CN105574357B - 一种生物标记物的功能验证芯片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物标记物的功能验证芯片的制备方法，其特征在于包括：a.选择一个或多个候选生物标记物列表；b.预测一个或多个候选生物标记物列表的功能，并合并所预测的功能，产生最终的需验证的功能列表；C.产生生物标记物功能验证芯片，包括针对最终功能列表的生物标记物。本发明提供了提供的方法，可以快速、系统地评价特定的生物标记物的生物学功能，可以快速优先排序和解释高通量研究结果。

Description

一种生物标记物的功能验证芯片的制备方法

技术领域

本发明涉及计算机辅助软件系统，特别涉及生物标记物的功能验证芯片的制备方法。

背景技术

新兴的个性化医学的概念，如精准医学，已经被人们很好地接受。个性化医学需要使用生物标记物来判定哪种治疗是对特定病人最好的。为了能够识别出潜在的生物标记物，科学家使用高通量的方法。

二代测序(NGS)的发展和其他高通量检测技术生成了前所未有的大量原始数据。而分析这些原始数据产生了大量的结果，这对很快确定这些结果的生物学意义带来了巨大的挑战。传统生物学标记物研究的概念已经遭遇到了瓶颈。

由于对高通量研究数据的低效探索，使得大量的工作浪费在了生物标记物研究。因此，挑战不在于高通量技术，而是如何从大量的结果中选择有希望的候选者并确定所选生物标记物的功能，进而对生物标记物的进一步研究进行调整。

以往的发明注重于对高通量技术本身的确证，而不是生物标记记物的功能验证。例如，发明(公开号：wo2013/138727A1，标题为：生物标记物验证的方法、试剂盒和芯片及临床使用)提供了使用qPCR芯片来验证芯片结果的方法。然而，在生物标记物的发展进程中，仅仅验证了高通量研究的技术是不足够的。最关键的一步是了解生物标记物的生物学功能及相关分子及细胞机制。因此需要在生物体系中对生物标记物进行功能验证。因此，需要系统解决方案来满足对生物标记物的快速功能验证，尤其是对新发现的遗传变化，如基因突变。

在生物标记物的研究中使用了一些平台，例如NGS，qPCR，ELISA。那些在使用中的平台并不提供一个系统的方法来预测和验证功能。功能基因组学运用siRNA以及质粒库对基因的功能进行筛选，但这些功能基因组学研究都不运用功能预测来规划实验，因此花费大量的时间和资金来产生并不需要的数据。进一步说，那些使用这些平台的人员大多不使用知识数据库的预测和选择所要验证的功能，从而限制了为进一步研究选择出最佳生物标记物的潜力。

发明内容

针对以上缺陷，本发明目的是如何提供一个解决方案，能快速验证由高通量研究产生的可预测的生物标记物功能。

为了实现上述目的，本发明提供了一种生物标记物的功能验证芯片的制备方法，其特征在于包括：

a.选择一个或多个候选生物标记物列表；

b.预测一个或多个候选生物标记物列表的功能，并合并所预测的功能，产生最终的需验证的功能列表；

c.产生生物标记物功能验证芯片，包括针对最终功能列表的生物标记物。

所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法，其特征在于所述一个或多个候选药物列表是从分析一个或多个高通量研究而得出。

所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法，其特征在于所述的一个或多个候选药物列表是基于一个或多个研究兴趣、临床实用、药物反应、种类和质量进行选择而得出。

所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法，其特征在于所述的预测包括分析，所述的分析是用一个或多个包含了启动子分析、5’UTR分析、通路分析、相互作用网络分析、上游分析和文献挖掘的方法来进行。

所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法，其特征在于功能验证芯片，包括功能干预芯片和功能检测芯片，以及使用功能验证芯片的协议。

还公开了一种功能干预芯片，其特征在于所述的功能干预芯片由权利要求1所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法制成。

所述的功能干预芯片，其特征在于所述的功能干预芯片中每个明确的位置都对应于一个干预生物功能的试剂；所述的功能干预芯片是为了增加或减少任何一个mRNA的、miRNA、lncRNA,、蛋白、蛋白修饰，代谢产物和它们的组合；功能干预剂包括化学物质、siRNA、miRNA、质粒、蛋白、代谢产物和其组合。

