得るが、好ましい実施形態では、線形最小二乗(「LLS」)曲線適合が使用される。この曲線適合は、所定の下限と上限の間の一部のデータのみに対して行なわれる。データを適合させた曲線を得た後の最終目的は、曲線またはその突出部が予め規定した閾値と交差する点に対応する時間を推測することである。一実施形態において、標準化されたデータの閾値は0.11である。上限と下限は、曲線をさまざまな制御データセットに適合させる範囲が、与えられた閾値に関連する時間において最も少ないばらつきを示すように、実験的に決定される。一実施形態において、下限は0.04であり、上限は0.36である。曲線は、最初に下限より下になったデータ点から最初に上限を超えたデータ点に及ぶデータに対して適合させる。次に、該適合の傾きが統計学的に有意であるか否かの判定が行なわれる。例えば、一次係数のp値が0.05未満である場合、該適合は有意であるとみなして演算処理を継続するが、そうでない場合は演算処理を終了する。あるいは、データの妥当性が、R2値によって判定され得る。適合された曲線について、直線y=mx+bの傾きmと切片bが決定される。この情報を用いて、Ttimeは、以下のようにして決定され得る。
「TArc」および「OTArc」と称する時間依存性増幅兆候は、リアルタイム実施曲線のベクターに基づく解析を用いて決定される。TArc値により、増殖曲線が曲線となり始める、または上方に「曲がり」始める時点が特定される。この測定点は、標準曲線を作成するため、または試験試料中の分析物ポリヌクレオチドの量または濃度に関する増幅反応のパラメータを確立するために使用され得る。ベクター解析は、実質的に均一な時間間隔にわたって分布したデータ点を有する増殖曲線を用いて最も簡便に行なわれる。TArc値およびOTArc値の決定および使用に関する詳細の提示は、出願番号が60/693,455である米国特許出願(この出願の明細書および図面は、引用により本明細書に組み込まれる)に見られる。
注目すべきことに、4−パラメータロジスティック(4PL)方程式を、特に本発明の例示において使用したが、他の数学関数もまた、該手順に使用され得る。実際、ベースライン調整係数を有する実質的に任意の方程式が、リアルタイム増幅結果のモデル作成を行なうための曲線適合手順において使用され得る。上記のように、ベースライン調整係数は、標準的なプロットにおいて、曲線の形状を変更することなく曲線全体を垂直次元においてのみ調整する目的に供される。
検量アルゴリズムの実行のための装置
本明細書に開示した方法は、コンピュータまたは類似した演算処理デバイス(本明細書において以下、「コンピュータ」)を用いて簡便に実行される。種々の好ましい実施形態において、アルゴリズムを実行するためのソフトウェアまたは機械で実行可能な使用説明書が、独立型のコンピュータのメモリ要素、または解析中の生成物の量を(好ましくは時間の関数として)モニタリングするために使用されるデバイスに連結されたコンピュータのメモリ要素に、ロードあるいは保持され得る。非常に好ましい実施形態において、検量アルゴリズムを実行するためのソフトウェアは、反応混合物中に存在するアンプリコンの量が時間の関数としてモニタリングされ得るデバイスに接続された、または該デバイスの一体化された一部であるコンピュータのメモリ要素に保持される。
以下に、上記の方法によってマスター検量線を調整するための2種類の異なるアプローチの比較を例示する。各場合において、マスター検量線は、第1の組の増幅/検出機器で得られた結果を用いて作成した(すなわち、アッセイ製造業者によるマスター曲線の作成をシミュレーション)。次いで、作成されたマスター曲線(1つまたは複数)を、異なる増幅/検出機器で得られた結果の解析に使用した(すなわち、エンドユーザーまたはカスタマーによって操作された機器でシミュレーション)。
保存マスター検量線曲線の作成および使用
まず、米国特許出願公開公報番号2006/0046265A1に開示された一般的な方法に従って行なわれる標準的な単一プライマー等温核酸増幅反応のための一群の標準試料を調製した。試料は、102〜108コピー/試料にわたる範囲の出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を含むものとした。さらに、各試料には、分析物ポリヌクレオチド標準と関連のない一定の出発量の30,000コピーの内部検量物質核酸を含む。この場合、内部検量物質は、分析物ポリヌクレオチド標準内の増幅対象の配列の長さとは異なるある長さのHIV−1核酸(すなわち、分析物ポリヌクレオチド標準と異なるウイルス標的)内に提示される複数の塩基のスクランブル型配列からなる人工標的配列とした。したがって、増幅反応で合成された内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準のアンプリコンは、長さとG+C含有率(%)の両方が異なった。さらに、分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質は、異なるオリゴヌクレオチドを用いた核酸増幅反応において同時に増幅した(すなわち、2種類の標的は、共用プライマーを用いて増幅されたものではなかった)。
Claims (83)
- 調整後の検量線についての方程式を確立する方法であって、該方法は、
(a)各々が一定の出発量の内部検量物質および既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を得る工程;
(b)該複数の標準試料の各々における該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程;
(c)該複数の標準試料の各々に対して、同時に増幅された該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準の増幅の兆候を決定し、それにより
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該内部検量物質の決定した一群の増幅兆候、および
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該分析物ポリヌクレオチド標準の決定した一群の増幅兆候
が得られる工程;
(d)該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該内部検量物質の決定した一群の増幅兆候に第1の曲線を適合させるため、第1の方程式を最適化し、それにより適合した第1の方程式を得る工程;
(e)該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該分析物ポリヌクレオチド標準の決定した一群の増幅兆候に第2の曲線に適合させるため、第2の方程式を最適化し、それにより適合した第2の方程式を得る工程;
(f)所定量の該分析物ポリヌクレオチド標準および該一定の出発量の内部検量物質を含む調整検量物質を得る工程;
(g)該調整検量物質の内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程;
(h)該調整検量物質に関して、同時に増幅された該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程;
(i)該調整検量物質の内部検量物質について決定された増幅兆候を用いて、該適合した第1の方程式を修正し、これにより、該内部検量物質の適合された増幅兆候に対する調整後の適合した第1の方程式が、該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として得られる工程;
(j)該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチドに対して決定された増幅兆候を用いて、該適合した第2の方程式を修正し、これにより、該分析物ポリヌクレオチド標準の適合された増幅兆候に対する調整後の適合した第2の方程式が、該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として得られる工程;ならびに
