KR102516307B1 - RNase H 효소 및 이의 항체를 포함하는, 표적 핵산 증폭용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

RNase H 효소 및 이의 항체를 포함하는, 표적 핵산 증폭용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 RNase H 효소 및 이의 일부 영역 또는 전부를 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되는 것인, 표적 핵산 증폭용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 표적 서열을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본원의 조성물 및 방법을 이용하면, RNAse H의 촉매 활성을 효율적으로 조절할 수 있으므로, 표적 핵산 서열 검출 및 증폭에 이용할 수 있다.

Description

RNase H 효소 및 이의 항체를 포함하는, 표적 핵산 증폭용 조성물 및 이의 용도 {A composition for amplifying target nucleic acid, including RNase H enzyme and antibody thereof, and use thereof}
본원은 RNase H 효소 및 이의 일부 영역 또는 전부를 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되는 것인, 표적 핵산 증폭용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 표적 서열을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서는 2019년 9월 23일에 한국특허청에 제출된 한국 특허 출원 제 10-2019-0116686 호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용 전부는 본 명세서에 포함된다.
유전자 발현을 연구하기 위하여 가장 널리 사용되는 기술 중 하나는 PCR 증폭을 위한 주형으로서 mRNA 서열(들)의 제1가닥 cDNA를 이용하는 것이다. 역전사 효소-PCR 기법과 조합된 PCR 반응의 동역학을 측정하는 능력은 필요한 수준의 민감도로 표적 RNA 서열의 정확하고 정밀한 측정을 촉진할 것을 보장한다. 특히, "CATACLEAVETM 엔도뉴클레아제 분석(미국 특허 제5,763,181호에 상세히 개시됨)과 같은 형광 이중-표지된 혼성화 프로브 기술은 실시간으로 역전사 효소-PCR 증폭의 검출을 가능하게 한다. 표적 서열의 검출은 증폭 반응에서 RNAse H와 함께 CATACLEAVETM프로브를 포함함으로써 이루어진다. 역전사 효소 - PCR 증폭 산물내의 표적 서열에 상보적인 CATACLEAVETM프로브는 RNA 서열 및 DNA 서열을 포함하는 키메라 구조를 갖고, 그의 5' 및 3' 말단이 검출가능한 마커, 예를 들어 FRET 쌍 표지된 DNA 서열이 존재한다. FRET 쌍의 형광 표지가 소광제(quencher)에 가까우면 온전한 프로브의 형광을 억제한다. 역전사 효소 - PCR 산물에 프로브를 어닐링하면 반응 혼합물에 존재하는 RNAse H에 의하여 절단될 수 있는 RNA: DNA 듀플렉스가 생성된다. 어닐링된 프로브의 RNA 부분 내의 절단은 소광제로부터 형광 표지를 분리시키고 뒤이어 형광의 방출을 초래한다.
본원은 RNase H 효소를 포함하는, 표적 핵산 증폭용 조성물로서, 상기 RNase H 효소는 서열 번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고, 상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되는 것인, 표적 핵산 증폭용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 표적 서열 증폭 및 검출하는 방법에 관한 것이다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제1측면은, RNase H 효소를 포함하는, 표적 핵산 증폭용 조성물로서, 상기 RNase H 효소는 서열 번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고, 상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되는 것인, 표적 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.
본원의 제2측면은, 표적 서열을 증폭하는 방법으로서, 하기를 포함하는 증폭 반응 혼합물을 제공하는 단계; 표적 DNA 서열을 포함하는 시료; DNA 폴리머라제와 RNase H 효소를 포함하는 조성물로서, 상기 RNase H 효소는 서열 번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고, 상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되고, 상기 RNase H 효소의 활성은 90℃ 이상의 온도에서 유도되고 열-유도성인 것인 조성물; 상기 표적 DNA 서열의 5' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제1 프라이머; 상기 표적 DNA 서열의 3' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머; 및 검출가능한 표지와 연결되고 상기 RNase H에 의하여 절단될 수 있는 위치를 갖는 프로브; 및 상기 증폭 반응 조성물로 하나 이상의 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 증폭 산물을 생성하는 단계, 및 수득된 증폭 산물의 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 증폭 반응은 90℃ 이상의 온도로 상기 반응 조성물을 가열하는 단계를 포함하는 것인, 표적 서열을 증폭하는 방법을 제공한다.
본원의 제3측면은, 시료에서 표적 RNA 서열을 검출하는 방법으로서, 하기를 포함하는 증폭 반응 조성물을 제공하는 단계; 표적 RNA 서열을 포함하는 시료, 역전사 효소, DNA 폴리머라제 및 RNase H 효소를 포함하는 조성물로서, 상기 RNase H 효소는 서열번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고, 상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되고, 상기 RNase H의 활성은 90℃ 이상의 온도에서 유도되고 열-유도성인 것인 조성물; 검출가능한 표지를 포함하고 상기 RNase H의 절단 서열을 포함하는 프로브 서열; 상기 표적 RNA 서열의 5' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제1프라이머; 및 상기 표적 RNA 서열의 3' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제2프라이머; RNA:cDNA 듀플렉스를 형성하기 위하여 표적 RNA의 역전사를 개시하는 단계; 90℃ 이상의 온도까지 상기 반응 조성물을 가열하고 그에 의해 RNA:cDNA 듀플렉스의 RNA 부분을 분해하기 위하여 상기 RNase H를 활성화시키는 단계; 하나 이상의 증폭 산물을 형성하기 위하여 하나 이상의 증폭 반응을 개시하는 단계, 및 수득된 증폭 산물의 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하는 것인, 표적 RNA 서열을 검출하는 방법을 제공한다.
본원의 RNase H 효소 및 상기 효소의 일부 영역에 대한 항체를 포함하는 표적 핵산 증폭용 조성물을 이용하면, RNAse H의 촉매 활성을 효율적으로 조절할 수 있으므로, 표적 핵산 서열 검출 및 증폭에 이용할 수 있다.
도 1은 5종류의 항체(Ab 1 내지 Ab 5) 부착시의 RNase H 효소의 활성도를 나타낸 도면이다.
도 2는 항체 Ab 5 항체 부착 후 활성유도 유무에 따른 RNase H 효소의 활성도를 나타낸 도면이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합(들)"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는 "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
본원은 시험 시료에서 핵산 서열의 개량된 CATACLEAVE 프로브 검출을 위하여 효소의 특정 항원결정기(epitope)를 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 조절된 '핫 스타트' RNAse H 효소 및 이를 포함하는 조성물이 개시된다. 상기 효소 조성물의 중요한 특징은 역전사-PCR 반응 중에 온도에 의해 항체의 결합여부가 결정됨에 따라, RNAse H의 촉매 활성을 조절하는 능력이다. 따라서, 상기의 RNAse H 활성은 역전사 전에 RNA:DNA 프라이머 헤테로듀플렉스의 분해를 최소화하기 위해서 처음에는 억제될 수 있다. cDNA 합성이 완료된 후에, RNAse H 활성이 유도되어 역전사 효소-PCR 산물 내의 표적 DNA 서열에 어닐링하는 CATACLEAVETM 프로브의 절단 및 형광 검출을 촉진한다. 상기 유도성 RNAse H 효소는 단일 반응 혼합물에서 1 단계 역전사 효소 CATACLEAVETM PCR을 필요로 하는 고속 대량 분석에 적합하다.
본원의 제1측면은, RNase H 효소를 포함하는, 표적 핵산 증폭용 조성물로서, 상기 RNase H 효소는 서열 번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고, 상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되는 것인, 표적 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 CataCleave™ 역전사 효소 PCR 반응에 사용하기 위한 변형된 열안정성 RNase H 효소일 수 있다.
본원 명세서에서 사용되는 용어 "RNase H" 또는 "RNase H 효소"는 RNA-DNA 하이브리드 중 RNA를 가수분해하는 효소로서, 송아지 흉선에서 처음 발견된 RNase H는 그 이후에 여러 생물에서 개시되었다. 사실, RNase H 활성은 진핵생물 및 박테리아에 편재한 것으로 보인다. RNase H는 다양한 분자량과 핵산 분해 활성을 갖는 단백질의 패밀리를 형성하나, 기질 요구성은 다양한 아형에 대하여 유사한 것으로 보인다. 예를 들어, 현재까지 연구된 대부분의 RNase H는 엔도뉴클레아제로서 기능하고 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는 절단 산물을 생성하기 위하여 2가 양이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+)을 요구한다.
