CN114456266A

CN114456266A - 一种原位检测分离酶裂解产物的方法

Info

Publication number: CN114456266A
Application number: CN202210194125.7A
Authority: CN
Inventors: 亚历山大·斯特轮尼科夫·弗拉基米罗维; 梁杰荣; 刘剑; 吴琼芳; 阿卜杜拉林·布卡巴
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2022-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2042-03-01
Also published as: CN115819572A; CN114456266B

Abstract

本发明提供了一种原位检测分离酶裂解产物的方法，包括使用抗REC8新表位单克隆抗体和/或抗RAD21新表位单克隆抗体，识别内聚蛋白水解后产生的新表位，再配合ChIP‑seq分析，构建染色质蛋白裂解图谱，对分离酶裂解产物进行原位检测。本发明还提供了一种抗REC8新表位单克隆抗体和一种抗RAD21新表位单克隆抗体。上述两种内聚蛋白新表位单克隆抗体具有良好的特异性，为染色质蛋白裂解图谱的构建以及分离酶裂解产物的原位检测创造了条件。

Description

一种原位检测分离酶裂解产物的方法

技术领域

本发明属于表观遗传学技术领域，尤其涉及一种原位检测分离酶裂解产物的方法。

背景技术

内聚蛋白复合物是一种多功能蛋白聚合物，在体细胞中既可在分裂间期组织基因表达，同时又在细胞有丝分裂周期的特定时间维持和释放姐妹染色单体内聚，发挥着关键作用。然而，在配子发育过程中，哺乳动物种系细胞中同时存在多种不同的内聚蛋白复合物，目前实验研究已经对至少两种内聚蛋白复合物进行了详细的特征研究：基于REC8和RAD21L的复合物(Biswas，2016)。虽然RAD21L在低等真核生物中不存在，但REC8是普遍存在的减数分裂内聚蛋白亚基，同时在减数分裂的染色体和染色单体分离中发挥关键作用。

减数分裂的基因表达程序和细胞调控极其复杂，涉及多个相互独立的调控因子。减数分裂内聚蛋白复合物REC8/SMC1B/SMC3/STAG3和RAD21L/SMC1B/SMC3/STAG3对于减数分裂的基因重组和染色体分离是必不可少的，而体细胞内聚蛋白复合物RAD21/SMC1A/SMC3/SA1orSA2在减数分裂中发挥的作用较小。在第一次减数分裂期间，分离酶对减数分裂内聚蛋白REC8的位点特异性剪切是真核生物产生配子的关键步骤，但目前，这一关键裂解步骤的染色体定位和动态分析只能基于较低等真核生物的下游遗传数据中大概推断。

内聚蛋白复合物是有丝分裂和减数分裂中染色体分离所必需的。减数分裂内聚蛋白亚基在癌症中经常以癌睾丸(CT)基因的形式表达，并与肿瘤的发生具有潜在的相关性。染色质内聚蛋白的移除依赖于分离酶的裂解，这一蛋白水解作用是人类生育的重要过程，也可能与某些癌症的发生初期具有相关性，非计划性的分裂和分裂阻滞都不利于物种的遗传内稳态。因此，准确研究出这一通路的作用机制及功能对于人类健康发展具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种原位检测分离酶裂解产物的方法，其可以在原生未受干扰的细胞中绘制特定的染色质蛋白的裂解图谱。该方法以一种特异性单克隆抗体为中心，设计用于识别体内特定蛋白水解产生的多肽(例如新表位)的COOH末端，并结合ChIP-seq分析，即可构建染色质蛋白的裂解图谱。既适用于非人类的灵长类动物，也适用于人类细胞，而且还可以被开发应用于其他物种。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种原位检测分离酶裂解产物的方法，所述原位检测分离酶裂解产物的方法包括：

使用抗REC8新表位单克隆抗体和/或抗RAD21新表位单克隆抗体，识别内聚蛋白水解后产生的新表位，再配合ChIP-seq分析，构建染色质蛋白裂解图谱，对分离酶裂解产物进行原位检测。

本发明中，所述原位检测分离酶裂解产物的方法通过使用可以分别识别两种内聚蛋白水解后产生的新表位的单克隆抗体，从而确定水解过程中具体的蛋白断裂位点，再结合ChIP-seq分析等手段，构建了染色质蛋白裂解图谱，为相关的研究创造了条件。

优选地，所述的抗REC8新表位单克隆抗体识别REC8蛋白水解后产生的新表位；

所述抗REC8新表位单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的CDR3。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.2所示的CDR2。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.3所示的CDR1。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的CDR3。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.5所示的CDR2。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.6所示的CDR1。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

优选地，所述抗REC8新表位单克隆抗体的重链包括SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。

优选地，所述抗REC8新表位单克隆抗体的轻链包括SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.1：GVRQGAWFAY；

SEQ ID No.2：RNDPANGNSKYDPKFQG；

SEQ ID No.3：DTYMH；

SEQ ID No.4：FQGSHVFT；

SEQ ID No.5：KVSNRFS；

SEQ ID No.6：RSSQSIVHSNGNTYLE；

SEQ ID No.7：

EVQLQQSGAEVVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVNQRPEQGLEWIGRNDPANGNSKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGVRQGAWFAYWGQGTLVTVSA；

