ES2875276T3 - Un procedimiento de detección fluorescente de amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) de un ácido nucleico diana - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de detección de amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) de una secuencia de ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: i) poner en contacto una muestra de prueba que contenga posiblemente la secuencia de ácido nucleico diana con ADN polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de hebra y un conjunto de oligonucleótidos que consiste en: a. un primer cebador externo F3 y un segundo cebador externo B3; b. un primer cebador interno FIP y un segundo cebador interno BIP, en los que FIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' F2 y una secuencia de ácido nucleico en 5' F1c y BIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' B2 y una secuencia de ácido nucleico en 5' B1c, en los que F2 es complementaria a una región F2c de la secuencia de ácido nucleico diana y B2 es complementaria a una región B2c de la secuencia de ácido nucleico diana, en los que F2c y B2c son regiones no solapantes localizadas en hebras opuestas de la secuencia de ácido nucleico diana; c. un primer cebador en bucle LF y opcionalmente un segundo cebador en bucle LB, que se pueden hibridar a regiones respectivas de la secuencia de ácido nucleico diana, en los que el cebador en bucle LF o bien el cebador en bucle LB, si está presente, se marca con al menos un aceptor fluoróforo en su extremo 5'; d. una sonda de ácido nucleico que se puede hibridar a la secuencia de ácido nucleico diana en una posición que esté en 5' con respecto al cebador en bucle LF o LB marcado, de modo que, cuando la sonda de ácido nucleico se hibride a la secuencia de ácido nucleico diana, el extremo 3' de la sonda de ácido nucleico se acerque en estrecha proximidad al extremo 5' del cebador en bucle LF o LB marcado durante la amplificación isotérmica mediada por bucles, en la que la sonda de ácido nucleico se marca en su extremo 3' con al menos un fluoróforo donante que pueda transferir energía de excitación al al menos un fluoróforo aceptor del cebador en bucle LF o LB, y en la que la intensidad de la emisión de fluorescencia del fluoróforo aceptor se incrementa tras la absorción de la energía de excitación del fluoróforo donante; y ii) detectar un cambio de un parámetro de fluorescencia como una indicación de amplificación LAMP de la secuencia de ácido nucleico diana, en el que el cambio del parámetro de fluorescencia es un incremento de la intensidad de la emisión de fluorescencia del fluoróforo aceptor.

Description

DESCRIPCIÓN

Un procedimiento de detección fluorescente de amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) de un ácido nucleico diana

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la amplificación de ácido nucleico por medio de amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP), así como a un conjunto de oligonucleótidos y un kit para llevar a cabo el procedimiento de la invención.

La amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) es un procedimiento desarrollado recientemente de amplificación de ácido nucleico por medio de una reacción de desplazamiento de hebra autocíclica, que se realiza a una temperatura constante, normalmente de entre 60 °C y 65 °C (Notomi T. et al. 2000. Nucleic acids Res. Vol. 28(12)-e63). Esta tecnología emplea una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra y un conjunto de cuatro oligonucleótidos, denominados cebadores internos y externos, diseñados específicamente para reconocer seis sitios de reconocimiento diferentes en el ácido nucleico diana. Los dos cebadores externos desempeñan un papel en el desplazamiento de hebra solo durante la etapa no cíclica, mientras que los cebadores internos incluyen secuencias tanto sentido como antisentido y contribuyen a la formación de productos de amplificación LAMP típicos que tienen estructuras de tallo-bucle.

Además de los cuatro cebadores oligonucleotídicos, el ensayo de LAMP puede implicar el uso de dos cebadores adicionales, los llamados cebadores en bucle, para mejorar la eficacia de la amplificación, dando como resultado, de este modo, un total de seis cebadores por secuencia diana. Una combinación de este tipo de diferentes cebadores, que abarcan ocho secuencias distintas en el ácido nucleico diana, proporciona un notable grado de especificidad del ensayo.

La tecnología basada en LAMP posee las ventajas de sensibilidad alta, amplificación rápida y funcionamiento simple. El ensayo de LAMP da como resultado una síntesis altamente eficaz de los productos amplificados, que es al menos 50 veces mayor que la obtenida por reacciones de PCR clásica en volúmenes idénticos. Además, la capacidad de amplificar el ácido nucleico en condiciones isotérmicas posibilita el uso de equipos simples y rentables, sin el requisito de ciclado térmico. En los ensayos de LAMP, tanto la amplificación como la detección de amplicones específicos se puede lograr en una única etapa, reduciendo, de este modo, significativamente el tiempo de reacción en comparación con una RT-PCR estándar.

Se han empleado varios procedimientos para la detección de los productos de amplificación LAMP, incluyendo el examen visual o la supervisión de la turbidez del pirofosfato de magnesio precipitado (Tomita N., et al. 2008. Nat. Protoc. 3:877-882; Mori Y., et al. 2001. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289:150-154), detección por fluorescencia de ADN bicatenario (ADNbc) con un fluoróforo intercalante (Zhang X, et al. 2013, PLoS One 8(12):e82841; Mair G. et al. 2013, BMC Veterinary Research 9:108.), emisión de bioluminiscencia a través de conversión de pirofosfato (Gandelman OA., et al. 2010, PLoS One 5(11): e14155).