(k)該調整後の適合した第1の方程式および該調整後の適合した第2の方程式を互いに数学的に関係付けることにより、調整後の検量線についての方程式を確立する工程
を含む、方法。 - 同時に増幅する工程(b)および(g)が等温での同時増幅を含む、請求項1に記載の方法。
- 等温での同時増幅が、RNAポリメラーゼを含む転写関連増幅反応における等温での同時増幅を含む、請求項2に記載の方法。
- 同時に増幅する工程(b)および(g)が異なる機器で行なわれる、請求項1に記載の方法。
- 同時に増幅する工程(b)が、第1の機器で行なわれる核酸増幅反応での同時増幅を含む、
同時に増幅する工程(g)が、第2の機器で行なわれる核酸増幅反応での同時増幅を含む、ならびに
最適化する工程(d)および(e)の適合した第1および第2の方程式を該第2の機器に接続したコンピュータのメモリデバイスに保存する、
請求項1に記載の方法。 - 確立する工程(k)が、前記第2の機器での使用のため、前記調整後の検量線についての方程式を確立することを含む、請求項5に記載の方法。
- 同時に増幅する工程(b)が、第1の機器で行なわれる等温核酸増幅反応においての同時増幅を含む、
同時に増幅する工程(g)が、第2の機器で行なわれる等温核酸増幅反応での同時増幅を含む
;ならびに
最適化する工程(d)および(e)の適合した第1および第2の方程式を、該第2の機器に接続したコンピュータのメモリデバイスに保存する、
請求項1に記載の方法。 - 工程(d)および(e)の適合した第1および第2の方程式が、各々、複数の係数を含み、得る工程(f)が、さらに、該適合した第1および第2の方程式それぞれに対する該複数の係数を得ることを含む、請求項7に記載の方法。
- 最適化する工程(d)および(e)の第1および第2の方程式が非線形方程式であり、各々が複数の係数を含む、請求項7に記載の方法。
- 確立する工程(k)で互いに数学的に関係付けるプロセスが、前記調整後の適合した第2の方程式を用いて計算された数値結果および前記調整後の適合した第1の方程式を用いて計算された数値結果を比として数学的に関係付けることを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程(b)および(g)の等温核酸増幅反応が、各々、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む、請求項9に記載の方法。
- 同時に増幅する工程(b)および(g)の等温核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない、請求項9に記載の方法。
- 同時に増幅する工程(b)および(g)の等温核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項9に記載の方法。
- 同時に増幅する工程(b)および(g)により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび該内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項9に記載の方法。
- 同時に増幅する工程(b)および(g)により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび該内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのG+C塩基を含む、請求項9に記載の方法。
- 最適化する工程(d)の適合した第1の方程式が、適合した第1の方程式の複数の係数を含み、最適化する工程(e)の適合した第2の方程式が、適合した第2の方程式の複数の係数を含む、請求項1に記載の方法。
- 確立する工程(k)で互いを数学的に関係付けるプロセスが、前記調整後の適合した第2の方程式を用いて計算された数値結果および前記調整後の適合した第1の方程式を用いて計算された数値結果を比として数学的に関係付けることを含む、請求項1に記載の方法。
- 確立する工程(k)で互いを数学的に関係付けるプロセスが、該調整後の適合した第2の方程式を用いて計算された数値結果および該調整後の適合した第1の方程式を用いて計算された数値結果を差として数学的に関係付けることを含む、請求項1に記載の方法。
- 修正する工程(i)が、
前記調整検量物質の内部検量物質に対して決定した増幅兆候、および
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の所定量に等しい該分析物ポリヌクレオチドの出発量で前記適合した第1の方程式を解くことにより計算された値
を用いて、該内部検量物質に対する調整因子を決定すること;および
該内部検量物質に対する調整因子を、該適合した第1の方程式の係数の1つに加算すること
を含み;ならびに
修正する工程(j)が、
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準について決定した増幅兆候、および
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の所定量に等しい該分析物ポリヌクレオチドの出発量で適合した前記第2の方程式を解くことにより計算された値
を用いて、分析物ポリヌクレオチドに対する調整因子を決定すること;および
該分析物ポリヌクレオチドに対する調整因子を、該適合した第2の方程式の係数の1つに加算すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 同時に増幅する工程(b)および(g)が、各々、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む核酸増幅反応での同時増幅を含む、請求項1に記載の方法。
- 同時に増幅する工程(b)および(g)が、各々、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含むが該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない核酸増幅反応での同時増幅を含む、請求項1に記載の方法。
- 同時に増幅する工程(b)および(g)が、各々、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない核酸増幅反応中での同時増幅を含む、請求項1に記載の方法。
- さらに、
第2の所定量の前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記一定量の内部検量物質を含む第2の調整検量物質を得る工程;
該第2の調整検量物質の内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程;
該第2の調整検量物質について、同時に増幅された該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程;ならびに
該第2の調整検量物質の内部検量物質および該第2の調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候をそれぞれ用いて、前記適合した第1および第2の方程式を修正する工程