본원이 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소의 활성은 90℃ 이상의 온도에서 유도되고 열-유도성인 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소의 활성은 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 110℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 유도되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 열-유도성으로서, 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 비활성화된 RNase H 효소가 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 110℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 활성이 유도되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 표적 핵산 증폭용 조성물은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 RNA H 효소에 상기 항체가 가역적으로 결합된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 피로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코시 (Pyrococcus horikoshi), 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 써머스 써모필러스 (Thermus thermophilus) 또는 대장균 (E. coli)으로부터 분리되는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 RNase H 효소는 피로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus)로부터 분리된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이며, 보다 구체적으로 상기 RNase H 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시된, Pfu(피로코커스 퓨리오서스) RNase HⅡ의 아미노산 서열(서열 번호 1)과 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 열안정성 RNAse H일 수 있다. 상동성은, 예를 들어 컴퓨터 프로그램 DNASIS-Mac (Takara Shuzo), 컴퓨터 알고리즘 FASTA (버전 3.0; Pearson, W. R. et al., Pro. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988) 또는 컴퓨터 알고리즘 BLAST (버전 2.0, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)을 이용하여 결정될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNAse H 효소는 서열번호 1의 5-20 (서열번호 11), 33-44 (서열번호 12), 132-150 (서열번호 13), 및 158-173 (서열번호 14) 위치에 상응하는 상동성 영역 1-4 중 하나 이상을 갖는 열안정성 RNAse H일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 서열 번호 11, 12, 13, 또는 14의 폴리펩티드 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 서열 상동성을 갖는 상동성 영역 중 하나 이상을 갖는 열안정성 RNAse H이다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "서열 상동성(sequence identity)"은 서열이 비교의 창에서 아미노산 대 아미노산 기준으로 동일하거나 기능적으로 또는 구조적으로 유사한 정도를 의미한다. 따라서, "서열 상동성의 백분율 (percentage of sequence identity)"은, 예를 들어, 비교의 창에서 두개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교하고, 일치된 위치의 갯수를 수득하기 위해 두 서열에서 동일한 아미노산이 나타나는 위치의 수를 결정하며, 비교의 창(즉 창의 크기)에서 위치들의 총 수에 의하여 상기 일치된 위치의 갯수를 나누고, 서열 상동성의 백분율을 수득하기 위해 그 결과에 100을 곱하는 것에 의해 계산될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 RNaseHII 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 상기 RNAse H 의 일부 영역, 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 변형된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 변형된 RNAse H 효소일 수 있으며, 구체적으로 상기 변형된 RNAse H 효소는 RNase H 효소의 일부 영역(구체적으로, 특정 항원결정기), 보다 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역에 결합하는 항체가 가역적으로 결합된 것일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "변형된 RNase H(modified RNase H)"는 RNase H의 엔도뉴클레아제 활성의 상실을 유발하는 억제 인자에 가역적으로 연결되거나 가역적으로 결합한 RNase H일 수 있다. RNase H로부터 억제 인자의 방출 또는 분리(decoupling)는 RNase H의 엔도뉴클레아제 활성의 완전한 또는 적어도 일부 활성을 회복시킨다. 온전한(intact) RNase H의 활성의 약 30 - 100%가 충분할 수 있다. 억제 인자는 리간드 또는 화학적 변형일 수 있다. 리간드는 항체, 앱타머, 수용체, 공동인자(cofactor) 또는 킬레이트제 일 수 있다. 리간드는 RNAse H 효소의 활성 부위에 결합할 수 있고 이에 의해 효소 활성을 저해할 수 있거나 또는 RNAse의 활성 부위로부터 멀리 떨어진 부위에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 리간드는 입체구조적 변화를 유도할 수 있다. 상기 화학적 변형은 교차 결합(예를 들어, 포름알데히드에 의한 교차결합) 또는 아실화일 수 있다. RNase H Ⅱ로부터 억제 인자의 방출 또는 분리는 연결된 RNase HⅡ(불활성)를 포함하는 시료 또는 혼합물을 약 65℃ 내지 약 95℃ 또는 그 이상의 온도까지 가열하거나, 및/또는 시료 또는 혼합물의 pH를 약 7.0 이하로 낮춤으로써 이루어질 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "불활성화된 RNase H(inactivated RNase H)" 또는 "불활성 RNase H(inactive RNase H)"는 그 외에는 동일한 실험 조건 하에서 50℃에서 결정된 변형되지 않은 RNase H (100%로 간주됨)와 비교하여, 약 75% 이상 또는 약 85% 이상 또는 약 95% 이상의 엔도뉴클레아제 활성을 상실한 RNase H를 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "활성화된 RNase H(activated RNase H)" 또는 "활성 RNase H(active RNase H)"는 전술된 바와 같이 변형되고, 그 외에는 동일한 실험 조건 하에서 50℃에서 결정된 변형되지 않은 RNase H (100% 로 간주됨)와 비교하여 약 5% 이상 또는 약 10% 이상 또는 약 15% 이상 또는 약 20% 이상 또는 약 25% 이상 또는 약 30% 이상의 엔도뉴클레아제 활성을 회복한 RNase HⅡ를 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "유도성(inducible)" RNAse H 활성은 리간드와의 결합에 의하여 조절될 수 있는 엔도뉴클레아제 촉매 활성을 갖는 본 명세서에 기재된 변형된 RNAse H를 의미한다. 허용적(permissive) 조건에서, RNAse H 엔도뉴클레아제 촉매 활성은 활성화되나, 비-허용적(non-permissive)관대한 조건 하에서, 상기 RNAse H 엔도뉴클레아제 촉매 활성은 억제된다. 일부 구체예에서, 변형된 RNAse H의 촉매 활성은 역전사에 적합한 온도, 즉 약 42℃에서 억제될 수 있고, PCR 반응에서 발견되는 좀더 높은 온도 즉 약 65℃ 내지 95℃에서 활성화될 수 있다. 이러한 특성을 가진 변형된 RNAse H는 "열유도성(heat inducible)"이라고 언급된다.
본원의 일 실시예에 따르면, 상기 변형된 RNAse H의 촉매 활성은 상기 RNAse H의 일부 또는 전부 영역을 표적으로 하는 항체의 결합 정도를 변화시킴으로서 조절될 수 있으며, 구체적으로 상기 변형된 RNAse H는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 비활성화되고, 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 110℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 항체의 결합 정도를 억제함으로서 활성이 유도된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하며, 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 결합된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgGDCH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디(tetrabody), 트리아바디(triabody), 디아바디(diabody), (scFv)2, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, scFv-Fc, Fc 단편, 단일 가변도메인 항체 또는 Fv 등을 포함하며 항체의 항원 결합 형태를 포함한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNAse H 효소는 핫 스타트(hot start) RNAse H 효소일 수 있으며, 상기 조성물은 핫 스타트(hot start) 효소 조성물일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 ""핫 스타트(hot start)" 효소 또는 조성물은 비-허용적 온도, 즉 약 25℃ 내지 약 45℃에서 저해되고 PCR 반응에 적합한 온도, 예를 들어 약 55℃ 내지 약 95℃에서 활성화되는 효소 활성을 갖는 효소 또는 조성물을 말한다. 일부 구체예에서, "핫 스타트" 효소 조성물은 당업계에서 알려진 '핫 스타트' RNAse H 및/또는 '핫 스타트' 열안정성인 DNA 폴리머라제를 가질 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 폴리머라제를 더 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 역전사효소를 더 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 표적 서열을 증폭하거나, 표적 서열을 검출하는 데에 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 증폭 반응 조성물일 수 있다. 상기 증폭 반응 조성물에서 상기 가열 단계의 지속 시간은 변형된 RNase H, PCR에 사용된 버퍼 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 일반적으로, 95℃로 약 30초 - 4분 동안 증폭 조성물을 가열하는 것은 RNase H 활성을 회복하는 데 충분하다. 일 구체예에서, 인비트로젠 AgPath™ 버퍼와 같이 상업적으로 이용가능한 버퍼를 사용하여, 피로코커스 푸리오서스 RNase HⅡ의 완전한 활성은 약 2분의 가열 후에 회복된다.
RNase H 활성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 제1방법에 따라, 단위 활성은 정의된 분석 조건 하에서 동일 몰의 폴리티미딜 산의 존재에서 방사성 표지된 폴리아데닐 산의 특정 몰수의 산-가용화(acid-solubilization)의 측면에서 정의된다(Epicentre Hybridase thermostable RNase HI 참조). 제2방법에서, 단위 활성은 정의된 분석 조건 하에서 프로브와 상보적인 주형 DNA의 동량을 포함하는 반응의 상대적 형광 강도에서 특이적 증가로 정의된다.
본원의 제2측면은, 표적 서열을 증폭하는 방법으로서, 하기를 포함하는 증폭 반응 혼합물을 제공하는 단계,
표적 DNA 서열을 포함하는 시료;
DNA 폴리머라제와 RNase H 효소를 포함하는 조성물로서, 상기 RNase H 효소는 서열 번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고, 상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되고, 상기 RNase H 효소의 활성은 90℃ 이상의 온도에서 유도되고 열-유도성인 것인 조성물;
상기 표적 DNA 서열의 5' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제1 프라이머;
상기 표적 DNA 서열의 3' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머; 및
검출가능한 표지와 연결되고 상기 RNase H에 의하여 절단될 수 있는 위치를 갖는 프로브; 및
상기 증폭 반응 혼합물로 하나 이상의 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 증폭 산물을 생성하는 단계, 및
수득된 증폭 산물의 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 증폭 반응은 90℃ 이상의 온도로 상기 반응 조성물을 가열하는 단계를 포함하는 것인, 표적 서열을 증폭하는 방법을 제공한다. 제1측면과 중복되는 내용은 제2측면의 방법에도 공히 적용된다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 반응 조성물을 가열하는 단계는 95℃ 이상에서 수행되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 하나 이상의 DNA 서열 부분과 하나의 RNA 서열 부분을 포함하고, 상기 RNA 부분이 RNA 서열의 3' 말단과 5' 말단이 두개의 DNA 서열의 각각에 연결되는 방식으로 두개의 DNA 서열 사이에 배열된 올리고뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소의 활성은 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 110℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 유도되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 열-유도성으로서, 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 비활성화된 RNase H 효소가 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 110℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 활성이 유도되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 RNA H 효소에 상기 항체가 가역적으로 결합된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 변형된 RNAse H 효소일 수 있으며, 구체적으로 상기 변형된 RNAse H 효소는 RNase H 효소의 일부 영역(구체적으로, 특정 항원결정기), 보다 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역에 결합하는 항체가 가역적으로 결합된 것일 수 있다.
본원의 일 실시예에 따르면, 상기 변형된 RNAse H의 촉매 활성은 상기 RNAse H의 일부 또는 전부 영역을 표적으로 하는 항체의 결합 정도를 변화시킴으로서 조절될 수 있으며, 구체적으로 상기 변형된 RNAse H는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 비활성화되고, 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 110℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 항체의 결합 정도를 억제함으로서 활성이 유도된 것일 수 있다.
본원의 제3측면은, 시료에서 표적 RNA 서열을 검출하는 방법으로서, 하기를 포함하는 증폭 반응 조성물을 제공하는 단계;
표적 RNA 서열을 포함하는 시료,
역전사 효소, DNA 폴리머라제 및 RNase H 효소를 포함하는 조성물로서, 상기 RNase H 효소는 서열번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고, 상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되고, 상기 RNase H의 활성은 90℃ 이상의 온도에서 유도되고 열-유도성인 것인 조성물;
검출가능한 표지를 포함하고 상기 RNase H의 절단 서열을 포함하는 프로브 서열;
상기 표적 RNA 서열의 5' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제1프라이머; 및
상기 표적 RNA 서열의 3' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제2프라이머;
RNA:cDNA 듀플렉스를 형성하기 위하여 표적 RNA의 역전사를 개시하는 단계;
90℃ 이상의 온도까지 상기 반응 조성물을 가열하고 그에 의해 RNA:cDNA 듀플렉스의 RNA 부분을 분해하기 위하여 상기 RNase H를 활성화시키는 단계;
하나 이상의 증폭 산물을 형성하기 위하여 하나 이상의 증폭 반응을 개시하는 단계, 및
수득된 증폭 산물의 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하는 것인, 표적 RNA 서열을 검출하는 방법을 제공한다. 제1측면 및 제2측면과 중복되는 내용은 제3측면의 방법에도 공히 적용된다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 하나 이상의 DNA 서열 부분과 하나의 RNA 서열 부분을 포함하고, 상기 RNA 부분이 RNA 서열의 3' 말단과 5' 말단이 두개의 DNA 서열의 각각에 연결되는 방식으로 두개의 DNA 서열 사이에 배열된 것인 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 반응 조성물을 가열하는 단계는 95℃ 이상에서 수행되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소의 활성은 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 110℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 유도되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 열-유도성으로서, 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 비활성화된 RNase H 효소가 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 110℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 활성이 유도되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 RNA H 효소에 상기 항체가 가역적으로 결합된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNase H 효소는 변형된 RNAse H 효소일 수 있으며, 구체적으로 상기 변형된 RNAse H 효소는 RNase H 효소의 일부 영역(구체적으로, 특정 항원결정기), 보다 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역에 결합하는 항체가 가역적으로 결합된 것일 수 있다.