Las estrategias conocidas para la detección indirecta de la amplificación LAMP se basan esencialmente en la formación de pirofosfato como un subproducto de reacción. A medida que las reacciones de LAMP prosiguen, se liberan iones de pirofosfato por la incorporación de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) en la hebra de ADN durante la polimerización del ácido nucleico y estos iones reaccionan con iones de metal divalente, en particular, iones de magnesio, presentes en la mezcla de reacción para producir un precipitado de pirofosfato de magnesio insoluble y blanco (Mori Y., et al. 2001. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289:150-154). Este producto da como resultado un incremento progresivo de la turbidez de la solución de reacción y los precipitados de pirofosfato se pueden medir cuantitativamente en términos de turbidez u observar a simple vista como un sedimento después de la centrifugación. En un formato alternativo, la detección de la amplificación LAMP se logra a través de la incorporación de iones de manganeso y calceína en la reacción. La fluorescencia de la calceína se extingue de forma natural por la unión de iones de manganeso. La producción de pirofosfato como un subproducto de la reacción de LAMP retira los iones de manganeso del tampón a través de la precipitación, y la turbidez incrementada junto con la fluorescencia de la calceína restablecida posibilita una fácil lectura visual tras la excitación con luz visible o bien UV (Tomita N., et al. 2008. Nat. Protoc. 3:877-882). En todavía otro formato de detección, la conversión enzimática de pirofosfato en ATP, que se produce durante la síntesis de ADN, se supervisa a través de la bioluminiscencia generada por luciferasa de luciérnaga termoestable (Gandelman OA., et al. 2010, PLoS One 5(11): e14155).

También se pueden detectar productos de amplificación LAMP a través de enfoques directos que actúen por medio de emisión de fluorescencia. La mayoría de dichos enfoques se basa en el uso de tintes intercalantes, tales como bromuro de etidio, SYBR Green, EvaGreen y YO-PRO-I (Zhang X, et al. 2013, PLoS One 8(12):e82841; Mair G. et al. 2013, BMC Veterinary Research 9:108.). Típicamente, los tintes intercalantes son tintes fluorescentes no específicos de secuencia que presentan un gran incremento de emisión de fluorescencia tras unirse en el ADNbc. Dicha propiedad se puede usar para supervisar la amplificación de ácido nucleico en tiempo real midiendo continuamente la fluorescencia durante la reacción de LAMP. Sin embargo, puesto que los tintes intercalantes se unen a cualquier ADNbc, la implementación de dichos tintes en procedimientos de amplificación en tiempo real no permite discriminar entre productos de amplificación de la diana y artefactos coproducidos específicos, tales como amplicones y dímeros de cebadores no específicos, lo que puede dar como resultado una sobreestimación de la concentración de diana. En consecuencia, la detección de la amplificación de ácido nucleico por tintes intercalantes requiere una extensa optimización y normalmente se necesitan ensayos de seguimiento para validar los resultados.

La detección basada en fluorescencia de la amplificación LAMP también puede depender del mecanismo de transferencia de energía por resonancia de Forster (FRET) (Chen Q, et al. 1997 Biochemistry 36(15):4701-11). FRET es una interacción dependiente de la distancia entre los estados electrónicos excitados de dos cromóforos en la que la energía de excitación se transfiere de una molécula donante a una molécula aceptora. Cuando el propio aceptor es un fluoróforo, el estado excitado del aceptor inducido por FRET se puede relajar posteriormente por la emisión de fluorescencia del aceptor. El cromóforo aceptor no necesita ser por sí mismo fluorescente, y se han implementado en gran medida en los últimos años sistemas de FRET con aceptores oscuros. Por ejemplo, se pueden usar extintores oscuros, que son cromóforos que se pueden excitar a estados electrónicos más altos tras la absorción de fotones y relajarse al estado fundamental preferentemente por procedimientos no radiativos, permaneciendo, de este modo, oscuros (Le Reste L. et al. 2012. Biophysical Journal 102: 2658-2668). La aceptación de la energía del donante por un aceptor en FRET requiere que el espectro de absorbancia del cromóforo aceptor se solape con el espectro de emisión del cromóforo donante. Además, se necesita que los cromóforos donante y aceptor estén en estrecha proximidad para que se produzca la transferencia de energía y la eficacia de dicha transferencia es altamente dependiente de la sexta potencia de la distancia entre los dos cromóforos (Clegg RM. 1995 Curr. Opin. Biotechnol. 6: 103-110).