SEQ ID No.8：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVFTFGAGTKLELK；

SEQ ID No.9：

EVQLQQSGAEVVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVNQRPEQGLEWIGRNDPANGNSKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGVRQGAWFAYWGQGTLVTVSAATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPGK；

SEQ ID No.10：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVFTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。

本发明中，所述的抗REC8新表位单克隆抗体命名为IE22-D。

本发明中，所述抗REC8新表位单克隆抗体可以识别REC8蛋白经分离酶水解后产生的新表位，从而确定减数分裂中具体的蛋白断裂位点，为染色质蛋白裂解图谱的构建创造了条件。所述抗REC8新表位单克隆抗体具有良好的特异性，可应用于免疫印迹及ChIP等相关的检测中。

本发明中，所述新表位是指抗原蛋白质水解后新产生的表位。识别抗原新表位的抗体通常不能识别天然蛋白质。

优选地，所述的抗RAD21新表位单克隆抗体识别RAD21蛋白水解后产生的新表位；

所述抗RAD21新表位单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID No.11所示的CDR3。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.12所示的CDR2。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.13所示的CDR1。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.14所示的CDR3。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.15所示的CDR2。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.16所示的CDR1。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.17所示的氨基酸序列。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.18所示的氨基酸序列。

优选地，所述抗RAD21新表位单克隆抗体的重链包括SEQ ID No.19所示的氨基酸序列。

优选地，所述抗RAD21新表位单克隆抗体的轻链包括SEQ ID No.20所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.11：PSYSGSSPFAY；

SEQ ID No.12：RIRSKSKNYAIYYADSVKD；

SEQ ID No.13：NYAMN；

SEQ ID No.14：FQGSHVPFT；

SEQ ID No.15：KVSNRFS；

SEQ ID No.16：RSSQSFVHSNGNTYLE；

SEQ ID No.17：

EVQLVESGGGLVQPRGSLKLSCAASGFTFNNYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSKNYAIYYADSVKDRFTISRDDSQTMLYLQMNNLKTEDTGMYYCVAPSYSGSSPFAYWGQGTLVTVSA；

SEQ ID No.18：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSFVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK；

SEQ ID No.19：

EVQLVESGGGLVQPRGSLKLSCAASGFTFNNYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSKNYAIYYADSVKDRFTISRDDSQTMLYLQMNNLKTEDTGMYYCVAPSYSGSSPFAYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK；

SEQ ID No.20：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSFVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。

本发明中，所述的抗RAD21新表位单克隆抗体命名为IB22-S。

本发明中，抗RAD21新表位单克隆抗体可以识别RAD21蛋白经分离酶水解后产生的新表位，从而确定有丝分裂中具体的蛋白断裂位点，为染色质蛋白裂解图谱的构建创造了条件。所述抗RAD21新表位单克隆抗体具有良好的特异性，可应用于免疫印迹及ChIP等相关的检测中。

优选地，所述的染色质蛋白裂解图谱包括体细胞染色质蛋白裂解图谱或生殖细胞染色质蛋白裂解图谱。

第二方面，本发明提供了一种抗REC8新表位单克隆抗体，所述抗REC8新表位单克隆抗体为第一方面中所述的抗REC8新表位单克隆抗体。

优选地，所述抗REC8新表位单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的CDR3、SEQ ID No.2所示的CDR2和SEQ ID No.3所示的CDR1。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的CDR3、SEQ ID No.5所示的CDR2和SEQ ID No.6所示的CDR1。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

第三方面，本发明提供了一种抗RAD21新表位单克隆抗体，所述抗RAD21新表位单克隆抗体为第一方面中所述的抗RAD21新表位单克隆抗体。

优选地，所述抗RAD21新表位单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.11所示的CDR3、SEQ ID No.12所示的CDR2和SEQ ID No.13所示的CDR1。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.14所示的CDR3、SEQ ID No.15所示的CDR2和SEQ ID No.16所示的CDR1。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.17所示的氨基酸序列。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.18所示的氨基酸序列。

第四方面，本发明提供了核酸分子，所述核酸分子编码第二方面所述的抗REC8新表位单克隆抗体或第三方面所述的抗RAD21新表位单克隆抗体。

优选地，编码所述抗REC8新表位单克隆抗体IE22-D的重链的核酸分子包括SEQ IDNo.21所示的核苷酸序列，编码所述抗REC8新表位单克隆抗体IE22-D的轻链的核酸分子包括SEQ ID No.22所示的核苷酸序列。

优选地，编码所述抗RAD21新表位单克隆抗体IB22-S的重链的核酸分子包括SEQID No.23所示的核苷酸序列，编码所述抗RAD21新表位单克隆抗体IB22-S的轻链的核酸分子包括SEQ ID No.24所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.21：

