JP7023229B2 - 標的核酸のループ介在等温増幅（ｌａｍｐ）の蛍光検出の方法、オリゴヌクレオチド及びそれらのキット - Google Patents

標的核酸のループ介在等温増幅（ｌａｍｐ）の蛍光検出の方法、オリゴヌクレオチド及びそれらのキット Download PDF

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Description

本発明は、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）による核酸増幅の検出方法ならびに本発明の方法を実施するためのオリゴヌクレオチドのセット及びキットに関する。
ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）は、近年開発されたオートサイクリック（ａｕｔｏｃｙｃｌｉｃ）鎖置換反応による核酸増幅の方法であり、通常は６０℃～６５℃の一定温度で行われる（Ｎｏｔｏｍｉ Ｔら、２０００．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２８（１２）－ｅ６３）。この技術は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、標的核酸上の６つの異なる認識部位を認識するように特異的に設計されたインナープライマー及びアウタープライマーと呼ばれる４つのオリゴヌクレオチドのセットとを使用する。２つのアウタープライマーは、非サイクリック工程の間のみ鎖置換に関与するが、インナープライマーはセンス配列及びアンチセンス配列の両方を含み、ステムループ構造を有する典型的なＬＡＭＰ増幅産物の形成に寄与する。
４つのオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、ＬＡＭＰアッセイは、増幅効率を向上させるための２つの追加のプライマー、いわゆるループプライマーの使用を含み、それにより標的配列あたり合計６つのプライマーが得られ得る。標的核酸上の８つの異なる配列にまたがる異なるプライマーのそのような組合せにより、顕著なアッセイ特異性が提供される。
ＬＡＭＰベースの技術は、高感度、迅速な増幅及び簡単な操作という利点を有する。ＬＡＭＰアッセイは、増幅産物の高効率な合成をもたらし、これは、同一容量を用いた古典的なＰＣＲ反応によって得られるものの少なくとも５０倍である。さらに、等温条件下で核酸を増幅する能力は、熱サイクリングを必要とせずに、単純かつ費用対効果の高い装置の使用を可能にする。ＬＡＭＰアッセイでは、特異的なアンプリコンの増幅及び検出の両方を単一工程で達成することができ、それによって標準ＲＴ－ＰＣＲと比較して反応時間を大幅に短縮することができる。
沈殿したピロリン酸マグネシウムの目視検査又は濁度モニタリング（Ｔｏｍｉｔａ Ｎ．ら、２００８．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：８７７－８８２；Ｍｏｒｉ Ｙ．ら、２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８９：１５０－１５４）、インターカレート型フルオロフォア（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を用いた二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の蛍光検出（Ｚｈａｎｇ Ｘら、２０１３、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１２）：ｅ８２８４１；Ｍａｉｒ Ｇ．ら、２０１３、ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９：１０８）、ピロリン酸変換によって報告される生物発光（Ｇａｎｄｅｌｍａｎ ＯＡ．ら、２０１０、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１１）：ｅ１４１５５）など、いくつかの方法がＬＡＭＰ増幅産物の検出のために使用されている。
ＬＡＭＰ増幅の間接的な検出のための既知の戦略は、反応副産物としてのピロリン酸の生成に本質的に依存する。ＬＡＭＰ反応が進行するにつれて、核酸重合中にデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をＤＮＡ鎖に組み込むことによってピロリン酸イオンが放出され、これらのイオンが、反応混合物中に存在する二価金属イオン、特にマグネシウムイオンと反応して、白色の不溶性ピロリン酸マグネシウム沈殿物を生成する（Ｍｏｒｉ Ｙ．ら、２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８９：１５０－１５４）。この生成物は反応液の濁度を徐々に増加させ、ピロリン酸沈殿物は濁度に関して定量的に測定することができるか、遠心分離後のペレットとして肉眼で観察することができる。別の形式では、ＬＡＭＰ増幅の検出は、マンガンイオン及びカルセインを反応に組み込むことによって達成される。カルセインの蛍光は、マンガンイオンの結合によって自然に消光される。ＬＡＭＰ反応の副産物としてのピロリン酸生成は、沈殿によって緩衝液からマンガンイオンを除去し、回復したカルセイン蛍光と結合した濁度の増加は、可視光又はＵＶ光による励起時の容易な視覚的読み取りを可能にする（Ｔｏｍｉｔａ Ｎ．ら、２００８．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：８７７－８８２）。さらに別の検出形式では、ＤＮＡ合成中に産生されるＡＴＰへのピロリン酸の酵素的変換が、熱安定性ホタルルシフェラーゼによって生成された生物発光を介してモニターされる（Ｇａｎｄｅｌｍａｎ ＯＡ．ら、２０１０、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１１）：ｅ１４１５５）。