Chou et al. (Chou PH, et al. 2011 J Virol Methods. 173(1):67-74) describen un ensayo para el diagnóstico de las infecciones por el virus del síndrome de las manchas blancas (WSSV) en gambas, que combina la tecnología de LAMP y la de sondas de hibridación para FRET. Más específicamente, además del conjunto estándar de cebadores para LAMP, que incluye los llamados cebadores en bucle, el ensayo por Chou et al. implica el uso de dos sondas fluorescentes marcadas en la secuencia de extremo 3' y 5', respectivamente (figura 1A), que se hibridan en una configuración de cabeza a cola a la región en bucle monocatenaria presente en los productos de LAMP intermedios. Al acercar los dos fluoróforos en estrecha proximidad, se produce una transferencia de energía y se genera una señal de FRET en tiempo real durante la reacción de amplificación isotérmica. La figura 1A ilustra un producto intermedio de LAMP, en el que un extremo en bucle se ha ampliado para mostrar en detalle la hibridación de los oligonucleótidos empleados en la etapa de detección del ensayo de FRET.

Entre los procedimientos de detección basados en la transferencia de energía por fluorescencia, la extinción de la fluorescencia inducida por hibridación también se ha explotado en aplicaciones de LAMP, en particular, a través del principio de extinción por guanina (Zerilli et al. 2010. Clin Chem 56:1287-96). En un enfoque de este tipo, la fluorescencia emitida por un cebador en bucle para LAMP marcado en 5' se extingue progresivamente tras la hibridación a una secuencia diana complementaria que contiene una guanina. La extensión del efecto de extinción depende del número y posiciones de las bases G contiguas en la secuencia diana complementaria. A medida que las secuencias diana se acumulan en un ensayo de LAMP en tiempo real, se pueden lograr mediciones cuantitativas de amplificación de ácido nucleico supervisando la cantidad de fluorescencia extinguida como consecuencia de la incorporación del cebador en bucle marcado con tinte en los productos de amplificación. Sin embargo, una estrategia de este tipo adolece de la desventaja de ser dependiente de la secuencia de nucleótidos específica del ácido nucleico diana y está limitada por la presencia y/o posición de nucleótidos de guanina dentro de dicha secuencia.

En los últimos años, se han dirigido grandes esfuerzos hacia la adaptación de procedimientos isotérmicos, tales como LAMP, en ensayos de diagnóstico molecular, que aprovechan el equipo de prueba simplificado que no requiere ciclado de temperatura y permite que se produzcan versiones para su uso en entornos sanitarios bastante básicos. Dado que se adoptan técnicas isotérmicas como herramientas de diagnóstico, un requisito esencial para dichas técnicas es su capacidad de generar el resultado para un paciente en muy poco tiempo, para proporcionar una asistencia fiable y rápida en la toma de decisiones clínicas para cada fase de la atención del paciente, es decir, diagnóstico precoz, evaluación de riesgos, cribado, estadificación y pronóstico, selección del tratamiento y supervisión. Por ejemplo, el diagnóstico precoz de las neoplasias hemáticas, tales como leucemia aguda, es crucial para garantizar un buen pronóstico para los pacientes, puesto que un tratamiento a tiempo puede ser crucial y decisivo en la atención integral de las enfermedades.

Por tanto, existe una necesidad en la técnica de desarrollar procedimientos de amplificación isotérmica mediada por bucles que puedan lograr una detección rápida de secuencias de ácido nucleico diana sin afectar a parámetros del ensayo críticos, tales como especificidad, sensibilidad y exactitud.

Esta y otras necesidades se satisfacen por el procedimiento como se define en las reivindicaciones adjuntas, que forman una parte integral de la descripción.

Como se ilustra además en la sección experimental a continuación, la presente invención proporciona un procedimiento para la detección de la amplificación LAMP de secuencias de ácido nucleico diana, que incluye opcionalmente la detección de mutaciones en secuencias de ácido nucleico diana, que hace uso del principio de transferencia de energía por fluorescencia. El procedimiento de la presente invención emplea una a Dn polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de hebra y un conjunto de cebadores para LAMP oligonucleotídicos que consiste en dos cebadores externos, a saber, F3 y B3, dos cebadores internos, a saber, FIP y BIP, uno o dos cebadores en bucle, a saber, LF y/o LB, y una sonda de ácido nucleico. Se puede encontrar una descripción de los rasgos característicos y función de los cebadores para LAMP y cebadores en bucle, por ejemplo, en el sitio web de Eiken (loopamp.eken.co.jp/e/lamp/primer.html;loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/loop.html).

De acuerdo con la presente invención, el primer cebador interno FIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' designada como F2, que es complementaria a una región F2c de la secuencia de ácido nucleico diana, y una secuencia de ácido nucleico en 5' designada como F1c. El segundo cebador interno BIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' designada como B2, que es complementaria a una región B2c de la secuencia de ácido nucleico diana, y una secuencia de ácido nucleico en 5' designada como B1c. Las regiones F2c y B2c son regiones no solapantes localizadas en hebras opuestas de la secuencia de ácido nucleico diana.

El cebador exterior F3 consiste en la región F3 que es complementaria a la región F3c; el cebador exterior B3 consiste en la región B3 que es complementaria a la región B3c. Como se menciona anteriormente, el procedimiento de la presente invención emplea uno o dos cebadores en bucle, es decir, un cebador en bucle B y/o un cebador en bucle F (que se designan en lo que sigue como "cebador en bucle LF" y "cebador en bucle LB", respectivamente), que contienen secuencias complementarias a la región en bucle monocatenaria localizada entre las regiones B1 y B2 o localizada entre las regiones F1 y F2.