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGGTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAACCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGAATGATCCTGCGAATGGTAATAGTAAATATGATCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAATACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAGGGGTACGACAGGGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTACAACAACAGCCCCATCTGTCTATCCCTTGGTCCCTGGCTGCAGTGACACATCTGGATCCTCGGTGACACTGGGATGCCTTGTCAAAGGCTACTTCCCTGAGCCGGTAACTGTAAAATGGAACTATGGAGCCCTGTCCAGCGGTGTGCGCACAGTCTCATCTGTCCTGCAGTCTGGGTTCTATTCCCTCAGCAGCTTGGTGACTGTACCCTCCAGCACCTGGCCCAGCCAGACTGTCATCTGCAACGTAGCCCACCCAGCCAGCAAGACTGAGTTGATCAAGAGAATCGAGCCTAGAATACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCATGCCCACCTGGTAACATCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGCACTCATGATCTCCCTAACCCCCAAGGTTACGTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCATGTCAGCTGGTTTGTGGACAACAAAGAAGTACACACAGCCTGGACACAGCCCCGTGAAGCTCAGTACAACAGTACCTTCCGAGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGGGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGAAGAGCCCAGACACCTCAAGTATACACCATACCCCCACCTCGTGAACAAATGTCCAAGAAGAAGGTTAG TCTGACCTGCCTGGTCACCAACTTCTTCTCTGAAGCCATCAGTGTGGAGTGGGAAAGGAACGGAGAACTGGAGCAGGATTACAAGAACACTCCACCCATCCTGGACTCAGATGGGACCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCACTGTGGATACAGACAGTTGGTTGCAAGGAGAAATTTTTACCTGCTCCGTGGTGCATGAGGCTCTCCATAACCACCACACACAGAAGAACCTGTCTCGCTCCCCTGGTAAA；

SEQ ID No.22：

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTGTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTTTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT；

SEQ ID No.23：

GAAGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAGAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAACTACGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAGTAAAAATTATGCAATATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGGTTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAACCATGCTCTATCTGCAAATGAACAACTTGAAAACTGAGGACACAGGCATGTATTACTGTGTGGCCCCCTCATACTCCGGTAGTAGCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCG GGTAAA；

SEQ ID No.24：

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCTTTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT。

第五方面，本发明提供重组载体，所述重组载体含有至少一个拷贝的第四方面的核酸分子。

第六方面，本发明提供重组细胞，所述重组细胞分泌第二方面所述的抗REC8新表位单克隆抗体或第三方面所述的抗RAD21新表位单克隆抗体。

优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第四方面所述的核酸分子。

优选地，所述重组细胞中含有第五方面所述的重组载体。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的抗REC8新表位单克隆抗体和抗RAD21新表位单克隆抗体可以分别识别两种内聚蛋白水解后产生的新表位，从而确定水解过程中具体的蛋白断裂位点，为相关的研究及染色质蛋白裂解图谱的构建创造了条件。这两种单克隆抗体还具有良好的特异性，可应用于免疫印迹及ChIP等相关的检测中。

(2)本发明还提供了一种基于新表位单克隆抗体、在体细胞和生殖系的灵长类细胞中原位检测分离酶裂解产物的方法，可以作为体细胞培养中多线化以及减数分裂突触机制的研究工具，并应用于染色质蛋白裂解图谱的构建中。过去的研究技术方法主要针对体细胞和减数分裂期间内聚蛋白的蛋白裂解生物学，依赖于小鼠遗传实验方法。然而，关于蛋白裂解细节的研究信息主要是从酵母细胞等较低的真核生物的遗传研究数据中推断出来的。因此，本发明提供的方法不仅能够通过ChIP-seq技术在体内定位内聚蛋白，探究其裂解作用机制，而且可以解决许多与人类生育能力密切相关的生物学问题。即该方法能够在空间和时间上精确地绘制内聚蛋白裂解的表观基因组图谱。

附图说明

图1A和图1B为基于RAD21的复合物和基于REC8的复合物的水解示意图，其中，图1A代表体细胞内聚蛋白复合物(RAD21-based)和从中期到后期过渡的蛋白水解示意图，图1B为种系特异性内聚蛋白复合物(REC8-based)和第一次减数分裂的前中期和第二次减数分裂后期的蛋白水解示意图。

图2为新表位蛋白特异性抗体的检测表位示意图。

图3A为RAD21切割位点及新表位特异性抗体与表位结合的模式图。

图3B为RAD21切割位点附近多肽与GST融合的大肠杆菌提取物的免疫印迹检测结果图片，其中下划线标注的氨基酸残基与未切割的RAD21残基相匹配。

图3C为表达RAD21预测裂解产物的HEK-293细胞提取物的免疫印迹检测结果图片。

图3D为表达RAD21预测裂解产物的HEK-293细胞提取物的ChIP检测结果图片。

图4A为REC8切割位点及新表位特异性抗体与表位结合的模式图。

图4B为REC8切割位点附近多肽与GST融合的大肠杆菌提取物的免疫印迹检测结果图片，其中下划线标注的氨基酸残基与未切割的REC8残基相匹配。

图4C为表达REC8预测裂解产物的HEK-293细胞提取物的免疫印迹检测结果图片。

图4D为表达内源性REC8的MOLT-4细胞提取物的免疫印迹检测结果图片，图中，S-可溶性蛋白，N-未与细胞核结合的蛋白，P-染色质沉淀。

图4E为表达REC8预测裂解产物的HEK-293细胞提取物的ChIP检测结果图片。

图5为通过对同步化细胞ChIP-seq分析绘制的内聚蛋白裂解图谱，其中，A图为双胸腺嘧啶抑制剂阻滞同步DLD-1细胞后不同时间点的流式分析结果图片；B图为基因组非重复部分SMC3强弱峰对应的ChIP-seq标签密度热图以及相应的RAD21新表位标签密度图，C图为RAD21新表位的平均标签密度的联合峰值图。