본원의 일 실시예에 따르면, 상기 변형된 RNAse H의 촉매 활성은 상기 RNAse H의 일부 또는 전부 영역을 표적으로 하는 항체의 결합 정도를 변화시킴으로서 조절될 수 있으며, 구체적으로 상기 변형된 RNAse H는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 비활성화되고, 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 110℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 항체의 결합 정도를 억제함으로서 활성이 유도된 것일 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
1. 항체
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "항체"는 목표항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미하며, 다클론 항체 및 단일클론항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 특히, 항체는 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain)가 각각 2개씩 모여 이루어지는 헤테로테트라머이며 각각의 사슬은 아미노산 서열이 가변적인 가변도메인(variable domain)과 일정한 서열을 가지는 불변도메인(constant domain)으로 이루어질 수 있으나, 상기 형태에 제한되지 않는다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하며, 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 결합된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgGDCH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디(tetrabody), 트리아바디(triabody), 디아바디(diabody), (scFv)2, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, scFv-Fc, Fc 단편, 단일 가변도메인 항체 또는 Fv 등을 포함하며 항체의 항원 결합 형태를 포함한다. 상기 Fc 단편은 Fc 수용체와 같은 세포 표면 수용체와 결합할 수 있는 항체의 말단 부위를 의미하며, 항체의 두 개의 중쇄의 2번 또는 3번째 불변 도메인(constant domain)으로 구성된다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(dsFv, disulfide-stabilized variable frament)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv, single chain variable frament)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역(VH)과 경쇄의 가변 영역(VL)이 공유 결합으로 연결되어 있다. 단일 가변도메인 항체는 중쇄 또는 경쇄 가변도메인 하나만으로 이루어진 항체조각을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "상보성 결정부위" (Complementarity determining region, CDR)는 가변도메인의 경쇄와 중쇄에 각각 3개씩 존재하는 부위이며 가변도메인 중에서도 아미노산 서열의 가변성이 특히 높은 부분으로 이러한 높은 가변성에 의해 다양한 항원에 대해 특이적 항체가 찾아질 수 있다. 중쇄의 상보성 결정부위 3개를 아미노 말단부터 카르복실 말단방향으로 차례로 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3라 하며, 경쇄의 상보성 결정부위 3개를 아미노 말단부터 카르복실 말단방향으로 차례로 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3라 한다. 하나의 항체에서 이 여섯 개의 상보성 결정부위가 모여 항원 결합부위를 형성한다. 항체 가변부위 서열 상의 아미노산 번호(numbering) 및 CDR들의 위치를 정의하는 몇 가지 방법이 알려져 있으며, 본원 명세서에서는 그 중 카밧 정의(Kabat definition)을 따른다.
2. 핵산 주형 준비
본원의 일 구현예에 있어서, 시료는 정제된 핵산 주형(예를 들어, mRNA, rRNA, 및 그의 혼합물)을 포함한다. 시료로부터 RNA의 추출 및 정제의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, RNA는 TRIzol™ 시약 (인비트로젠) 추출 방법을 사용하여 세포로부터 분리될 수 있다. RNA 양과 질은 그 다음에 예를 들어 Nanodrop™ 분광광도계 및 아질런트 2100 바이오어날라이저를 사용하여 결정된다.
본원의 일 구현예에 있어서, 시료는 약 6 내지 약 9의 pH를 갖는 용해 버퍼, 약 0.125% 내지 약 2% 농도의 양쪽 이온성 디터전트, 약 0.3 내지 약 2.5㎎/㎖ 농도의 아지드 및 프로티나제 K와 같은 프로테아제 (약 1㎎/㎖)를 사용하여 세포를 용해시킴으로써 얻어진 세포 용해물이다. 55℃에서 15분 동안 인큐베이션 한 후, 고효율 PCR 또는 역전사 PCR 분석과 조화되는 "실질적으로 단백질 불포함(substantially protein free)" 용해물을 생성하기 위하여 프로티나제 K를 95℃에서 10분 동안 불활성화시킨다.
본원의 일 구현예에 있어서, 1×용해 시약은 12.5mM Tris 아세테이트 또는 Tris-HCl 또는 HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰 산) (pH=7-8), 0.25% (w/v) CHAPS, 0.3125㎎/㎖ 아지드화 나트륨 및 1㎎/㎖의 프로티나제 K를 포함한다.
본원 명세서에서 전체에서 사용된 용어 "용해물(lysate)"은 용해된 세포 잔해물 및 핵산을 포함하는 액상을 말한다.
본원 명세서에서 전체에서 사용된 용어 "실질적으로 단백질 불포함"은 대부분의 단백질들이 프로테아제에 의한 단백질 분해 절단에 의하여 불활성화된 것인 용해물을 의미한다. 프로테아제는 프로티나제 K를 포함할 수 있다. 세포를 용해시키는 동안에 프로티나제 K의 첨가는 표적 핵산을 분해할 수 있는 뉴클레아제를 빠르게 불활성화시킨다. "실질적으로 단백질 불포함" 용해물은 불활성화된 단백질을 제거하는 처리를 거치거나 거치지 않을 수 있다.
본원 명세서에서 전체에서 사용된 용어 "세포"는 원핵 또는 진핵 세포를 의미할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, "세포"는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 항산성 박테리아 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 박테리아와 같은 미생물을 의미할 수 있으며, 시험 대상 "세포"는 표면의 면봉 샘플링(swab sampling)을 사용하여 수집될 수 있고, "세포"는 병원성 개체를 의미할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 시료는 바이러스 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 시료는 HIV-1 또는 HIV-2와 같은 렌티바이러스 핵산을 포함할 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용된 용어, "양쪽 이온성 디터전트(zwitterionic detergent)"는 양쪽성 이온의 특성(예를 들어, 순전하를 갖지 않음, 전도도 및 전기영동 이동도가 없음, 이온-교환 수지에 결합하지 않음, 단백질간 결합을 깨뜨림)을 보이는 디터전트를 의미하고, CHAPS, CHAPSO 및 베타인 유도체, 예를 들어, 바람직하게는 브랜드명 Zwittergent(Calbiochem, San Diego, CA) 및 Anzergent(Anatrace, Inc. Maumee, OH)으로 판매되는 설포베타인을 포함하나,
본원의 일 구현예에 있어서, 양쪽 이온성 디터전트는 하기의 구조를 갖는 3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트 (미국 특허 제4,372,888호에 더 상세히 기재됨)의 약어인, CHAPS (CAS Number: 75621-03-3; SIGMA-ALDRICH 제품 번호 C3023-1G로 구입 가능함)이다:
Figure 112020101067102-pat00001
본원의 일 구현예에 있어서, CHAPS는 총 조성물의 약 0.125% 내지 약 2% 중량/부피(w/v)의 농도로 존재한다. 추가적인 구체예에서, CHAPS는 총 조성물의 약 0.25% 내지 약 1% w/v의 농도로 존재한다. 또다른 구체예에서, CHAPS는 총 조성물의 약 0.4% 내지 약 0.7% w/v의 농도로 존재한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 용해 버퍼는 노니뎃(Nonidet), 트윈(Tween) 또는 트리톤(Triton) X-100과 같은 다른 비-이온성 디터전트를 포함할 수 있다.
본원 명세서에서 전체에서 사용되는 용어 "버퍼(buffer)"는 25℃에서 약 6 내지 약 9의 pKa를 가지고, pH 값을 pH 6 내지 9고 효과적으로 유지할 수 있는 조성물을 말한다. 본 명세서에서 기재된 버퍼는 일반적으로 효소 활성의 기능과 조화가능하고 생물학적 고분자가 그들의 정상적인 생리적 및 생화학적 기능을 보유할 수 있게 하는 생리적으로 적합한 버퍼(physiologically compatible buffer)이다.
버퍼의 예는 HEPES ((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰 산), MOPS (3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신산 (트리신), 트리스(히드록시메틸)메틸아민산(트리스), 피페라진-N,N′-비스(2-에탄설폰산) (PIPES) 및 아세테이트 또는 포스페이트를 포함하는 버퍼(K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원 명세서에서 전체에서 사용되는 용어 "아지드(azide)"는 식 -N3으로 기재된다. 일 구체예에서, 아지드는 일반적인 살균제로 작용하는 아지드화 나트륨 NaN3(CAS number 26628-22-8; SIGMA-ALDRICH 제품 번호 S2002-25G로 구입 가능함)이다.
본원 명세서에서 전체에서 사용되는 용어 "프로테아제(protease)"는 펩티드 결합을 가수분해하는 (프로테아제 활성을 갖는) 효소이다. 프로테아제는 또한 예를 들어, 펩티다제, 프로티나제, 펩티드 히드롤라제, 또는 단백질 분해 효소라고도 불린다. 본 발명에 따른 사용을 위한 프로테아제는 폴리펩티드 사슬에서 내부로 작용하는 엔도 타입(엔도펩티다제)일 수 있다. 일 구체예에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 프로티나제 K (EC 3.4.21.64; Roche Applied Sciences에서 구입 가능함, 재조합 프로티나제 K 50 U/㎖ (Pichiapastoris유래) Cat. No. 03 115 887 001)일 수 있다.
프로티나제 K는 핵산 제제(nucleic acid preparation)로부터 단백질을 분해하고 오염을 제거하기 위하여 사용된다. 핵산 제제에 프로티나제 K를 첨가하여 뉴클레아제를 빠르게 불활성화시키는데, 그렇지 않으면 뉴클레아제가 정제 과정 동안 DNA 또는 RNA를 분해시킬 수 있다. 프로티나제 K는 단백질을 변성시키는 화학물질의 존재하에서 활성이 있고 약 95℃의 온도에서 약 10분 동안 불활성화될 수 있기 때문에 본 실험에 상당히 적합하다.
본원의 일 구현예에 있어서, 리스테리아, 살모넬라, 및 대장균과 같은, 그람 양성 및 그람 음성 박테리아의 용해는 또한 용해 시약이 프로티나제 K (1㎎/㎖)를 포함할 것을 요구한다. 세포 용해물 중 단백질은 55℃에서 15분 동안 프로티나제 K에 의하여 분해되고 그 다음에 95℃에서 10분 동안 프로티나제 K를 불활성화시킨다. 냉각시킨 후에, 실질적으로 단백질 불포함 용해물은 고효율 PCR 증폭에 적합하다.