Típicamente, cuando se usan en una reacción de LAMP, los cebadores en bucle se hibridan a los productos de LAMP intermedios y proporcionan un número incrementado de puntos de partida para la síntesis de ADN. De acuerdo con la invención, el cebador en bucle LF o bien el cebador en bucle LB, si está presente, se marca en su extremo 5' con al menos un fluoróforo aceptor.

En comparación con la tecnología de LAMP estándar, el procedimiento de la invención implica el uso de un oligonucleótido adicional, más en particular, una sonda de ácido nucleico, que se marca en su extremo 3' con al menos un fluoróforo donante. Dicha sonda de ácido nucleico se puede hibridar a la secuencia de ácido nucleico diana en una posición que esté en 5' con respecto al cebador LF o LB marcado, de modo que, cuando se hibride a la secuencia de ácido nucleico diana, el extremo 3' de la sonda de ácido nucleico se acerque en estrecha proximidad al extremo 5' del cebador en bucle LF o LB marcado. En la presente descripción, una secuencia de ácido nucleico (un cebador o bien una sonda) que se pueda hibridar a una secuencia de ácido nucleico diana dada es, por ejemplo, complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico.

Cabe señalar que solo se produce una "estrecha proximidad" de dicho cebador en bucle marcado y dicha sonda de ácido nucleico marcada durante la fase de amplificación de una reacción de LAMP cuando el cebador en bucle se incorpora y extiende en el producto de amplificación LAMP.

Como se muestra en la figura 1B, el procedimiento de acuerdo con la invención emplea un cebador en bucle marcado en su extremo 5' con al menos un fluoróforo aceptor en combinación con una sonda de ácido nucleico marcada en su extremo 3' con al menos un fluoróforo donante. La figura 1B ilustra un producto intermedio de LAMP, en el que un extremo en bucle se ha ampliado para mostrar en detalle la hibridación de los oligonucleótidos empleados en la etapa de detección del ensayo de FRET.

El cebador en bucle marcado puede ser LF o bien LB (cuando LB está presente). De acuerdo con la invención, tras la hibridación de dichos oligonucleótidos con la secuencia de ácido nucleico diana durante la reacción de LAMP, el fluoróforo donante en el extremo 3' de la sonda de ácido nucleico se acerca en estrecha proximidad al fluoróforo aceptor en el extremo 5' del cebador en bucle LF o LB. La transferencia de energía por fluorescencia se produce entre dichos fluoróforos, por ejemplo, el fluoróforo donante localizado en el extremo 3' de la sonda de ácido nucleico transfiere energía de excitación al fluoróforo aceptor localizado en el extremo 5' del cebador en bucle LF o LB. Como resultado, se genera y detecta un incremento de la intensidad de la emisión de fluorescencia del fluoróforo aceptor. Un incremento de este tipo es una indicación de la amplificación de ADN, puesto que se genera tras la incorporación del cebador en bucle marcado en el producto de amplificación LAMP y la posterior extensión del cebador.

El rendimiento del procedimiento de la invención se evaluó por los autores de la presente invención en comparación con ensayos de LAMP basados en fluorescencia de la técnica anterior, más específicamente, el ensayo de LAMP basado en FRET descrito por Chou et al. y el sistema de LAMP que hace uso de tintes intercalantes.

Para comparar el rendimiento del procedimiento de LAMP de la invención con el ensayo por Chou et al., se usó un diseño de dilución y se sometieron series de valoración que variaban de 2x101 copias/pl a 2x106 copias/pl de un plásmido desnaturalizado que contenía un fragmento genómico de WSSV a amplificación LAMP en un instrumento Rotor-Gene Q (Qiagen). En particular, se realizó un análisis comparativo sobre las diluciones correspondientes a 2x103 copias/pl y 2x106 copias/pl, respectivamente. La amplificación de la diana produjo una señal fluorescente creciente con forma sigmoidea que se detectó estableciendo lecturas con una etapa de 1 minuto.

Usando el programa informático Rotor-Gene se generó la señal normalizada y estableciendo un umbral de fluorescencia en 0,2 correspondiente a alrededor de un 50 % del incremento de fluorescencia se identificó el tiempo umbral (minutos) para detectar la amplificación de la diana.

Un análisis comparativo del tiempo umbral generado para estas muestras diluidas por cada uno de los procedimientos de LAMP en examen mostró que el procedimiento de la invención logra una detección más temprana significativa de la secuencia de ácido nucleico diana en comparación con el procedimiento por Chou et al. (mostrado en la figura 2).

Además, se calculó la significación estadística de la diferencia en el tiempo de detección medido entre los procedimientos de LAMP en examen realizando una prueba de la t de Student, que proporcionó un valor de p menor de 0,05.