图6为数据集的标准化折叠富集和着丝粒的alpha卫星图谱。

图7为猕猴睾丸的全基因组ChIP测序分析的结果图片，其中，A图为m5和m6的联合峰分析中ChIP-seq标签在6kb窗口中心的ChIP峰上的标签密度热图；B图为以种系特异性方式与SMC3结合的抗REC8单克隆抗体的联合峰图；C图为结合REC8 peaks数据集在峰值分数上的log2折叠富集的拟合(-log10 q-value)结果图片，带有标记点的右上区域代表得分超过100和至少4倍的峰值。

图8为猕猴睾丸的ChIP-ChEP-seq分析结果图片，其中，A图为CENP-A和REC8串联重复序列的结合分析结果；B图为串联重复的标准化标记密度与REC8 Input的标准化富集的火山图。

图9为本发明中的内聚蛋白新表位单克隆抗体的结构示意图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1实验方案设计

图1A和图1B为基于RAD21的复合物和基于REC8的复合物的水解示意图，其中，图1A代表体细胞内聚蛋白复合物(RAD21-based)和从中期到后期过渡的蛋白水解示意图，三个蛋白水解片段分别为RAD21*N、RAD21*M和RAD21*C；图1B为种系特异性内聚蛋白复合物(REC8-based)和第一次减数分裂的前中期和第二次减数分裂后期的蛋白水解示意图，三个蛋白水解片段分别为REC8*N、REC8*M和REC8*C。

内聚蛋白的切割在分裂中期到后期的转变过程中在着丝粒处进行。为了研究减数分裂和有丝分裂周期内内聚蛋白分裂的表观基因组图谱，需要一种试剂能够从分离酶产生的蛋白水解片段中识别出全长的内聚蛋白亚基，这需要通过识别分离酶驱动的蛋白水解产生的新表位的抗体来实现。

因此，需要制备能识别由分离酶裂解内聚蛋白水解产生的COOH末端的特异性抗体。图2为蛋白水解片段*N和*M的COOH末端新表位的抗体特异性检测表位示意图。由于在体内裂解的相对动力学机制目前还尚未研究清楚，因此选择两个主要的确定切割位点(如图3A所示)进行研究。虽然过去的研究表明分离酶介导的裂解产物RAD21*M易于快速降解(Kudo，2009#6527)，但推测*N和*M片段是作为COOH新表位抗原的来源。

实施例2抗RAD21新表位单克隆抗体的鉴定

为了制备识别分离酶裂解内聚蛋白RAD21水解产生的COOH末端的特异性单克隆抗体，使用模拟切割位点的多肽DREIMR和IEEPSR对小鼠进行免疫，多肽序列与切割位点的对应关系如图3A中所示。

取免疫后小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选得到的阳性克隆移植到小鼠的腹腔内。选取杂交瘤腹水用于免疫印迹实验，以一些较短和较长的肽作为对照，对RAD21切割位点附近多肽COOH末端与GST的融合肽进行检测。

通过上述操作，分别鉴定出两个对RAD21*N端具有目的特异性的克隆和两个对RAD21*M端具有目的特异性的克隆(如图3B所示)。由图可以看出，抗体4L13d和3N22s识别肽段DREIMR(切割位点1)，而抗体1B22s和2B16s识别肽段IEEPSR(切割位点2)。除了4L13d，其他几个抗体对模拟裂解的RAD21融合蛋白具有较高的特异性。另外，切割位点-4位点处谷氨酸残基的缺失会破坏融合肽与抗体的结合，这表明单克隆抗体不仅只针对两个COOH末端残基，而且可以深入到多肽分子中。

对体外表达RAD21预测裂解产物的HEK-293细胞提取物进行免疫印迹检测。将表达RAD21*片段的质粒瞬时转染到HEK-293细胞系中，得到的细胞提取物使用相应的单克隆抗体进行检测。在RIPA缓冲液下进行免疫印迹实验，检测在ChIP条件下单克隆抗体能否识别其抗原表位。结果如图3C所示。可以看出，一种抗RAD21*N的抗体3N22s没有通过这一验证，表明其是不符合ChIP级别的单克隆抗体。

按照标准ChIP的步骤对四种同种抗体进行了检测，用相应的单克隆抗体沉淀HEK-293细胞提取物中表达的重组蛋白，测试上述单克隆抗体是否符合ChIP级别标准，结果如图3D所示，结果显示只有抗RAD21*M的单克隆抗体能够结合特异性多肽。经验证，获得了两个独立的ChIP级别的单克隆抗体2B16s和1B22s，可以识别由分离酶裂解RAD21产生的COOH末端新表位。

实施例3抗REC8新表位单克隆抗体的鉴定

采用实施例2中类似的方法，制备识别分离酶裂解内聚蛋白REC8水解产生的COOH末端的特异性单克隆抗体。使用模拟切割位点的多肽对小鼠进行免疫，多肽序列与切割位点的对应关系如图4A所示。

取免疫后小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选得到的阳性克隆移植到小鼠的腹腔内。选取杂交瘤腹水用于免疫印迹实验，对REC8切割位点附近的多肽COOH末端和GST的融合肽进行筛选，发现了一系列特异性识别REC8*N和REC8*M的抗体，如图4B所示。由图可以看出，抗体2M17s和4M8s识别肽段EEAILLEIPR(切割位点1)，而抗体1E22d识别肽段PSEIEVPR(切割位点2)，单克隆抗体仅能识别与裂解REC8对应的C端残基。另外，去除切割位点-4位点处的谷氨酸残基会导致抗体的结合明显减少，这表明其能够被这些抗体所部分识别。