ＬＡＭＰ増幅産物はまた、蛍光報告を介して作用する直接的アプローチによって検出され得る。そのようなアプローチの大部分は、インターカレーティング色素、例えば、エチジウムブロミド、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ及びＹＯ－ＰＲＯ－Ｉの使用に基づく（Ｚｈａｎｇ Ｘら、２０１３、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１２）：ｅ８２８４１；Ｍａｉｒ Ｇ．ら、２０１３、ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９：１０８）。典型的には、インターカレーティング色素は、ｄｓＤＮＡへの結合時に蛍光発光の大きな増加を示す非配列特異的蛍光色素である。このような特性を使用して、ＬＡＭＰ反応中の蛍光を連続的に測定することによって、リアルタイムで核酸増幅をモニターすることができる。しかし、インターカレーティング色素はあらゆるｄｓＤＮＡに結合するため、このような色素をリアルタイム増幅法に導入しても、特異的な標的増幅産物と、非特異的アンプリコン及びプライマーダイマーなどの共産生アーチファクト（ｃｏ－ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｒｔｉｆａｃｔ）とを区別することはできず、標的濃度を過大評価する結果となる可能性がある。その結果、インターカレーティング色素による核酸増幅の検出には広範囲な最適化が必要とされ、結果を検証するためには、通常、フォローアップアッセイが必要となる。
ＬＡＭＰ増幅の蛍光ベースの検出はまた、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の機構に依存し得る（Ｃｈｅｎ Ｑら、１９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６（１５）：４７０１－１１）。ＦＲＥＴは、励起エネルギーがドナー分子からアクセプター分子に移動する電子励起状態の２つの発色団間の距離依存性相互作用である。アクセプター自体がフルオロフォアである場合、ＦＲＥＴ誘発アクセプター励起状態は、その後アクセプター蛍光発光によって緩和することができる。アクセプター発色団自体が蛍光を発する必要はなく、近年では、ダークアクセプターを用いたＦＲＥＴシステムが主に実施されている。例えば、フォトンの吸収時に高い電子状態に励起され、非放射性プロセスによって基底状態に優先的に緩和され、それにより暗状態のままであり得る発色団であるダーククエンチャーを使用することができる（Ｌｅ Ｒｅｓｔｅ Ｌ．ら、２０１２．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １０２：２６５８－２６６８）。ＦＲＥＴアクセプターによるドナーエネルギーの受容は、アクセプター発色団の吸光度スペクトルが、ドナー発色団の発光スペクトルと重なることを必要とする。さらに、ドナー及びアクセプター発色団は、エネルギー移動が起こるためには近接している必要があり、このような移動の効率は、２つの発色団の間の距離の６乗に大きく依存する（Ｃｌｅｇｇ ＲＭ．１９９５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１０３－１１０）。
Ｃｈｏｕら（Ｃｈｏｕ ＰＨら、２０１１ Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１７３（１）：６７－７４）は、エビの白斑症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）感染症の診断のためのアッセイを記載しており、これは、ＬＡＭＰとＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ技術とを組み合わせたものである。さらに具体的には、Ｃｈｏｕらによるアッセイは、いわゆるループプライマーを含む標準的なＬＡＭＰプライマーセットに加えて、ＬＡＭＰの中間産物中に存在する一本鎖ループ領域に対して頭－尾配置（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）でハイブリダイズする、それぞれ３’－及び５’末端配列（図１Ａ）が標識された２つの蛍光プローブの使用を含む。２つのフルオロフォアを近接させることにより、エネルギー移動が起こり、等温増幅反応中にリアルタイムＦＲＥＴシグナルが生成される。図１Ａは、ＦＲＥＴアッセイ検出工程で使用されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを詳細に示すために、１つのループ末端が拡大されたＬＡＭＰの中間産物を示す。
蛍光エネルギー移動に基づく検出方法の中でも、特にグアニン消光の原理（Ｚｅｒｉｌｌｉら、２０１０．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：１２８７－９６）により、ＬＡＭＰ用途にハイブリダイゼーション誘発蛍光消光が利用されている。そのようなアプローチでは、５’標識ＬＡＭＰループプライマーによって放出される蛍光は、グアニンを含有する相補的標的配列へのハイブリダイゼーションの際に、徐々に消光される。消光効果の程度は、相補的標的配列上の隣接するＧ塩基の数及び位置に依存する。リアルタイムＬＡＭＰアッセイでは標的配列が蓄積するため、増幅産物中の色素標識ループプライマーの組込みの結果として消光された蛍光の量をモニターすることによって、核酸増幅の定量的測定を達成することができる。しかし、そのような戦略は、標的核酸の特異的ヌクレオチド配列に依存するという欠点を有し、そのような配列内のグアニンヌクレオチドの存在及び／又は位置によって制限される。