프로티나제 K에 더해 또는 이를 대신하여, 용해 시약은 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 서브틸리신, 스트렙토그리신, 써미타제, 아쿠아리신, 플라스민, 쿠쿠미신, 또는 카르복시펩티다제 A, D, C, 또는 Y과 같은 세린 프로테아제를 포함할 수 있다. 세린 프로테아제에 더하여, 용해 용액은 파파인, 칼파인, 또는 클로스트리파인과 같은 시스테인 프로테아제; 펩신, 키모신, 또는 카텝신과 같은 산 프로테아제; 또는 프로나제, 써모리신, 콜라게나제, 디스파제, 아미노 펩티다제 또는 카르복시펩티다제 A, B, E/H, M, T, 또는 U와 같은 메탈로프로테아제를 포함할 수 있다. 프로티나제 K는 넓은 pH 범위(pH 4.0-10.0)에서 안정하고 양쪽 이온성 디터전트가 포함된 버퍼에서 안정하다.
3. 역전사 효소 - PCR 증폭
역전사 효소-PCR 과정은 종점(end-point) 또는 실시간 분석 중 하나로 설정될 수 있다. cDNA 증폭은 본질적으로 두 단계의 분리된 분자적 합성을 요구한다: (ⅰ) RNA 주형으로부터 cDNA의 합성; 및 (ⅱ) PCR 증폭을 통한, 새롭게 합성된 cDNA의 복제. 역적사 효소-PCR과 종종 관련된 기술적 문제들을 해결하기 위해, 다수의 프로토콜들이 하기 과정의 3가지 기본 단계를 고려하여 개발되었다: (a) RNA의 변성과 역방향 프라이머의 혼성화; (b) cDNA의 합성; 및 (c) PCR 증폭. 소위 "분리된(uncoupled)" 역전사 효소-PCR 과정(예를 들어,　2　단계 역전사 효소-PCR)에서, 역전사는 역전사 효소 활성을 위한 최적 버퍼 조건을 사용하여 독립적인 단계로 수행된다. cDNA 합성에 이어, 수득된 반응액을 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위한 최적 조건으로 MgCl2　및 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP) 농도를 감소시키도록 희석하고, 표준 조건에 따라 PCR을 수행한다(미국 특허 번호 제4,683,195호 및 제4,683,202호 참조). 반대로, "연결된(coupled)" 역전사 효소 PCR 방법은 역전사 효소와 Taq DNA 폴리머라제를 위한 공통된 버퍼를 사용한다. 하나의 버전에서, 역방향 프라이머의 어닐링은 효소의 첨가 전의 별개의 단계이고, 그 후 하나의 반응 용기에 첨가된다. 다른 버전에서, 역전사 효소 활성은 열안정성 Tth DNA 폴리머라제의 성분이다. 어닐링 및 cDNA 합성은 Mn2+의 존재 하에서 수행되고 그 뒤 PCR은 킬레이트제에 의하여 Mn2+을 제거한 후에 Mg2+의 존재하에서 수행된다. 마지막으로, "지속적(continuous)" 방법 (예를 들어, 1 단계 역전사 효소-PCR)은 3 단계의 역전사 효소-PCR 단계들을 구성 요소 또는 효소 첨가를 위한 반응 튜브를 여는 것을 피하는 단일 지속적 반응으로 통합한다. 지속적 역전사 효소-PCR은 최초 65℃ RNA 변성 단계가 생략된 것인 열안정성 Taq DNA 폴리머라제 및 Tth 폴리머라제의 역전사 효소 활성을 사용하는 일 효소 시스템과 AMV 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제를 사용한 두 개의 효소 시스템으로 기재된다.
최고의 민감도를 유지하기 위하여 cDNA 합성 전에 RNA가 분해되지 않는 것이 중요하다. 전술된 바와 같이, 1 단계 역전사 PCR 프로토콜에서 RNase H의 존재는 역전사 효소를 위한 기질로서 작용할 수 있기 전에 RNA:DNA 프라이머 하이브리드의 원치않는 분해의 원인이 될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형된 RNase H는 역전사를 위해 필요한 온도, 즉 약 45-55℃에서 RNAse H 엔도뉴클레아제 촉매적 활성을 불활성화시킴으로써 이런 문제를 해결한다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된, 핫 스타트 RNAse H 활성은 염기성 조건 하에서 시스-아코니트 무수물과 RNAse H의 반응 후에 생성된 가역적 화학적 변형을 가진 RNAse H일 수 있다. 변형된 효소는 Tris 기초 버퍼와 반응에 사용되고 온도가 95℃까지 상승되면 용액의 pH가 떨어지고 RNase H 활성이 회복된다. 이 방법은 역전사의 개시 전에 반응 혼합물 중 RNase H의 포함을 허락한다.
실시간 역전사 PCR의 제1단계는 주형 특이적인 DNA 프라이머 중 하나를 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 생성하는 것이다. 종래의 PCR 반응에서 이 산물은 변성되고, 제2주형 특이적 프라이머가 cDNA에 결합하며, 듀플렉스 DNA를 형성하기 위하여 신장된다. 이 산물은 그 뒤에 PCR 증폭의 다음 단계에서 증폭된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "폴리머라제 연쇄 반응(PCR)"은 시료에서 표적 폴리뉴클레오티드의 세그먼트의 농도를 증가시키기 위하여 당업계에서 잘 알려진 증폭을 위한 방법을 의미하고, 상기 시료는 단일 폴리뉴클레오티드, 또는 복수의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일반적으로, PCR 과정은 시료, 완충제, 열안정성 DNA 폴리머라제, 표적 핵산 서열(들), dNTP들 (4종의 디옥시뉴클레오티드 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 각각), 및 시료의 이중 가닥 표적 서열의 반대편 가닥에 상보적인 프라이머들을 포함하는 10-100㎖ 반응 혼합물에 몰 과량(molar excess)의 2종 이상의 신장가능한 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 도입하는 단계로 구성된다. 반응 혼합물을 DNA 폴리머라제의 존재하에 열 사이클링의 프로그램에 적용하여, 그 결과 DNA 프라이머들에 의해 둘러싸인(flank) 원하는 표적 서열이 증폭된다. 하나의 PCR 반응은 폴리뉴클레오티드 분자의 변성과 합성의 약 5 내지 약 100 "사이클"로 구성될 수 있다.
PCR 기법은 Innis 등에 의한 PCR: A Practical Approach, M. J. McPherson, et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990), 및 PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich, Stockton Press (1989)을 포함하는, 수많은 문헌에 개시되어 있다. PCR은 또한 미국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호; 제4,889,818호; 제5,075,216호; 제5,079,352호; 제5,104,792호; 제5,023,171호; 제5,091,310호; 및 제5,066,584호를 포함한, 많은 미국 특허에도 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 리보스, 아라비노스, 자일로스 및 피라노스와 같은 당, 및 이들의 당 유사체f의 C-1' 탄소에 연결된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 화합물을 의미한다. 용어 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 당은 치환 또는 비치환될 수 있다. 대체된 리보스 당은 하나 이상의 탄소 원자, 예를 들어 2'-탄소 원자가 동일하거나 다른 Cl, F, -R, -OR, -NR2 또는 할로겐 기 중 하나 이상에 의해 치환되고, 각각의 R은 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 C5-C14 아릴인 것인 리보스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 리보스는 2'-(C1-C6)알콕시리보스, 2'-(C5-C14)아릴옥시리보스, 2',3'-디데히드로리보스(didehydroribose), 2'-데옥시-3'-할로리보스, 2'-데옥시-3'-플루오로리보스, 2'-데옥시-3'-클로로리보스, 2'-데옥시-3'-아미노리보스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알킬리보스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알콕시리보스 및 2'-데옥시-3'-(C5-C14)아릴옥시리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2',3'-디데옥시리보스(dideoxyribose), 2'-할로리보스, 2'-플루오로리보스, 2'-클로로리보스, 및 2'-알킬리보스, 예를 들어, 2'-O-메틸, 4'-α-아노머 뉴클레오티드, 1'-α-아노머 뉴클레오티드, 2'-4'- 및 3'-4'-연결된 및 다른 "잠긴(locked)" 또는 "LNA", 이중고리 당 변형을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다(예를 들어, PCT 공개 제WO98/22489호, 제WO98/39352호, 및 제WO99/14226호; 및 미국 특허 제6,268,490호 및 제6,794,499호 참조).