还公开了一种功能检测芯片，其特征在于所述的功能干预芯片由权利要求1所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法制成。

所述的功能检测芯片，其特征在于在功能检测芯片中每一个明确的位置对应于一个用来检测生物功能的活性水平的试剂；其中功能检测芯片是为了分析任何一个mRNA、miRNA、lncRNA、蛋白、蛋白质修饰、代谢产物和它们的组合；其中检测包括定量PCR或基于免疫PCR的检测。

还公开了一种实现权利要求1所述制备方法的在线平台，其特征在于包括：

8.1一个界面，允许用户上传一个或多个候选生物标记物名单；

8.2一个预测系统，用来预测上传的候选生物标记物的功能并综合预测的功能以产出最终的需验证的功能列表；

8.3一个生成系统，用来产生生物标记物的功能验证芯片，包括针对最终的功能列表的验证试剂；

8.4一个在线数据分析系统，用以允许用户获得一个或多个通过上传和分析一个或多个高通量的研究数据而产生的候选生物标记物的名单。

所述的在线平台，其特征在于：

所述的在线数据分析系统，包括数据分析的流水线来执行一个或多个微芯片数据分析、RNA测序数据、全外显子测序数据、全基因组测序数据、蛋白质组学数据、代谢组学数据；

所述的预测系统，包括功能预测算法，该算法包括DNA、RNA和蛋白质的序列和结构分析、通路分析、相互作用网络分析、上游调节因子分析。

所述的在线平台，其特征在于：系统可用于产生生物标记物的功能验证芯片，进一步包括至少一个功能验证试剂的文库、一个液体处理仪器将选定的功能验证试剂分配到芯片中。

本发明提供了提供的方法，可以快速、系统地评价特定的生物制剂的生物学功能，如生物标记物，可以快速优先排序和解释高通量研究结果。

附图说明

图1是生物标记物的功能验证芯片的制备方法框图；

图2是制备和使用功能干预芯片的示例框图；

图3是制备和使用检测芯片的示例框图；

图4是在线平台示例框图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本说明书中，一般来说，术语“大约”用在本文中通20％的方差来修改设定数值的上下界的；所用的“制剂”是指可能对生物系统产生影响的任何材料，通常情况下，制剂是指化学品、基因、蛋白质、多肽、抗体、细胞、基因产物、酶、激素；所用的“生物标记物”指的是可提供存在信息和/或疾病严重性或病人的损伤情况的可测量的特性；与某种生物通路的关系；某种药效关系或者产出；某种结合诊断；某一特定的种系；或者某种生物样本的质量。生物标记物的示例包括基因、蛋白质、多肽、抗体、细胞、基因产物、酶、激素等；除非特别说明，本文中的技术科学术语的含义与具有本申请涉及到的领域技能的人的常规理解一致。本文中的参考采用了不同的方法和材料，这些方法和材料被具有该领域一般技能的人所熟知。

自从二代测序(NGS)、微芯片技术和其他分子表达谱可用于临床样本，在文献中已经报道了数千种疾病相关的生物标记物。然而，这些生物标记物的功能通常不好理解，这限制了其进一步开发。

尽管生物信息学分析，如基因本体论和通路分析能够预测一系列的标记物的功能，这些预测倾向于假阳性。学术研究和临床医生均不能依靠生物标记物的预测功能来做出知情决策。现有的生物标记物的功能验证是低输出量的，无法满足来源于NGS、微芯片和其他高输出量研究的迅速增加的结果。因此，迫切需要一个解决方案，能快速验证由高通量研究产生的可预测的生物标记物功能。

一个被提出的主要方案是：功能的验证用一种微孔板或qPCR板格式的芯片进行，这使得大多数生物医学实验室的都能够方便使用，从而大大提高功能验证的效率。虽然使用qPCR检测来验证NGS或微芯片结果的概念已被文献证明，大量的验证生物标记物的功能，特别是与指导生物资讯功能性预测相关，还没有得到证实。

