JP2013528384A5 - - Google Patents
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本願は、２０１０年５月２５日に出願されたアメリカ仮出願第６１／３４７，９８４号から主張される優先権の利益を主張し、前記仮出願の内容は、その全体として参照として本明細書に含まれる。
本発明は、ＲＮＡ配列の改善されたリアルタイム逆転写酵素−ＰＣＲ検出のための修飾されたＲＮａｓｅ Ｈに関する。
遺伝子発現を研究するために最も汎用される技術のうち一つは、ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして、ｍＲＮＡ配列の第１鎖ｃＤＮＡを利用することである。逆転写酵素−ＰＣＲ技法と組み合わされたＰＣＲ反応の動力学を測定する能力は、必要なレベルの感度でもって、標的ＲＮＡ配列の正確で精密な測定を促進することを保証する。特に、「CATACLEAVE(商標)エンドヌクレアーゼ分析」（特許文献１に詳細に開示；図１参照）のような蛍光二重標識されたハイブリダイゼーションプローブ技術は、リアルタイムで逆転写酵素−ＰＣＲ増幅の検出を可能にする。標的配列の検出は、増幅反応で、ＲＮａｓｅ Ｈと共に、
CATACLEAVE(商標)プローブを含むことによって達成される。逆転写酵素−ＰＣＲ増幅産物内の標的配列に相補的なCATACLEAVE(商標)プローブは、ＲＮＡ配列及びＤＮＡ配列を含むキメラ構造を有し、その５’末端及び３’末端が、検出可能なマーカー(例えば、ＦＲＥＴ対標識されたＤＮＡ配列に隣接する。ＦＲＥＴ対の蛍光標識が消光剤（quencher）に近接すると、完全なプローブの蛍光を抑制する。逆転写酵素−ＰＣＲ産物にプローブをアニーリングすれば、反応混合物に存在するＲＮａｓｅ Ｈによって切断されるＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖が生成される。アニーリングされたプローブのＲＮＡ部分内の切断は、消光剤から蛍光標識を分離させ、引き続いて蛍光の放出をもたらす。
CATACLEAVE(商標)プローブを含むことによって達成される。逆転写酵素−ＰＣＲ増幅産物内の標的配列に相補的なCATACLEAVE(商標)プローブは、ＲＮＡ配列及びＤＮＡ配列を含むキメラ構造を有し、その５’末端及び３’末端が、検出可能なマーカー(例えば、ＦＲＥＴ対標識されたＤＮＡ配列に隣接する。ＦＲＥＴ対の蛍光標識が消光剤（quencher）に近接すると、完全なプローブの蛍光を抑制する。逆転写酵素−ＰＣＲ産物にプローブをアニーリングすれば、反応混合物に存在するＲＮａｓｅ Ｈによって切断されるＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖が生成される。アニーリングされたプローブのＲＮＡ部分内の切断は、消光剤から蛍光標識を分離させ、引き続いて蛍光の放出をもたらす。
試験試料で、核酸配列の改善されたCATACLEAVE(商標)プローブ検出のための、可逆的に修飾された「ホットスタート（hot start）」ＲＮａｓｅ Ｈ酵素組成物について記載する。前記酵素組成物の重要な特徴は、逆転写ＰＣＲサイクルの過程中、ＲＮａｓｅ Ｈの触媒活性を調節する能力である。従って、逆転写前に、ＲＮＡ：ＤＮＡプライマーヘテロ二本鎖の分解を最小化するために、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、最初は抑制される。ｃＤＮＡ合成が完了した後、逆転写酵素−ＰＣＲ産物内の標的ＤＮＡ配列にアニーリングするCATACLEAVE(商標)プローブの切断と蛍光検出とを促進するために、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が誘導される。誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、単一反応混合物で、一段階逆転写酵素CATACLEAVE(商標)ＰＣＲを要求する高速大量適用（high through application）に使われる。
一実施態様において、本発明は、誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を含むホットスタート酵素組成物を含む。前記酵素は、配列番号１１，１２，１３または１４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％，８０％，９０％，９５％または９９％の配列相同性を有することができる熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈドメインを有することができる。
ホットスタート組成物は、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性のようなポリメラーゼ活性を有することができる。前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、熱誘導性またはｐＨ誘導性であってもよい。
一実施態様において、前記誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素は、ピューロコッカス・フリオスス（Prococcus furiosus）ＲＮａｓｅ ＨＩＩ、ピューロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshi）ＲＮａｓｅ ＨＩＩ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）ＲＮａｓｅ ＨＩ、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）ＲＮａｓｅ ＨＩ、大腸菌（Ｅ．coli）ＲＮａｓｅ ＨＩまたは大腸菌ＲＮａｓｅ ＨＩＩであってもよい。
前記誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素は、化学的修飾によって、可逆的に修飾されもする。実施態様において、前記酵素は、リシンのような、酵素のアミノ酸のアシル化、または約０．２ないし約１％（ｗ／ｖ）の濃度を有するホルムアルデヒドとの反応によって可逆的に修飾されもする。
一実施態様において、ホットスタート酵素組成物は、リガンドをさらに含み、誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、リガンドと酵素との結合によって抑制されたり、あるいはリガンドと酵素との結合の干渉によって誘導されもする。リガンドは、熱不安定性であってもよい。酵素とリガンドとの結合は、非共有性結合である。
前記リガンドは、誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有した前記酵素に対して、１０−１Ｍ以下のＫＤ解離定数を有するペプチド、核酸または小分子であってもよい。いくつかの実施態様において、前記リガンドは、ＲＮａｓｅ Ｈドメインに結合したり、あるいはＲＮａｓｅ Ｈドメインの立体構造変化（conformational change）を誘導することができる。
前記リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマーまたはキレート剤であってもよい。
前記抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単一鎖Ｆｖまたは単一鎖ｓｃＦｖ、二硫化結合されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディー（intrabody）、ＩｇＧＤＣＨ２、ミニボディ（minibody）、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ（tetrabody）、トリアボディ（triabody）、ジアボディ（diabody）、（ｓｃＦｖ）２、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２またはｓｃＦｖ−Ｆｃであってもよい。
前記抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単一鎖Ｆｖまたは単一鎖ｓｃＦｖ、二硫化結合されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディー（intrabody）、ＩｇＧＤＣＨ２、ミニボディ（minibody）、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ（tetrabody）、トリアボディ（triabody）、ジアボディ（diabody）、（ｓｃＦｖ）２、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２またはｓｃＦｖ−Ｆｃであってもよい。
前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、（１）酵素を含む溶液を約９０℃以上の温度まで加熱したり、あるいは（２）酵素を含む溶液のｐＨを約７．０以下で下げることによって誘導される。前記溶液は、標的核酸配列を含むポリメラーゼ連鎖反応試料であってもよい。
酵素とリガンドとの結合は、共有結合であってもよい。例えば、リガンドは、交差結合剤（cross-linking agent）である。
一実施態様において、本発明は、標的配列を増幅する方法であって、
標的ＤＮＡ配列を含む試料と、
ＤＮＡポリメラーゼと誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含むホットスタート酵素組成物と、標的核酸配列の５’末端に相補的な配列を含む第１プライマーと、
標的核酸配列の３’末端に相補的な配列を含む第２プライマーと、
検出可能な標識と連結され、ＲＮａｓｅ Ｈによって切断される組成を有するプローブと、を有する増幅反応混合物を提供する段階；
一つ以上の増幅産物を生成するために、増幅反応組成物に一つ以上の増幅反応を遂行する段階；及び
収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階を含み、前記増幅反応は、約９０℃の温度に反応組成物を加熱する段階を含む方法である。
標的ＤＮＡ配列を含む試料と、
ＤＮＡポリメラーゼと誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含むホットスタート酵素組成物と、標的核酸配列の５’末端に相補的な配列を含む第１プライマーと、
標的核酸配列の３’末端に相補的な配列を含む第２プライマーと、
検出可能な標識と連結され、ＲＮａｓｅ Ｈによって切断される組成を有するプローブと、を有する増幅反応混合物を提供する段階；
一つ以上の増幅産物を生成するために、増幅反応組成物に一つ以上の増幅反応を遂行する段階；及び
収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階を含み、前記増幅反応は、約９０℃の温度に反応組成物を加熱する段階を含む方法である。
前記反応組成物を加熱する段階は、約９５℃で遂行されもする。
前記プローブは、一つ以上のＤＮＡ配列部分と、１つのＲＮＡ配列部分とを含み、前記ＲＮＡ部分は、ＲＮＡ配列の３’末端と５’末端とが２つのＤＮＡ配列のそれぞれに連結される方式で、２つのＤＮＡ配列の間に配列されるものであるオリゴヌクレオチドであってもよい。
前記加熱段階は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素とリガンドとの結合を破壊することによって、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導することができる。前記リガンドは、熱不安定性であってもよい。
他の実施態様において、本発明は、試料中の標的ＲＮＡ配列を検出する方法であり、
標的ＤＮＡ配列を含む試料と、
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を含み、前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、リガンドによって抑制されるものであるホットスタート酵素組成物と、
検出可能な標識を含み、ＲＮａｓｅ Ｈの切断配列を含むプローブ配列と、
標的核酸配列の５’末端に相補的な配列を含む第１プライマーと、
標的核酸配列の３’末端に相補的な配列を含む第２プライマーと、
を含む増幅反応組成物を提供する段階；
ＲＮＡ：ＤＮＡ（ｃＤＮＡは、産物が二重鎖ＤＮＡであり、逆転写酵素産物ではないものを意味する）二本鎖を形成するために標的ＲＮＡの逆転写を開始する段階；
約９０℃以上の温度に反応組成物を加熱し、それにより、ＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ部分を分解する誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化させる段階；
一つ以上の増幅産物を生成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階；及び収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階；
を有する方法である。
標的ＤＮＡ配列を含む試料と、
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を含み、前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、リガンドによって抑制されるものであるホットスタート酵素組成物と、
検出可能な標識を含み、ＲＮａｓｅ Ｈの切断配列を含むプローブ配列と、
標的核酸配列の５’末端に相補的な配列を含む第１プライマーと、
標的核酸配列の３’末端に相補的な配列を含む第２プライマーと、
を含む増幅反応組成物を提供する段階；
ＲＮＡ：ＤＮＡ（ｃＤＮＡは、産物が二重鎖ＤＮＡであり、逆転写酵素産物ではないものを意味する）二本鎖を形成するために標的ＲＮＡの逆転写を開始する段階；
約９０℃以上の温度に反応組成物を加熱し、それにより、ＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ部分を分解する誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化させる段階；
一つ以上の増幅産物を生成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階；及び収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階；
を有する方法である。
プローブは、一つ以上のＤＮＡ配列部分と、１つのＲＮＡ配列部分とを含み、前記ＲＮＡ部分は、ＲＮＡ配列の３’末端と５’末端とが２つのＤＮＡ配列のそれぞれに連結される方式で、２つのＤＮＡ配列間に配列されたものであるオリゴヌクレオチドであってもよい。標的ＲＮＡ配列は、レトロウイルスであってもよい。反応組成物を加熱する段階は、約９５℃で遂行されもする。前記加熱段階は、誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化させることができる。前記リガンドは、熱不安定性であってもよい。
さらに他の実施態様において、本発明は、本明細書に記載されたホットスタート酵素組成物を有するマイクロアレイを記載する。
さらに他の実施態様において、本発明は、複数の試料で標的ＲＮＡ配列を検出する方法であって、
標的ＲＮＡ配列を含む試料と、
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性
を含み、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、前記リガンドによって抑制されるホットスタート酵素組成物と、検出可能な標識を含み、
ＲＮａｓｅ Ｈの切断配列を含むプローブ配列と、
標的核酸配列の５’末端に相補的な配列を含む第１プライマーと、
標的核酸配列の３’末端に相補的な配列を含む第２プライマーと、
を含む複数の増幅反応組成物を有するマイクロアレイを提供する段階；
マイクロアレイの中でそれぞれの増幅反応組成物に対して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖を形成するために標的ＲＮＡの逆転写を開始する段階；
約９０℃以上の温度まで前記反応組成物を加熱し、それにより、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を分解する誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化させる段階；
一つ以上の増幅産物を形成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階；及び
収得した増幅産物の検出可能な標識を測定する段階；を含む方法である。
前記標的ＲＮＡ配列は、レトロウイルスであってもよい。前記反応組成物を加熱する段階は、誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化させることができる約９５℃で遂行されもする。前記リガンドは、熱不安定性であってもよい。
一実施態様において、本発明は、逆転写酵素活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を含むことができるホットスタート組成物のマイクロアレイを有するキットを開示する。
標的ＲＮＡ配列を含む試料と、
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性
を含み、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、前記リガンドによって抑制されるホットスタート酵素組成物と、検出可能な標識を含み、
ＲＮａｓｅ Ｈの切断配列を含むプローブ配列と、