近年、温度サイクルを必要とせず、極めて基本的な医療現場で使用するための型を作製することができる単純化された試験装置を利用して、ＬＡＭＰなどの等温法を分子診断アッセイに適応させることに多くの努力が傾けられている。診断ツールとして等温技術が採用されていることから、このような技術には、患者ケアのあらゆる段階、すなわち、早期診断、リスク評価、スクリーニング、病期分類及び予後、治療選択及びモニタリングに関する臨床的判断に対して信頼できる迅速な支援を提供するために、極めて短時間で患者の評価結果を生成する能力が必須要件となる。例えば、疾患管理には適時の治療が重要かつ決定的であり得るため、急性白血病などの血液悪性腫瘍の早期診断が、患者の予後良好を確実にするために極めて重要である。
したがって、当技術分野では、特異性、感度及び精度などの重要なアッセイパラメーターに影響を与えることなく、標的核酸配列の迅速な検出を達成することができるループ介在等温増幅法を開発する必要がある。
これらの必要性は、説明の不可欠な部分を形成する添付の特許請求の範囲に定義される方法、オリゴヌクレオチドのセット及びキットによって満たされる。
Ｎｏｔｏｍｉ Ｔら、２０００．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２８（１２）－ｅ６３ Ｔｏｍｉｔａ Ｎ．ら、２００８．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：８７７－８８２ Ｍｏｒｉ Ｙ．ら、２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８９：１５０－１５４ Ｚｈａｎｇ Ｘら、２０１３、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１２）：ｅ８２８４１ Ｍａｉｒ Ｇ．ら、２０１３、ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９：１０８ Ｇａｎｄｅｌｍａｎ ＯＡ．ら、２０１０、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１１）：ｅ１４１５５ Ｃｈｅｎ Ｑら、１９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６（１５）：４７０１－１１ Ｌｅ Ｒｅｓｔｅ Ｌ．ら、２０１２．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １０２：２６５８－２６６８ Ｃｌｅｇｇ ＲＭ．１９９５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１０３－１１０ Ｃｈｏｕ ＰＨら、２０１１ Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１７３（１）：６７－７４ Ｚｅｒｉｌｌｉら、２０１０．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：１２８７－９６
以下の実験セクションでさらに説明するように、本発明は、場合により、蛍光エネルギー移動の原理を利用した標的核酸配列の変異の検出を含む標的核酸配列のＬＡＭＰ増幅の検出方法を提供する。本発明の方法は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、２つのアウタープライマー、すなわちＦ３及びＢ３、２つのインナープライマー、すなわちＦＩＰ及びＢＩＰ、１つ又は２つのループプライマー、すなわちＬＦ及び／又はＬＢ、ならびに１つの核酸プローブからなるオリゴヌクレオチドＬＡＭＰプライマーのセットとを用いる。ＬＡＭＰプライマー及びループプライマーの特徴及び機能の説明については、例えば、Ｅｉｋｅｎのウェブサイト（ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｅ／ｌａｍｐ／ｐｒｉｍｅｒ．ｈｔｍｌ；ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｅ／ｌａｍｐ／ｌｏｏｐ．ｈｔｍｌ）を参照されたい。
本発明によれば、第１のインナープライマーＦＩＰは、標的核酸配列のＦ２ｃ領域に相補的なＦ２と呼ばれる３’核酸配列と、Ｆ１ｃと呼ばれる５’核酸配列とからなる。第２のインナープライマーＢＩＰは、標的核酸配列のＢ２ｃ領域に相補的なＢ２と呼ばれる３’核酸配列と、Ｂ１ｃと呼ばれる５’核酸配列とからなる。Ｆ２ｃ及びＢ２ｃ領域は、標的核酸配列の反対側の鎖上に位置する非重複領域である。
外部プライマーＦ３は、Ｆ３ｃ領域に相補的なＦ３領域に含まれ、外部プライマーＢ３は、Ｂ３ｃ領域に相補的なＢ３領域に含まれる。
上述したように、本発明の方法は、１つ又は２つのループプライマー、すなわちループプライマーＢ及び／又はループプライマーＦ（以下、「ＬＦループプライマー」及び「ＬＢループプライマー」と称する）を用い、これらは、Ｂ１領域とＢ２領域との間に位置するか、Ｆ１領域とＦ２領域との間に位置する一本鎖ループ領域に相補的な配列を含有する。
典型的には、ＬＡＭＰ反応に使用する場合、ループプライマーは、ＬＡＭＰの中間産物にハイブリダイズし、ＤＮＡ合成の開始点の数を増加させる。本発明によれば、ＬＦループプライマー又は存在する場合にはＬＢループプライマーのいずれかが、その５’末端で少なくとも１つのアクセプターフルオロフォアにより標識される。
標準的なＬＡＭＰ技術と比較して、本発明の方法は、追加のオリゴヌクレオチド、さらに具体的には、その３’末端が少なくとも１つのドナーフルオロフォアにより標識された核酸プローブの使用を含む。前記核酸プローブは、標識されたＬＦ又はＬＢプライマーに対して５’の位置で標的核酸配列にハイブリダイズすることができ、その結果、標的核酸配列にハイブリダイズした際に、標識されたＬＦ又はＬＢループプライマーの５’末端に核酸プローブの３’末端を近接させる。