Para evaluar además el procedimiento de la invención para determinar la capacidad de detectar ácidos nucleicos diana en una matriz natural, se aplicó el procedimiento experimental como se describe anteriormente a la misma dilución del plásmido de WSSV (2x103 copias/pl y 2x106 copias/pl) en ADN genómico humano (20 ng/pl). Las reacciones de amplificación LAMP realizadas en dichas diluciones revelaron que la presencia de material, tal como ADN genómico, que puede provocar interferencia, generó un retraso en la detección de la secuencia de ácido nucleico diana por ambos procedimientos. Además, se logró la detección de la diana por el procedimiento de la invención 10 o más minutos más temprano que la detección lograda por el sistema de LAMP por Chou et al.

En la validación del ensayo, la linealidad representa uno de los indicadores más pertinentes de la exactitud del ensayo, en tanto que mide la capacidad del procedimiento de devolver valores que sean directamente proporcionales a la concentración del analito diana en las muestras de prueba. En el presente estudio, los datos de amplificación LAMP obtenidos aplicando el procedimiento de la invención o bien el procedimiento por Chou et al. en las series de valoración de muestras indicadas anteriormente, se sometieron a análisis de regresión lineal.

En la figura 3, el tiempo umbral (indicado en minutos) se representa frente a la concentración de la diana de ácido nucleico plasmídico, expresada como copias/pl, tanto para (A) el procedimiento de LAMP de la invención como para (B) el ensayo de LAMP por Chou et al. Esta figura muestra que el procedimiento de la presente invención proporciona una linealidad superior, puesto que se calcularon un coeficiente de correlación (R2) = 0,99 y una pendiente = -7,2 para la línea de regresión. Además, la determinación de una linealidad tan buena también es indicativa de la precisión del ensayo, ya que implica una alta reproducibilidad entre las mediciones repetidas.

Los autores de la presente invención realizaron otra evaluación comparando el rendimiento del procedimiento de la invención con un ensayo de LAMP que implica el uso de tintes intercalantes para la detección por fluorescencia. Se aplicó un análisis de regresión lineal sobre los datos de amplificación LAMP obtenidos llevando a cabo el procedimiento de la presente invención o el ensayo basado en tinte intercalante en muestras de ADN plasmídico diluidas en serie diez veces que contenían el gen MYH11. Los resultados del análisis de regresión lineal se muestran en la figura 4. Esta figura muestra el tiempo umbral (indicado en minutos) representado frente a la concentración de la diana de ácido nucleico plasmídico, expresada como copias/ul, tanto para (A) el procedimiento de LAMP de la invención como para (B) el ensayo con tinte intercalante. Los datos obtenidos confirman una linealidad significativamente mayor del procedimiento de la presente invención en comparación con el sistema de LAMP que usa el tinte intercalante YO-PRO (R2 = 0,97 frente a R2 = 0,80).

Junto con la mejor linealidad del ensayo, se observaron una mayor sensibilidad analítica y un intervalo de linealidad más amplio para el procedimiento de la presente invención. Finalmente, en comparación con el LAMP basado en tinte intercalante, el procedimiento de la presente invención que emplea un par de FRET cebador en bucle/sonda marcados da como resultado una especificidad del ensayo mejorada, puesto que los tintes intercalantes, tales como YO-PRO emiten una señal de fluorescencia tras unirse a cualquier ADN bicatenario, independientemente de la secuencia de nucleótidos específica.

En el procedimiento de la presente invención, la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana da lugar a un cambio detectable de un parámetro de fluorescencia, a saber, un incremento de la intensidad de fluorescencia del aceptor cuando se produce la transferencia de energía entre el fluoróforo donante en el extremo 3' de la sonda de ácido nucleico y el fluoróforo aceptor en el extremo 5' del cebador en bucle LF o LB.

Se debe entender que también se pueden evaluar otros parámetros de fluorescencia que se ven afectados por la proximidad de los fluoróforos donante y aceptor y, en consecuencia, por la emisión de fluorescencia del aceptor, incluyendo, por ejemplo, la proporción de intensidades de fluorescencia o tiempo de vida de fluorescencia del donante y/o aceptor.

Como se explica anteriormente, la aceptación de la energía de excitación del donante por un fluoróforo aceptor en FRET requiere una estrecha proximidad entre dichas moléculas y la eficacia de FRET es muy sensible a la distancia y orientación relativa entre el donante y el aceptor. De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, tras la hibridación a la secuencia de ácido nucleico diana, la distancia entre el extremo 3' marcado de la sonda de ácido nucleico y el extremo 5' marcado del cebador en bucle debería estar comprendida preferentemente entre cero y 6 nucleótidos, por ejemplo cero, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos.

De acuerdo con la presente invención, la sonda de ácido nucleico comprende al menos un fluoróforo donante enlazado a su extremo 3'. Un fluoróforo donante de este tipo actúa como un bloqueante de la síntesis de ADN en tanto que hace que el extremo 3' de la sonda de ácido nucleico ya no esté disponible como origen para la polimerización del ADN.

Por el contrario, en la presente invención, el fluoróforo aceptor transportado por el cebador en bucle marcado está enlazado al extremo 5' de dicho oligonucleótido para evitar cualquier interferencia con la síntesis de ADN durante la reacción de LAMP. Específicamente, el cebador en bucle marcado de acuerdo con la invención tiene un grupo hidroxilo libre en 3' que sirve como origen para la síntesis de la hebra de ADN complementaria.