本发明还提供了一套功能预测算法，可引导qPCR芯片用户验证功能面板和最终产生一种符合进一步发展标准的生物标记物。

常规的功能基因组学筛选通常耗时耗力，需要昂贵的机器人以及专业人士，所取得的大量数据也需要专业的生物信息学人员处理，不是常规的生物医学实验室能够开展。利用功能预测事先筛选感兴趣的功能，再对此预测得到的功能进行验证，能够有效将功能验证的实验规模缩小到一个常规生物医学实验室能处理的大小，从而从整体上提升整个科研界的科学发现的速度。

分子检测方法如ELISA和实时聚合酶链反应(PCR)广泛应用于生物医学实验室。对照对于监测样本间的输入差异至关重要，这样使他们可以公平地比较。对照也可以帮助识别和最小化系统的变化。选择了错误的对照是文献中发表了错误的“生物标记物”验证的一个原因。监测试验质量本身的关键性对照长在发表的文章中被忽略，没有关键性对照则试验的系统性变化不能在数据进行对比前被校正。本发明提供了一种描述如何选择正确的多种功能验证芯片的对照。

预测的生物标记物的功能是在一个更实际的实验平台来验证，如ELISA、PCR、免疫PCR平台，为了进一步发展而被接受和调整，或用于辅助临床实践。不幸的是，几乎所有的“生物标记”都停留在探索阶段，没有机会看到其在临床上的实际使用，部分是因为生物标记物的功能还不是很清楚。

图1是生物标记物的功能验证芯片的制备方法：1)选择一个或多个候选药物列表，或者选择一个或多个生物标记物列表，这是来自高通量研究的数据，来自于分析原始数据和用户提供的生物标记物；2)功能预测所选的一个或多个候选列表的功能，包括通路分析，相互作用网络分析、上游分析、蛋白质结构分析和启动子分析；3)选择一个或多个需要验证的功能并生成带有优化实验设计及适当对照的功能验证芯片；4)提供配套的算法，并在研究中完成功能验证板和生成每个功能的概率得分(影响通路，表型或疾病状态的能力)下。

功能验证芯片，文中描述的包括两大类：1)功能干预芯片和2)功能检测芯片。

功能干预芯片使用一个或多个功能干预剂来扰乱一个或多个功能，从而来评估这些功能对某一预选功能的影响。功能干预芯片有助于理解功能的相互作用，如药物*药物、基因*药物、基因*基因的相互作用，或任何生物活性物质的相互作用。

功能干预芯片是一种预分配的功能干预剂，其被干燥后放置于板上。芯片中每个确定的位置都对应于一个生物标记物(激酶或任何活性物质)。功能干预剂可能是一种化学，蛋白质，siRNA，miRNA，质粒和激素。检测可以通过报告系统，如细胞计数或引入的报告基因，取决于进行测试的功能。

功能检测芯片使用功能检测剂来检测由一个或多个生物活性物质引起的改变的功能变化。

功能干预芯片是一种预分配的功能干预剂，其被干燥后放置于板上。芯片中每个确定的位置都对应于一个生物标记物。在使用qPCR来检测功能的情况下，标记物是一种基因或核酸分子。qPCR检测是通过使用适当的反应混合物及生物和病理标本(如从总RNA反转录的cDNA)。

本发明还提供了一个包括独特的对照的系统。在生物学实验中的一个关键问题是对照。任何给定基因的表达和功能可以收到组织类型的影响、疾病状态、样品收集和储存条件的影响。即使是一些常见的管家基因可以被疾病的情况所改变。采用一组精心挑选的标准化对照，其能更好地正确对照每个检测中的组织样品用量，允许对某些基因的表达进行准确的比较，这些也在本发明中提供。对照面板还包括为了检测质量对照，以帮助确定任何影响的生物标记物的功能评价的条件。