本明細書では、所与の標的核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列（プライマー又はプローブのいずれか）は、例えば前記核酸配列に相補的である。
前記標識されたループプライマーと前記標識された核酸プローブとの「近接」は、ループプライマーがＬＡＭＰ増幅産物に組み込まれ伸長された場合のＬＡＭＰ反応の増幅段階中にのみ生じることに留意されたい。
図１Ｂに示すように、本発明による方法は、その３’末端が少なくとも１つのドナーフルオロフォアにより標識された１つの核酸プローブと組み合わせて、その５’末端が少なくとも１つのアクセプターフルオロフォアにより標識されたループプライマーを用いる。図１Ｂは、ＦＲＥＴアッセイ検出工程で使用されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを詳細に示すために、１つのループ末端が拡大されたＬＡＭＰ中間産物を示す。
標識されたループプライマーは、ＬＦ又はＬＢのいずれかであってよい（ＬＢが存在する場合）。本発明によれば、ＬＡＭＰ反応の間に前記オリゴヌクレオチドを標的核酸配列にハイブリダイゼーションさせると、ＬＦ又はＬＢループプライマーの５’末端のアクセプターフルオロフォアに、核酸プローブの３’末端のドナーフルオロフォアが近接する。蛍光エネルギー移動は、このようなフルオロフォア間で起こる。例えば、核酸プローブの３’末端に位置するドナーフルオロフォアは、ＬＦ又はＬＢループプライマーの５’末端に位置するアクセプターフルオロフォアに励起エネルギーを伝達する。その結果、アクセプターフルオロフォアの蛍光発光の強度が増加し、検出される。このような増加は、ＬＡＭＰ増幅産物に標識されたループプライマーが組み込まれ、その後プライマーが伸長した際に発生するため、ＤＮＡ増幅の指標となる。
本発明の方法の性能は、従来技術の蛍光ベースのＬＡＭＰアッセイ、さらに具体的にはＣｈｏｕらが記載したＦＲＥＴベースのＬＡＭＰアッセイ及びインターカレーティング色素を使用するＬＡＭＰシステムと比較して、本発明者らによって評価された。
Ｃｈｏｕらによるアッセイと本発明のＬＡＭＰ法の性能を比較するために、希釈デザインを使用し、ＷＳＳＶゲノム断片を含む変性プラスミド２×１０１コピー／μＬ～２×１０６コピー／μＬの範囲の滴定シリーズに対してＲｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ装置（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＬＡＭＰ増幅を行った。特に、２×１０３コピー／μＬ及び２×１０６コピー／μＬに対応する希釈物についてそれぞれ比較分析を行った。標的の増幅により、１分の工程で測定値を設定することによって検出されたシグモイド形状を有する蛍光シグナルが増加した。
Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅソフトウェアを使用することにより、正規化されたシグナルが生成され、蛍光増分の約５０％に対応する０．２に蛍光閾値を設定することにより、標的増幅を検出するための閾値時間（分）を同定した。
試験中の各ＬＡＭＰ法によるこれらの希釈試料について生成された閾値時間の比較分析では、本発明の方法の方が、Ｃｈｏｕらによる方法よりも、標的核酸配列を有意に早く検出することが示された（図２）。
さらに、スチューデントｔ検定を行うことによって、試験中のＬＡＭＰ法の間の測定された検出時間の差の統計的有意性を計算し、０．０５未満のｐ値を得た。
天然のマトリックス中の標的核酸を検出する能力について本発明の方法をさらに評価するために、ヒトゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）中のＷＳＳＶプラスミドの同じ希釈物（２×１０３コピー／μＬ及び２×１０６コピー／μＬ）に、上記の実験手順を適用した。そのような希釈物に対して実施されたＬＡＭＰ増幅反応から、干渉を引き起こす可能性のあるゲノムＤＮＡなどの物質の存在が、両方法による標的核酸配列の検出を遅延させることが明らかにされた。さらに、ＣｈｏｕらによるＬＡＭＰシステムによって達成された検出よりも１０分以上早く、本発明の方法によって標的検出が達成された。
アッセイのバリデーションでは、直線性は、試験試料中の標的分析物の濃度に正比例する値を戻す手順の能力を測定する点で、アッセイ精度の最適な指標の１つを表す。本試験では、本発明の方法又はＣｈｏｕらによる方法のいずれかを上記の試料滴定シリーズに適用することによって得られたＬＡＭＰ増幅データに対して、線形回帰分析を行った。
図３では、（Ａ）本発明のＬＡＭＰ法及び（Ｂ）ＣｈｏｕらによるＬＡＭＰアッセイの両方について、コピー数／μＬで表したプラスミド核酸標的の濃度に対して閾値時間（分で示す）をプロットする。この図は、相関係数（Ｒ２）＝０．９９及び傾き＝－７．２が回帰直線について計算されたことから、本発明の方法が優れた直線性を提供することを示している。さらに、このような優れた直線性の決定は、複製測定間の再現性が高いことを意味するため、アッセイの精度も示す。
本発明者らは、本発明の方法の性能と、蛍光検出のためのインターカレーティング色素を使用するＬＡＭＰアッセイとを比較することにより、さらに評価を行った。ＭＹＨ１１遺伝子を含有する１０倍段階希釈したプラスミドＤＮＡ試料に対して、本発明の方法又はインターカレーティング色素ベースのアッセイのいずれかを実施することによって得られたＬＡＭＰ増幅データに、線形回帰分析を適用した。線形回帰分析の結果を図４に示す。この図は、（Ａ）本発明のＬＡＭＰ法及び（Ｂ）インターカレーティング色素アッセイの両方について、コピー／ｕＬで表したプラスミド核酸標的の濃度に対してプロットされた閾値時間（分で示す）を示す。得られたデータから、ＹＯ－ＰＲＯインターカレーティング色素を用いたＬＡＭＰシステムと比較して、本発明の方法の直線性が有意に高いことが確認される（Ｒ２＝０．９７対Ｒ２＝０．８０）。