Puesto que se logra la detección de la diana directamente por medio de componentes de señal enlazados en oligonucleótidos específicos, el procedimiento de la presente invención proporciona una tecnología de detección específica de secuencia. De acuerdo con la invención, la sonda de ácido nucleico marcada y/o cebador en bucle marcado se pueden diseñar para tolerar variaciones de secuencia para la detección de diversas secuencias de ADN o ARN o para diferenciar entre polimorfismos en secuencia. Además, se entiende que la hibridación de la sonda de ácido nucleico o el cebador en bucle con sus secuencias complementarias respectivas en el ácido nucleico diana se puede potenciar incorporando en dichos oligonucleótidos determinados tipos de nucleótidos modificados, por ejemplo, 2'-O-metilribonucleótidos o nucleótidos basados en nitropirrol, o determinados tipos de análogos de ácido nucleico con cadena principal no natural, por ejemplo, APN (ácido peptidonucleico) o ANB (ácido nucleico bloqueado). El uso de análogos de ácido nucleico en procedimientos de amplificación de ácido nucleico está muy establecido y es conocido por el experto en la técnica.

En el contexto de la presente invención, el término "secuencia de ácido nucleico diana" se refiere a secuencias de ácido nucleico que se van a amplificar y detectar. Esto también incluye la segunda hebra complementaria de las secuencias de ácido nucleico que se van a amplificar y cualquier hebra de una copia de la secuencia de ácido nucleico que se produce por amplificación. El ácido nucleico diana se puede originar de una variedad de fuentes. Por ejemplo, los ácidos nucleicos diana pueden ser ADN o ARN natural aislado de cualquier fuente, moléculas recombinantes, ADNc, o análogos sintéticos, como es conocido en la técnica. En algunos modos de realización, la secuencia de ácido nucleico diana puede comprender uno o más polimorfismos mononucleotídicos (SNP), variantes alélicas y otras mutaciones, tales como mutaciones por deleción, mutaciones por inserción, mutaciones puntuales. En otros modos de realización, la secuencia de ácido nucleico diana puede comprender una secuencia de unión de un gen de fusión, posiblemente asociado con cáncer. Aún en otro modo de realización, la secuencia de ácido nucleico diana se puede originar de un microorganismo, incluyendo clones o cepas específicos de microorganismos, posiblemente implicados en la inducción de enfermedades en seres humanos y animales.

El procedimiento de la presente invención también es adecuado para determinar cuantitativamente la cantidad de secuencias de ácido nucleico diana en una muestra. En un modo de realización preferente de la invención, la cuantificación de una secuencia de ácido nucleico diana se logra por medio de la generación de una curva estándar representando un gráfico del número de copias (o concentración) conocido de dicha secuencia de ácido nucleico diana frente al tiempo del ensayo de LAMP hasta la positividad. La cuantificación del número de copias (o concentración) de diana no conocido en las muestras de prueba se puede extrapolar de la curva estándar en base al tiempo hasta la positividad medida en la muestra no conocida.

De acuerdo con la invención, el cebador en bucle LF o bien el cebador en bucle LB (cuando LB está presente) se marca en su extremo 5' con al menos un fluoróforo aceptor y la sonda de ácido nucleico se marca en su extremo 3' con una al menos un fluoróforo donante.

Un requisito para que se produzca la transferencia de energía por resonancia de Forster es que el espectro de emisión del fluoróforo donante se solape con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor, de modo que la excitación por luz de menor longitud de onda del fluoróforo donante esté seguida de la transferencia de la energía de excitación al fluoróforo aceptor.

Existen muchas moléculas que pueden servir como fluoróforo donante o bien aceptor en la presente invención. De acuerdo con un modo de realización preferente, el fluoróforo donante se selecciona del grupo que consiste en fluoresceína, BODIPY FL, Alexa555, ATTO550, Cy3, FAM, TET, HEX, JOE, VIC, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TAMRA y/o el fluoróforo aceptor se selecciona del grupo que consiste en Cy5.5, Cy5, ATTO647N, Alexa 647, ROX, LC red 610, Texas red, LC red 640, LC red 670, Quasar 670, Oyster 645, Lc red 705.

Es especialmente preferente el par donante/aceptor BODIPY FL/ATTO647N.

Aún en otro modo de realización, la sonda de ácido nucleico y/o el cebador en bucle se marcan con más de un fluoróforo, preferentemente dos fluoróforos.

En el modo de realización lo más preferente, el par donante/aceptor en FRET consiste en dos fluoróforos BODIPY FL y un fluoróforo ATTO647N, respectivamente. La selección del par de fluoróforos donante/aceptor adecuado para la presente invención está completamente dentro del conocimiento del experto en la técnica. Se proporciona la siguiente sección experimental meramente a modo de ilustración y no se pretende que limite el alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.

SECCIÓN EXPERIMENTAL EJEMPLO 1: comparación del procedimiento de LAMP de la invención con el ensayo de LAMP por Chou et al.