功能干预剂可以是化学，siRNA，miRNA，质粒或其它生物活性物质。这些功能干预剂具有不同的性质并需要不同的输送方式以达到优化效果。对照保证输送效率。化学品可能具有不同的溶解度，因此具有相似的溶解度化学将被分配到相同的芯片和对照溶剂将用作阴性对照。至于siRNA/miRNA，其需要转染试剂如脂质体将小分子引入细胞，荧光分子染色的对照siRNA或miRNA的将用作转染对照。质粒也需要转染试剂进入细胞，表达荧光蛋白的质粒可以作为一种输送对照。

功能检测剂可以是基于PCR的核酸检测或蛋白检测(免疫PCR)，或基于抗体的蛋白质检测(ELISA或免疫印迹法)。在功能检测芯片中，阴性对照没有检测制剂。针对看家基因的检测制剂，如β-肌动蛋白，将作为阳性对照以及标准化对照。

如果96/384板用来生产功能验证芯片(功能干预芯片或功能检测芯片)，最好是两个芯片在相同的96/384板上进行设计来最小化板对板的变化。

还提供了一个在线平台，该系统包括生物标记物的功能验证解决方案，可使客户分析他们的高通量研究产生的数据、预测功能、生成他们的功能验证芯片并分析验证结果以选择进一步研究的最佳焦点。

它还提供了一个排名系统，可以基于重要性来对用作生物标记物的预测的功能进行排名(例如一个特定的表型或疾病的重要性)。

方法聚焦于定量分子检测工具，可系统地验证生物标记物的功能，并运用合适的对照物。

还提供了基于生物信息学工具的选择预期功能的方法，包括文献挖掘。

为了研究主题和研究课题，以及数据质量和样本分组，公共的高通量分析数据集被进行了生物学的、临床的和统计学分析。

有明确的研究课题和高质量的高通量分析的数据集的可被加工成标准，该标准可以结合/比较及输入到生物信息学模型系统。

加工后的高通量分析数据用得到确认的统计学模型系统5进行了分析和排名，如t检验、方差分析、生存测试、联合检验、回归模型。

研究主题包括疾病分类、治疗反应的预测或通路的激活/抑制。本研究课题被用来在发布的数据库中挖掘文献，以便选择最重要的、研究表明作为标记在明确的主题中发挥重要作用的目标。所有感兴趣的目标是基于生物标记物的相关重要性来排序。

选择的功能是通过将单独的列表放在一起的方式进行组合，或用各种不同的排名的组合重新排序。一个最终名单{如96孔或384孔，取决于格式)是通过把所有最重要的预测功能综合在一起而生成的。

功能验证芯片，包含了功能干预芯片和功能检测芯片。

至于功能干预芯片、预分配和干燥的功能干预剂，每个都在芯片中一个明确的位置上，该芯片侧重于经过良好分析和选择的生物标记物(一个基因或任何分子)。不同处理的样品被分配到每个位置来培育功能干预剂。检测是通过预定义的读出来进行。在使用细胞活力作为读出的情况下，WST-1试剂被添加到每个位置来测量活细胞。在荧光素酶报告基因中，检测荧光素酶活性的试剂将被使用。

在基于qPCR的功能检测芯片中，预分配和干燥的PCR引物，每个都在芯片中一个明确的位置上，该芯片侧重于经过良好分析和选择的生物标记物(一个基因或任何核酸分子)。检测可以通过使用适当反应混合物及生物和病理标本的qPCR(如来自总RNA反转录的cDNA)来进行。

为了达到工业标准的敏感度、特异性和效率，对选定目标的检测进行设计并测试。检测测试是具体的、与输入的变化具有良好相关性并低信号检测足够敏感。

还提供了一种包括一个功能预测平台的系统，该平台允许客户对他们的候选名单进行在线功预测能并选择功能进行验证。该平台允许客户订购功能验证芯片来验证预测的功能。这里所公开的系统提供质量控制分析来帮助客户评估功能验证试验的质量、样品的质量和潜在的异常值。