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "핵산(Nucleic acid)"은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미하고, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있거나 또는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 2 내지 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 단일-가닥 중합체이다. 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 중합체이다. 폴리뉴클레오티드는 제2가닥이 제1올리고뉴클레오티드의 역 상보적인 서열을 가진 올리고뉴클레오티드인 것인 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 DNA, 디옥시티미딘을 포함하는 단일-가닥 핵산 중합체, 단일가닥 RNA, 이중 가닥 RNA 또는 RNA/DNA 헤테로듀플렉스 중 어느 하나 일 수 있다. 핵산은 게놈 DNA, RNA, cDNA, hnRNA, snRNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, siRNA, 단편화된 핵산, 미토콘드리아나 엽록체와 같은 세포 소기관으로부터 얻은 핵산, 및 생물학적 시료 내 또는 위에 존재할 수 있는 미생물이나 DNA 또는 RNA 바이러스로부터 얻은 핵산을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 핵산은 예를 들어, RNA 및 DNA의 경우에서처럼, 당 부분의 단일 유형이거나 또는 RNA/DNA 키메라의 경우에서처럼 상이한 당 부분의 혼합물로 구성될 수 있다. 명세서에서, 뉴클레오티드 “A”, “C”, 및 "G”는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나 일 수 있고, 리보뉴클레오티드 A, 리보뉴클레오티드 C, 및 리보뉴클레오티드 G는 올리고뉴클레오티드의 서열에서 각각 “rA”, “rC”, 및“rG”로 표시된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "표적 DNA(target DNA)" 또는 "표적 RNA" 또는 "표적 핵산" 또는 "표적 핵산 서열"은 DNA 증폭을 위하여 표적이 된 핵산을 의미한다. 표적 핵산 서열은 PCR 반응 또는 역전사 효소-PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로 작용한다. 표적 핵산 서열은 천연 분자 및 합성 분자들 모두를 포함할 수 있다. 예시적인 표적 핵산 서열은 게놈 DNA 또는 게놈 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 때때로 "프라이머(primer)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"와 호환적으로 사용된다. 용어 "프라이머"는 PCR 반응에서 DNA 합성의 개시 위치로 작용하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 대개 길이가 약 15개 내지 약 35개의 뉴클레오티드로 이루어지고 표적 서열에서 상보적인 영역에 혼성화된다. 올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진 적절한 방법(화학적 합성과 같은)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 상업적인 출처를 통하여 편리하게 이용할 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "어닐링(annealing)" 및 "혼성화(hybridization)"는 호환적으로 사용되고 듀플렉스, 트리플렉스, 또는 다른 고차원 구조의 형성을 초래하는 하나의 핵산과 다른 핵산의 염기쌍 형성 상호작용을 의미한다. 일부 구체예에서, 일차적인 상호작용은 왓슨/크릭(Watson/Crick) 및 후그스틴(Hoogsteen)-유형 수소 결합에 의하여, 염기 특이적이고, 예를 들어 A/T 및 G/C이다. 일부 실시예에서, 염기-스택킹(base-stacking) 및 소수성 상호작용은 또한 듀플렉스 안정성에 기여할 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "완충제(buffering agent)" 또는 "버퍼"는 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형하는, 증폭 반응에 첨가되는 화합물이다. 일부 완충제가 당업계에 잘 알려져 있고, 트리스, 트리신, MOPS (3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), 및 HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "시료(sample)"는 핵산 분자를 포함하는 물질을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "첨가제"는 조성물의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형하는, 조성물에 첨가되는 화합물이다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 증폭 반응 조성물이다. 일부 구체예에서, 첨가제는 오염 효소를 불활성화시키고 단백질 폴딩을 안정화시키고, 및/또는 응집을 감소시킨다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 예시적인 첨가제는 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl2, MgOAc, MgCl2, NaCl, NH4OAc, NaI, Na(CO3)2, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로스, 디메틸에틸설폭시드 ("DMSO"), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨 ("DTT"), 피로포스파타제 (써모플라스마 애시도필룸 무기 피로포스파타제 ("TAP")를 포함하지만, 이에 한정되지 않음), 우태아 혈청 알부민 ("BSA"), 프로필렌 글리콜, 글리신아미드, CHES, Percoll™, 아우린트리카르복실산, 트윈 20, 트윈 21, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 85, Brij 30, NP-40, 트리톤 X-100, CHAPS, CHAPSO, 맥커니움(Mackernium), LDAO (N-도데실-N,N-디메틸아민-N-옥시드), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, E. Coli SSB, RecA, 절단하는 엔도뉴클레아제(nicking endonucleases), 7-데아자G, dUTP, 및 UNG, 음이온성 디터전트, 양이온성 디터전트, 비-이온성 디터전트, 양쪽 이온성 디터전트(zwittergent), 스테롤, 삼투조절물질(osmolytes), 양이온, 및 증폭의 효율을 변화시킬 수 있는 기타 화학물질, 단백질, 또는 보조인자(cofactor)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 첨가제가 증폭 반응에 포함된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, “DNA 폴리머라제 활성(DNA polymerase activity)”은 데옥시리보뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 효소 활성을 의미한다. 일반적으로, 상기 효소는 핵산 주형 서열에 어닐링된 프라이머의 3'-말단에서 합성을 시작할 것이고, 주형 가닥의 5' 말단을 향해 진행할 것이다. 공지된 DNA 폴리머라제는 예를 들어, 피로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) (Pfu) DNA 폴리머라제 (Lundberg et al., 1991, Gene, 108:1), E. coli DNA 폴리머라제 Ⅰ (Lecomte and Doubleday, 1983, Nucleic Acids Res. 11:7505), T7 DNA 폴리머라제 (Nordstrom et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:3112), 써모스 써모필러스(Thermus thermophilus) (Tth) DNA 폴리머라제 (Myers and Gelfand 1991, Biochemistry 30:7661), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) DNA 폴리머라제 (Stenesh and McGowan, 1977, Biochim Biophys Acta 475:32), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) (Tli) DNA 폴리머라제 (또한 Vent DNA 폴리머라제라고도 함, Cariello et al., 1991, Nucleic Acids Res, 19: 4193), 9°Nm DNA 폴리머라제 (New England Biolabs로부터 단종된 제품), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) (Tma) DNA 폴리머라제 (Diaz and Sabino, 1998 Braz J. Med. Res, 31:1239), 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq) DNA 폴리머라제 (Chien et al., 1976, J. Bacteoriol, 127: 1550), 피로코커스 코다카라엔시스(Pyrococcus kodakaraensis) KOD DNA 폴리머라제 (Takagi et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:4504), JDF-3 DNA 폴리머라제 (Patent application WO 0132887), 및 피로코커스(Pyrococcus) GB-D (PGB-D) DNA 폴리머라제 (Juncosa-Ginesta et al., 1994, Biotechniques, 16:820)를 포함한다. 전술된 효소 폴리머라제 활성은 당업계에서 잘 알려진 수단으로 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, DNA 폴리머라제 1 유닛은 최적 온도에서(예를 들어, Pfu DNA 폴리머라제의 경우 72℃) 30분 동안 10나노몰의 총 dNTP을 중합 형태로의 결합(incorporation)을 촉매하는 효소의 양으로 정의된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "역전사 효소 활성(reverse transcriptase activity)" 및 "역전사(reverse transcription)"는 주형으로 RNA 가닥을 사용하여 DNA 가닥(즉, 상보적인 DNA, cDNA)을 합성할 수 있는 RNA-의존적 DNA 폴리머라제로 특징지어지는 한 종류의 폴리머라제의 효소 활성을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "역전사 효소-PCR"은 DNA-의존적 DNA 폴리머라제 프라이머 연장의 복수 사이클 전에 단일 가닥 DNA 분자를 우선 생성하기 위하여 RNA 주형과 역전사 효소, 또는 역전사 효소 활성을 갖는 효소를 사용하는 PCR 반응이다. 멀티플렉스 PCR은 일반적으로 단일 반응에서 2종 이상의 프라이머를 첨가함으로써, 단일 반응에서 1종 이상의 증폭된 산물을 생성하는 PCR 반응을 의미한다. 예시적인 역전사 효소는 미국 특허 제4,943,531호에 기재된 M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RT, 미국 특허 제5,405,776호에 기재된 RNase H 활성이 결여된 M-MLV-RT의 돌연변이 형태, BLV(bovine leukemia virus) RT, RSV(Rous sarcoma virus) RT, AMV(Avian Myeloblastosis Virus) RT 및 미국 특허 제7,883,871호에 개시된 역전사 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
PCR 증폭을 위하여, 본 발명에서 사용된 효소들은 바람직하게는 열안정성이다. 용어 "열안정성(thermostable)"은 열에 안정하고 열 저항적이며, 예를 들어 50℃ 내지 90℃의 고온에서 기능을 하는 효소를 의미한다. 본 발명에 따른 열안정성 효소는 증폭 반응에 효과적이라는 단일 기준을 만족해야 하고, 즉, 상기 효소는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 변성을 수행하기 위해 필요한 시간 동안 상승된 온도에 노출될 때 비가역적으로 변성되지 않아야 한다. 이와 관련하여 사용된 "비가역적 변성(irreversible denaturation)"에 의하여, 효소 활성의 영구적이고 완전한 소실을 가져오는 과정을 의미한다. 변성을 위해 필요한 가열 조건은 예를 들어, 버퍼 염 농도와 변성되는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 뉴클레오티드 조성에 따라 결정되나, 일반적으로 온도는 짧은 폴리뉴클레오티드에 대해 약 85℃, 내지 약 105℃의 범위이고 시간은 온도와 폴리뉴클레오티드의 길이에 주로 의존하는 시간 동안, 일반적으로 짧은 폴리뉴클레오티드에 대한 0.25분, 내지 더 긴 DNA 조각에 대한 약 4.0분의 범위이다. 버퍼 염 농도 및/또는 폴리뉴클레오티드의 GC 조성이 증가하면 더 높은 온도가 용인될 수 있을 것이다. 바람직하게는, 효소는 약 90℃ 내지 약 100℃에서 비가역적으로 변성되지 않을 것이다. 본 발명에 따르면, 비가역적으로 변성되지 않는 효소는 증폭 반응 동안에 약 10% 이상, 또는 약 25% 이상, 또는 약 50% 이상 기능이나 활성을 보유한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 하나 이상의 프라이머들이 표지될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "표지(label)", "검출가능한 표지(detectable label)", 또는 "마커(marker)", 또는 "검출가능한 마커(detectable marker)"는 명세서에서 호환적으로 사용되고, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체, 또는 핵산 결합 인자에 부착된 화학적 부분(chemical moiety)을 의미하고, 상기 부착은 공유 결합성 또는 비공유 결합성일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지는 검출 가능하고 상기 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체가 본 발명의 실시자에게 검출될 수 있게 한다. 검출가능한 표지는 발광 분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 소광제(quenching agent), 유색 분자, 방사성 동위원소 또는 신틸런트(scintillant)를 포함한다. 검출가능한 표지는 또한 유용한 링커 분자 (예를 들면, 비오틴, 아비딘, 스트랩트아비딘, HRP, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni2+, FLAG 태그, myc 태그), 중금속, 효소(예를 들어, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 및 루시퍼라제를 포함함), 전자 공여체/수용체, 아크리디늄 에스테르, 염료 및 열량 측정 기질(calorimetric substance)을 포함한다. 또한 표면 플라스몬 공명 검출의 경우와 같이, 질량의 변화가 검출가능한 표지로 간주될 수 있다는 것을 고려할 수 있다. 당업자는 전술되지 않은 유용한 검출가능한 표지를 용이하게 인식할 수 있을 것이고, 이것은 본 발명의 실시에 이용될 수 있을 것이다.
1 단계 역전사 효소-PCR는 분리된 역전사 효소-PCR 대비 여러 장점을 제공한다. 1 단계 역전사 효소-PCR은 분리된 역전사 효소-PCR보다 반응 혼합물 시약과 핵산 산물의 조작이 덜 요구되고(예를 들어, 두 반응 단계들 사이에서 성분 또는 효소의 첨가를 위해 반응 튜브를 여는 것), 그러므로 노동 강도가 적고, 요구되는 인 시간(person hour)을 감소시킨다. 1 단계 역전사 효소-PCR은 또한 시료를 더 적게 요구하고, 오염의 위험을 줄인다. 1 단계 역전사 효소-PCR의 민감도와 특이성은 특정 시료 중 여러 유전자들 중에 하나의 발현 수준의 연구나 또는 병원성 RNA의 검출에 매우 적합하다고 증명되었다. 일반적으로, 이런 과정은 cDNA 합성을 시작하기 위한 유전자-특이적인 프라이머의 사용으로 한정되었다.
이와 같은 역전사 효소-PCR 기법과 조합된 실시간 검출에 의한 PCR 반응의 동역학을 측정하는 능력은 높은 민감도로 RNA 카피 수를 정확하고 정밀하게 결정할 수 있게 한다. 이는 하기에서 설명되는, 5' 형광 발생 뉴클레아제 분석("Taq-Man") 또는 엔도뉴클레아제 분석("CataCleave")과 같은, 형광 이중-표지된 혼성화 프로브 기술에 의하여 증폭 과정 동안 PCR 산물의 형광 모니터링 및 측정을 통해 역전사 효소-PCR 산물을 검출함으로써 가능하게 된다.