標的核酸配列の５’末端に相補的な配列を含む第１プライマーと、
標的核酸配列の３’末端に相補的な配列を含む第２プライマーと、
を含む複数の増幅反応組成物を有するマイクロアレイを提供する段階；
マイクロアレイの中でそれぞれの増幅反応組成物に対して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖を形成するために標的ＲＮＡの逆転写を開始する段階；
約９０℃以上の温度まで前記反応組成物を加熱し、それにより、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を分解する誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化させる段階；
一つ以上の増幅産物を形成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階；及び
収得した増幅産物の検出可能な標識を測定する段階；を含む方法である。
前記標的ＲＮＡ配列は、レトロウイルスであってもよい。前記反応組成物を加熱する段階は、誘導性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化させることができる約９５℃で遂行されもする。前記リガンドは、熱不安定性であってもよい。
一実施態様において、本発明は、逆転写酵素活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を含むことができるホットスタート組成物のマイクロアレイを有するキットを開示する。
前述の具現例は、ＲＮＡ配列のCATACLEAVE(商標)逆転写ＰＣＲ検出の感度を向上させるために、修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ酵素を使用することを含む多くの長所を有する。向上した検出方法は、早くて正確であり、高速大量適用に適する。ＲＮＡ配列の高速大量検出のための、便利であってユーザ親和的であり、信頼性ある診断キットをも記載する。
本明細書に開示された実施態様の実施は、取り立てて表示されなければ、当業界で知られた一般的なな分子生物学的技法を利用する。このような技法は、当業者に周知されており、文献に十分に説明されている。例えば、すべての付録を含んだ、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８７−２００８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。
本明細書で取り立てて、定義されていない限り、本明細書で使用されたすべての技術的、科学的な用語は、当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。また、本明細書は、詳細な説明及び請求項の解釈の一助とするために、用語の定義を提供する。本明細書の定義が、他の定義と一致しなければ、本明細書に説明された定義が適用されるのである。
ＲＮａｓｅ Ｈ酵素及びＲＮａｓｅ Ｈドメイン
本願は、CataCleave(商標)逆転写酵素ＰＣＲ反応に使用するための修飾された熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ酵素組成物を開示する。
ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのうちＲＮＡを加水分解する。子牛胸腺で初めて発見されたＲＮａｓｅ Ｈは、その後多くの生物で開示された。事実、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、真核生物及びバクテリアに偏在しているように見える。ＲＮａｓｅ Ｈは、多様な分子量と核酸分解活性とを有するタンパク質のファミリーを形成するが、基質要求性は、多様な亜型に対して類似していると見られる。例えば、現在まで研究されたほとんどのＲＮａｓｅ Ｈは、エンドヌクレアーゼとして機能し、５’ホスフェート末端及び３’ヒドロキシル末端を有する切断産物を生成するために、二価陽イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋）を要求する。
本願は、CataCleave(商標)逆転写酵素ＰＣＲ反応に使用するための修飾された熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ酵素組成物を開示する。
ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのうちＲＮＡを加水分解する。子牛胸腺で初めて発見されたＲＮａｓｅ Ｈは、その後多くの生物で開示された。事実、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、真核生物及びバクテリアに偏在しているように見える。ＲＮａｓｅ Ｈは、多様な分子量と核酸分解活性とを有するタンパク質のファミリーを形成するが、基質要求性は、多様な亜型に対して類似していると見られる。例えば、現在まで研究されたほとんどのＲＮａｓｅ Ｈは、エンドヌクレアーゼとして機能し、５’ホスフェート末端及び３’ヒドロキシル末端を有する切断産物を生成するために、二価陽イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋）を要求する。
ＲＮａｓｅ Ｈは、原核生物で、クローニングされ、広範囲に特徴づけられている（Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｔａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３１２（Ｐｔ２），５９９−６０８；Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７２，２７５１３−２７５１６；Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，３９０−３９８；Ｌｉｍａ ｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７２，１８１９１−１８１９９；Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２００７） Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，８３−９１；Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，７３−８２；Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７８，１４９０６−１４９１２；Ｌｉｍａ ｅｔａｌ．，（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７８，４９８６０−４９８６７；Ｉｔａｙａ Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，８５８７−８５９１を参照）。例えば、Ｅ．Coli ＲＮａｓｅ ＨＩは、長さが１５５個のアミノ酸からなるが、Ｅ．Coli ＲＮａｓｅ ＨＩＩは、長さが２１３個のアミノ酸からなる。Ｅ．coli ＲＮａｓｅ ＨＩＩは、Ｅ．coli ＲＮａｓｅ ＨＩとわずか１７％の相同性を示す。Ｓ．typhimuriumからクローニングされたＲＮａｓｅ Ｈは、Ｅ．coli ＲＮａｓｅ ＨＩと科１１個の位置でのみ異なり、長さが１５５個のアミノ酸からなる（Ｉｔａｙａ Ｍ．ａｎｄ Ｋｏｎｄｏ Ｋ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９１，１９，４４４３−４４４９）。
ＲＮａｓｅ Ｈ活性を示すタンパク質もまた、数多くのウイルス、他のバクテリア及び酵母からクローニングされて精製された（Ｗｉｎｔｅｒｓｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，１９９０，４８，２５９−２８０）。多くの場合、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するタンパク質は、ＲＮａｓｅ Ｈが他の酵素、しばしばＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された融合タンパク質であるようだ。ＲＮａｓｅ Ｈドメインは、Ｅ．coli ＲＮａｓｅ ＨＩに相同性が高いと一貫して確認されたが、他のドメインが相当に異なるため、その融合タンパク質の分子量及び他の特性が幅広く多様である。
高等真核生物で、分子量、二価陽イオンの効果、スルフィドリル作用剤（sulfhydryl agents）及び免疫学的交差−反応性での差異に基づいて、２種のＲＮａｓｅ Ｈが定義された（Ｂｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，１９７７，７４，２０３−２０８）。ＲＮａｓｅ ＨＩ酵素は、６８ないし９０ｋＤａ範囲の分子量を有し、Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋によって活性化され、スルフィドリル作用剤に敏感ではないと報告された。一方、ＲＮａｓｅ ＨＩＩ酵素は、３１ないし４５ｋＤａ範囲の分子量を有し、Ｍｇ２＋を要求し、スルフィドリル作用剤に相当に敏感であり、Ｍｎ２＋によって抑制されると報告された（Ｂｕｓｅｎ，Ｗ．，ａｎｄ Ｈａｕｓｅｎ，Ｐ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７５，５２，１７９−１９０；Ｋａｎｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８８，２７，３１８７−３１９６；Ｂｕｓｅｎ，Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８２，２５７，７１０６−７１０８）。
異種からのＲＮａｓｅの詳細な比較は、Ｏｈｔａｎｉ Ｎ，Ｈａｒｕｋｉ Ｍ，Ｍｏｒｉｋａｗａ Ｍ，Ｋａｎａｙａ Ｓ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．１９９９；８８（１）：１２−９に報告された。
また、ＲＮａｓｅ ＨＩＩ特性を有した酵素がヒト胎盤からほぼ純粋に（homogeneity）分離された（Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２，５２４７−５２５４）。このタンパク質は、約３３ｋＤａの分子量を有し、ｐＨ６．５ないし１０の範囲で活性があり、最適ｐＨがｐＨ８．５ないし９である。前記酵素は、Ｍｇ２＋を要求し、Ｍｎ２＋及びｎ−エチルマレイミドによって阻害される。切断反応の産物は、３’ヒドロキシル末端と５’ホスフェート末端を有する。
実施態様で使用されるＲＮａｓｅ Ｈ酵素の例は、ピューロコッカス・フリオススＲＮａｓｅ ＨＩＩ、ピューロコッカス・ホリコシイＲＮａｓｅ ＨＩＩ、サーモコッカス・リトラリスＲＮａｓｅ ＨＩ、サーマス・サーモフィルスＲＮａｓｅ ＨＩのような好熱性生物から分離した熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈをさらに含むが、これらに限定されるものではない。実施態様で使用される他のＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、例えば、ウエモリの米国特許第７，４２２，８８８号明細書またはワルダー米国公開出願第２００９／０３２５１６９号に記載されており、その内容は、本明細書に参照として含まれる。
一実施態様において、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、下記で表示される、Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩのアミノ酸配列（配列番号１）と、４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，９５％または９９％の相同性を有する熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈである。
MKIGGIDEAG RGPAIGPLVV ATVVVDEKNI EKLRNIGVKD SKQLTPHERK NLFSQITSIA ６０
DDYKIVIVSP EEIDNRSGTM NELEVEKFAL ALNSLQIKPA LIYADAADVD ANRFASLIER １２０
RLNYKAKIIA EHKADAKYPV VSAASILAKV VRDEEIEKLK KQYGDFGSGY PSDPKTKKWL１８０
EEYYKKHNSF PPIVRRTWET VRKIEESIKA KKSQLTLDKF FKKP ２２４
DDYKIVIVSP EEIDNRSGTM NELEVEKFAL ALNSLQIKPA LIYADAADVD ANRFASLIER １２０
RLNYKAKIIA EHKADAKYPV VSAASILAKV VRDEEIEKLK KQYGDFGSGY PSDPKTKKWL１８０
EEYYKKHNSF PPIVRRTWET VRKIEESIKA KKSQLTLDKF FKKP ２２４
相同性は、例えば、コンピュータ・プログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（Takara Shuzo）、コンピュータ・アルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４４−２４４８，１９８８）またはコンピュータ・アルゴリズムＢＬＡＳＴ（バージョン２．０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）を利用して決定される。
他の実施態様において、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、配列番号１の５ないし２０，３３ないし４４，１３２ないし１５０、及び１５８ないし１７３の位置に相応する相同性領域１ないし４のうち一つ以上を有する熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈである（図１２参照）。
相同性領域１：ＧＩＤＥＡＧ ＲＧＰＡＩＧＰＬＶＶ（配列番号１０；配列番号１の５ないし２０の位置に相当する）
相同性領域２：ＬＲＮＩＧＶＫＤ ＳＫＱＬ（配列番号１１；配列番号１の３３ないし４４の位置に相当する）
相同性領域３：ＨＫＡＤＡＫＹＰＶ ＶＳＡＡＳＩＬＡＫＶ（配列番号１２；配列番号１の１３２ないし１５０の位置に相当する）
相同性領域４：ＫＬＫ ＫＱＹＧＤＦＧＳＧＹＰＳＤ（配列番号１３；配列番号１の１５８ないし１７３の位置に相当する）
相同性領域２：ＬＲＮＩＧＶＫＤ ＳＫＱＬ（配列番号１１；配列番号１の３３ないし４４の位置に相当する）
相同性領域３：ＨＫＡＤＡＫＹＰＶ ＶＳＡＡＳＩＬＡＫＶ（配列番号１２；配列番号１の１３２ないし１５０の位置に相当する）
相同性領域４：ＫＬＫ ＫＱＹＧＤＦＧＳＧＹＰＳＤ（配列番号１３；配列番号１の１５８ないし１７３の位置に相当する）
他の実施態様において、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、配列番号１０，１１，１２または１３のポリペプチド配列と、５０％，６０％，７０％，８０％，９０％の配列相同性を有する相同性領域のうち一つ以上を有する熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈである。
本明細書で使用される用語「配列相同性（sequence identity）」は、配列が比較のウィンドーで、アミノ酸対アミノ酸の基準において同一であるか、あるいは機能的にまたは構造的に類似した程度を意味する。従って、「配列相同性の百分率（percentage of sequence identity）」は、例えば、比較のウィンドーで、２つの最適に整列された配列を比較し、一致した位置の数を収得するために、２つの配列で同一のアミノ酸が示される位置の数を決定し、比較のウィンドー（すなわち、ウィンドーの大きさ）で、位置の総数によって、前記一致した位置の数を分け、配列相同性の百分率を収得するために、その結果に１００を乗じることによって計算されもする。
ＲＮａｓｅ Ｈの修飾
本明細書で使用される用語「修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ（modified ＲＮａｓｅ Ｈ）」は、ＲＮａｓｅ Ｈのエンドヌクレアーゼ活性の喪失を誘発する抑制因子に可逆的に連結されたり、あるいは可逆的に結合したＲＮａｓｅ Ｈであってもよい。ＲＮａｓｅ Ｈからの抑制因子の放出または分離（decoupling）は、ＲＮａｓｅ Ｈのエンドヌクレアーゼ活性の完全な、または少なくとも一部活性を回復させる。完全な（intact）ＲＮａｓｅ Ｈの活性の約３０ないし１００％が十分である。抑制因子は、リガンドまたは化学的修飾であってもよい。リガンドは、抗体、アプタマー、受容体、共同因子またはキレート剤であってもよい。リガンドは、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性部位に結合し、これにより、酵素活性を阻害したり、あるいはＲＮａｓｅの活性部位から遠く離れた部位に結合することができる。一部実施態様において、前記リガンドは、立体構造的変化を誘導することができる。前記化学的修飾は、交差結合（例えば、ホルムアルデヒドによる交差結合）またはアシル化であってもよい。ＲＮａｓｅ ＨＩＩからの抑制因子の放出または分離は、連結されたＲＮａｓｅ ＨＩＩ（不活性）を含む試料または混合物を、約６５℃ないし約９５℃、またはそれ以上の温度まで加熱し、かつ／または試料または混合物のｐＨを約７．０以下に下げることによって達成される。