アッセイの直線性が良好であることに加えて、本発明の方法の方が、分析感度が高く、直線性の範囲が広いことが観察された。最後に、ＹＯ－ＰＲＯなどのインターカレーティング色素は、特異的なヌクレオチド配列とは無関係に、あらゆる二本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光シグナルを放出するため、インターカレーティング色素ベースのＬＡＭＰと比較して、標識されたループプライマー／プローブＦＲＥＴ対を用いる本発明の方法では、アッセイ特異性が改善される。
本発明の方法では、標的核酸配列の増幅は、核酸プローブの３’末端のドナーフルオロフォアとＬＦ又はＬＢループプライマーの５’末端のアクセプターフルオロフォアとの間でエネルギー移動が起きた場合に、蛍光パラメーターの検出可能な変化、すなわち、アクセプター蛍光強度の増加をもたらす。
例えば、ドナー及び／又はアクセプターの蛍光強度又は蛍光寿命の比率など、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの近接によって、したがってアクセプター蛍光発光によって影響を受ける他の蛍光パラメーターも評価することができることが理解されるべきである。
上記に概説したように、ＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアによるドナー励起エネルギーの受容は、前記分子間の近接性を必要とし、ＦＲＥＴの効率は、ドナーとアクセプターとの間の距離及び相対的配向に対して極めて感度が高い。本発明の方法によれば、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に、核酸プローブの標識された３’末端とループプライマーの標識された５’末端との間の距離は、好ましくは、０～６ヌクレオチド、例えば、０、１、２、３、４、５又は６ヌクレオチドである必要がある。
本発明によれば、核酸プローブは、その３’末端に連結された少なくとも１つのドナーフルオロフォアを含む。このようなドナーフルオロフォアは、核酸プローブの３’末端をＤＮＡ重合の起点として利用できなくするという点で、ＤＮＡ合成のブロッカーとして作用する。
逆に、本発明では、標識されたループプライマーによって担持されたアクセプターフルオロフォアが、ＬＡＭＰ反応中のＤＮＡ合成との干渉を避けるために、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に連結される。具体的には、本発明による標識されたループプライマーは、相補的ＤＮＡ鎖の合成の起点となる３’－遊離ヒドロキシル基を有する。
特異的なオリゴヌクレオチドに連結されたシグナル成分を介して標的検出が直接達成されるため、本発明の方法は、配列特異的検出技術を提供する。本発明によれば、標識された核酸プローブ及び／又は標識されたループプライマーは、多様なＤＮＡ又はＲＮＡ配列の検出のために配列変異を許容するように、又は配列多型間を区別するように設計され得る。さらに、そのようなオリゴヌクレオチドに、特定のタイプの修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドもしくはニトロピロールベースのヌクレオチド又は非天然骨格を有する特定のタイプの核酸類似体、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）もしくはＬＮＡ（ロックド核酸）を組み込むことによって、核酸プローブ又はループプライマーと標的核酸上のそれらのそれぞれの相補的配列とのハイブリダイゼーションが強化され得ることが理解される。核酸増幅法に対する核酸類似体の使用は十分に確立されており、当業者に知られている。
本発明の文脈では、用語「標的核酸配列」は、増幅され検出される核酸配列を指す。これはまた、増幅されるべき核酸配列の相補的な第２鎖及び増幅によって生成される核酸配列のコピーのいずれかの鎖を含む。標的核酸は、様々な供給源に由来し得る。例えば、標的核酸は、当該分野で公知のように、任意の供給源から単離された天然に存在するＤＮＡもしくはＲＮＡ、組換え分子、ｃＤＮＡ又は合成類似体であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子変異体、及び欠失変異、挿入変異、点変異などの他の変異を含み得る。他の実施形態では、標的核酸配列は、癌に関連する可能性がある融合遺伝子の接合配列を含み得る。さらに別の実施形態では、標的核酸配列は、ヒト及び動物の疾患の誘発に関与する可能性がある微生物の特異的なクローン又は株を含む微生物に由来し得る。
本発明の方法はまた、試料中の標的核酸配列の量を定量的に決定するのに適している。本発明の好ましい実施形態では、標的核酸配列の定量は、ＬＡＭＰアッセイの陽性時間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）に対して、そのような標的核酸配列の既知のコピー数（又は濃度）のグラフをプロットすることによって、標準曲線の生成を介して達成される。試験試料中の未知の標的コピー数（又は濃度）の定量は、未知の試料で測定された陽性時間に基づいて、標準曲線から推定することができる。