4. CataCleave프로브를 이용한 표적 핵산 서열의 실시간 PCR
증폭 후 앰플리콘 검출은 노동과 시간을 소요한다. 실시간 방법은 PCR 과정 동안의 증폭을 모니터하기 위하여 개발되었다. 이러한 방법들은 일반적으로 새롭게 합성된 DNA에 결합하는 형광 표지 프로브 또는 이중가닥 DNA 사이에 끼어 들어가면 형광 방출이 증가되는 염료를 이용한다.
상기 프로브들은 일반적으로 표적이 없으면 공여체 방출이 두개의 발색단 사이의 형광 공명 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer: FRET)에 의하여 소광(quench)되도록 디자인된다. 공여체 발색단은 들뜬 상태(excited state)에서, 그 쌍이 가까운 거리에 있으면 수용체 발색단으로 에너지를 전달할 수 있다. 이러한 전달은 항상 비-방사능성이고 쌍극자-쌍극자 결합을 통하여 일어난다. 발색단들간의 거리를 충분히 증가시키는 모든 과정은 FRET 효율을 감소시켜서 공여체 발색단 방출이 방사능적으로 검출될 수 있다. 일반적인 수용체 발색단은 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, 및 Texas Red를 포함한다. 수용체 발색단은 그의 들뜸 스펙트럼이 공여체의 방출 스펙트럼과 겹치도록 선택된다. 이러한 결합 쌍의 예는 FAM-TAMRA이다. 또한 광범위한 공여체를 소광시키는 비 형광 수용체도 있다. 적절한 공여체-수용체 FRET 쌍의 다른 예들은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다.
PCR의 실시간 검출을 위해 사용될 수 있는 FRET 프로브의 일반적인 예는 분자 비콘(molecular beacon)(예를 들어, 미국 특허 제5,925,517호), TaqMan 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호), 및 CataCleave 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,763,181호)를 포함한다. 분자 비콘은 결합하지 않은 상태에서는 프로브가 공여체와 수용체 발색단이 가까이 위치하여 공여체 방출이 감소되는 것인 이차 구조를 형성하도록 디자인된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 적절한 반응 온도에서 비콘은 구조가 풀어지고 앰플리콘에 특이적으로 결합한다. 일단 풀리게 되면 공여체와 수용체 발색단 사이의 거리가 증가하여 FRET이 역전되고 공여체 방출이 특화된 기기를 사용하여 모니터링될 수 있다. TaqMan과 CataCleave 기술은 이용되는 FRET 프로브가 절단되어 공여체와 수용체 발색단이 FRET을 역전시키도록 충분히 떨어지게 된다는 점에서 분자 비콘과 다르다.
TaqMan 기술은 5' 말단에서 공여체 발색단으로 표지되고 3' 말단에서 수용체 발색단으로 표지된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 증폭을 위해 사용되는 DNA 폴리머라제는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 포함해야 한다. TaqMan 프로브는 프라이머가 결합하는 것과 동시에 앰플리콘의 하나의 가닥에 결합한다. DNA 폴리머라제가 프라이머를 신장시키면 폴리머라제는 결국에는 결합된 TaqMan 프로브와 마주치게 될 것이다. 이때에 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성은 Taq-Man 프로브를 5' 말단에서 시작하여 순차적으로 분해할 것이다. 상기 프로브가 분해되면 프로브를 포함하는 모노뉴클레오티드는 반응 버퍼로 방출된다. 공여체가 수용체로부터 멀리 확산되고 FRET은 역전된다. 공여체로부터의 방출은 프로브 절단을 확인하기 위하여 모니터링된다. TaqMan이 작용하는 방식 때문에 특이적인 앰플리콘이 PCR의 매 싸이클 마다 오직 한번씩 검출될 수 있다. TaqMan 표적 부위를 통한 프라이머의 신장은 앰플리콘이 다음 PCR 싸이클에서 변성되기 전까지 TaqMan 프로브의 추가 결합을 막는 이중 가닥 산물을 생성한다.
그 내용이 본 명세서에 참조로서 포함된 미국 특허 제5,763,181호는 또 다른 실시간 검출 방법(본 명세서에서 "CataCleave"로 기재됨)을 기재한다. CataCleave 기술은 프로브의 절단이 폴리머라제 활성을 갖지 않는 제2효소에 의해 수행된다는 점에서 TaqMan과 다르다. CataCleave 프로브는 예를 들어 제한 효소나 RNase와 같은, 엔도뉴클레아제의 표적인 분자 내의 서열을 갖는다. 일 실시예에서, CataCleave 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단이 DNA로 구성되고 절단 부위가 RNA를 포함하는 것인 키메라 구조를 갖는다. 프로브의 DNA 서열 부분은 양 말단이나 또는 내부에 FRET 쌍으로 표지된다. PCR 반응은 RNA-DNA 듀플렉스의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단하는 RNase H 효소를 포함한다. 절단 후에, 프로브의 두개의 반쪽은 반응 온도에서 표적 앰플리콘으로부터 분리되고 반응 버퍼로 확산된다. 공여체 및 수용체가 분리되면 FRET은 Taq-Man 프로브와 같은 방식으로 역전되고 공여체 방출이 모니터링 될 수 있다. 절단과 분리는 추가적인 CataCleave 결합을 위한 부위를 재생한다. 이러한 방식으로, 프라이머가 CataCleave 프로브 결합 부위를 통하여 신장될 때까지 단일 앰플리콘이 복수회의 프로브 절단의 표적으로 작용하는 것이 가능하다.
5. CataCleave프로브의 표지화
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "프로브"는 특이적인 핵산 서열 예를 들어, 표적 핵산 서열의 상보적인 영역과 서열-특이적인 방식으로 혼성화 되도록 디자인된 특이적인 부분을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 약 15개 내지 약 60개 뉴클레오티드의 범위에 있다. 또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 약 18개 내지 약 30개 뉴클레오티드 범위에 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 정확한 서열과 길이는 상기 프로브가 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드의 속성에 부분적으로 의존한다. 결합 위치와 길이는 특정한 구체예에서 적절한 어닐링 및 융해 특성을 이루도록 다양할 수 있다. 이러한 디자인 선택을 하기 위한 지침은 미국 특허 제5,763,181호, 제6,787,304호, 및 제7,112,422호에 기재된, Taq-man 분석 또는 CataCleave를 기재하는 다수의 참조문헌에서 발견될 수 있고, 그 내용이 전체로서 본 명세서에 참조로 포함된다.
프로브는 앞서 논의된 것처럼 "표지" 또는 "검출가능한 표지"로 표지될 수 있다. 구체예에서, 표지는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 프로브에 부착된 형광 색소 화합물이다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "형광 색소(fluorochrome)"는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의한 들뜸(excitation)으로 빛을 방출하는 형광 화합물을 의미한다. 용어 "형광 공여체(fluorescent donor 또는 fluorescence donor)"는 본 발명에 기재된 분석에서 측정되는 빛을 방출하는 형광 색소를 의미한다. 더욱 구체적으로, 형광 공여체는 형광 수용체에 의해 흡수되는 에너지(전달은 비 방사능성(non radiative)이고, 그것이 단어 "빛"을 삭제한 이유이다)를 제공한다. 용어 "형광 수용체(fluorescent acceptor 또는 fluorescence acceptor)"는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하는 제2형광 색소 또는 소광 분자를 의미한다. 제2형광 색소는 형광 공여체로부터 방출된 에너지를 흡수하고 형광 공여체에 의해 방출되는 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 소광 분자는 형광 공여체에 의해 방출된 에너지를 흡수한다.
발광 분자, 바람직하게는 형광 색소 및/또는 형광 소광제(quencher)가 본 발명의 실시에 사용될 수 있고, 상기 발광 분자는 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor680, 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복실산, 플루오레세인, Oregon Green 488, Oregon Green 514, 테트라메틸로다민, 로다민 X, 텍사스 레드 염료, QSY 7, QSY33, Dabcyl, BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY 6501665, BODIPYTMR-X, BODIPY TR-X, 디알킬아미노쿠마린, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, DTPA(Eu3+)-AMCA 및 TTHA(Eu3+)AMCA를 포함한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브의 3' 말단 뉴클레오티드는 블록킹되어 있거나 또는 핵산 폴리머라제에 의해 신장되지 못하도록 되어 있다. 이러한 블록킹은 프로브의 말단 3' 위치에 리포터 또는 소광제 분자를 부착함으로써 편리하게 수행된다.
본원의 일 구현예에 있어서, 리포터 분자는 연결 부분(linking moiety)을 통해 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단으로의 부착을 위해 유도체화된 형광 유기 염료이다. 바람직하게는, 소광제 분자는 또한 본 발명의 구체예에 따라, 형광일 수 있거나 형광이 아닐 수 있는, 유기 염료이다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 소광제 분자는 비-형광이다. 일반적으로 소광제 분자가 형광이거나 또는 비-방사능성 분해(non-radiative decay)에 의하여 리포터로부터 전달된 에너지를 단순히 방출하는 지에 관계없이, 상기 소광제의 흡수 밴드는 상기 리포터 분자의 형광 방출 밴드와 실질적으로 중첩되어야 한다. 들뜬 리포터 분자로부터 에너지를 흡수하나, 방사성으로 에너지를 방출하지 않는, 비-형광 소광제 분자는 본원에서 발색성 분자(chromogenic molecule)로 본원에서 지칭된다.
예시적인 리포터-소광제 쌍은 플루오레세인을 포함한 크산텐 염료, 및 로다민 염료들로부터 선택될 수 있다. 이러한 화합물들의 다수의 적절한 형태들이 올리고뉴클레오티드의 부착을 위하여 결합 부위로서 또는 결합 관능기(functionality)로 이용될 수 있는 페닐 부분에 치환기를 가지고 폭넓게 상업적으로 입수가능하다. 형광 화합물의 다른 그룹은 알파 또는 베타 위치에 아미노기를 갖는, 나프틸아민이다. 그와 같은 나프틸아미노 화합물에 포함되는 것은 1-디메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트 및 2-p-토우이디닐-6-나프탈렌 설포네이트이다. 다른 염료는 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘 및 아크리딘 오렌지과 같은 아크리딘; N-(p-(2-벤조옥사졸릴)페닐)말레이미드; 벤조옥사디아졸, 스틸벤, 피렌 등을 포함한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 리포터 및 소광제 분자는 플루오레세인 및 비-형광 소광제 염료로부터 선택된다.
하기 참조 문헌에 의하여 예시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 리포터 또는 소광제 분자를 부착하기 위한 많은 연결 부분 및 방법론들이 존재한다: Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al., Nucleic Acids Research, 15: 5305-5321 (1987) (올리고뉴클레오티드의 3' 티올 기); Sharma et al., Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3' 설프히드릴); Giusti et al., PCR Methods and Applications, 2: 223-227 (1993) and Fung et al., U.S. Pat. No. 4,757,141 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.로부터 이용가능한 Aminolink.. II를 통한 5' 포스포아미노 기); Stabinsky, 미국 특허 번호 제4,739,044호 (3' 아미노알킬포스포릴 기); Agrawal et al., Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (포스포르아미데이트 연결을 통한 부착); Sproat et al., Nucleic Acids Research, 15: 4837 (1987) (5' 머캅토 기); Nelson et al., Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194 (1989) (3' 아미노 기); 등.