利用异位表达REC8预测裂解产物(REC8、REC8*N+M以及REC8*N和REC8*M片段)的HEK-293细胞提取物进行免疫印迹检测。将表达REC8片段的质粒瞬时转染到HEK-293细胞系中，得到的全细胞提取物使用能够识别相应抗原表位的抗体进行检测。在RIPA缓冲液下进行免疫印迹实验，检测在ChIP条件下单克隆抗体能否识别其抗原表位。结果如图4C所示。可以看出，这些抗体不能识别裂解的REC8，但是能够和新表位位点1和位点2结合。

使用REC8基因被激活的MOLT-4急性淋巴细胞白血病细胞系，对体内正常REC8位点表达的REC8进行免疫印迹检测。参考protein atlas数据库，在这个细胞系中，REC8基因不仅被转录，而且还被翻译成REC8蛋白。染色质分离后的MOLT-4细胞提取物的免疫印迹分析结果如图4D所示。结果显示，REC8蛋白确实在该细胞系中表达，大部分蛋白没有与染色质沉淀(P)结合，而是分布在可溶性(S)和未与细胞核结合的部分(N)之间(第一个图中的箭头所示)，REC8单抗检测主要有两条条带(第二个图中的箭头所示)，可能代表被分离酶剪切的REC8。这三种单克隆抗体都能识别相同的条带，这表明在体内这三种抗体应该能够同时检测人的REC8*N和REC8*M COOH末端表位。尽管不能稳定地与染色质结合，但正如实验所预期的，这是由于没有减数分裂内聚蛋白复合物的其他亚基参与所导致的。

进一步对选择的三种抗REC8单克隆抗体进行分析，可以看出均检测到两条蛋白表达条带，而且表达蛋白与REC8*N和REC8*M片段大小的预期范围相对应。

利用HEK-293细胞提取物，按照标准ChIP的步骤对上述抗体进行了检测(未进行染色质交联)，结果如图4E所示，三种单克隆抗体2M17s、4M8s和1E22d都能够沉淀REC8*N和REC8*N+M片段。2M17S被确认为是符合ChIP级别的抗体。4M8s抗体尽管在图4C中免疫印迹信号较弱，但仍能免疫沉淀特异性抗原。

实施例4抗RAD21新表位单克隆抗体的ChIP-seq鉴定

使用抗RAD21新表位单克隆抗体进行了ChIP-seq实验。由于人体细胞内聚蛋白亚基RAD21在分裂后期较短时间内即被蛋白水解，所以选择使用对同步化细胞进行ChIP测序的方法来绘制内聚蛋白裂解图谱。

首先使用胸腺嘧啶抑制剂(thymidine)两次阻滞同步DLD-1细胞到G1-S期，在释放细胞后(0h，移除胸腺嘧啶)，从G2期(8h)开始每30min收集释放(不含胸苷培养基)的细胞样本并进行细胞流式(FACS)和ChIP分析。频繁的取样能够在8.5～9.5h内精确地定位到从中期到后期的转变，RAD21能够在这个时间段内被精确的切割，尤其是在着丝粒处的特异性裂解。结果如图5中A图所示。根据FACS数据，对照组和实验组(胸苷处理)同步完成有丝分裂，从中期到后期的转变在释放后8.5h到9.5h之间较为明显。

使用SMC3 ChIP-seq标记体细胞内聚蛋白的结合位点。第一个位点(RAD21*N)以单克隆抗体RAD21*N作为阴性对照，第二个位点(RAD21*M)以单克隆抗体RAD21*M进行实验。在同步有丝分裂过程中，对应SMC3强弱峰的ChIP-seq标签密度和人类基因组非重复部分对应的RAD21新表位标签密度表明RAD21新表位信号较低(如图5中B图所示)。而第二个位点的单克隆抗体从9h开始信号稍高。从这些数据集中，将密度标准化为指定的数据文件中匹配的标签总数，去除来自噪点非常大的区域的峰值，得到的平均标签密度峰值的组合剖面图如图5中C图所示，其进一步证实了这一结果。

进一步分析着丝粒重复位点，其中RAD21裂解应该发生在分裂中期到后期的过渡阶段。从数据集获得标准化折叠富集和着丝粒的alpha卫星图谱，如图6所示，结果显示位点2(RAD21*M)ChIP的富集度最高，只有免疫沉淀中至少有500次hits的重复才包含在内。对于高富集的染色体着丝区alpha卫星DNA，富集高峰与后期(8～10h)重合，证实了位点2的单克隆抗体确实识别出了蛋白水解的RAD21。

实施例5利用抗REC8新表位单克隆抗体对猕猴睾丸进行全基因组ChIP测序分析

为了评估抗REC8新表位单克隆抗体的检测能力，选择了食蟹猴的睾丸组织进行实验。在猕猴中，只有第二个假定的REC8分离酶裂解位点是保守的，这仍然使ChIP-seq方法成为可能。