这里所公开的系统提供了一个排名系统。当选择这些功能为与功能相关的目标时，可以根据它们的重要性来对功能进行排名(例如多个预测出现的频率)。

在实施中，高通量的基因表达数据集是在研究兴趣、研究目标、种系和质量的基础上进行进行选择。

选定的数据集进行标准化处理，然后通过t检验、方差分析、关联分析进行分析，从而生成候选名单。从功能分析中得到的排名考前的目标相结合，以产生一系列的预测功能。为了技术的敏感性、特异性和动态范围，对所有候选目标的功能检测试验进行设计和测试。

添加适当的规范化对照检测和性能对照使最后的功能验证试验得以完成。

图2是制备和使用功能干预芯片的示例框图，显示了制备和使用功能的功能干预芯片的一个例子。在这个例子中，使用了96孔板，并且芯片在相同的板上来最小化板到板的变化。研究者尝试：1)建立了一个实验系统，其允许进一步功能干预；确定读出的结果；样品收集和分配到功能干预芯片，然后2)孵化和测量指定的信号，3)显示数据分析门户：

A.检测信号标准化，并有基于研究者的样本来选择的最终标准化对照；

B.对于两个或多个样品之间的差异进行的目标功能的排名。

图3是制备和使用检测芯片的示例框图，显示了制备和使用功能检测芯片的一个例子。在这个例子中，使用了96孔板，并且芯片在相同的板上来最小化板到板的变化。研究者尝试：1)建立了一个实验系统，收集和处理样品，使其适合于检测和分配到功能检测芯片，然后2)孵化和测量指定的信号，3)显示数据分析门户：

A.检测信号标准化，并有基于研究者的样本来选择的最终标准化对照，

B.对于两个或多个样品之间的差异进行的目标功能的排名。

图4是在线平台示例框图显示了在线平台制备功能验证芯片的实例。在该例中，系统提供了一个界面以允许研究人员直接上传一个或多个候选名单，或允许研究上传高通量研究的数据，以通过分析获得一个或更多候选剂名单。在线系统允许研究人员预测候选剂的功能并要验证的选择功能。在线系统将控制一个液体处理器从功能验证剂实验室来接收功能扰剂或功能检测剂，并将其分配到芯片、适当的微孔板。

生物标记物的功能验证芯片的研制：

在实施中，提供了功能验证芯片的制备方法。相应地，这些方法包括从高通量研究的数据集中选择一个或多个候选制剂列表，通过一个或多个数学模型预测一个或多个候选制剂列表的功能，来产生预测功能、需验证的选择功能，生成功能验证芯片。通过干扰或检测所选择的功能，分别命名为功能干预芯片或功能检测芯片。

在实施例中，一个或多个高通量数据集(包括微芯片数据集和二代测序)进行选择，而这种选择是基于一个或更多临床实用性(如特定疾病的生物标记物)、研究兴趣(例如生物特异性通路的标记物)、药物反应(例如药效学生物标记物或伴随诊断标记物)、品种和质量。

在实施例中，分析包括与一个或更多的数学模型的数据集进行的分析，这些模型包括但不限于t检验、方差分析、相关分析。

在实施例中，功能分析包括使用两个，或更适当地，基于数据生成的预测功能和功能验证芯片。相应的，功能分析包括通路分析来预测蛋白质对蛋白质相互作用的影响，启动子分析来预测转录因子对基因启动子的影响或转录因子对下游基因的影响，5’UTR(非翻译区)分析来预测microRNA对翻译的影响或一个基因的mRNA稳定性，miRNA对潜在的目标的影响，或上游分析来预测一个既定系列基因的潜在的上游调控因子。

如本文所述，分析可以进一步包括文献挖掘来产生预测功能。这允许进一步的信息添加来澄清和定义所需的功能预测。

相应的，该方法进一步包括，为了在功能验证芯片中包含对照功能而选择一个或多个对照。如本文所述，正是这些对照剂的选择(即，在功能验证芯片或功能验证剂中不显示变化的药物，总是在功能验证芯片中表现出变化)，为本文中的方法和芯片提供了一个独特的试剂，从而产生最有用的芯片信息。