本発明の別の態様は、標的核酸配列のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）を検出するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、このセットは、第１のアウタープライマーＦ３、第２のアウタープライマーＢ３、第１のインナープライマーＦＩＰ、第２のインナープライマーＢＩＰ、第１のループプライマーＬＦ、第２のループプライマーＬＢ及び１つの核酸プローブからなり、これらはいずれも、本発明の方法に関して上記で定義した通りである。
ＬＦループプライマー又はＬＢループプライマーのいずれか（ＬＢが存在する場合）が、その５’末端で少なくとも１つのアクセプターフルオロフォアにより標識され、核酸プローブはその３’末端で少なくとも１つのドナーフルオロフォアにより標識される。
フェルスター共鳴エネルギー移動が起こるための必要条件は、ドナーフルオロフォアの発光スペクトルがアクセプターフルオロフォアの吸収スペクトルと重なり、その結果、ドナーフルオロフォアの低波長光による励起の後に、励起エネルギーのアクセプターフルオロフォアへの移動が続くことである。
本発明では、ドナー又はアクセプターフルオロフォアのいずれかとして機能することができる多くの分子が存在する。
好ましい実施形態によれば、ドナーフルオロフォアは、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ａｌｅｘａ５５５、ＡＴＴＯ５５０、Ｃｙ３、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、Ｃｙ３、ＮＥＤ、Ｑｕａｓａｒ ５７０、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、ＴＡＭＲＡからなる群から選択され、及び／又はアクセプターフルオロフォアは、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、Ａｌｅｘａ ６４７、ＲＯＸ、ＬＣ ｒｅｄ ６１０、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、ＬＣ ｒｅｄ ６４０、ＬＣ ｒｅｄ ６７０、Ｑｕａｓａｒ ６７０、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、ＬＣ ｒｅｄ ７０５からなる群から選択される。
ドナー／アクセプター対ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＡＴＴＯ６４７Ｎが特に好ましい。
さらに別の実施形態では、核酸プローブ及び／又はループプライマーは、２つ以上のフルオロフォア、好ましくは２つのフルオロフォアにより標識される。
最も好ましい実施形態では、ＦＲＥＴドナー／アクセプター対は、それぞれ２つのＢＯＤＩＰＹ ＦＬフルオロフォアと１つのＡＴＴＯ６４７Ｎフルオロフォアからなる。本発明に適した好適なドナー／アクセプターフルオロフォア対の選択は、十分に当業者の知識の範囲内である。
上記のように、本発明のさらなる態様は、標的核酸配列のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）を検出するためのキットであり、該キットは、上記で定義したオリゴヌクレオチドのセット、ならびに鎖置換活性を有する１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、Ｂｓｔラージフラグメントポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０、Ｂｓｔ３．０、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）、Φ２９ファージ、ＭＳ－２ファージ、Ｚ－Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウフラグメント、ＧｓｐＳＳＤ、ＧｓｐＦ、ＯｍｎｉＡｍｐ Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ、ＳＤ Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。最も好ましいＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔラージフラグメントポリメラーゼである。
図１Ａは、ＦＲＥＴアッセイ検出工程で使用されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを詳細に示すために、１つのループ末端が拡大されたＬＡＭＰの中間産物を示す。図１Ｂは、ＦＲＥＴアッセイ検出工程で使用されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを詳細に示すために、１つのループ末端が拡大されたＬＡＭＰ中間産物を示す。 試験中の各ＬＡＭＰ法による希釈試料について生成された閾値時間の比較分析を示す。 （Ａ）本発明のＬＡＭＰ法及び（Ｂ）ＣｈｏｕらによるＬＡＭＰアッセイの両方について、コピー数／μＬで表したプラスミド核酸標的の濃度に対して閾値時間（分で示す）をプロットする。この図は、相関係数（Ｒ２）＝０．９９及び傾き＝－７．２が回帰直線について計算されたことから、本発明の方法が優れた直線性を提供することを示している。 （Ａ）本発明のＬＡＭＰ法及び（Ｂ）インターカレーティング色素アッセイの両方について、コピー／ｕＬで表したプラスミド核酸標的の濃度に対してプロットされた閾値時間（分で示す）を示す。
以下の実験セクションは、単に説明のために提供され、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実験セクション
例１－本発明のＬＡＭＰ法とＣｈｏｕらのＬＡＭＰアッセイとの比較
試料調製