本明細書で使用される用語「修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ（modified ＲＮａｓｅ Ｈ）」は、ＲＮａｓｅ Ｈのエンドヌクレアーゼ活性の喪失を誘発する抑制因子に可逆的に連結されたり、あるいは可逆的に結合したＲＮａｓｅ Ｈであってもよい。ＲＮａｓｅ Ｈからの抑制因子の放出または分離（decoupling）は、ＲＮａｓｅ Ｈのエンドヌクレアーゼ活性の完全な、または少なくとも一部活性を回復させる。完全な（intact）ＲＮａｓｅ Ｈの活性の約３０ないし１００％が十分である。抑制因子は、リガンドまたは化学的修飾であってもよい。リガンドは、抗体、アプタマー、受容体、共同因子またはキレート剤であってもよい。リガンドは、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性部位に結合し、これにより、酵素活性を阻害したり、あるいはＲＮａｓｅの活性部位から遠く離れた部位に結合することができる。一部実施態様において、前記リガンドは、立体構造的変化を誘導することができる。前記化学的修飾は、交差結合（例えば、ホルムアルデヒドによる交差結合）またはアシル化であってもよい。ＲＮａｓｅ ＨＩＩからの抑制因子の放出または分離は、連結されたＲＮａｓｅ ＨＩＩ（不活性）を含む試料または混合物を、約６５℃ないし約９５℃、またはそれ以上の温度まで加熱し、かつ／または試料または混合物のｐＨを約７．０以下に下げることによって達成される。
本明細書で使用される用語「不活性化されたＲＮａｓｅ Ｈ（「または」不活性ＲＮａｓｅ Ｈ」は、それ以外には、同一の実験条件下で、５０℃で決定された修飾されていないＲＮａｓｅ Ｈ（１００％と見なされる）と比較し、約７５％以上、約８５％以上または約９５％以上のエンドヌクレアーゼ活性を喪失したＲＮａｓｅ Ｈを意味する。
本明細書で使用される用語「活性化されたＲＮａｓｅ Ｈ」または「活性ＲＮａｓｅ Ｈ」は、前述のように修飾され、それ以外には、同一の実験条件下で、５０℃で決定された修飾されていないＲＮａｓｅ Ｈ（１００％と見なされる）と比較し、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上または約３０％以上のエンドヌクレアーゼ活性を回復したＲＮａｓｅ ＨＩＩを意味する。
本明細書で使用された「誘導性」ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、リガンドとの結合によって調節されるエンドヌクレアーゼ触媒活性を有する本明細書に記載された修飾されたＲＮａｓｅ Ｈを意味する。許容的（permissive）条件で、ＲＮａｓｅ Ｈエンドヌクレアーゼ触媒活性は活性化されるが、非許容的（non-permissive）条件下で、前記ＲＮａｓｅ Ｈエンドヌクレアーゼ触媒活性は抑制される。一部実施態様において、修飾されたＲＮａｓｅ Ｈの触媒活性は、逆転写に適する温度、すなわち、約４２℃で抑制され、ＰＣＲ反応で発見されるさらに高い温度、すなわち、約６５℃ないし９５℃で活性化されもする。このような特性を有した修飾されたＲＮａｓｅ Ｈは、「熱誘導性」と言及される。
他の実施態様において、修飾されたＲＮａｓｅ Ｈの触媒活性は、前記酵素を含む溶液のｐＨを変化させることによって調節される。
本明細書で使用された「ホットスタート（hot start）」酵素組成物は、非許容的温度、すなわち、約２５℃ないし約４５℃で阻害され、ＰＣＲ反応に適する温度、例えば、約５５℃ないし約９５℃で活性化される酵素活性を有する組成物をいう。一部実施態様において、「ホットスタート」酵素組成物は、当業界で知られた「ホットスタート」ＲＮａｓｅ Ｈ及び／または「ホットスタート」熱安定性であるＤＮＡポリメラーゼを有することができる。
ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の交差結合は、例えば、ホルムアルデヒドを使用して遂行されもする。一実施態様において、熱安定性ＲＮａｓｅ ＨＩＩにホルムアルデヒドを使用して調節されて制限された交差結合を遂行する。不活性化状態である修飾されたＲＮａｓｅ ＨＩＩを含む増幅反応組成物を、約９５℃以上の温度まで長期間、例えば、約１５分間加熱することによって、交差結合が逆転され、前記ＲＮａｓｅ ＨＩＩ活性は回復する。
一般的に、交差結合の程度が低いほど、交差結合の逆転後、酵素のエンドヌクレアーゼ活性がさらに高い。交差結合の程度は、ホルムアルデヒドの濃度及び交差結合反応の持続時間を変化させることによって調節される。例えば、約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．４％（ｗ／ｖ）、約０．６％（ｗ／ｖ）または約０．８％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒドが、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を交差結合させることに使用される。約１０分の０．６％ホルムアルデヒドを使用した交差結合反応は、ピューロコッカス・フリオスス由来のＲＮａｓｅ ＨＩＩを不活性化するのに十分である。
一般的に、交差結合の程度が低いほど、交差結合の逆転後、酵素のエンドヌクレアーゼ活性がさらに高い。交差結合の程度は、ホルムアルデヒドの濃度及び交差結合反応の持続時間を変化させることによって調節される。例えば、約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．４％（ｗ／ｖ）、約０．６％（ｗ／ｖ）または約０．８％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒドが、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を交差結合させることに使用される。約１０分の０．６％ホルムアルデヒドを使用した交差結合反応は、ピューロコッカス・フリオスス由来のＲＮａｓｅ ＨＩＩを不活性化するのに十分である。
交差結合されたＲＮａｓｅ ＨＩＩは、約３７℃で測定可能なエンドヌクレアーゼ活性を示さない。一部の場合、交差結合されたＲＮａｓｅ ＨＩＩの測定可能な部分的再活性化が、ＰＣＲ変性温度よりさらに低い約５０℃の温度で起こる。前記酵素のこのような意図しない再活性化を避けるために、修飾されたＲＮａｓｅ ＨＩＩを再活性化まで、５０℃より低い温度で保管したり、あるいは維持することが必要である。
一般的に、ＰＣＲは、二重鎖標的配列を変性させるために、約９５℃に、各サイクルで増幅組成物を加熱することを必要とし、これはまた、ＲＮａｓｅ Ｈから不活性化因子を放出させ、前記酵素の活性を部分的に、または全部回復させる。
ＲＮａｓｅ Ｈはまた、前記酵素にアシル化試薬、例えば、ジカルボン酸を使用して、リシン残基のアシル化を行うことによって修飾されもする。ＲＮａｓｅ Ｈのアシル化は、アシル化バッファー中において、ＲＮａｓｅ Ｈの溶液にｃｉｓ−アコニット酸無水物（cis-aconite anhydride）を添加し、約１ないし２０℃で、５ないし３０時間の間収得した混合物をインキュベーションさせることによって行われる。一実施態様において、前記アシル化は、約３ないし８℃近辺で、１８ないし２４時間の間遂行される。アシル化バッファーの種類は、特別に制限さるものではない。実施態様において、前記アシル化バッファーは、約７．５ないし約９．０の間のｐＨを有する。
アシル化されたＲＮａｓｅ Ｈの活性は、増幅組成物のｐＨを約７．０以下に下げることによって回復される。例えば、Ｔｒｉｓバッファーが緩衝剤として使用される場合、前記組成物は、約９５℃まで加熱され、その結果、ｐＨが約８．７（２５℃）から６．５（９５℃）に下げられる。
増幅反応組成物で、前記加熱段階の持続時間は、修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ、ＰＣＲに使用されたバッファーなどによって変わることがある。しかし、一般的に、９５℃で約３０秒ないし４分間、増幅組成物を加熱することは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を回復するのに十分である。一実施態様において、インビトロジェンＡｇＰａｔｈ(商標)バッファーと共に、商業的に利用可能なバッファーを使用し、ピューロコッカス・フリオススＲＮａｓｅ ＨＩＩの完全な活性は、約２分の加熱後に回復する。
ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、当業界に周知の方法を使用して決定されもする。例えば、第１方法によって、単位活性は、定義された分析条件下で、同一モルのポリチミジル酸の存在で、放射性標識されたポリアデニル酸の特定モル数の酸可溶化（acid-solubilization）の側面で定義される（Epicentre Hybridase thermostable ＲＮａｓｅ ＨＩ参照）。第２方法で、単位活性は、定義された分析条件下で、プローブと相補的なテンプレートＤＮＡの同量を含む反応の相対的蛍光強度で特異的な増加と定義される。この第２方法は、実施例でさらに詳細に説明する。
本発明によって修飾されたＲＮａｓｅ Ｈを使用する方法は、CataCleave(商標)逆転写酵素ＰＣＲ検出を使用した試験試料で、ＲＮＡ配列を検出する代表的実施態様で開示される。
核酸テンプレートの準備
一部実施態様において、試料は、精製された核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びその混合物）を含む。試料からのＲＮＡ抽出及び精製の方法は、当業界に周知である。例えば、ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ(商標)試薬（インビトロジェン）抽出方法を使用して細胞から分離することができる。ＲＮＡの量と質は、その次に、例えば、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ(商標)分光光度計及びアジレント２１００バイオアナライザを使用して決定される。
一部実施態様において、試料は、精製された核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びその混合物）を含む。試料からのＲＮＡ抽出及び精製の方法は、当業界に周知である。例えば、ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ(商標)試薬（インビトロジェン）抽出方法を使用して細胞から分離することができる。ＲＮＡの量と質は、その次に、例えば、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ(商標)分光光度計及びアジレント２１００バイオアナライザを使用して決定される。
他の実施態様において、試料は、約６ないし約９のｐＨを有する溶解バッファー、約０．１２５％ないし約２％濃度の両性イオン性デタージェント、約０．３ないし約２．５ｍｇ／ｍｌ濃度のアジド及びプロテアーゼＫのようなプロテアーゼ（約１ｍｇ／ｍｌ）を使用して細胞を溶解させることによって得られた細胞溶解物である。５５℃で１５分間インキュベーションした後、高効率ＰＣＲまたは逆転写ＰＣＲ分析と調和する「実質的にタンパク質不包含（substantially protein free」溶解物を生成するために、プロテアーゼＫを９５℃で１０分間不活性化させる。
一実施態様において、１×溶解試薬は、１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓアセテート、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ＝７ないし８）、０．２５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．３１２５ｍｇ／ｍｌアジド化ナトリウム及び１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫを含む。
本明細書で使用される用語「溶解物」は、溶解された細胞残骸物及び核酸を含む液状をいう。
本明細書で使用される用語「実質的にタンパク質を含まない」は、ほとんどのタンパク質がプロテアーゼによるタンパク質分解切断によって不活性化されたものである溶解物を意味する。プロテアーゼは、プロテアーゼＫを含んでもよい。細胞を溶解させる間、プロテアーゼＫの添加は、標的核酸を分解することができるヌクレアーゼを早く不活性化させる。「実質的にタンパク質を含まない」溶解物は、不活性化されたタンパク質を除去する処理を経たり、あるいは経ないこともある。
本明細書で使用される用語「細胞」は、原核細胞または真核細胞を意味することができる。
一実施態様において、用語「細胞」は、グラム陽性バクテリア、グラム陰性バクテリア、抗酸性バクテリアなどを含むが、これらに限定されないバクテリアのような微生物を意味することができる。一部実施態様において、試験対象「細胞」は、表面の綿棒サンプリング（swab sampling）を使用して収集されもする。他の実施態様において、「細胞」は、病原性個体を意味することができる。
他の実施態様において、試料は、ウイルス核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む。一部実施態様において、試料は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のようなレンチバイロス核酸を含んでもよい。
本明細書で使用された「両性イオン性界面活性剤」は、両性イオンの特性（例えば、純電荷を有さず、伝導度及び電気泳動移動度がなく、イオン交換樹脂に結合せず、タンパク質間結合を崩す）を示す界面活性剤を意味し、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ及びベタイン誘導体、例えば、望ましくは、ブランド名Zwittergent（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びAnzergent（Ａｎａｔｒａｃｅ、Ｉｎｃ．Ｍａｕｍｅｅ、ＯＨ）として販売されるスルホベタインを含むが、これらに限定されるものではない。
一実施態様において、両性イオン性界面活性剤は、下記の構造を有する３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（米国特許第４，３７２，８８８号明細書にさらに詳細に記載されている）の略語であるＣＨＡＰＳ（ＣＡＳ Number：７５６２１−０３−３；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製品番号Ｃ３０２３−１Ｇとして購入できる）である：
追加的な実施態様において、ＣＨＡＰＳは、すべて組成物の約０．１２５％ないし約２％重量／体積（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。追加的な実施態様において、ＣＨＡＰＳは、すべて組成物の約０．２５％ないし約１％ｗ／ｖの濃度で存在する。さらに他の実施態様において、ＣＨＡＰＳは、総組成物の約０．４％ないし約０．７％ｗ／ｖの濃度で存在する。
他の実施態様において、溶解バッファーは、ノニデット（Nonidet）、トゥイーン（Tween）またはトリトン（Triton）Ｘ−１００のような他の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。
本明細書で使用される用語「バッファー（buffer）」は、２５℃で、約６ないし約９のｐＫａを有し、ｐＨ値をｐＨ６ないし９に効果的に維持することができる組成物をいう。本明細書で記載したバッファーは、一般的に、酵素活性の機能と調和可能であり、生物学的高分子が、それらの正常な生理的及び生化学的な機能を保有することができるようにする生理的に適するバッファー（physiologically compatible buffer）である。
バッファーの例は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ−）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン酸（トリシン）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン酸（トリス）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、及びアセテートまたはホスフェートを含むバッファー（Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４）などを含むが、これらに限定されるものではない。
バッファーの例は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ−）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン酸（トリシン）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン酸（トリス）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、及びアセテートまたはホスフェートを含むバッファー（Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４）などを含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書に使用される用語「アジド」は、化学式−Ｎ３で記載される。一実施態様において、アジドは、一般的な殺菌剤と作用するアジド化ナトリウムＮａＮ３（ＣＡＳ number ２６６２８−２２−８；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製品番号Ｓ２００２−２５Ｇとして購入可能）である。