还提供了通过本文所述的方法制备的功能验证芯片。功能验证的芯片包括两大类：功能干预芯片和功能检测芯片。

对于功能干预芯片，芯片中每个确定的位置都是用来干扰一种生物学功能。在实施例中，功能干预芯片被设计为各种干预的功能，以观察这些干预功能对结果的影响。干预目标包括各种通路、酶、转录因子、细胞状态。

功能干预剂可以是任何生物活性物质，包括但不限于化学品、siRNA、miRNA、蛋白质、肽和激素。相应地，功能干预芯片可以是任何生物活性物质制成的的芯片。

为了其性能(包括功能干预剂的输送效率等)，设计好的功能干预测试通过其对照样品进行了评估。

在基于化学的功能干预的情况下，试验性能的对照包括阴性对照，这是溶剂解决方案；及阳性对照，它们可以是可在荧光显微镜或酶标仪下监测的荧光化学物质。

在siRNA/miRNA/质粒为基础的功能干预的情况下，检测性能对照包括阴性对照，它们仅为转染剂；及转染对照，其采用荧光标记的siRNA/miRNA或表达质粒的GFP。

对于功能检测芯片，芯片中每个确定的位置都用来检测一种生物功能。

在实施例中，功能检测芯片被设计用来检测各种功能，包括对各种通路、表型的影响，例如，用于细胞周期对照的分析，对表皮生长因子通路的分析，对细胞死亡的分析等，以及它们的组合。

然后该方法进一步包括给功能检测设定一个单一概率得分。即，一个单一数值被赋予检测，该检测可用于确定检测水平是否表明测量/预期结果。某一被检测的功能的“临界”值，低于或高于这一值，被检测功能的出现具有决定性，可适当地延伸这一数值，即按照要求上延或下延。

如文中所述，可验证的功能的重点是可根据市场需求、客户要求、合作等进行选择。

高通量的研究是基于主题的选择(从公共数据库或合作或客户自己的数据)。数据被标准化处理并下载适当的注释文件。标准化的数据用于进行分析。t检验、方差分析、相关分析是用来识别相关基因并产生一个独立的列表。所有的列表是根据每个基因在该列表中的排名每个列表中的进行综合。

文献挖掘是用来寻找被广泛接受的、认可的具有类似功能的生物标记物并被添加到功能列表。

在定量PCR为基础的检测的情况下，为了试验设计靶基因序列被投入一个引物设计工具。探针被设计，且围绕每个探针的设计一个PCR引物对也被设计。相应的，一套实验设计包括一对引物和探针。

设计好的功能性检测法用对照样品的性能进行评估(包括灵敏度、特异性、效率等)。

在mRNA水平的功能检测，如RT-qPCR，试验性能对照包括基因组DNA的污染对照、反转录效率对照和定量PCR性能对照，这样有助于任何低质量数据的识别。

在蛋白水平的功能检测，如免疫PCR、ELISA、免疫印迹，为了标准化和背景对照(一个免除了溶剂对照解决方案、没有任何功能检测剂的位置)，芯片对照包括内部对照(如管家基因β-肌动蛋白)

生物标记物功能验证芯片的使用:

功能干预芯片对检测多个功能干预剂对特定功能的影响有用。对于功能干预芯片，一个活的模型系统，如细胞，将被分配到芯片中以允许通过芯片中的分配剂进行进一步的功能干预。在使用细胞的情况下，两种类型的细胞将从同一母细胞中产生，一个是对照，另一个将被引进一种生物标记物或功能报告物。对照和处理的细胞被分配到两个完全相同的芯片以通过功能干预剂进行孵育。相应的，两个相同的芯片是在相同的96/384孔板上。功能干预后，受影响的功能将用一个预定的报告物进行检测。

对于功能检测芯片，多功能检测将被执行。一个活的模型系统将被采用。在使用细胞的情况下，两种类型的细胞将从同一母细胞中产生。一个是对照，另一个将被引进一种生物标记物。细胞裂解液将通过芯片上的检测剂得到和孵育。检测将由一个统一的反应来进行，如PCR，辣根过氧化物酶(HRP)的显色反应。