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記同時に増幅する工程(b)および(g)により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび該内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項1に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程(b)および(g)により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび該内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのG+C塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 最適化する工程(d)および(e)の第1および第2の方程式が非線形方程式であり、各々が複数の係数を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)および(e)の適合した第1および第2の方程式が、各々、複数の係数を含み、得る工程(f)が、さらに、該適合した第1および第2の方程式に対するそれぞれの複数の係数を得ることを含む、請求項1に記載の方法。
- 保存マスター検量線を調整するための検量物質を備えるキットを作製するための方法であって、該方法は、
各々が一定出発量の内部検量物質および既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を形成する工程;
該複数の標準試料の各々における核酸増幅反応において、該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程;
各核酸増幅反応において同時に増幅された該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定し、これにより、
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該内部検量物質について決定した一群の増幅兆候、および
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該分析物ポリヌクレオチド標準について決定した一群の増幅兆候
が得られる、工程;
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該内部検量物質について決定した該一群の増幅兆候に第1の曲線を適合させるため、第1の方程式を最適化し、それにより、適合した第1の方程式の一組の係数を含む適合した第1の方程式を得る工程;
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該分析物ポリヌクレオチド標準について決定した該一群の増幅兆候に第2の曲線を適合させるため、第2の方程式を最適化し、それにより、適合した第2の方程式の一組の係数を含む適合した第2の方程式を得る工程;ならびに
(a)明確な形態の適合した第1の方程式の該一組の係数、
(b)明確な形態の適合した第2の方程式の該一組の係数、および
(c)所定量の該分析物ポリヌクレオチド標準と、
該一定の出発量の内部検量物質と
を含む調整検量物質
を含むパッケージ化された組合せを作製する工程
を含む、方法。 - 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が等温核酸増幅反応である、請求項28に記載の方法。
- 前記等温核酸増幅反応が、RNAポリメラーゼを含む転写関連増幅反応である、請求項29に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない、請求項28に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項28に記載の方法。
- 前記増幅兆候を決定する工程が時間依存性増幅兆候の決定を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記最適化する工程の第1および第2の方程式が第1および第2の非線形方程式である、請求項28に記載の方法。
- 前記明確な形態の適合した第1および第2の方程式の係数の組が、機械可読形態の適合した該第1および第2の方程式の係数の組を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記機械可読形態の適合した第1および第2の方程式の係数の組がバーコードを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、該内部検量物質アンプリコンおよび該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なる長さである、請求項28に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、該内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なるパーセンテージのG+C塩基を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記作製する工程のパッケージ化された組合せが、さらに、
第2の所定出発量の前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記一定出発量の内部検量物質を含む第2の調整検量物質を含む、請求項28に記載の方法。 - 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が等温核酸増幅反応であり、最適化する工程の第1および第2の方程式が第1および第2の非線形方程式である、請求項28に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない、請求項41に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応は、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項41に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、該内部検量物質アンプリコンおよび該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なるパーセンテージのG+C塩基を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、該内部検量物質アンプリコンおよび該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なる長さである、請求項41に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む、請求項46に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない、請求項46に記載の方法。
- 前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応は、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項46に記載の方法。
- 一定量の内部検量物質を含む多重核酸増幅反応において分析物ポリヌクレオチドを定量するための方程式の作成方法であって、該方法は、
核酸増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を特定する保存マスター曲線の第1の方程式の複数の係数を得る工程;
核酸増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質の増幅兆候を特定する保存マスター曲線の第2の方程式の複数の係数を得る工程;
既知量の分析物ポリヌクレオチド標準および一定の出発量の内部検量物質を含む調整検量物質を用いて核酸増幅反応を実施する工程であって、ここで、該核酸増幅反応により、該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質が同時に増幅され、該核酸増幅反応により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンが生成される、工程;