本明細書で使用される用語「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を加水分解する（プロテアーゼ活性を有する）酵素である。プロテアーゼはまた、例えば、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ペプチドヒドロラーゼまたはタンパク質分解酵素とも呼ばれる。本発明による使用のためのプロテアーゼは、ポリペプチド鎖において、内部に作用するエンドタイプ（エンドペプチダーゼ）であってもよい。一実施態様において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、プロテアーゼＫ（ＥＣ ３．４．２１．６４；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入可能である組み換えプロテアーゼＫ ５０ Ｕ／ｍｌ（Pichia pastoris由来）Ｃａｔ．Ｎｏ．０３１１５８８７００１）であってもよい。
プロテアーゼＫは、核酸製剤（nucleic acid preparation）からタンパク質を分解して汚染を除去するために使用される。核酸製剤にプロテアーゼＫを添加し、ヌクレアーゼを早く不活性化させるが、そうではなければ、ヌクレアーゼが精製過程の間、ＤＮＡまたはＲＮＡを分解させることがある。プロテアーゼＫは、タンパク質を変性させる化学物質の存在下で活性があり、約９５℃の温度で約１０分間で不活性化されるので、本実験に相当に適する。
一実施態様において、リステリア、サルモネラ及び大腸菌のような、グラム陽性及びグラム陰性バクテリアの溶解はまた、溶解試薬がプロテアーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）を含むことを要求する。細胞溶解物のうちタンパク質は、５５℃で１５分間でプロテアーゼＫによって分解され、その次に、９５℃で１０分間でプロテアーゼＫを不活性化させる。冷却させた後、実質的にタンパク質不包含溶解物は、高効率ＰＣＲ増幅に適する。
プロテアーゼＫに加え、またはその代わりに、溶解試薬は、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サブチリシン、ストレプトグリシン、サーミターゼ、アクアリシン、プラスミン、ククミシン、またはカルボキシペプチダーゼＡ，Ｄ，ＣまたはＹのようなセリンプロテアーゼを含んでもよい。セリンプロテアーゼに加えて、溶解溶液は、パパイン、カルパインまたはクロストリパインのようなシステインプロテアーゼ；ペプシン、キモシンまたはカテプシンのような酸プロテアーゼ；またはプロナーゼ、サーモリシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、アミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼＡ，、Ｂ，Ｅ／Ｈ，Ｍ，ＴまたはＵのようなメタロプロテアーゼを含んでもよい。プロテアーゼＫは、広いｐＨ範囲（ｐＨ４．０ないし１０．０）で安定しており、両性イオン性界面活性剤が含まれたバッファーで安定する。
逆転写酵素−ＰＣＲ増幅
逆転写酵素−ＰＣＲ過程は、終点（end-point）またはリアルタイム分析のうち一つに設定されもする。ｃＤＮＡ増幅は、本質的に２つの段階に分離された分子的合成を要求する：（ｉ）ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡの合成、及び（ii）ＰＣＲ増幅を介した新たに合成されたｃＤＮＡの複製。逆転写酵素−ＰＣＲとたびたび関連する技術的問題を解決するために、多数のプロトコルが下記過程の３種の基本段階を考慮して開発された：（ａ）ＲＮＡの変性とリバースプライマーとのハイブリダイゼーション；（ｂ）ｃＤＮＡの合成、及び（ｃ）ＰＣＲ増幅。いわゆる「分離された（uncoupled）」逆転写酵素−ＰＣＲ過程（例えば、２段階逆転写酵素−ＰＣＲ）で、逆転写は、逆転写酵素活性のための最適バッファー条件を使用して、独立した段階として遂行される。ｃＤＮＡ合成に続き、収得された反応液をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ活性のための最適条件により、ＭｇＣｌ２及びジオキシリボヌクルレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）ｍｐ濃度を低下させるように希釈し、標準条件によってＰＣＲを遂行する（米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書参照）。一方、「連結された（coupled）」逆転写酵素ＰＣＲ方法は、逆転写酵素及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのための共通したバッファーを使用する。１つのバージョンで、リバースプライマーのアニーリングは、酵素添加の前の別個の段階であり、その後、１つの反応容器に添加される。他のバージョンで、逆転写酵素活性は、熱安定性Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの成分である。アニーリング及びｃＤＮＡ合成は、Ｍｎ２＋の存在下で行われ、その後ＰＣＲは、キレート剤によって、Ｍｎ２＋を除去した後、Ｍｇ２＋の存在下で行われる。最後に、「持続的（continuous）」方法（例えば、１段階逆転写酵素−ＰＣＲ）は、３段階の逆転写酵素−ＰＣＲ段階を、構成要素または酵素の添加のための反応チューブを開くことを避ける単一持続的反応に統合する。持続的逆転写酵素−ＰＣＲは、最初の６５℃ＲＮＡ変性段階が省略されたものである熱安定性Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用する一酵素システムと、ＡＭＶ逆転写酵素及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した２つの酵素システムとで記載される。
逆転写酵素−ＰＣＲ過程は、終点（end-point）またはリアルタイム分析のうち一つに設定されもする。ｃＤＮＡ増幅は、本質的に２つの段階に分離された分子的合成を要求する：（ｉ）ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡの合成、及び（ii）ＰＣＲ増幅を介した新たに合成されたｃＤＮＡの複製。逆転写酵素−ＰＣＲとたびたび関連する技術的問題を解決するために、多数のプロトコルが下記過程の３種の基本段階を考慮して開発された：（ａ）ＲＮＡの変性とリバースプライマーとのハイブリダイゼーション；（ｂ）ｃＤＮＡの合成、及び（ｃ）ＰＣＲ増幅。いわゆる「分離された（uncoupled）」逆転写酵素−ＰＣＲ過程（例えば、２段階逆転写酵素−ＰＣＲ）で、逆転写は、逆転写酵素活性のための最適バッファー条件を使用して、独立した段階として遂行される。ｃＤＮＡ合成に続き、収得された反応液をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ活性のための最適条件により、ＭｇＣｌ２及びジオキシリボヌクルレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）ｍｐ濃度を低下させるように希釈し、標準条件によってＰＣＲを遂行する（米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書参照）。一方、「連結された（coupled）」逆転写酵素ＰＣＲ方法は、逆転写酵素及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのための共通したバッファーを使用する。１つのバージョンで、リバースプライマーのアニーリングは、酵素添加の前の別個の段階であり、その後、１つの反応容器に添加される。他のバージョンで、逆転写酵素活性は、熱安定性Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの成分である。アニーリング及びｃＤＮＡ合成は、Ｍｎ２＋の存在下で行われ、その後ＰＣＲは、キレート剤によって、Ｍｎ２＋を除去した後、Ｍｇ２＋の存在下で行われる。最後に、「持続的（continuous）」方法（例えば、１段階逆転写酵素−ＰＣＲ）は、３段階の逆転写酵素−ＰＣＲ段階を、構成要素または酵素の添加のための反応チューブを開くことを避ける単一持続的反応に統合する。持続的逆転写酵素−ＰＣＲは、最初の６５℃ＲＮＡ変性段階が省略されたものである熱安定性Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用する一酵素システムと、ＡＭＶ逆転写酵素及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した２つの酵素システムとで記載される。
最高の感度を維持するために、ｃＤＮＡ合成前に、ＲＮＡが分解されないことが重要である。前述のように、１段階逆転写ＰＣＲプロトコルでのＲＮａｓｅ Ｈの存在は、逆転写酵素のための基質として作用することができる前に、ＲＮＡ：ＤＮＡプライマーハイブリッドの所望しない分解の原因になることがある。本明細書に記載された修飾されたＲＮａｓｅ Ｈは、逆転写のために必要な温度、すなわち、約４５ないし５５℃で。ＲＮａｓｅ Ｈエンドヌクレアーゼ触媒的活性を不活性化させることによって、このような問題を解決する。例えば、本明細書に使用されたホットスタートＲＮａｓｅ Ｈ活性は、塩基性条件下で、ｃｉｓ−アコニット酸無水物とＲＮａｓｅ Ｈとの反応後に生成された可逆的化学的修飾を有したＲＮａｓｅ Ｈであってもよい。修飾された酵素は、Ｔｒｉｓ基礎バッファーとの反応に使われ、温度が９５℃まで上昇されれば、溶液のｐＨが下がり、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が回復される。この方法は、逆転写の開始前に、反応混合物のうちＲＮａｓｅ Ｈを含むことを許容する。
リアルタイム逆転写ＰＣＲの第１段階は、テンプレート特異的なＤＮＡプライマーのうち一つを使用して、相補的なＤＮＡ鎖を生成するのである。従来のＰＣＲ反応において、この産物は変性され、第２テンプレート特異的プライマーがｃＤＮＡに結合し、デュプレックスＤＮＡを形成するために伸張される。この産物は、その後、ＰＣＲ増幅の次の段階で増幅される。
用語「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、試料において、標的ポリヌクレオチドのセグメントの濃度を上昇させるために、当業界で周知の増幅のための方法を意味し、前記試料は、単一ポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドであってもよい。一般的に、ＰＣＲ過程は、試料、緩衝剤、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸配列、ｄＮＴＰ（４種のジオキシヌクレオチドｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ）、及び試料の二重鎖標的配列の反対側鎖に相補的なプライマーを含む１０ないし１００ｍｌ反応混合物に、モル過糧（molar excess）の２種以上の伸張可能なオリゴヌクレオチド・プライマーを導入する段階で構成される。反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、熱サイクリングのプログラムに適用し、その結果、ＤＮＡプライマーによって取り囲まれた（flank）所望の標的配列が増幅される。１つのＰＣＲ反応は、ポリヌクレオチド分子の変性と合成との約５ないし約１００「サイクル」で構成されてもよい。
ＰＣＲ技術は、ＩｎｎｉｓらによるＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、及びＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を含む数多くの文献に開示されている。ＰＣＲはまた、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８００，１５９号明細書、同第４，９６５，１８８号明細書、同第４，８８９，８１８号明細書、同第５，０７５，２１６号明細書、同第５，０７９，３５２号明細書、同第５，１０４，７９２号明細書、同第５，０２３，１７１号明細書、同第５，０９１，３１０号明細書及び同第５，０６６，５８４号明細書を含んだ多くの米国特許にも記載されており、これらそれぞれは、本明細書に参照として挿入される。
本明細書で使用される用語「ヌクレオチド（nucleotide）」は、リボース、アラビノース、キシロース及びピラノースのような糖、及びこれらの糖類似体ｆのＣ−１’炭素に連結されたヌクレオチド塩基を含む化合物を意味する。用語ヌクレオチドはまた、ヌクレオチド類似体を含む。糖は、置換または非置換である。代替されたリボース糖は、一つ以上の炭素原子、例えば、２’−炭素原子が同一であるか、あるいは異なるＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２またはハロゲン基のうち一つ以上によって置換され、それぞれのＲは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル基またはＣ５−Ｃ１４アリール基であるリボースを含むが、これらに限定されるものではない。例示的なリボースは、２’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース（didehydroribose）、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース及び２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース（dideoxyribose）、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、及び２’−アルキルリボース、例えば、２’−Ｏ−メチル，４’−α−アノマーヌクレオチド，１’−α−アノマーヌクレオチド，２’−４’−，３’−４’−連結された及び他の「ロックド（locked）」または「ＬＮＡ」二重環糖修飾を含むが、これらに限定されるものではない（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２２４８９号パンフレット、同第ＷＯ９８／３９３５２号パンフレット及び同第ＷＯ９９／１４２２６号パンフレット、並びに米国特許第６，２６８，４９０号明細書及み同第６，７９４，４９９号明細書参照）。
本明細書で使用される用語「核酸（nucleic acid）」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味し、前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、修飾されてよく、あるいは修飾された塩基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、２ないし６０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドの単一鎖重合体である。ポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの重合体である。ポリヌクレオチドは、第２鎖が第１オリゴヌクレオチドの逆相補的な配列であるオリゴヌクレオチドであるアニーリングされたオリゴヌクレオチドを含む二重鎖ＤＮＡ、ジオキシチミジンを含む単一鎖核酸重合体、単一鎖ＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュ二本鎖のうちいずれか一つであってもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、断片化された核酸、ミトコンドリアや葉緑体のような細胞小器官から得た核酸、及び生物学的試料の内または上に存在する微生物やＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスから得た核酸を含むが、これらに限定されるものではない。核酸は、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡの場合のように、単一型の糖部分や、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラの場合でのように、異なる糖部分の混合物から構成されもする。明細書で、ヌクレオチド「Ａ」，「Ｃ」，及び「Ｇ」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのうちいずれか一つであり、リボヌクレオチドＡ、リボヌクレオチドＣ及びリボヌクレオチドＧは、オリゴヌクレオチドの配列で、それぞれ「ｒＡ」、「ｒＣ」及び「ｒＧ」と表示される。
「標的ＤＮＡ」、「標的ＲＮＡ」、「標的核酸」または「標的核酸配列」は、ＤＮＡ増幅のために標的になる核酸を意味する。標的核酸配列は、ＰＣＲ反応または逆転写酵素−ＰＣＲ反応において、増幅のためのテンプレートとして作用する。標的核酸配列は、天然分子及び合成分子いずれも含んでもよい。例示的な標的核酸配列は、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡを含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、時折「プライマー」または「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」と互換的に使用される。用語「プライマー」は、ＰＣＲ反応において、ＤＮＡ合成の開始位置に作用するオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、おおむね長さが約１５個ないし約３５個のヌクレオチドからなり、標的配列で、相補的な領域にハイブリダイゼーションされる。