Ｃｈｏｕらに記載のＬＡＭＰアッセイと本発明のＬＡＭＰ法とを比較するために、好適な標的核酸配列を調製した。要約すると、Ｓｆｉ Ｉ／Ｓｆｉ Ｉ制限部位の組合せを用いて、ｐＭＡ－Ｔベクター（ＧＥＮＥＡＲＴ）に、白斑症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）ゲノム（ｎｔ２２６６８１－２２７９３４、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ３３２０９３．１）由来の３５０ｂｐのＤＮＡ断片をクローニングして、陽性対照を得た。組換えＷＳＳＶプラスミドについて、約２×１０６コピー／μＬ～２×１０１コピー／μＬの範囲の１０倍希釈系列を調製した。
希釈液としてＴｒｉｓ－ＨＣｌ １０ｍＭ、ｐＨ８．５単独、又はヒトゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ／μｌ）をさらに含有するこの緩衝液のいずれかを用いて、２つの異なるプラスミド希釈系列を調製した。
本試験では、分析したプラスミド希釈液を１００℃で１０分間変性させた。変性後、プラスミド試料を直ちに氷上に１０分間置いた。
ＬＡＭＰ反応
比較分析に用いたＬＡＭＰオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブをＣｈｏｕらに記載されているように設計し、以下の表１に列挙する。
Figure 0007023229000001
表１に、Ｃｈｏｕらによるアッセイに使用されるオリゴヌクレオチドの完全なセットを記載する。本発明のＬＡＭＰ法に使用されるオリゴヌクレオチドのセットは、以下の特徴について、Ｃｈｏｕらが設定したオリゴヌクレオチドとは異なる。
１）１つの単一の核酸プローブ、すなわち、その３’末端がフルオレセインにより標識されているＬＣＦを含有し、
２）ループプライマーＬｏｏｐＢを含まず、後者は、その５’末端が蛍光部分ＬＣ６４０により標識されたＬＣＱプライマーに置換される。上記に照らして、Ｃｈｏｕらによる方法は、標識されたドナープローブと標識されたアクセプタープローブとの間のＦＲＥＴ機構による蛍光増幅シグナルの生成を提供する。逆に、本発明による方法では、アクセプターオリゴヌクレオチドの機能は、予め標識されたループプライマーの１つによって行われ、それによってＬＡＭＰ反応に用いられるオリゴヌクレオチドの数が減少する。さらに、本発明の方法は、同じ標的ヌクレオチド配列への結合に関して、前記アッセイに使用されるＦＲＥＴプローブと、ループプライマーとが競合する可能性があるというＣｈｏｕらによるアッセイに伴う欠点を克服する。
本試験では、以下のプライマー濃度をＬＡＭＰ反応に用いた：０．３７５μＭのアウタープライマー（Ｆ３及びＢ３）、２μＭのインナープライマー（ＦＩＰ及びＢＩＰ）、１．１μＭのループプライマーＬｏｏｐＦ、０．３μＭのループプライマーＬｏｏｐＢ（Ｃｈｏｕらによる反応にのみ存在する）、０．２５μＭのＬＣＦ及びＬＣＱ
ＬＡＭＰ反応は、０．３７５ｍＭのｄＮＴＰ、２．４ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、１×反応緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９、２０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）を含有する２０μｌ混合物中で行った。
Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ装置（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、反応混合物を６０℃で１２０分間インキュベートした。次に増幅産物を４℃に保った。
反応中に生成された正規化された蛍光シグナルの分析によって、組換えＷＳＳＶプラスミドのＬＡＭＰ増幅を検出した。閾値時間は、蛍光増分の約５０％に対応する０．２に蛍光閾値を設定することによって同定した。
データ分析及び正規化
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ内の統計パッケージを使用してデータ分析を行った。同じパッケージを線形回帰分析に使用した。
Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｐｕｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｖ２．１ソフトウェアを用いてデータの正規化を行った。
例２－本発明のＬＡＭＰ法とインターカレーティング色素ベースのＬＡＭＰアッセイとの比較
試料調製
インターカレーティング色素の使用を含むＬＡＭＰアッセイと本発明の方法の性能を比較するために、好適な標的核酸配列を調製した。要約すると、Ｓｆｉ Ｉ／Ｓｆｉ Ｉ制限部位の組合せを用いて、ｐＭＡ－Ｔベクター（ＧＥＮＥＡＲＴ）に、ＭＹＨ１１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ１０６６７．１）由来の３５０ｂｐのＤＮＡ断片をクローニングして、陽性対照を得た。
約２×１０６コピー／μＬから２×１０１コピー／μＬまで、緩衝液Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １０ｍＭ、ｐＨ８．５中で組換えＭＹＨ１１プラスミドを１０倍段階希釈した。
本試験では、分析したプラスミド希釈液を１００℃で１０分間変性させた。変性後、プラスミド試料を直ちに氷上に１０分間置いた。
ＬＡＭＰ反応
以下の表２に、比較分析に使用されたＬＡＭＰオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを列挙する。
Figure 0007023229000002