該核酸増幅反応で同時に増幅された分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の増幅兆候を決定する工程;
該核酸増幅反応により決定された分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候、および
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の該既知量に等しい分析物ポリヌクレオチド標準の該出発量での該保存マスター曲線の第1の方程式を解くことにより計算された値
を用いて分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整因子を確立する工程;
該核酸増幅反応により決定された内部検量物質の増幅兆候、および
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の該既知量に等しい分析物ポリヌクレオチド標準の該出発量での保存マスター曲線の第2の方程式を解くことにより計算された値
を用いて内部検量物質に対する調整因子を確立する工程;
分析物ポリヌクレオチド標準に対する該調整因子を用いて、該保存マスター曲線の第1の方程式の係数の1つを修正し、これにより、分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整後の検量線を特定する方程式を得る工程;
内部検量物質に対する該調整因子を用いて、該保存マスター曲線の第2の方程式の係数の1つを修正し、これにより、内部検量物質に対する調整後の検量線を特定する方程式を得る工程;ならびに
(a)分析物ポリヌクレオチド標準に対する該調整後の検量線を特定する方程式、および
(b)内部検量物質に対する該調整後の検量線を特定する方程式
を互いに数学的に関係付けることにより、分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程
を含む、方法。 - 前記核酸増幅反応を実施する工程が等温核酸増幅反応の実施を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記等温核酸増幅反応が、RNAポリメラーゼを含む転写関連増幅反応である、請求項51に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項50に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのG+C塩基を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記実施する工程が、第1の核酸増幅機器での前記核酸増幅反応の実施を含み、ならびに
前記得る工程の保存マスター曲線の第1の方程式の前記複数の係数および保存マスター曲線の第2の方程式の前記複数の係数は、該第1の核酸増幅機器を用いて決定されない、請求項50に記載の方法。 - 前記増幅兆候を決定する工程が時間依存性増幅兆候の決定を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記保存マスター曲線の第1および第2の方程式が非線形方程式である、請求項50に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも1種類のプライマーを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項50に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項50に記載の方法。
- 前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、比を求めるための除算による数学的関係付けを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、差を求めるための減算による数学的関係付けを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応を実施する工程が等温核酸増幅反応の実施を含み、前記保存マスター曲線の第1および第2の方程式が非線形方程式である、請求項61に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも1種類のプライマーを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項63に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項63に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのG+C塩基を含む、請求項63に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項63に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも1種類のプライマーを含む、請求項68に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項68に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項68に記載の方法。
- 前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、
分析物ポリヌクレオチド標準に対する前記調整後の検量線を特定する方程式を用いて計算された数値、および
内部検量物質に対する前記調整後の検量線を特定する方程式を用いて計算された数値
を数学的に関係付けることを含む、請求項50に記載の方法。 - 前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、比を計算するための除算による数学的関係付けを含む、請求項72に記載の方法。
- 前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、差を計算するための減算による数学的関係付けを含む、請求項72に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応を実施する工程が等温核酸増幅反応の実施を含み、前記保存マスター曲線の第1および第2の方程式が非線形方程式である、請求項50に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも1種類のプライマーを含む、請求項75に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項75に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項75に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのG+C塩基を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項75に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも1種類のプライマーを含む、請求項80に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項80に記載の方法。
- 前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項80に記載の方法。
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