オリゴヌクレオチドは、当業界に公知の適切な方法（例えば、化学的合成）によって合成されて製造される。オリゴヌクレオチドはまた、商業的な出所を介して利便に利用することができる。
用語「アニーリング」及び「ハイブリダイゼーション」は、互換的に使われ、二本鎖、三本鎖または他の高次元構造の形成をもたらす１つの核酸と他の核酸との塩基対形成相互作用を意味する。一部実施態様において、一次的な相互作用は、ワトソン／クリック及びフーグスティーン−類型水素結合によって、塩基特異的であり、例えば、Ａ／Ｔ及びＧ／Ｃである。一部実施例で、塩基−スタッキング及び疎水性相互作用はまた、二本鎖安定性に寄与することができる。
「緩衝剤」または「バッファー」は、増幅反応のｐＨを調節することによって、増幅反応の一つ以上の構成要素の安定性、活性及び／または寿命を変化させる、増幅反応に添加される化合物である。一部緩衝剤が当業界に周知されており、トリス、トリシン、３−（Ｎ−モルホリノ−）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含むが、これらに限定されるものではない。
用語「試料」は、核酸分子を含む物質を意味する。
添加剤は、組成物の一つ以上の構成要素の安定性、活性及び／または寿命を変化させる、組成物に添加される化合物である。一部実施態様において、前記組成物は、増幅反応組成物である。一部実施態様において、添加剤は、汚染酵素を不活性化させてタンパク質ホールディングを安定化させ、かつ／または凝集を減少させる。増幅反応に含まれる例示的な添加剤は、ベタイン、ホルムアミド、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＯＡｃ、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、ＮＨ４ＯＡｃ、ＮａＩ、Ｎａ（ＣＯ３）２、ＬｉＣｌ、ＭｎＯＡｃ、ＮＭＰ、トレハロース、ジメチルエチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ピロホスファターゼ（テルモプラズマ・アキドピルム無機ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）を含むが、これに限定されるものではない）、牛胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロピレングリコール、グリシンアミド、ＣＨＥＳ、Ｐｅｒｃｏｌｌ(商標)、アウリントリカルボン酸、トゥイーン２０、トゥイーン２１、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８５、Ｂｒｉｊ３０、ＮＰ−４０、トリトンＸ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、マッケルニウム（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ）、ＬＤＡＯ（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド）、Zwittergent ３−１０、Xwittergent ３−１４、Xwittergent ＳＢ ３−１６、Empigen、ＮＤＳＢ−２０、Ｔ４Ｇ３２、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＳＳＢ、ＲｅｃＡ、切断する（nicking）エンドヌクレアーゼ、７−デアーザＧ、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、ステロール、浸透調節物質、陽イオン、増幅の効率を変化させることができるその他化学物質、タンパク質、または補助因子（cofactor）を含むが、これらに限定されるものではない。一部実施態様において、２個以上の添加剤が増幅反応に含まれる。
本明細書で使用された「ＤＮＡポリメラーゼ活性」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する酵素活性を意味する。一般的に、前記酵素は、核酸テンプレート配列にアニーリングされたプライマーの３’末端で合成を始め、テンプレート鎖５’末端に向かって進むのである。公知されたＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ピューロコッカス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１）、Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ ａｎｄ Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ １９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ ａｎｄ ＭｃＧｏｗａｎ，１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４７５：３２）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼともいう、Ｃａｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９：４１９３）、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから断種された製品）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ ａｎｄ Ｓａｂｉｎｏ，１９９８ Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，１２７：１５５０）、ピューロコッカスコダカラエンシス（Pyrococcus kodakaraensis）ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ０１３２８８７）、及びピューロコッカス（Pyrococcus）ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０）を含む。前述の酵素ポリメラーゼ活性は、当業界で周知の手段で決定されもする。本発明によれば、ＤＮＡポリメラーゼ１ユニットは、最適温度で（例えば、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの場合、７２℃）３０分間、１０ナノモルの全ｄＮＴＰの重合形態への結合を触媒する酵素の量と定義される。
用語「逆転写酵素活性」及び「逆転写」は、テンプレートとしてＲＮＡ鎖を使用し、ＤＮＡ鎖（すなわち、相補的なＤＮＡ、ｃＤＮＡ）を合成することができるＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼとして特徴される１種のポリメラーゼの酵素活性を意味する。
「逆転写酵素−ＰＣＲ」は、ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ・プライマー延長の複数サイクル前に、単一鎖ＤＮＡ分子をまず生成するために、ＲＮＡテンプレート及び逆転写酵素、または逆転写酵素活性を有する酵素を使用するＰＣＲ反応である。マルチプルレックスＰＣＲは、一般的に、単一反応において２種以上のプライマーを添加することによって、単一反応において１種以上の増幅された産物を生成するＰＣＲ反応を意味する。
例示的な逆転写酵素は、米国特許第４，９４３，５３１号明細書に記載されたＭ−ＭＬＶ（Moloney murine leukemia virus）ＲＴ、米国特許第５，４０５，７７６号明細書に記載されたＲＮａｓｅ Ｈ活性が欠如したＭ−ＭＬＶ−ＲＴの突然変異形態、ＢＬＶ（bovine leukemia virus）ＲＴ、ＲＳＶ（Rous sarcoma virus）ＲＴ、ＡＭＶ（avian myeloblastosis virus）ＲＴ、及び米国特許第７，８８３，８７１号明細書に開示された逆転写酵素を含むが、これらに限定されるものではない。
ＰＣＲ増幅のために、本発明において使用された酵素は、望ましくは熱安定性である。用語「熱安定性」は、熱に安定しており、熱抵抗的であり、例えば、５０℃ないし９０℃の高温で機能する酵素を意味する。本発明による熱安定性酵素は、増幅反応に効果的であるという単一基準を満足しなければならず、すなわち、前記酵素は、二重鎖ポリヌクレオチドの変性を行うために必要な時間の間、上昇された温度に露出されるとき、非可逆的に変性されることがあってはならない。これと係わって使用された「非可逆的変性」によって、酵素活性の永久的で完全な消失をもたらす過程を意味する。変性のために必要な加熱条件は、例えば、バッファー塩濃度、変性されるポリヌクレオチドの長さ及びヌクレオチド組成によって決定されるが、一般的に温度は、短いポリヌクレオチドについて、約８５℃ないし約１０５℃の範囲であり、時間は、温度とポリヌクレオチド長とに主に依存する時間の間、一般的に、短いポリヌクレオチドについては、０．２５分、さらに長いＤＮＡ断片については、約４．０分の範囲である。バッファー塩濃度及び／またはポリヌクレオチドのＧＣ組成が増加すれば、さらに高い温度が容認されもする。望ましくは、酵素は、約９０℃ないし約１００℃で、非可逆的に変性されないのである。本発明によれば、非可逆的に変性されない酵素は、増幅反応の間に、約１０％以上、約２５％以上、または約５０％以上の機能や活性を保有する。
一実施態様において、一つ以上のプライマーが標識されてよい。本明細書で使用された「標識」、「検出可能な標識」、または「マーカー」または「検出可能なマーカー」は、明細書で互換的に使われ、ヌクレオチド、ヌクレオチド重合体または核酸結合因子に付着した化学的部分）を意味し、前記付着は、共有結合性または非共有結合性であってもよい。望ましくは、前記標識は、検出可能であり、前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド重合体が、本発明の実施者に検出される。検出可能な標識は、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光消光剤、有色分子、放射性アイソトープまたはシンチラントを含む。検出可能な標識はまた、有用なリンカー分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ＨＲＰ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、抗体またはその断片、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ）、重金属、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ及びルシフェラーゼを含む）、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、染料及び熱量測定基質を含む。また、表面プラズモン共鳴検出の場合のように、質量の変化が検出可能な標識と見なされもするということを考慮することができる。当業者は、前記で述べられていない有用な検出可能な標識を容易に認識することができ、それらは、本発明の実施に利用されるであろう。
１段階逆転写酵素−ＰＣＲは、分離した逆転写酵素−ＰＣＲに比べて、多くの長所を提供する。１段階逆転写酵素−ＰＣＲは、分離した逆転写酵素−ＰＣＲより反応混合物試薬と核酸産物との操作がそれほど要求されず（例えば、２つの反応段階間で、成分または酵素の添加のために、反応チューブを開くこと）、従って、労動強度が少なく、要求される人手時間（person hour）を短縮させる。１段階逆転写酵素−ＰＣＲはまた、試料をさらに少なく要求し、汚染の危険を減らす。１段階逆転写酵素−ＰＣＲの感度と特異性は、特定試料において、多くの遺伝子のうち１つの発現レベルの研究、または病原性ＲＮＡの検出に非常に適すると証明された。一般的にこのような過程は、ｃＤＮＡ合成を始めるための遺伝子特異的なプライマーの使用に限定された。
このような逆転写酵素−ＰＣＲ技法と組み合わされたリアルタイム検出によるＰＣＲ反応の動力学を測定する能力により、高い感度で、ＲＮＡコピー数を正確で精密に決定することができるようにする。これは、下記で説明する、５’蛍光発生ヌクレアーゼ分析（Ｔａｑ−Ｍａｎ）またはエンドヌクレアーゼ分析（CataCleave）のような、蛍光二重標識されたハイブリダイゼーションプローブ技術によって、増幅過程間、ＰＣＲ産物の蛍光モニタリング及び測定を介して、逆転写酵素−ＰＣＲ産物を検出することによって可能になる。
CataCleaveプローブを利用したサルモネラ標的核酸配列のリアルタイムＰＣＲ
増幅後のアンプリコン検出は、労動と時間とを必要とする。リアルタイム方法は、ＰＣＲ過程間の増幅をモニタリングするために開発された。このような方法は、一般的に、新たに合成されたＤＮＡに結合する蛍光標識プローブまたは二重鎖ＤＮＡの間に挿入されると、蛍光放出が増加する染料を利用する。
増幅後のアンプリコン検出は、労動と時間とを必要とする。リアルタイム方法は、ＰＣＲ過程間の増幅をモニタリングするために開発された。このような方法は、一般的に、新たに合成されたＤＮＡに結合する蛍光標識プローブまたは二重鎖ＤＮＡの間に挿入されると、蛍光放出が増加する染料を利用する。
前記プローブは、一般的に標的がなければ、供与体放出が２つの発色団間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：fluorescence resonance energy transfer）によって消光されるようにデザインされる。供与体発色団は、励起状態で、その対が近い距離にあれば、受容体発色団にエネルギーを伝達することができる。このような伝達は、常に非放射能性であり、双極子−双極子結合を介して起こるのである。発色団間の距離を十分に増大させるあらゆる過程は、ＦＲＥＴ効率を低下させ、供与体発色団放出が放射能的に検出されもする。一般的な受容体発色団は、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＴｅｘａｓＲｅｄを含む。受容体発色団は、その励起スペクトルが。供与体の放出スペクトル、と重なるように選択される。このような結合対の例は、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡである。また広範囲な供与体を消光させる非蛍光受容体もある。適切な供与体−受容体ＦＲＥＴ対の他の例は、当業者に周知されている。
ＰＣＲのリアルタイム検出のために使用されるＦＲＥＴプローブの一般的な例は、分子ビーコン（molecular beacon）（例えば、米国特許第５，９２５，５１７号明細書）、ＴａｑＭａｎプローブ（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号明細書及び同第５，４８７，９７２号明細書）、及びCataCleaveプローブ（例えば、米国特許第５，７６３，１８１号明細書）を含む。分子ビーコンは、結合していない状態では、供与体と受容体発色団とが近辺に位置して供与体放出が低減する二次構造をプローブが形成するようにデザインされた単一鎖オリゴヌクレオチドである。適切な反応温度でビーコンは、構造が解体され、アンプリコンに特異的に結合する。いったん解体されるようになれば、供与体と受容体発色団との間の距離が増大し、ＦＲＥＴが逆転され、供与体放出が特化された機器を使用してモニタリングされる。ＴａｑＭａｎ及びCataCleaveの技術は、利用されるＦＲＥＴプローブが切断され、供与体と受容体発色団とがＦＲＥＴを逆転させるように、十分に距離をとらせるという点で分子ビーコンと異なる。
ＴａｑＭａｎ技術は、５’末端で供与体発色団で標識され、３’末端で受容体発色団で標識された単一鎖オリゴヌクレオチド・プローブを利用する。増幅のために使用されるＤＮＡポリメラーゼは、５’−＞３’エキソヌクルレアーゼ活性を含まなければならない。ＴａｑＭａｎプローブは、プライマーが結合すると同時に、アンプリコンの１つの鎖に結合する。ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸張させれば、ポリメラーゼは、結局、結合されたＴａｑＭａｎプローブと対向することになる。このとき、ポリメラーゼのエキソヌクルレアーゼ活性は、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブを、５’末端から始めて順次に分解する。前記プローブが分解されれば、プローブを含むモノヌクレオチドは、反応バッファーに放出される。供与体が受容体から遠く拡散し、ＦＲＥＴは逆転される。供与体からの放出は、プローブ切断を確認するために、モニタリングされる。ＴａｑＭａｎが作用する方式のために特異的なアンプリコンが、ＰＣＲのサイクルごとに、ただ一回ずつ検出される。ＴａｑＭａｎ標的部位を介したプライマーの伸張は、アンプリコンが次のＰＣＲサイクルで変性されるまで、ＴａｑＭａｎプローブの追加結合を阻む二重鎖産物を生成する。
その内容について、本明細書に参照として含まれた米国特許第５，７６３，１８１号で、他のリアルタイム検出方法（本明細書で、「CataCleave」と記載）を記載している。CataCleave技術は、プローブの切断が、ポリメラーゼ活性を有さない第２酵素によって行われるという点で、ＴａｑＭａｎと異なる。CataCleaveプローブは、例えば、制限酵素やＲＮａｓｅのような、エンドヌクレアーゼの標的な分子内の配列を有する。一実施例で、CataCleaveプローブは、プローブの５’末端及び３’末端がＤＮＡで構成され、切断部位がＲＮＡを含むものであるキメラ構造を有する。プローブのＤＮＡ配列部分は、両末端や内部に、ＦＲＥＴ対として標識される。ＰＣＲ反応は、ＲＮＡ−ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ配列部分を特異的に切断するＲＮａｓｅ Ｈ酵素を含む（図２参照）。切断後、プローブの２つの半分は、反応温度で標的アンプリコンから分離され、反応バッファーに拡散する。供与体及び収容体が分離すれば、ＦＲＥＴは、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブのような方式で逆転され、供与体放出がモニタリングされる。切断と分離は、追加的なCataCleave結合のための部位を再生する。このような方式で、プライマーがCataCleaveプローブ結合部位を介して伸張されるまで、単一アンプリコンが、複数回のプローブ切断の標的として作用することが可能である。