为了交叉验证ChIP-seq结果，使用了两个独立的猕猴睾丸提取物进行生物学重复，同时采用了一种改进的程序即ChIP-ChEP-seq，它有两个的重要改进：首先，在实验中，ChIP-seq样品的制备涉及用尿素使染色质变性，这可能是发现微小抗原表位的重要步骤，同时降低了减数分裂不同阶段浓缩和半浓缩染色质之间的结构差异水平。其次，ChIP的Input样品不包含任何的非染色质结合蛋白，这将减少自然产生的结合于相似表位的蛋白质带来的竞争，从而提高信噪比。另外，同样重要的是只分析与核心内聚蛋白亚基结合相一致的REC8信号(如SMC3)，这是体细胞和生殖细胞中所有内聚蛋白复合物所共有的。

因此，首先使用SMC3抗体进行了ChIP-ChEP-seq实验。通过使用m5参数进行Bowtie比对，剔除属于重复DNA的峰，即RepeatMasker和简单重复(TRF)序列的并集，以消除已知的与重复DNA相关的偏差。结果显示在两只猴子中均存在32200个峰，并根据这些峰进行了筛选，筛选出来的被称为SMC3“超集”。对于两个独立的动物(m5和m6)，anti-REC8ChIP-ChEP-seq产生了相当数量的峰，对其进行分层聚类以消除噪声区域的峰。

再在REC8和SMC3 ChIP-seq标签密度数据集上，使用带有10个簇参数的Seqminer进行分层聚类，将密度标准化为指定数据文件中匹配标签的总数。噪点非常大的区域的峰值被排除。其中的m5和m6分别是5#猴子睾丸和6#猴子睾丸。

结果显示，m5有9251个峰，m6有11323个峰，与SMC3相同(非重复峰)。这些峰中只有一小部分与CpG岛重叠(m5有1053个，m6有1504个)。在两个重复中，几乎没有重叠，只有略微超过1000个峰与SMC3重叠(如图7中A图)，形成了一个经过验证的合集。相应的REC8峰值的富集水平与SMC3相当，但是富集程度要小得多(如图7中B图)。总体而言，用q值拟合富集倍数的结果表明，REC8峰值的置信度较低，只有少数能使染色质IP稳定，即至少四倍富集和峰值得分超过100(如图7中C图)。

这些较强的峰大部分是固有的，并且在TSS附近与CpG重叠，这可能是由于与选择性睾丸特异性启动子结合。然而，上述ChIP-seq结果可以作为沿着染色体臂REC8分裂的强热点缺失的证据，与小鼠细胞学数据完全一致，但不能忽视一些技术障碍，特别是来自于分裂的短暂性和对小部分种系细胞的限制。

为了研究是否可以在减数分裂I中的着丝粒处检测到发挥关键调控作用的分离酶作用于REC8裂解，首先确定了M.fasc染色体中可能存在的着丝粒核心元素，使用抗CENP-A抗体进行ChIP-ChEP-seq分析。

目前在灵长类减数分裂中，还没有相关的CENP-A染色体结合的研究实验数据。CENP-A是哺乳动物着丝粒的核心和最稳定的组成部分。然而，通过传统ChIP-seq鉴定核心着丝粒组件在技术上具有挑战性，因此，应用ChIP-ChEP-seq这样的变性方法是非常必要的。此外，M.fasc alpha卫星DNA的全光谱鉴别尚未进行测序，目前的基因组装配基本上包含着中心体周围的卫星。

在当前基因组组合中存在着丝点序列，从原始基因组测序文件中提取了串联重复序列，排除所有小于10个标准化标签hits的重复。由基因组序列生成的串联重复序列数据集(TRF)包含超过9×10⁵个个体的重复序列，其中，120nt及以上的序列能够和M.fascChIP-seq DNA匹配。

总体而言，与CENP-A相比，REC8在alpha-satellite repeats(ALR)处的富集相对较低(图8中A图，171nt和342nt分别代表单体和二聚体alpha-satellites，CENP-A的富集明显更高。SMC3富集后仅显示120nt和更长的重复序列)。然而，其他重复片段富集显著，其中许多属于简单重复，包括端粒和着丝粒，以及重要的正弦元件(图8中B图，标签密度的下限为0.0083，对应于每120nt序列一个hit，整个数据集的127个序列子集仅显示REC8和SMC3至少富集1.2倍的重复)。

可以很明显看出，REC8在串联重复序列处形成了一种独特的富集模式，这与一般的内聚蛋白(SMC3)富集相关，而与CENP-A无关。因此，制备的单克隆抗体能够识别特异性内聚裂解机制，即体细胞中的RAD21和种系中的REC8的蛋白水解。

实施例6新表位单克隆抗体序列的测定

为了确定抗RAD21和REC8新抗原表位单克隆抗体的代表性蛋白序列信息，对两个具有代表性的杂交瘤IB22s和IE22d的mRNA序列进行了测序分析，对应的抗体结构示意图如图9所示。按照RNA-easy Isolation Reagent技术手册从这些杂交瘤细胞中提取总RNA，然后参照SMARTScribe Reverse Transcriptase技术手册，使用同型特异性反义引物(GenScript)或通用引物(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)将RNA反转录(SMARTScribe逆转录酶)成cDNA。重链和轻链抗体片段按照金斯瑞cDNA末端快速扩增(RACE)标准操作程序(SOP)进行扩增。扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中，进行菌落PCR以筛选具有正确插入片段大小的克隆。每个片段对不少于五个具有正确插入片段大小的菌落进行了测序，比对不同克隆的序列，并提供这些克隆的共有序列。