Preparación de la muestra

Para comparar el procedimiento de LAMP de la invención con el ensayo de LAMP descrito en Chou et al., se preparó una secuencia de ácido nucleico diana adecuada. En resumen, se clonó un fragmento de ADN de 350 pb derivado del genoma del virus del síndrome de las manchas blancas (WSSV) (nt226681-227934, GenBank AF332093.1) en el vector pMA-T (GENEART) usando la combinación del sitio de restricción para Sfi I / Sfi I para proporcionar el control positivo. Se prepararon series de diluciones de diez veces en el intervalo de aproximadamente 2x106 copias/gl a 2x101 copias/gl para el plásmido de WSSV recombinante.

Se prepararon dos series de diluciones del plásmido diferentes usando como diluyente Tris-HCl 10 mM, solo pH 8,5, o bien este tampón que contenía adicionalmente ADN genómico humano (20 ng/gl). En el presente estudio, las diluciones del plásmido analizadas se desnaturalizaron a 100 °C durante 10 minutos. Después de su desnaturalización, las muestras de plásmido se colocaron de inmediato en hielo durante 10 minutos. Reacción de LAMP

Las sondas y cebadores oligonucleotídicos para LAMP empleados para el análisis comparativo se diseñaron como se describe en Chou et al., y se enumeran en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1

La tabla 1 contiene el conjunto completo de oligonucleótidos usados en el ensayo por Chou et al. El conjunto de oligonucleótidos empleado en el procedimiento de LAMP de acuerdo con la invención difiere del conjunto de oligonucleótidos por Chou et al. para los siguientes rasgos característicos:

1) contiene una única sonda de ácido nucleico, a saber, LCF, que se marca en su extremo 3' con fluoresceína;

2) no incluye ningún cebador en bucle Bucle-B, y este último se reemplaza por el cebador LCQ, que está marcado en su extremo 5' con el resto fluorescente LC640. En vista de lo anterior, el procedimiento por Chou et al. proporciona la generación de una señal de amplificación fluorescente por medio del mecanismo de FRET entre una sonda donante marcada y una sonda aceptora marcada. Por el contrario, en el procedimiento de acuerdo con la presente invención, la función de oligonucleótido aceptor se lleva a cabo por uno de los cebadores en bucle, marcado previamente, reduciendo, de este modo, el número de oligonucleótidos empleados en la reacción de LAMP. Además, el procedimiento de la invención supera la desventaja asociada con el ensayo por Chou et al. de una posible competencia de las sondas para FRET empleadas en dicho ensayo con los cebadores en bucle en cuanto a la unión a la misma secuencia de nucleótidos diana.

En el presente estudio, se usaron las siguientes concentraciones de cebador en las reacciones de LAMP: 0,375 pM para cebadores externos (F3 y B3), 2 pM para cebadores internos (FIP y BIP), 1,1 pM para cebador en bucle Bucle-F, 0,3 pM para cebador en bucle Bucle-B (presente solo en la reacción de acuerdo con Chou et al.), 0,25 pM para LCF y LCQ.

Las reacciones de LAMP se realizaron en una mezcla de 20 pl que contenía: dNTP 0,375 mM, 2,4 U de fragmento grande de ADN polimerasa de Bst (New England BioLabs, Beverly, MA, EE. UU.), 1x tampón de reacción (tampón HEPES 20 mM, pH 7,9, KCl 20 mM, MgCl23 mM y Tritón X100 al 0,1 %).

Las mezclas de reacción se incubaron a 60 °C durante 120 minutos en un instrumento Rotor-Gene Q (Qiagen). A continuación, los productos de amplificación se mantuvieron a 4 °C.

Se detectó la amplificación LAMP del plásmido de WSSV recombinante por el análisis de la señal fluorescente normalizada generada durante la reacción. El tiempo umbral se identificó estableciendo un umbral de fluorescencia en 0,2, correspondiente a alrededor de un 50 % del incremento de fluorescencia.

Análisis y normalización de los datos

El análisis de los datos se realizó usando el paquete estadístico dentro de Microsoft Excel. Se usó el mismo paquete para el análisis de regresión lineal.

La normalización de los datos se obtuvo por medio del programa informático Rotor-Gene Pure Detection v2.1.

en tinte intercalante.

Preparación de la muestra

Para comparar el rendimiento del procedimiento de la invención con un ensayo de LAMP que implica el uso de tintes intercalantes, se preparó una secuencia de ácido nucleico diana adecuada. En resumen, se clonó un fragmento de ADN de 350 pb derivado del gen MYH11 (GenBank D10667.1) en el vector pMA-T (GENEART) usando la combinación del sitio de restricción para Sfi I / Sfi I para proporcionar el control positivo.

El plásmido de MYH11 recombinante se diluyó en serie 10 veces en tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, de aproximadamente 2x106 copias/pl a 2X101 copias/pl.

En el presente estudio, las diluciones del plásmido analizadas se desnaturalizaron a 100 °C durante 10 minutos. Después de su desnaturalización, las muestras de plásmido se colocaron de inmediato en hielo durante 10 minutos.

Reacción de LAMP

En la tabla 2 a continuación se enumeran las sondas y cebadores oligonucleotídicos para LAMP empleados para el análisis comparativo.