CataCleaveプローブの標識化
用語「プローブ」は、特異的な核酸配列、例えば、標的核酸配列の相補的な領域と、配列特異的な方式でハイブリダイゼーションされるようにデザインされた特異的な部分を有するポリヌクレオチドを含む。一実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、長さが、約１５個ないし約６０個のヌクレオチド範囲にある。他の実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、長さが約１８個ないし約３０個のヌクレオチド範囲にある。オリゴヌクレオチド・プローブの正確な配列と長さは、前記プローブが結合する標的ポリヌクレオチドの属性に部分的に依存する。結合位置と長さは、特定の実施態様で、適切なアニーリング及び融解特性をなすように多様である。このようなデザイン選択をするための指針は、米国特許第５，７６３，１８１号明細書、同第６，７８７，３０４号明細書及び同第７，１１２，４２２号明細書に記載された、Ｔａｑ−ｍａｎ分析またはCataCleaveを記載する多数の参照文献に見られ、その内容が全体として本明細書に参照として含まれる。
用語「プローブ」は、特異的な核酸配列、例えば、標的核酸配列の相補的な領域と、配列特異的な方式でハイブリダイゼーションされるようにデザインされた特異的な部分を有するポリヌクレオチドを含む。一実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、長さが、約１５個ないし約６０個のヌクレオチド範囲にある。他の実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、長さが約１８個ないし約３０個のヌクレオチド範囲にある。オリゴヌクレオチド・プローブの正確な配列と長さは、前記プローブが結合する標的ポリヌクレオチドの属性に部分的に依存する。結合位置と長さは、特定の実施態様で、適切なアニーリング及び融解特性をなすように多様である。このようなデザイン選択をするための指針は、米国特許第５，７６３，１８１号明細書、同第６，７８７，３０４号明細書及び同第７，１１２，４２２号明細書に記載された、Ｔａｑ−ｍａｎ分析またはCataCleaveを記載する多数の参照文献に見られ、その内容が全体として本明細書に参照として含まれる。
プローブは、前述のように「標識」または「検出可能な標識」で標識されてよい。実施態様において、標識は、共有結合または非共有結合によって、プローブに付着された蛍光色素化合物である。
本明細書で使用される、「蛍光色素）」は、放出される光よりさらに短い波長の光による励起によって光を放出する蛍光化合物を意味する。用語「蛍光供与体」は、本発明に記載された分析で測定される光を放出する蛍光色素を意味する。さらに具体的には、蛍光供与体は、蛍光受容体によって吸収されるエネルギー（伝達は、非放射能性）を提供する。用語「蛍光受容体」は、蛍光供与体から放出されるエネルギーを吸収する第２蛍光色素または消光分子を意味する。第２蛍光色素は、蛍光供与体から放出されたエネルギーを吸収し、蛍光供与体によって放出される光よりさらに長い波長の光を放出する。消光分子は、蛍光供与体によって放出されたエネルギーを吸収する。
発光分子、望ましくは蛍光色素及び／または蛍光消光剤が、本発明の実施に使用され、前記発光分子は、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、フルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、テトラメチルロダミン、ロダミンＸ、テキサスレッド染料、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ３３、Ｄａｂｃｙｌ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０１６６５、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ、ジアルキルアミノクマリン、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３、ＤＴＰＡ（Ｅｕ３＋）−ＡＭＣＡ及びＴＴＨＡ（Ｅｕ３＋）ＡＭＣＡを含む。
一実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブの３’末端ヌクレオチドは、ブロッキングされていたり、あるいは核酸ポリメラーゼによって、伸張することがないようになっている。このようなブロッキングは、プローブの末端３’位置に、レポーターまたは消光剤分子を付着させることによって利便に行われる。
他の実施態様において、レポーター分子は、連結部分を介して、プローブの３’末端または５’末端への付着のために誘導体化された蛍光有機染料である。望ましくは、消光剤分子はまた、本発明の実施態様によっては蛍光であってもなくともよい有機染料である。例えば、本発明の望ましい実施態様において、前記消光剤分子は、非蛍光である。一般的に、消光剤分子が蛍光や非放射能性分解によって、レポーターから伝達されたエネルギーを単純に放出するか否かにかかわらず、前記消光剤の吸収バンドは、前記レポーター分子の蛍光放出バンドと実質的に重畳されなければならない。励起レポーター分子からエネルギーを吸収するが、放射性にエネルギーを放出しない非蛍光消光剤分子は、本発明で、発色性分子と呼ぶ。
例示的なレポーター消光剤対は、フルオレセインを含んだキサンテン染料及びロダミン染料から選択されもする。このような化合物の多数の適切な形態が、オリゴヌクレオチドの付着のために、結合部位として、または結合官能基として利用されるフェニル部分に置換基を有し、幅広く商業的に入手可能である。蛍光化合物の他のグループは、アルファ位置またはベータ位置にアミノ基を有するナフチルアミンである。そのようなナフチルアミノ化合物に含まれるのは、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート及び２−ｐ−トウイジニル−６−ナフタレンスルホネートである。他の染料は、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、９−イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジのようなアクリジン；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサゾール、スチルベン、ピレンなどを含む。
一実施態様において、レポーター及び消光剤分子は、フルオレセイン及び非蛍光消光剤染料から選択される。
下記参照文献によって例示されたように、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に、レポーターまたは消光剤分子を付着させるための多くの連結部分及び方法論が存在する：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５３０５−５３２１（１９８７）（オリゴヌクレオチドの３’チオール基）；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：３０１９（１９９１）（３’スルフヒドリル）；Ｇｉｕｓｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２２３−２２７（１９９３）；Ｆｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７５７，１４１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から利用可能なＡｍｉｎｏｌｉｎｋ．．ＩＩを介した５’ホスホアミノ基）；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７３９，０４４号明細書（３’アミノアルキルホスホリル基）；Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１：１５４３−１５４６（１９９０）（ホスホロアミノ酸連結を介した付着）；Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８３７（１９８７）（５’メルカプト基）；Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：７１８７−７１９４（１９８９）（３’アミノ基）；など。
ローダミン及び非蛍光消光剤染料はまた、例えば、Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２３１，１９１号明細書、及びＨｏｂｂｓ，Ｊｒ．，米国特許第４，９９７，９２８号明細書で、固体相合成の開始時、オリゴヌクレオチドの３’末端に利便に付着する。
固体支持体へのCataCleaveプローブの付着
本発明の一部実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、固体支持体に付着することができる。互いに異なるプローブが固体支持体に付着し、試料で互いに異なる標的配列を同時に検出するために使用される。互いに異なる蛍光波長を有するレポーター分子は、互いに異なるプローブに使用され、従って、互いに異なるプローブに対するハイブリダイゼーションが別個に検出されもする。
本発明の一部実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、固体支持体に付着することができる。互いに異なるプローブが固体支持体に付着し、試料で互いに異なる標的配列を同時に検出するために使用される。互いに異なる蛍光波長を有するレポーター分子は、互いに異なるプローブに使用され、従って、互いに異なるプローブに対するハイブリダイゼーションが別個に検出されもする。
オリゴヌクレオチド・プローブの固定化のための固体支持体の望ましい形態の例は、ポリスチレン、アビジンコーティングされたポリスチレンのビーズセルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル及び活性化されたデキストラン、調節された空隙ガラス（ＣＰＧ：controlled pore glass）、ガラスプレート及びその交差結合された（highly cross-linked）ポリスチレンを含む。このような固体支持体は、それらの化学的安定性、官能化（functionalization）の容易さ及び望ましく定義された表面積のために、ハイブリダイゼーション及び診断研究に望ましい。ＣＰＧ（５００，１０００）及び非膨脹、高い交差結合ポリスチレン（１０００）のような固体支持体がそれらのオリゴヌクレオチド合成との適合性の観点で特に望ましい。
オリゴヌクレオチド・プローブは、反応溶液で、ガラス状に存在することができる。代案としては、オリゴヌクレオチド・プローブは、多様な方式で固体支持体に付着することができる。例えば、該プローブは、固体支持体へのプローブの３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドの付着によって、固体支持体に付着することができる。しかし、該プローブは、前記固体支持体からプローブを分離させるリンカーによって固体支持体に付着することができる。該リンカーは、非常に望ましくは、長さが３０個以上の原子であり、さらに望ましくは、長さが５０個以上の原子である。
固体支持体に固定されたプローブのハイブリダイゼーションは、一般的に、プローブが３０個以上の原子、さらに望ましくは、５０個以上の原子によって、固体支持体から分離することを要求する。このような分離をなすために、リンカーは、一般的に、リンカーと３’ヌクルレオシドとの間に位置したスペーサを含む。オリゴヌクレオチド合成のために、リンカーム（arm）は、ほぼ固体支持体からオリゴヌクレオチドを遊離させるために、塩基性試薬によって切断されるエステル結合によって、３’ヌクルレオシドの３’−ＯＨに付着する。
オリゴヌクレオチド・プローブを固体支持体に付着させるのに使用される多種のリンカーが当業界に知られている。該リンカーは、標的配列が固体支持体に付着したプローブにハイブリダイゼーションされることを有意的に妨害しない化合物で形成されもする。該リンカーは、自動化された合成によって、リンカーに容易に添加される単一重合体性（homopolymeric）オリゴヌクレオチドで形成されもする。代案としては、官能化されたポリエチレングリコールのようなポリマーが、前記リンカーとして使用される。該ポリマーが、標的オリゴヌクレオチドにプローブがハイブリダイゼーションされることを有意的に妨害しないために、このようなポリマーは、単一重合体性オリゴヌクレオチドより望ましい。ポリエチレングリコールは、商業的に利用可能であり、有機及び水溶性の媒質いずれにも溶解可能であり、官能化しやすく、オリゴヌクレオチド合成及び合成後の条件下で、完全に安定しているので、特に望ましい。
固体支持体、リンカー及びプローブ間の結合は、望ましくは、高温で塩基性条件下で、塩基性保護基を除去する間に切断しない。望ましい結合の例は、カルバメート及びアミド結合を含む。プローブの固定化は、当業界に周知されており、当業界で当業者であるならば、固定化条件を決定することができるであろう。
本方法の一実施態様によれば、ハイブリダイゼーションプローブは、固体支持体に固定化される。オリゴヌクレオチド・プローブは、ハイブリダイゼーションに有利な条件下で、核酸の試料と接触される。ハイブリダイゼーションされていない状態では、蛍光標識は、消光剤によって消光される。標的にハイブリダイゼーションされれば、蛍光標識は、消光剤から分離して蛍光を出す。
固体支持体へのハイブリダイゼーションプローブの固定化はまた、プローブにハイブリダイゼーションされた標的配列を試料から容易に分離可能にする。その後の段階で、分離された標的配列は、研究者の特別な必要性に合うように、当業界に周知の方法によって、固体支持体から分離されて加工（例えば、精製、増幅）される。
CataCleaveプローブを使用した標的核酸配列のリアルタイム検出
標識されたオリゴヌクレオチド・プローブは、試料での標的核酸配列のリアルタイム検出のためのプローブとして使用される（図１及び図２参照）。
標識されたオリゴヌクレオチド・プローブは、試料での標的核酸配列のリアルタイム検出のためのプローブとして使用される（図１及び図２参照）。
CataCleaveオリゴヌクレオチド・プローブは、まず、選別された標的配列を含むＰＣＲアンプリコン内で発見される配列に相補的なＤＮＡ及びＲＮＡ配列に合成される。一実施態様において、前記プローブは、ＦＲＥＴ対で標識され、例えば、プローブの一末端は、フルオレセイン分子であり、他の末端は、非蛍光消光剤分子として標識される。
その次に、リアルタイム核酸増幅は、熱安定性核酸ポリメラーゼ、熱安定性修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ活性、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションされるＰＣＲ増幅プライマー対、及び標識されたCataCleaveオリゴヌクレオチド・プローブの存在の下で、標的ポリヌクレオチドで行われる。標的ＲＮＡ配列の検出のために、反応混合物は、本明細書で記載された最初のｃＤＮＡ合成段階のための逆転写酵素活性を含む。リアルタイムＰＣＲ反応の間、ＰＣＲアンプリコンとプローブとのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性によって切断されるＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を形成する。ＲＮａｓｅ Ｈによるプローブの切断は、蛍光消光剤から蛍光供与体を分離させ、試料での標的ＤＮＡ配列のリアルタイム検出に相応するプローブの蛍光のリアルタイム増加をもたらす。
一部実施態様において、リアルタイム核酸増幅は、約４０ＰＣＲ増幅サイクル以下で、単一標的ＤＮＡ分子のリアルタイム検出が可能である。
キット
本発明はまた、試料での標的核酸配列のリアルタイム検出のための一つ以上の試薬を有する包装単位を含むキット形態を提供する。該キットはまた、下記の品目を一つ以上含んでもよい：バッファー、使用説明書、及び陽性または陰性の対照群。該キットは、本明細書に記載された方法を遂行するために、適切な比率で共に混合した試薬の容器を含んでもよい。試薬容器は、望ましくは、本方法を遂行するとき、測定する段階を不要にさせる単位量の試薬を含む。
本発明はまた、試料での標的核酸配列のリアルタイム検出のための一つ以上の試薬を有する包装単位を含むキット形態を提供する。該キットはまた、下記の品目を一つ以上含んでもよい：バッファー、使用説明書、及び陽性または陰性の対照群。該キットは、本明細書に記載された方法を遂行するために、適切な比率で共に混合した試薬の容器を含んでもよい。試薬容器は、望ましくは、本方法を遂行するとき、測定する段階を不要にさせる単位量の試薬を含む。
該キットはまた、熱安定性ポリメラーゼ、熱安定性修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ、核酸標的配列を増幅させるために選別されたプライマー、及びリアルタイムＰＣＲ産物にアニーリングされ、本明細書に記載された方法論によって標的核酸配列の検出を可能にする標識されたCataCleaveオリゴヌクレオチド・プローブを含むが、これらに限定されない、リアルタイムＰＣＲのための反応試薬を含む。キットは、２以上の標的核酸配列の検出のための試薬を含んでもよい。他の実施態様において、キット試薬は、生物学的試料からゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡの抽出のための試薬をさらに含んでもよい。キット試薬はまた、適用することができる場合、逆転写酵素−ＰＣＲ分析のための試薬を含んでもよい。