其中，抗REC8新表位单克隆抗体IE22-D包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的CDR3；

所述重链可变区包括SEQ ID No.2所示的CDR2；

所述重链可变区包括SEQ ID No.3所示的CDR1；

所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的CDR3；

所述轻链可变区包括SEQ ID No.5所示的CDR2；

所述轻链可变区包括SEQ ID No.6所示的CDR1；

所述重链可变区包括SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；

所述轻链可变区包括SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；

所述抗REC8新表位单克隆抗体的重链包括SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；

所述抗REC8新表位单克隆抗体的轻链包括SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.1：GVRQGAWFAY；

SEQ ID No.2：RNDPANGNSKYDPKFQG；

SEQ ID No.3：DTYMH；

SEQ ID No.4：FQGSHVFT；

SEQ ID No.5：KVSNRFS；

SEQ ID No.6：RSSQSIVHSNGNTYLE

SEQ ID No.7：

SEQ ID No.8：

SEQ ID No.9：

SEQ ID No.10：

抗RAD21新表位单克隆抗体IB22-S包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID No.11所示的CDR3；

所述重链可变区包括SEQ ID No.12所示的CDR2；

所述重链可变区包括SEQ ID No.13所示的CDR1；

所述轻链可变区包括SEQ ID No.14所示的CDR3；

所述轻链可变区包括SEQ ID No.15所示的CDR2；

所述轻链可变区包括SEQ ID No.16所示的CDR1；

所述重链可变区包括SEQ ID No.17所示的氨基酸序列；

所述轻链可变区包括SEQ ID No.18所示的氨基酸序列；

所述抗RAD21新表位单克隆抗体的重链包括SEQ ID No.19所示的氨基酸序列；

所述抗RAD21新表位单克隆抗体的轻链包括SEQ ID No.20所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.11：PSYSGSSPFAY；

SEQ ID No.12：RIRSKSKNYAIYYADSVKD；

SEQ ID No.13：NYAMN；

SEQ ID No.14：FQGSHVPFT；

SEQ ID No.15：KVSNRFS；

SEQ ID No.16：RSSQSFVHSNGNTYLE；

SEQ ID No.17：

SEQ ID No.18：

SEQ ID No.19：

SEQ ID No.20：

综上所述，为了探究内聚蛋白的裂解机制，本发明设计并制备了能够识别REC8蛋白水解产生的新表位的单克隆抗体以及体细胞内聚蛋白亚基RAD21水解产生的新表位的单克隆抗体，并用于后续的实验中。利用抗RAD21新表位单克隆抗体，通过对有丝分裂后期的人体细胞内聚蛋白进行ChIP-seq(染色质免疫共沉淀)分析，对RAD21内聚蛋白的裂解进行表观基因组定位，进而进行验证。再在灵长类动物精子形成过程中对REC8的裂解进行了定位，实验结果显示REC8的裂解与猕猴细胞中的CENP-A和alpha-satellite重复序列的结合体具有很强的相关联性，首次直接证明了减数分裂中内聚蛋白的水解作用位点与减数分裂中的着丝粒是一致的。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种原位检测分离酶裂解产物的方法

<130> 2022

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Val Arg Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Arg Asn Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Asp Thr Tyr Met His

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Phe Gln Gly Ser His Val Phe Thr

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Asn Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Arg Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Asn Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Arg Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser Asp Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Lys Trp

145 150 155 160

Asn Tyr Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val Arg Thr Val Ser Ser Val Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Leu Ser Ser Leu Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Lys Thr Glu Leu Ile Lys Arg Ile Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro Ser

210 215 220

Thr Pro Pro Gly Ser Ser Cys Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser

245 250 255

Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp

260 265 270

Pro Asp Val His Val Ser Trp Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr

275 280 285

Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val

290 295 300

Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu

305 310 315 320

Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe Ser Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu

370 375 380

Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln Asp Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr

405 410 415

Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu Ile Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His His Thr Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 10

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Pro Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Pro Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Arg Ile Arg Ser Lys Ser Lys Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Asp

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Asn Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Arg Ser Ser Gln Ser Phe Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 17

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Lys Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Thr Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Ala Pro Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Pro Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Phe Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Lys Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Thr Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Ala Pro Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Pro Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro

115 120 125

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

180 185 190

Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His

195 200 205

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro

210 215 220

Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu

245 250 255

Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu

275 280 285

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser

305 310 315 320

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val

355 360 365

Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val

370 375 380

Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg

405 410 415

Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val

420 425 430

Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg

435 440 445

Thr Pro Gly Lys

450

<210> 20

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Phe Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

145 150 155 160

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

180 185 190

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

195 200 205

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 21

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag gttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaaccagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg aatgatcctg cgaatggtaa tagtaaatat 180

gatccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa tacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaggggta 300

cgacagggag cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 360

acaacaacag ccccatctgt ctatcccttg gtccctggct gcagtgacac atctggatcc 420

tcggtgacac tgggatgcct tgtcaaaggc tacttccctg agccggtaac tgtaaaatgg 480

aactatggag ccctgtccag cggtgtgcgc acagtctcat ctgtcctgca gtctgggttc 540

tattccctca gcagcttggt gactgtaccc tccagcacct ggcccagcca gactgtcatc 600

tgcaacgtag cccacccagc cagcaagact gagttgatca agagaatcga gcctagaata 660

cccaagccca gtaccccccc aggttcttca tgcccacctg gtaacatctt gggtggacca 720

tccgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgcactca tgatctccct aacccccaag 780