Tabla 2

En la reacción de LAMP de acuerdo con el procedimiento de la invención, se usaron las siguientes concentraciones de oligonucleótido: 0,05 pM para cebadores externos (F3 y B3), 0,4 pM para cebadores internos (FIP y BIP), 0,2 pM para cebador en bucle LB aceptor y 0,2 pM para sonda para FRET donante. Por el contrario, además de los cebadores externos e internos indicados anteriormente, el conjunto de oligonucleótidos empleado en el ensayo de LAMP basado en tinte intercalante incluyó solo el cebador en bucle LB en forma no marcada.

Las reacciones de LAMP se realizaron en una mezcla de 25 pl que contenía: dNTP 1,4 mM, 8 U de fragmento grande de ADN polimerasa de Bst (New England BioLabs, Beverly, MA, EE. UU.), MgCl28 mM, 1x tampón de reacción (Tris-HCl 30 mM, pH 8,0, KCl 30 mM y Tritón X100 al 0,1 %). Las mezclas de reacción establecidas para el ensayo de LAMP basado en tinte intercalante incluían además el tinte intercalante YO-PRO (Life Technologies) a la concentración de 1 pM.

La reacción de amplificación LAMP se llevó a cabo a 65 °C durante 40 minutos en un instrumento Rotor-Gene Q (Qiagen). A continuación, los productos de amplificación se mantuvieron a 4 °C.

La amplificación LAMP del plásmido de MYH11 recombinante se detectó por el análisis de la señal fluorescente normalizada generada durante la reacción. El tiempo umbral se identificó estableciendo un umbral de fluorescencia en 0,2, correspondiente a alrededor de un 50 % del incremento de fluorescencia.

Análisis y normalización de los datos

El análisis de los datos se realizó usando el paquete estadístico dentro de Microsoft Excel. Se usó el mismo paquete para el análisis de regresión lineal.

La normalización de los datos se obtuvo por medio del programa informático Rotor-Gene Pure Detection v2.1.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de detección de amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) de una secuencia de ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

i) poner en contacto una muestra de prueba que contenga posiblemente la secuencia de ácido nucleico diana con ADN polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de hebra y un conjunto de oligonucleótidos que consiste en:

a. un primer cebador externo F3 y un segundo cebador externo B3;

b. un primer cebador interno FIP y un segundo cebador interno BIP,

en los que FIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' F2 y una secuencia de ácido nucleico en 5' F1c y BIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' B2 y una secuencia de ácido nucleico en 5' B1c,

en los que F2 es complementaria a una región F2c de la secuencia de ácido nucleico diana y B2 es complementaria a una región B2c de la secuencia de ácido nucleico diana,

en los que F2c y B2c son regiones no solapantes localizadas en hebras opuestas de la secuencia de ácido nucleico diana;

c. un primer cebador en bucle LF y opcionalmente un segundo cebador en bucle LB, que se pueden hibridar a regiones respectivas de la secuencia de ácido nucleico diana, en los que el cebador en bucle LF o bien el cebador en bucle LB, si está presente, se marca con al menos un aceptor fluoróforo en su extremo 5';

d. una sonda de ácido nucleico que se puede hibridar a la secuencia de ácido nucleico diana en una posición que esté en 5' con respecto al cebador en bucle LF o LB marcado, de modo que, cuando la sonda de ácido nucleico se hibride a la secuencia de ácido nucleico diana, el extremo 3' de la sonda de ácido nucleico se acerque en estrecha proximidad al extremo 5' del cebador en bucle LF o LB marcado durante la amplificación isotérmica mediada por bucles,

en la que la sonda de ácido nucleico se marca en su extremo 3' con al menos un fluoróforo donante que pueda transferir energía de excitación al al menos un fluoróforo aceptor del cebador en bucle LF o LB, y

en la que la intensidad de la emisión de fluorescencia del fluoróforo aceptor se incrementa tras la absorción de la energía de excitación del fluoróforo donante; y

ii) detectar un cambio de un parámetro de fluorescencia como una indicación de amplificación LAMP de la secuencia de ácido nucleico diana, en el que el cambio del parámetro de fluorescencia es un incremento de la intensidad de la emisión de fluorescencia del fluoróforo aceptor.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el extremo 3' de la sonda de ácido nucleico, cuando se hibrida a la secuencia de ácido nucleico diana, está separado del extremo 5' del cebador en bucle LF o LB marcado por no más de 6 nucleótidos, preferentemente no más de 1 nucleótido, más preferentemente por cero nucleótidos.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el cebador en bucle LF o LB marcado es un cebador extensible en tallo-bucle que comprende i) una secuencia de bucle central que selectivamente puede reconocer e hibridarse a la región respectiva de la secuencia de ácido nucleico diana y ii) una secuencia de extremo 5' y una secuencia de extremo 3' que son complementarias entre sí de modo que formen un tallo bicatenario.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de ácido nucleico diana comprende al menos una mutación, que se selecciona preferentemente de una mutación puntual, una deleción, una inserción o una translocación.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana es indicativa de la presencia o de la ausencia de la al menos una mutación.