下記の実施例は、本発明による修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ酵素組成物を使用する方法を提示している。本実施例に記載された方法の段階は、限定することを意図するものではないと理解される。前述のところ以外に、本発明の追加的な目的及び長所は、本発明の範囲を制限することを意図しない実施例から明白になるであろう。
実施例１．Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩ切断分析
プローブ：テンプレートの比率を変化させ、反応中のＰｆｕの量を一定に維持し、Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩの定量的切断活性を調査した。また、反応中のＰｆｕの量を変化させ、プローブ：テンプレートの比率を一定に維持して活性を調査した。
プローブ：テンプレートの比率を変化させ、反応中のＰｆｕの量を一定に維持し、Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩの定量的切断活性を調査した。また、反応中のＰｆｕの量を変化させ、プローブ：テンプレートの比率を一定に維持して活性を調査した。
Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩのアミノ酸配列は、配列番号１であり、下記に記載する。
実施例２．Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩの可逆的ホルムアルデヒド交差結合（cross linking）
Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを、多様な濃度のホルムアルデヒドを使用したホルムアルデヒド交差結合に供した。
Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを、多様な濃度のホルムアルデヒドを使用したホルムアルデヒド交差結合に供した。
下記の緩衝剤を使用した。
２ｘＲＮａｓｅ ＨＩＩ保存バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．２ｍＭ ＥＤＴＡ
２５ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌ（約５０ＯＤ）Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを、４７５ｍｌの交差結合バッファー（１．２５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ＯＤ）に希釈した。Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを、下記表１のような条件の下で、氷上で交差結合に適用させた：
その次に、反応混合物を３７℃水槽で３０分間インキュベーションした。混合物を氷上に配置し、各反応混合物に２ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８．０を添加した。反応が完了した後、２ｘＲＮａｓｅ ＨＩＩ保存バッファーであらかじめ平衡化させたＧ５０マイクロスピン・カロムを使用して反応混合物を精製し、その次に、−２０℃で保管するために、同じ体積のグリセロールで希釈した。下記に記載された条件を利用し、前記表の各交差結合条件をテストするために、一連の等温切断反応を行った。タイプ「Ａ」の反応は、プローブに相補的な標的を含んでいない。タイプ「Ｃ」の反応は、Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを含んでいない。
ＲＮａｓｅ ＨＩＩ活性は、活性化せずに５０℃、及び１５分間９５℃で活性化させた後で５０℃で測定した。
Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩによるフルオレセイン標識されたプローブの切断は、０ないし３０分の時間で表示された分析温度で、５１０ｎｍ（４６５ｎｍで励起）の蛍光放出でモニタリングした。実験の結果は図示され、Ｐｆｕ交差結合条件番号４は、切断活性の抑制程度が最も大きく、９５℃で活性化された後、活性回復が最も大きいということが分かった。図４Ａは、０．７５μｌの１３．８％ホルムアルデヒドとＰｆｕとの反応が、酵素の非存在下で観察されたところと類似しており、Ｐｆｕ切断活性の抑制をもたらしたということを示す。模擬処理されたＰｆｕ試料の活性は、切断活性のベースラインを示す。９５℃で活性化した後、ホルムアルデヒド処理されたＰｆｕの切断活性は、図４Ｂで表示された模擬処理されたレベルのほぼ５０％に回復した。図４Ｂ及び図４Ｃは、分析条件下で、テンプレートがなければ、プローブ切断が起きていないということを示している。
実施例３：ホルムアルデヒド交差結合されたＲＮａｓｅ ＨＩＩを使用したサルモネラｉｎｖＡ増幅の検出
ホルムアルデヒド交差結合されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩの性能を、サルモネラｉｎｖＡ CataCleave(商標)ＰＣＲ実験を使用して測定した。処理されていないＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩと、ホルムアルデヒド交差結合されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩ（実施例２の試料＃４）とを、５ないし５ｘ１０６コピーのサルモネラｉｎｖＡ遺伝子標的を検出するためのCataCleave(商標)ＰＣＲ分析で機能する能力についてテストした。
ホルムアルデヒド交差結合されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩの性能を、サルモネラｉｎｖＡ CataCleave(商標)ＰＣＲ実験を使用して測定した。処理されていないＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩと、ホルムアルデヒド交差結合されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩ（実施例２の試料＃４）とを、５ないし５ｘ１０６コピーのサルモネラｉｎｖＡ遺伝子標的を検出するためのCataCleave(商標)ＰＣＲ分析で機能する能力についてテストした。
図５Ａ及び図Ｂから分かるように、処理されていないＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩ（実施例２で試料＃１、図５の「模擬処理されたＰｆｕ」）とホルムアルデヒド交差結合されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩ（実施例２で試料＃４、図５の「ホルムアルデヒド交差結合されたＰｆｕ」）とのＰＣＲ効率間に有意性のある差がない。Ｃｐ値は、処理されていないＲＮａｓｅ ＨＩＩと比較し、ホルムアルデヒド交差結合されたＲＮａｓｅ ＨＩＩに対して、約２．５ないし３個のサイクルほどさらに高かった。終点蛍光はまた、ホルムアルデヒド交差結合されたＲＮａｓｅ ＨＩＩを使用した増幅に対してさらに低かった。
実施例４：Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩの可逆的ｃｉｓ−アコニチン化
Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを５０：１ないし２００：１モル比のｃｉｓ−アコニット酸無水物対酵素の多様な濃度のｃｉｓ−アコニット酸無水物を使用して、ｃｉｓ−アコニチン化させた（図３参照）
Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを５０：１ないし２００：１モル比のｃｉｓ−アコニット酸無水物対酵素の多様な濃度のｃｉｓ−アコニット酸無水物を使用して、ｃｉｓ−アコニチン化させた（図３参照）
アシル化のために、下記のバッファーを使用した。
２５ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌ（約５０ＯＤ）Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを、４７５ｍｌのアシル化バッファー（１．２５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ＯＤ）に希釈し、アシル化反応物を氷上に配置した。反応混合物を、４℃で約１８時間インキュベーションさせた。反応混合物を、２ｘＲＮａｓｅ ＨＩＩ保存バッファーで事前に平衡化させたＧ５０マイクロスピンカラムを使用して精製させた。
各反応混合物を−２０℃で保管するために、同じ体積のグリセロールで希釈した。ｃｉｓ−アコニット酸無水物とＲＮａｓｅ ＨＩＩとのモル比、及び他のアシル化条件を下記表２に表示する。
各反応混合物を−２０℃で保管するために、同じ体積のグリセロールで希釈した。ｃｉｓ−アコニット酸無水物とＲＮａｓｅ ＨＩＩとのモル比、及び他のアシル化条件を下記表２に表示する。
その次に、ｃｉｓ−アコニチン化されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩのエンドヌクレアーゼ活性を、９５℃で１５分間の熱処理（再活性化）下及び非処理の下、５０℃で決定した。下記ＲＮａｓｅ ＨＩＩ分析混合物を、ＲＮａｓｅ ＨＩＩ活性を測定するために使用した。
結果は、図６Ａ（再活性化していない）及び図６Ｂ（再活性化した）に表示する。
該結果は、約２００：１モル比のｃｉｓ−アコニット酸無水物：酵素が、５０℃でＲＮａｓｅ ＨＩＩの活性を完全に不活性化させるために必要であるということを示している。Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ８．４バッファーを使用して再活性化（すなわち、９５℃で加熱）を行った場合、使用されたあらゆる濃度のｃｉｓ−アコニット酸無水物が、９５℃で１５分後にＲＮａｓｅ ＨＩＩ活性をほぼ完全に再活性化させた。
該結果は、約２００：１モル比のｃｉｓ−アコニット酸無水物：酵素が、５０℃でＲＮａｓｅ ＨＩＩの活性を完全に不活性化させるために必要であるということを示している。Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ８．４バッファーを使用して再活性化（すなわち、９５℃で加熱）を行った場合、使用されたあらゆる濃度のｃｉｓ−アコニット酸無水物が、９５℃で１５分後にＲＮａｓｅ ＨＩＩ活性をほぼ完全に再活性化させた。
緩衝剤が再活性化に影響を及ぼすか否かを評価するために、１Ｘ反応バッファー（実施例２に記載された組成物）を使用するＲＮａｓｅ ＨＩＩ実験マスター混合物（２）を使用して、同一の再活性過程を行った。
ＲＮａｓｅ ＨＩＩ活性は、各サイクルごとに３０秒の維持時間５０℃（６０サイクル）で測定した。
結果（記載せず）は、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．８（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの代わり）を含む反応バッファーがまた再活性化を行うことができるということを示している。
実施例５：アシル化されたＲＮａｓｅ ＨＩＩを使用したサルモネラｉｎｖＡの検出
ホルムアルデヒド交差結合されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩの性能（実施例２の試料４）を、サルモネラｉｎｖＡ及びCataCleave(商標)ＰＣＲ分析を使用して測定した。増幅のためのマスター混合物は、以下である。分析は、ｐＨ８．４またはｐＨ８．７で行った。
ホルムアルデヒド交差結合されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩの性能（実施例２の試料４）を、サルモネラｉｎｖＡ及びCataCleave(商標)ＰＣＲ分析を使用して測定した。増幅のためのマスター混合物は、以下である。分析は、ｐＨ８．４またはｐＨ８．７で行った。
図７Ａ（ｐＨ８．４）及び図７Ｂ（ｐＨ８．７）の結果は、Ｔｒｉｓ−アセテートバッファー（ｐＨ８．４または８．７）を使用は、サルモネラｉｎｖＡ CATACLEAVE ｑＰＣＲ分析で（９５℃で１５分熱処理含む）、ｃｉｓ−アコニチン化されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩのほぼ完全な再活性化を行うのに適するということを示している。
また、約２００：１モル比のｃｉｓ−アコニット酸無水物：酵素が増幅で好ましく機能し、熱活性化なしに、最小のＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するホットスタートＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを作るのに必要であって十分であるということが分かる。
実施例６：ＨＩＶ−１の一段階ＲＴ ＰＣＲ増幅
前記で準備したような可逆的に修飾されたＲＮａｓｅ ＨＩＩは、特にウイルスＲＮＡ標的の一段階ＲＴ ＰＣＲ増幅に使用するのに適する。修飾された不活性ＲＮａｓｅ ＨＩＩは、試料内の標的ＲＮＡ分子を切断せずに、逆転写酵素がＲＮＡ核酸からウイルスｃＤＮＡ分子を生成することができる。
前記で準備したような可逆的に修飾されたＲＮａｓｅ ＨＩＩは、特にウイルスＲＮＡ標的の一段階ＲＴ ＰＣＲ増幅に使用するのに適する。修飾された不活性ＲＮａｓｅ ＨＩＩは、試料内の標的ＲＮＡ分子を切断せずに、逆転写酵素がＲＮＡ核酸からウイルスｃＤＮＡ分子を生成することができる。
例示的な実施態様において、修飾されたＲＮａｓｅ ＨＩＩが、ＨＩＶ−１標的ＲＮＡを検出するのに使用される。実施例２の試料＃４（組成物２）及び実施例４の試料＃４（組成物３）を検出するために、修飾されたＲＮａｓｅ ＨＩＩに使用した。比較のために、修飾されていないＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを使用した（組成物１）。
ＲＴ−ＰＣＲ条件は下記の通りである：
５０℃で３０分
９５℃で１５分
９５℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で６０秒のサイクル５０回
ＲＮａｓｅ ＨＩＩのエンドヌクレアーゼ活性は、実施例２で記載した過程に沿って測定した。
５０℃で３０分
９５℃で１５分
９５℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で６０秒のサイクル５０回
ＲＮａｓｅ ＨＩＩのエンドヌクレアーゼ活性は、実施例２で記載した過程に沿って測定した。
結果を図８に図示し、組成物１、組成物２、組成物３それぞれを使用し、ＲＴ−ＰＣＲ産物で決定された蛍光を示している。図８に図示されたように、ホルムアルデヒド交差結合されたＲＮａｓｅ ＨＩＩより、アシル化されたＲＮａｓｅ ＨＩＩがより急激なカーブを示すが、これは、多分にアシル化されたＲＮａｓｅ ＨＩＩが、実施例で使用された条件下で、さらに十分に再活性されるからであろう。高温のインキュベーションによるホルムアルデヒド処理されたＲＮａｓｅ ＨＩＩ活性が十分であるか、あるいは完全な回復は、均等な試料でｐＨを変化させることによって、アシル化処理された酵素で観察されたところよりさらに低い。
実施例７：可逆的にアシル化されたＲＮａｓｅ ＨＩＩの感度
修飾されたＲＮａｓｅ ＨＩＩの感度を決定するために、アシル化されたＲＮａｓｅ ＨＩＩ（実施例４の試料＃４）を使用し、ＨＩＶ−１標的ＲＮＡの濃度が増幅組成物で異なるという点以外において、実施例６に記載されたところと同一の過程を遂行した。
修飾されたＲＮａｓｅ ＨＩＩの感度を決定するために、アシル化されたＲＮａｓｅ ＨＩＩ（実施例４の試料＃４）を使用し、ＨＩＶ−１標的ＲＮＡの濃度が増幅組成物で異なるという点以外において、実施例６に記載されたところと同一の過程を遂行した。
結果を図９に表示する。図９から分かるように、アシル化されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ Ｈを含む一段階ＲＴ ＰＣＲは、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡのわずか１０個の注入コピーも検出することができた。陰性対照群では、いかなる増幅も観察されなかった。また反応は、濃度依存性を示した（記載せず）。
実施例８：可逆的にアシル化されたＲＮａｓｅ ＨＩＩと修飾されていないＲＮａｓｅ ＨＩＩとの比較
ＲＴ−ＰＣＲ条件は、下記の通りである：
５０℃で３０分
９５℃で１５分
９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で６０秒のサイクル５０回
５０℃で３０分
９５℃で１５分
９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で６０秒のサイクル５０回
約１，５００個のヌクレオチドのサルモネラｉｎｖＡ ＲＮＡを、Ｔ７／ポリメラーゼシステムを使用して合成した。ＲＮＡを定量し、１０６，１０５，１０４，１０３，１０２及び１０コピー／μｌの、既分注（pre-aliquoted）希釈でのコピー数によって標準化した。このような希釈は、使用するまで、およそ−８０℃で保管された。