对于一个具有相关领域常规技能的人而言，很明显，在不背离实施方案的范围前提下，本文所描述的方法或者应用的修改和适应是很容易实现。同时也很容易理解，当在本文中已经阐明和描述的某些实施例中，权利申明并不仅限于本文所描述和展示的特定形式或者安排。在规范中，已经有公开的说明性实施例中，即便使用了特定的术语，虽然具体的术语，也仅是用于方便类别或者描述的易于理解，并非为了对目标进行限定。基于上述教学，对实施例的修改和变化是可能的。因此，容易理解的是实施例是可以在本文描述以外的范畴进行实践的。

以上所揭露的仅为本发明一种实施例而已，当然不能以此来限定本之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种生物标记物的功能验证芯片的制备方法，其特征在于包括：

a.选择一个或多个候选生物标记物列表，这是来自高通量研究的数据，来自于分析原始数据和用户提供的生物标记物；

b.预测一个或多个候选生物标记物列表的功能，并合并所预测的功能，产生最终的需验证的功能列表，功能预测所选的一个或多个候选列表的功能，包括通路分析，相互作用网络分析、上游分析、蛋白质结构分析和启动子分析；

c.选择一个或多个需要验证的功能并生成带有优化实验设计及适当对照的功能验证芯片；产生生物标记物功能验证芯片，包括针对最终功能列表的生物标记物；

d.所述的预测包括分析，所述的分析是用一个或多个包含了启动子分析、5’UTR分析、通路分析、相互作用网络分析、上游分析和文献挖掘的方法来进行。

2.根据权利要求1所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法，其特征在于所述的一个或多个候选生物标记物列表是基于一个或多个研究兴趣、临床实用、药物反应、种类和质量进行选择而得出。

3.根据权利要求1所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法，其特征在于功能验证芯片，包括功能干预芯片和功能检测芯片，以及使用功能验证芯片的协议。

4.一种功能干预芯片，其特征在于所述的功能干预芯片由权利要求1所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法制成。

5.根据权利要求4所述的功能干预芯片，其特征在于所述的功能干预芯片中每个明确的位置都对应于一个干预生物功能的试剂；所述的功能干预芯片是为了增加或减少任何一个mRNA的、miRNA、IncRNA、蛋白、蛋白修饰，代谢产物和它们的组合；功能干预剂包括化学物质、siRNA、miRNA、质粒、蛋白、代谢产物和其组合。

6.一种功能检测芯片，其特征在于所述的功能干预芯片由权利要求1所述的生物标记物的功能验证芯片的制备方法制成。

7.根据权利要求6所述的功能检测芯片，其特征在于在功能检测芯片中每一个明确的位置对应于一个用来检测生物功能的活性水平的试剂；其中功能检测芯片是为了分析任何一个mRNA、miRNA、IncRNA、蛋白、蛋白质修饰、代谢产物和它们的组合；其中检测包括定量PCR或基于免疫PCR的检测。

8.一种实现权利要求1所述制备方法的在线平台，其特征在于包括：

8.1一个界面，允许用户上传一个或多个候选生物标记物名单；

8.2一个预测系统，用来预测上传的候选生物标记物的功能并综合预测的功能以产出最终的需验证的功能列表；

8.3一个生成系统，用来产生生物标记物的功能验证芯片，包括针对最终的功能列表的验证试剂；

8.4一个在线数据分析系统，用以允许用户获得一个或多个通过上传和分析一个或多个高通量的研究数据而产生的候选生物标记物的名单。

9.根据权利要求8所述的在线平台，其特征在于:

所述的在线数据分析系统，包括数据分析的流水线来执行一个或多个微芯片数据分析、RNA测序数据、全外显子测序数据、全基因组测序数据、蛋白质组学数据、代谢组学数据；

所述的预测系统，包括功能预测算法，该算法包括DNA、RNA和蛋白质的序列和结构分析、通路分析、相互作用网络分析、上游调节因子分析。

10.根据权利要求8所述的在线平台，其特征在于：系统可用于产生生物标记物的功能验证芯片，进一步包括至少一个功能验证试剂的文库、一个液体处理仪器将选定的功能验证试剂分配到芯片中。