本発明の方法によるＬＡＭＰ反応では、以下のオリゴヌクレオチド濃度を使用した：０．０５μＭのアウタープライマー（Ｆ３及びＢ３）、０．４μＭのインナープライマー（ＦＩＰ及びＢＩＰ）、０．２μＭのアクセプターＬＢループプライマー及び０．２μＭのドナーＦＲＥＴプローブ。逆に、インターカレーティング色素ベースのＬＡＭＰアッセイに用いたオリゴヌクレオチドのセットには、上記のアウタープライマー及びインナープライマーの他に、標識されていない形態のＬＢループプライマーのみを含めた。
ＬＡＭＰ反応は、１．４ｍＭのｄＮＴＰ、８ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、１×反応緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３０ｍＭのＫＣｌ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）を含有する２５μｌ混合物中で行った。
インターカレーティング色素ベースのＬＡＭＰアッセイのために調整された反応混合物には、１μＭの濃度でＹＯ－ＰＲＯインターカレーティング色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をさらに含めた。
Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ装置（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、６５℃で４０分間ＬＡＭＰ増幅反応を行った。次に増幅産物を４℃に保った。
反応中に生成された正規化された蛍光シグナルの分析によって、組換えＭＹＨ１１プラスミドのＬＡＭＰ増幅を検出した。閾値時間は、蛍光増分の約５０％に対応する０．２に蛍光閾値を設定することによって同定した。
データ分析及び正規化
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ内の統計パッケージを使用してデータ分析を行った。同じパッケージを線形回帰分析に使用した。
Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｐｕｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｖ２．１ソフトウェアを用いてデータの正規化を行った。

Claims (5)

  1. 標的核酸配列のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）を検出する方法であって、該方法が、
    ｉ）前記標的核酸配列を含有する可能性がある試験試料と、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、以下のａ、ｂ、ｃ及びｄからなるオリゴヌクレオチドのセットとを接触させる工程；
    ａ．第１のアウタープライマーＦ３及び第２のアウタープライマーＢ３、
    ｂ．第１のインナープライマーＦＩＰ及び第２のインナープライマーＢＩＰ、
    （ここで、ＦＩＰは３’核酸配列Ｆ２及び５’核酸配列Ｆ１ｃからなり、ＢＩＰは３’核酸配列Ｂ２及び５’核酸配列Ｂ１ｃからなり、
    Ｆ２は前記標的核酸配列のＦ２ｃ領域に相補的であり、かつＢ２は前記標的核酸配列のＢ２ｃ領域に相補的であり、
    Ｆ２ｃ及びＢ２ｃは、前記標的核酸配列の反対側の鎖上に位置する非重複領域である。）
    ｃ．前記標的核酸配列のそれぞれの領域にハイブリダイズすることができる第１のループプライマーＬＦ及び場合により第２のループプライマーＬＢ、
    （ここで前記ループプライマーＬＦ又は存在する場合前記ループプライマーＬＢのいずれかは、その５’末端が少なくとも１つのアクセプターフルオロフォアにより標識されている。）
    ｄ．前記標識されたＬＦ又はＬＢループプライマーに対して５’の位置で前記標的核酸配列にハイブリダイズすることができ、その結果、核酸プローブが前記標的核酸配列にハイブリダイズした際に、ループ介在等温増幅の間、前記標識されたＬＦ又はＬＢループプライマーの前記５’末端に、前記核酸プローブの前記３’末端を近接させる１つの核酸プローブ
    （ここで前記核酸プローブは、前記ＬＦ又はＬＢループプライマーの前記少なくとも１つのアクセプターフルオロフォアに励起エネルギーを伝達することができる少なくとも１つのドナーフルオロフォアにより、その３’末端が標識され、前記アクセプターフルオロフォアの蛍光発光の強度が前記ドナーフルオロフォア励起エネルギーの吸収時に増加する。）、並びに
    ｉｉ）前記標的核酸配列のＬＡＭＰ増幅の指標として蛍光パラメーターの変化を検出する工程を含み、前記蛍光パラメーターの前記変化は前記アクセプターフルオロフォアの前記蛍光発光の強度の増加である、上記方法。
  2. 前記核酸プローブの前記３’末端が、前記標的核酸配列にハイブリダイズした際に、前記標識されたＬＦ又はＬＢループプライマーの前記５’末端から６ヌクレオチド以下、好ましくは１ヌクレオチド以下、さらに好ましくは０ヌクレオチド離れている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記標識されたＬＦ又はＬＢループプライマーが、ｉ）前記標的核酸配列の前記それぞれの領域を選択的に認識及びハイブリダイズすることができる中心ループ配列、並びにｉｉ）二本鎖ステムを形成するように互いに相補的である５’末端配列及び３’末端配列を含むステムループ伸長可能プライマーである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記標的核酸配列が、好ましくは点変異、欠失、挿入又は転座から選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記標的核酸配列の増幅が、前記少なくとも１つの変異の存在又は非存在を示す、請求項４に記載の方法。
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