１０６，１０５，１０４，１０３，１０２及び１０コピーｉｎｖＡ ＲＮＡ／μｌをそれぞれ含む一段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅組成物（前記「一段階逆転写酵素−ＰＣＲ CATACLEAVE(商標)バッファー６」に表示された通り）を、下記条件下でＲＴ−ＰＣＲに供し、結果として得られる増幅産物の蛍光（４６５ないし５１０ｎｍ）を測定した。アシル化されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩとして、実施例４の試料＃４を使用した。比較のために、実施例４（試料＃４）のアシル化されたＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩではなく、修飾されていないＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを含む同一の増幅組成物を使用した。結果は、図１０に表示する。
図１０から分かるように、アシル化されたＲＮａｓｅ ＨＩＩを含む組成物は、約１，５００個のヌクレオチドを有するサルモネラＲＮＡ標的核酸配列わずか１０コピーを測定することができた。処理されていないＰｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩを使用すると、大きなＣｐシフト（約１０回のサイクル）と感度の低下（１０ないし１００倍（１ないし２orders o fmagnitude））が観察された。この実験は、ＲＴ反応が、活性ＲＮａｓｅ ＨＩＩの存在下で行われると、その感度は、ＲＮＡテンプレートの分解のため大きく低下するということを示す。これは、リアルタイム反応のためのＣｐ値の著しい増大と示される。
本明細書で開示されたあらゆる特許、特許出願、公開またはその他開示資料は、その全体で本明細書に参照として含まれる。本明細書で参照として含まれるが、本明細書の定義、陳述またはその他開示資料と矛盾する資料またはその一部は、含まれた資料と本明細書の開示資料とが矛盾しない程度のみに含まれる。
Claims (42)
- ホットスタートＲＮａｓｅ Ｈ酵素を含む、標的核酸を増幅するための組成物であって、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素はＲＮａｓｅ Ｈ相同性領域を含み、前記ＲＮａｓｅ Ｈ相同性領域は、配列番号１０，１１，１２または１３のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、ｃｉｓ−アコニット酸無水物（cis-aconite anhydride）またはホルムアルデヒドによって可逆的に修飾され、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性は、９０℃以上の温度で誘導され、かつ熱誘導性である、組成物。 - 前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、配列番号１０，１１，１２または１３のアミノ酸配列を有するＲＮａｓｅ Ｈ相同性領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、ピューロコッカス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）、ピューロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshi)、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）または大腸菌（Ｅ．coli）から単離されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- ポリメラーゼ活性をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼ活性は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
- 逆転写酵素活性をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性は、酵素を含む溶液のｐＨを変化させることによって誘導されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性は、可逆的に変化することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記ホルムアルデヒドは、０．２ないし１％（ｗ／ｖ）の濃度でホルムアルデヒドを含む溶液であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- リガンドをさらに含み、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性は、前記リガンドとＲＮａｓｅ Ｈ酵素との結合によって阻害され、前記結合が干渉されることによって誘導されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記リガンドは、熱不安定性（thermolabile）であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素と前記リガンドとの結合は、非共有性であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 前記リガンドは、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素に対して、１０−１Ｍ以下のＫＤ解離定数を有するペプチド、核酸または小分子であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 前記リガンドは、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素のドメインに結合することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 前記リガンドは、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素のドメインで、立体構造変化を誘導することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 前記リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマーまたはキレート剤であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 前記抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単一鎖Ｆｖまたは単一鎖ｓｃＦｖ、二硫化結合されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディー（intrabody）、ＩｇＧＤＣＨ２、ミニボディ（minibody）、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ（tetrabody）、トリアボディ（triabody）、ジアボディ（diabody）、（ｓｃＦｖ）２、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２またはｓｃＦｖ−Ｆｃであることを特徴とする請求項１７に記載の組成物。
- 前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性は、酵素を含む溶液のｐＨを７．０以下に下げることによって誘導されることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
- 前記溶液は、標的核酸配列を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試料であることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
- 前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素と前記リガンドとの結合は、共有結合であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 前記リガンドは、交差結合剤（cross-linking agent）であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 標的ＤＮＡ配列を増幅する方法であって、
標的ＤＮＡ配列を含む試料と、
ＤＮＡポリメラーゼとＲＮａｓｅ Ｈ酵素とを含む組成物であって、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素はＲＮａｓｅ Ｈ相同性領域を含み、前記ＲＮａｓｅ Ｈ相同性領域は、配列番号１０，１１，１２または１３のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、ｃｉｓ−アコニット酸無水物（cis-aconite anhydride）またはホルムアルデヒドによって可逆的に修飾され、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性は、９０℃以上の温度で誘導され、かつ熱誘導性である、組成物と、
前記標的ＤＮＡ配列の５’末端に相補的な配列を含む第１プライマーと、
前記標的ＤＮＡ配列の３’末端に相補的な配列を含む第２プライマーと、
検出可能な標識と連結され、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素によって切断され得る組成を有するプローブと、
を含む増幅反応混合物を提供する段階と、
前記増幅反応混合物を、一つ以上の増幅反応に供し、一つ以上の増幅産物を生成する段階と、
収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階と、
を含み、
前記増幅反応は、９０℃以上の温度で、前記増幅反応混合物を加熱する段階を含む方法。 - 前記増幅反応混合物を加熱する段階は、９５℃で行われることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
- 前記プローブは、一つ以上のＤＮＡ配列部分と、１つのＲＮＡ配列部分とを含み、前記ＲＮＡ部分が、ＲＮＡ配列の３’末端と５’末端とが２つのＤＮＡ配列のそれぞれに連結される方式で、２つのＤＮＡ配列間に配列されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
- 前記加熱段階は、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素とリガンドとの結合を破壊することによって、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性を誘導することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
- 前記増幅反応混合物は、熱不安定性であるリガンドを含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
- 試料で、標的ＲＮＡ配列を検出する方法であって、
標的ＲＮＡ配列を含む試料と、
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮａｓｅ Ｈ酵素を含む組成物であって、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素はＲＮａｓｅ Ｈ相同性領域を含み、前記ＲＮａｓｅ Ｈ相同性領域は、配列番号１０，１１，１２または１３のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、ｃｉｓ−アコニット酸無水物（cis-aconite anhydride）またはホルムアルデヒドによって可逆的に修飾され、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性は、９０℃以上の温度で誘導され、かつ熱誘導性である、組成物と、
検出可能な標識を含み、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の切断配列を含むプローブ配列と、
前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に相補的な配列を含む第１プライマーと、
前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に相補的な配列を含む第２プライマーと、
を含む増幅反応混合物を提供する段階と、
ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖を形成するために、標的ＲＮＡ配列の逆転写を開始する段階と、
９０℃以上の温度まで前記増幅反応混合物を加熱し、それによってＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を分解するために、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を活性化させる段階と、
一つ以上の増幅産物を形成するために、一つ以上の増幅反応を開始する段階と、
収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階と、
を含む方法。 - 前記プローブは、一つ以上のＤＮＡ配列部分と、１つのＲＮＡ配列部分とを含み、前記ＲＮＡ部分が、ＲＮＡ配列の３’末端と５’末端とが２つのＤＮＡ配列のそれぞれに連結される方式で、２つのＤＮＡ配列間に配列されたものであるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
- 前記標的ＲＮＡ配列は、レトロウイルスであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
- 前記増幅反応混合物を加熱する段階は、９５℃で行われることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
- 前記加熱段階は、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を活性化させることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
- 前記増幅反応混合物は、熱不安定性であるリガンドを含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
- 請求項１、９及び１１のうちいずれか１項に記載の組成物を含むマイクロアレイ。
- 複数の試料で、標的ＲＮＡ配列を検出する方法であって、
標的ＲＮＡ配列を含む試料と、
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮａｓｅ Ｈ酵素を含む組成物であって、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素はＲＮａｓｅ Ｈ相同性領域を含み、前記ＲＮａｓｅ Ｈ相同性領域は、配列番号１０，１１，１２または１３のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、ｃｉｓ−アコニット酸無水物（cis-aconite anhydride）またはホルムアルデヒドによって可逆的に修飾され、前記ＲＮａｓｅ Ｈの活性は、９０℃以上の温度で誘導され、かつ熱誘導性である、組成物と、
検出可能な標識を含み、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の切断配列を含むプローブ配列と、
標的ＲＮＡ配列の５’末端に相補的な配列を含む第１プライマーと、
標的ＲＮＡ配列の３’末端に相補的な配列を含む第２プライマーと、
をそれぞれ含む複数の増幅反応混合物を有するマイクロアレイを提供する段階と、
前記マイクロアレイのうちそれぞれの増幅反応混合物に対して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖を形成するために標的ＲＮＡの逆転写を開始する段階と、
９０℃以上の温度まで増幅反応混合物を加熱し、それによってＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を分解するために、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を活性化させる段階と、
一つ以上の増幅産物を形成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階と、
収得した増幅産物の検出可能な標識を測定する段階と、
を含む方法。 - 前記標的ＲＮＡ配列は、レトロウイルスであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
- 前記増幅反応混合物を加熱する段階は、９５℃で行われることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
- 前記加熱段階は、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を活性化させることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
- 前記増幅反応混合物は、熱不安定性であるリガンドを含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
- 請求項３４に記載のマイクロアレイを含むキット。
- 逆転写酵素活性を有する酵素をさらに含むことを特徴とする請求項４０に記載のキット。
- ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素をさらに含むことを特徴とする請求項４０に記載のキット。
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