로다민 및 비-형광 소광제 염료는 또한 예를 들어, Woo et al., 미국 특허 제5,231,191호; 및 Hobbs, Jr., 미국 특허 제4,997,928호에서 고체상 합성의 개시시 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 편리하게 부착된다.
6. 고체 지지체로의 CataCleave프로브의 부착
본원의 일 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 서로 다른 프로브들이 고체 지지체에 부착될 수 있고 시료에서 서로 다른 표적 서열들을 동시에 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 서로 다른 형광 파장을 갖는 리포터 분자는 서로 다른 프로브들에 사용될 수 있고, 따라서 서로 다른 프로브들에 대한 혼성화가 별개로 검출될 수 있게 한다.
올리고뉴클레오티드 프로브의 고정화를 위한 고체 지지체의 바람직한 형태의 예는 폴리스티렌, 아비딘 코팅된 폴리스티렌 비드 셀룰로즈, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 조절된 공극 유리(controlled pore glass: CPG), 유리 플레이트 및 고 교차-결합된(highly cross-linked) 폴리스티렌을 포함한다. 이러한 고체 지지체들은 그들의 화학적 안정성, 관능화(functionalization)의 용이 및 잘 정의된 표면적 때문에 혼성화 및 진단 연구에 바람직하다. CPG (500,　1000) 및 비-팽창 고 교차-결합 폴리스티렌 (1000)과 같은 고체 지지체가 그들의 올리고뉴클레오티드 합성과의 적합성의 관점에서 특히 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 프로브는 반응 용액에서 유리 형태로 존재할 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 프로브는 다양한 방식으로 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들면, 프로브는 고체 지지체로의 프로브의 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드의 부착에 의하여 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그러나, 프로브는 상기 고체 지지체로부터 프로브를 분리되게 하는 링커에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 링커는 가장 바람직하게는 길이가 30개 이상의 원자이고, 더 바람직하게는 길이가 50개 이상의 원자이다.
고체 지지체에 고정된 프로브의 혼성화는 일반적으로 프로브가 30개 이상의 원자, 더 바람직하게는 50개 이상의 원자에 의하여 고체 지지체로부터 분리되는 것을 요구한다. 이러한 분리를 이루기 위해서, 링커는 일반적으로 링커와 3' 뉴클레오시드 사이에 위치한 스페이서를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위해, 링커 팔(arm)은 대개 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 유리시키기 위하여 염기성 시약에 의해 절단될 수 있는 에스테르 결합에 의해 3' 뉴클레오시드의 3'-OH에 부착된다.
올리고뉴클레오티드 프로브를 고체 지지체에 부착하는데 사용될 수 있는 다양한 종류의 링커가 당업계에 알려져 있다. 링커는 표적 서열이 고체 지지체에 부착된 프로브에 혼성화되는 것을 유의성있게 방해하지 않는 화합물로 형성될 수 있다. 링커는 자동화된 합성에 의해 링커에 쉽게 첨가될 수 있는 단일중합체성(homopolymeric) 올리고뉴클레오티드로 형성될 수 있다. 대안적으로, 관능화된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 상기 링커로서 사용될 수 있다. 폴리머가 표적 올리고뉴클레오티드에 프로브가 혼성화 되는 것을 유의성있게 방해하지 않기 때문에 이러한 폴리머들은 단일중합체성 올리고뉴클레오티드보다 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜은 상업적으로 이용가능하고, 유기 및 수용성 매질 모두에 용해 가능하며, 관능화하기 용이하고, 올리고뉴클레오티드 합성 및 합성-후 조건 하에서 완전히 안정하기 때문에 특히 바람직하다.
고체 지지체, 링커 및 프로브 사이의 결합은 바람직하게는 높은 온도에서 염기성 조건 하에서 염기성 보호기를 제거하는 동안에 절단되지 않는다. 바람직한 결합의 예는 카르바메이트 및 아미드 결합을 포함한다. 프로브의 고정화는 당업계에 잘 알려져 있고 당업계에서 통상의 기술자는 고정화 조건을 결정할 수 있을 것이다.
본원의 일 구현예에 있어서, 혼성화 프로브는 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 혼성화에 유리한 조건 하에서 핵산의 시료와 접촉된다. 혼성화되지 않은 상태에서는, 형광 표지는 소광제에 의해 소광된다. 표적에 혼성화되면, 형광 표지는 소광제로부터 분리되어 형광을 낸다.
고체 지지체로의 혼성화 프로브의 고정화는 또한 프로브에 혼성화된 표적 서열을 시료로부터 쉽게 분리되게 할 수 있다. 이후의 단계에서, 분리된 표적 서열은 연구자의 특별한 필요에 맞게, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 고체 지지체에서 분리하여 가공(예를 들어, 정제, 증폭)될 수 있다.
7. CataCleave프로브를 사용한 표적 핵산 서열의 실시간 검출
표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 시료에서 표적 핵산 서열의 실시간 검출을 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브는 우선 선별된 표적 서열을 포함하는 PCR 엠플리콘 내에서 발견되는 서열에 상보적인 DNA 및 RNA 서열로 합성된다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 FRET 쌍으로 표지되고, 예를 들면 프로브의 한 쪽 말단은 플루오레세인 분자로, 및 다른 말단은 비-형광 소광제 분자로 표지된다.
그 다음에 실시간 핵산 증폭은 열안정성 핵산 폴리머라제, 열안정성 변형된 RNase H 활성, 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 PCR 증폭 프라이머 쌍, 및 표지된 CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브의 존재 하에 표적 폴리뉴클레오티드에서 수행된다. 표적 RNA 서열의 검출을 위하여, 반응 혼합물은 본 명세서에서 기재된 최초의 cDNA 합성 단계를 위한 역전사 효소 활성을 포함한다. 실시간 PCR 반응 동안, PCR 앰플리콘과 프로브의 혼성화는 RNase H 활성에 의하여 절단될 수 있는 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성한다. RNase H에 의한 프로브의 절단은 형광 소광제로부터 형광 공여체를 분리시키고 시료에서 표적 DNA 서열의 실시간 검출에 상응하는 프로브의 형광의 실시간 증가를 가져온다.
일부 구체예에서, 실시간 핵산 증폭은 약 40 PCR 증폭 싸이클 이하에서 단일 표적 DNA 분자의 실시간 검출을 가능하게 한다.
8. 키트
본 발명은 또한 시료에서 표적 핵산 서열의 실시간 검출을 위한 하나 이상의 시약을 갖는 포장 단위를 포함하는 키트 형태를 제공한다. 키트는 또한 하기의 품목을 하나 이상 포함할 수 있다: 버퍼, 사용설명서, 및 양성 또는 음성 대조군. 키트는 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위해 적절한 비율로 함께 혼합된 시약들의 용기들을 포함할 수 있다. 시약 용기들은 바람직하게는 본 방법을 수행할 때 측정하는 단계를 불필요하게 하는 단위 양들의 시약을 포함한다.
키트는 또한 열안정성 폴리머라제, 열안정성 변형된 RNase H, 핵산 표적 서열을 증폭시키기 위해 선별된 프라이머 및 실시간 PCR 산물에 어닐링되고 본 명세서에 기재된 방법론에 따라 표적 핵산 서열의 검출을 가능하게 하는 표지된 CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하나 이에 한정되지 않는, 실시간 PCR을 위한 반응 시약을 포함한다. 키트는 2 이상의 표적 핵산 서열의 검출을 위한 시약을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 키트 시약은 생물학적 시료로부터 게놈 DNA 또는 RNA의 추출을 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 키트 시약은 또한 적용할 수 있는 경우, 역전사 효소-PCR 분석을 위한 시약을 포함할 수 있다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것 일뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: RNase H 활성 억제 항체 개발
RNase H의 활성을 억제할 수 있는 항체를 선별하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 서열번호 1로 이루어진 RNase H의 일부 영역을 타겟으로 하는 8종의 항체를 개발하였으며, 상기 RNase H의 서열 및 상기 타겟 서열은 하기 표 1 및 2에 기재하였다.
효소 이름 아미노산 서열 서열번호
RNaseHII mkiggideag rgpaigplvv atvvvdekni eklrnigvkd skqltpherk nlfsqitsia ddykivivsp eeidnrsgtm nelevekfal alnslqikpa liyadaadvd anrfaslier
rlnykakiia ehkadakypv vsaasilakv vrdeeieklk kqygdfgsgy psdpktkkwl
eeyykkhnsf ppivrrtwet vrkieesika kksqltldkf fkkp		 1
항체이름 타겟 서열 서열번호
Ab1 mkiggideagrgpaigplvvatvvvdekni 2
Ab2 eklrnigvkdskqltpherknlfsqitsia 3
Ab3 ddykivivspeeidnrsgtmnelevekfal 4
Ab4 alnslqikpaliyadaadvdanrfaslier 5
Ab5 rlnykakiiaehkadakypvvsaasilakv 6
Ab6 vrdeeieklkkqygdfgsgypsdpktkkwl 7
Ab7 eeyykkhnsfppivrrtwetvrkieesika 8
Ab8 wetvrkieesikakksqltldkffkkp 9
다음으로, 상기에서 개발한 항체를 RNase H에 부착하기 위해 하기 표 3의 조건으로 실험을 수행하였다.
실험 시약 RNaseHII (1mg/ml) DEPC DW 10X PBS Ab 1~8 (200ug/ml) Total (ul)
사용량 (ul) 200 120 40 40 400
부착 조건 4℃, overnight
다음으로, 상기에서 개발한 항체가 RNase H의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 지 확인하기 위해, 서열번호 2 내지 6을 표적으로 하는 항체 Ab 1 내지 5를 실험 대상으로 하였으며, 상기 항체들을 각각 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 RNase H에 부착한 후, RNase H의 활성도 억제여부를 하기 실시예 2에 기재된 RNase H 활성도 측정 방법을 참고하여 측정하였다(항체를 RNase H에 부착한 후, 열처리하지 않은 상태에서 RNase 활성도를 측정함).
그 결과, 서열번호 6의 아미노산 서열을 타겟으로 하는 Ab 5 항체만이 RNase H의 활성도를 억제하는 것이 확인되었다(도 1). 따라서, 상기 서열번호 6(서열번호 1의 121번째 내지 150번째 아미노산)을 표적으로 하는 항체의 경우 우수한 RNase H 활성 억제효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 2: RNase H의 항체에 의한 가역적 활성 유도 효능 확인
상기 실시예 1에서 개발한 서열번호 6의 아미노산 서열을 타겟으로 하는 Ab 5 항체가 가역적으로 결합된 RNase H가 활성 유도 유무에 따라 활성을 가역적으로 조절할 수 있는지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 4의 시약 및 기기를 사용하였으며, 하기 프로브의 서열은 아래와 같다:
5'-FAM-AAG CCC TTrC rArGrC GGC CAG TAG -BHQ1-3' (서열번호 10)
사용 시약 및 기기
클린벤치 1M NaCl
Applied Biosystems, QuantStudio 5 1M NaOH
프로브 (10 pmol) 10X 반응 버퍼(Reaction buffer)for Taq DNA polymerase
증류수(DW) RNaseH
RNase H의 활성도를 측정하기 위하여, RNA 서열이 포함된 Probe를 RNase H와 반응시킨다. RNase H가 활성화 되어있는 경우 Probe는 분해되어 형광을 발현하고, 이는 형광측정 장비에 의해서 수치화된다.
실험 직전, Ab 5 항체가 부착된 RNase H(서열번호 1의 아미노산으로 구성됨)를 95℃에서 10분 동안 열 처리를 한 활성화된 RNaseH와, 열처리를 하지 않은 비-활성화된 RNaseH의 프로브 분해정도를 Applied Biosystems의 QuantStudio5 기기로 검사하여 비교하였다. 또한, 실험 전 RNaseH를 희석하였으며, 상기 희석은 10X 반응 버퍼(Reaction buffer)를 DW로 희석하여 1X 반응 버퍼로 만든 뒤, 아래 표 5의 예시처럼 RNaseH를 희석하였다.
RNaseHII 희석 예시
RNaseHII 1X 반응 버퍼
for Taq DNA polymerase
1/100 RNaseH 원액 5 ul 495 ul
1/500 RNaseH 1/100 90 ul 360 ul
1/750 RNaseH 1/500 100 ul 50 ul
1/1000 RNaseH 1/500 250 ul 250 ul
1/1250 RNaseH 1/1000 200 ul 50 ul
1/1750 RNaseH 1/1000 100 ul 75 ul
1/2000 RNaseH 1/1000 100 ul 100 ul
1/2500 RNaseH 1/1000 80 ul 120 ul
다음으로, 상기와 같이 희석된 RNaseH 중 열처리할 농도를 선택하였으며, 처음 실험 시 1/100로 희석된 RNaseH와 1/500로 희석된 RNaseH를 비-활성화로 선정하고, 95℃에서 10분 동안 열 처리를 할 RNaseH의 농도도 선택하였다 (예를 들어, 1/500, 1/1000, 1/1750 선택). 선택한 농도 중 열처리할 RNaseH 1/500, 1/1000, 1/1750은 실험 직전, 각각 10 ul를 95℃에서 10분 동안 열처리 한 후, 실험에 사용하였다. 또한, 실험을 위한 혼합물은 아래의 표 6과 같이 제작하고 필요한 실험양에 맞게 제작하였다.
프로브 가수분해 혼합물 (Probe Hydrolysis Mixture) 제작
10X 반응 버퍼
for Taq polymerase		 2 ul
증류수 12 ul 또는 5 ul
RNaseH (활성 또는 비활성) 또는 1M NaOH* 1 ul 또는 8 ul
전체 양 15 ul
1M NaOH는 프로브 가수분해의 양성 대조군으로 사용하였고, RNaseHII, 1M NaOH 대신 증류수를 넣어 음성 대조군으로 사용하였다. 96-웰 플레이트에 혼합한 시약 15 ul를 분주하였고, 상기 96-웰 플레이트의 가장자리는 에러를 줄이기 위해 사용하지 않았다.
다음으로, 어닐링(Annealing)된 프로브 10ul에 증류수를 240ul 넣고 볼텍싱하여 잘 섞어준 후, 상기 섞어준 시약을 5ul씩 12 채널 피펫을 이용하여 상기 96-웰 플레이트에 넣었다 (RNaseH 또는 1M NaOH에 의해 프로브 가수분해가 미리 진행되지 않도록 하여 실험간 차이를 최소화하면서 실험함). 다음으로 상기 96-웰 플레이트를 봉합한 후 스핀 다운하였고, 실험을 위해 Applied Biosystems의 QuantStudio5를 사용하였으며, 기기의 실험조건은 하기 표 7과 같다.
프로브 가수분해 조건
1 37 ℃ 1 초 1 사이클
2 55 ℃ * 1 초 1 사이클
3 55 ℃ 10 초 20 사이클
4 55 ℃ 10 초
5 55 ℃ * 30 초
6 37 ℃ 2 분 1 사이클
* 가 있는 온도에서 FAM 형광을 측정함.
상기와 같은 방법으로, 서열번호 6을 표적으로 하는 Ab 5를 RNase H에 부착한 후, 95℃, 10분 열처리 활성유도 유무에 따라 RNase H의 활성이 조절되는 지 확인한 결과, 활성 유도에 따라 활성이 조절되는 것을 확인하였는 바(도 2), 상기 Ab 5를 이용하면 RNase H의 활성을 효과적으로 조절할 수 있음을 알 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 본 발명을 구현할 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로 상기 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 한다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
<110> 1DROP <120> A composition for amplifying target nucleic acid, including RNase H enzyme and antibody thereof, and use thereof <130> PA19-093A <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfu_RNase H <400> 1 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile Glu Lys 20 25 30 Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro His Glu 35 40 45 Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala Asp Asp Tyr Lys 50 55 60 Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn Arg Ser Gly Thr Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu Ala Leu Asn Ser Leu Gln 85 90 95 Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn 100 105 110 Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr 165 170 175 Lys Lys Trp Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile 195 200 205 Lys Ala Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 210 215 220 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab1 <400> 2 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab2 <400> 3 Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro 1 5 10 15 His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab3 <400> 4 Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn Arg 1 5 10 15 Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab4 <400> 5 Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp Ala 1 5 10 15 Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab5 <400> 6 Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 20 25 30 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab6 <400> 7 Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp Phe 1 5 10 15 Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab7 <400> 8 Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg Arg 1 5 10 15 Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala 20 25 30 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab8 <400> 9 Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala Lys Lys Ser 1 5 10 15 Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 20 25 <210> 10 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <220> <223> 9 to 12 nucletides are ribonucletides <400> 10 aagcccttca gcggccagta g 21 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfu_RNase H_5-20 <400> 11 Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly Pro Leu Val Val 1 5 10 15 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfu_RNase H_33-44 <400> 12 Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfu_RNase H_132-150 <400> 13 His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfu_RNase H_158-173 <400> 14 Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp 1 5 10 15

Claims (10)

  1. RNase H 효소를 포함하는, 표적 핵산 증폭용 조성물로서,
    상기 RNase H 효소는 서열 번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고,
    상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되는 것인, 표적 핵산 증폭용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 RNase H 효소의 활성은 90℃ 이상의 온도에서 유도되고 열-유도성인 것인, 표적 핵산 증폭용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 RNase H 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 표적 핵산 증폭용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 RNase H 효소는 피로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코시 (Pyrococcus horikoshi), 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 써머스 써모필러스 (Thermus thermophilus) 또는 대장균 (E. coli)으로부터 분리되는 것인, 표적 핵산 증폭용 조성물.
  5. 표적 서열을 증폭하는 방법으로서,
    하기를 포함하는 증폭 반응 조성물을 제공하는 단계;
    표적 DNA 서열을 포함하는 시료;
    DNA 폴리머라제와 RNase H 효소를 포함하는 조성물로서, 상기 RNase H 효소는 서열 번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고, 상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되고, 상기 RNase H 효소의 활성은 90℃ 이상의 온도에서 유도되고 열-유도성인 것인 조성물;
    상기 표적 DNA 서열의 5' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제1 프라이머;
    상기 표적 DNA 서열의 3' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머; 및
    검출가능한 표지와 연결되고 상기 RNase H에 의하여 절단될 수 있는 위치를 갖는 프로브; 및
    상기 증폭 반응 조성물로 하나 이상의 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 증폭 산물을 생성하는 단계, 및
    수득된 증폭 산물의 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 증폭 반응은 90℃ 이상의 온도로 상기 반응 조성물을 가열하는 단계를 포함하는 것인, 표적 서열을 증폭하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 반응 조성물을 가열하는 단계는 95℃ 이상에서 수행되는 것인,
    표적 서열을 증폭하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 프로브는 하나 이상의 DNA 서열 부분과 하나의 RNA 서열 부분을 포함하고, 상기 RNA 서열 부분이 RNA 서열의 3' 말단과 5' 말단이 두개의 DNA 서열의 각각에 연결되는 방식으로 두개의 DNA 서열 사이에 배열된 올리고뉴클레오티드인 것인,
    표적 서열을 증폭하는 방법.
  8. 시료에서 표적 RNA 서열을 검출하는 방법으로서,
    하기를 포함하는 증폭 반응 조성물을 제공하는 단계;
    표적 RNA 서열을 포함하는 시료,
    역전사 효소, DNA 폴리머라제 및 RNase H 효소를 포함하는 조성물로서, 상기 RNase H 효소는 서열번호 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 RNase H 상동성 영역을 포함하고, 상기 RNase H 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역을 표적으로 하는 항체에 의해 가역적으로 활성이 유도되고, 상기 RNase H의 활성은 90℃ 이상의 온도에서 유도되고 열-유도성인 것인 조성물;
    검출가능한 표지를 포함하고 상기 RNase H의 절단 서열을 포함하는 프로브 서열;
    상기 표적 RNA 서열의 5' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제1프라이머; 및
    상기 표적 RNA 서열의 3' 말단에 상보적인 서열을 포함하는 제2프라이머;
    RNA:cDNA 듀플렉스를 형성하기 위하여 표적 RNA의 역전사를 개시하는 단계;
    90℃ 이상의 온도까지 상기 반응 조성물을 가열하고 그에 의해 RNA:cDNA 듀플렉스의 RNA 부분을 분해하기 위하여 상기 RNase H를 활성화시키는 단계;
    하나 이상의 증폭 산물을 형성하기 위하여 하나 이상의 증폭 반응을 개시하는 단계, 및
    수득된 증폭 산물의 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 프로브는 하나 이상의 DNA 서열 부분과 하나의 RNA 서열 부분을 포함하고, 상기 RNA 부분이 RNA 서열의 3' 말단과 5' 말단이 두개의 DNA 서열의 각각에 연결되는 방식으로 두개의 DNA 서열 사이에 배열된 것인 올리고뉴클레오티드인,
    표적 서열을 증폭하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 반응 조성물을 가열하는 단계는 95℃ 이상에서 수행되는 것인,
    표적 서열을 증폭하는 방법.
KR1020200122781A 2019-09-23 2020-09-23 RNase H 효소 및 이의 항체를 포함하는, 표적 핵산 증폭용 조성물 및 이의 용도 KR102516307B1 (ko)

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