gttacgtgtg tggtggtgga tgtgagcgag gatgacccag atgtccatgt cagctggttt 840

gtggacaaca aagaagtaca cacagcctgg acacagcccc gtgaagctca gtacaacagt 900

accttccgag tggtcagtgc cctccccatc cagcaccagg actggatgag gggcaaggag 960

ttcaaatgca aggtcaacaa caaagccctc ccagccccca tcgagagaac catctcaaaa 1020

cccaaaggaa gagcccagac acctcaagta tacaccatac ccccacctcg tgaacaaatg 1080

tccaagaaga aggttagtct gacctgcctg gtcaccaact tcttctctga agccatcagt 1140

gtggagtggg aaaggaacgg agaactggag caggattaca agaacactcc acccatcctg 1200

gactcagatg ggacctactt cctctacagc aagctcactg tggatacaga cagttggttg 1260

caaggagaaa tttttacctg ctccgtggtg catgaggctc tccataacca ccacacacag 1320

aagaacctgt ctcgctcccc tggtaaa 1347

<210> 22

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gatgttttga tgacccaaac tccactgtcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttttc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 360

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 420

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 480

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 540

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 600

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgt 654

<210> 23

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaagtgcagc ttgttgagtc tggtggagga ttggtgcagc ctagagggtc attgaaactc 60

tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat aactacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaaaaa ttatgcaata 180

tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaaccatg 240

ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaact gaggacacag gcatgtatta ctgtgtggcc 300

ccctcatact ccggtagtag cccgtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360

tctgcagcca aaacaacagc cccatcggtc tatccactgg cccctgtgtg tggagataca 420

actggctcct cggtgactct aggatgcctg gtcaagggtt atttccctga gccagtgacc 480

ttgacctgga actctggatc cctgtccagt ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 540

tctgacctct acaccctcag cagctcagtg actgtaacct cgagcacctg gcccagccag 600

tccatcacct gcaatgtggc ccacccggca agcagcacca aggtggacaa gaaaattgag 660

cccagagggc ccacaatcaa gccctgtcct ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg 720

ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca aagatcaagg atgtactcat gatctccctg 780

agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc 840

agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac acagctcaga cacaaaccca tagagaggat 900

tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt 960

ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc 1020

atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa 1080

gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa 1140

gacatttacg tggagtggac caacaacggg aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa 1200

ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag 1260

aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac 1320

cacacgacta agagcttctc ccggactccg ggtaaa 1356

<210> 24

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagctttgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 300

ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360

tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 420

ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 480

caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 540

agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 600

gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgt 657

Claims

1.一种原位检测分离酶裂解产物的方法，其特征在于，所述原位检测分离酶裂解产物的方法包括：

2.根据权利要求1所述的原位检测分离酶裂解产物的方法，其特征在于，所述的抗REC8新表位单克隆抗体识别REC8蛋白水解后产生的新表位；

所述抗REC8新表位单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的CDR3；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.2所示的CDR2；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.3所示的CDR1；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的CDR3；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.5所示的CDR2；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.6所示的CDR1；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；

优选地，所述抗REC8新表位单克隆抗体的重链包括SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；

3.根据权利要求1或2所述的原位检测分离酶裂解产物的方法，其特征在于，所述的抗RAD21新表位单克隆抗体识别RAD21蛋白水解后产生的新表位；

所述抗RAD21新表位单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID No.11所示的CDR3；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.12所示的CDR2；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.13所示的CDR1；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.14所示的CDR3；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.15所示的CDR2；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.16所示的CDR1；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.17所示的氨基酸序列；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.18所示的氨基酸序列；

优选地，所述抗RAD21新表位单克隆抗体的重链包括SEQ ID No.19所示的氨基酸序列；

4.根据权利要求1～3任一项所述的原位检测分离酶裂解产物的方法，其特征在于，所述的染色质蛋白裂解图谱包括体细胞染色质蛋白裂解图谱或生殖细胞染色质蛋白裂解图谱。

5.一种抗REC8新表位单克隆抗体，其特征在于，所述抗REC8新表位单克隆抗体为权利要求1～4任一项中所述的抗REC8新表位单克隆抗体；

优选地，所述抗REC8新表位单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的CDR3、SEQ ID No.2所示的CDR2和SEQID No.3所示的CDR1；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的CDR3、SEQ ID No.5所示的CDR2和SEQID No.6所示的CDR1；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；

6.一种抗RAD21新表位单克隆抗体，其特征在于，所述抗RAD21新表位单克隆抗体为权利要求1～4任一项中所述的抗RAD21新表位单克隆抗体；

优选地，所述抗RAD21新表位单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.11所示的CDR3、SEQ ID No.12所示的CDR2和SEQ ID No.13所示的CDR1；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.14所示的CDR3、SEQ ID No.15所示的CDR2和SEQ ID No.16所示的CDR1；

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.17所示的氨基酸序列；

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.18所示的氨基酸序列；

7.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求5所述的抗REC8新表位单克隆抗体或权利要求6所述的抗RAD21新表位单克隆抗体。

8.重组载体，其特征在于，所述重组载体含有至少一个拷贝的权利要求所述7的核酸分子。

9.重组细胞，其特征在于，所述重组细胞分泌权利要求5所述的抗REC8新表位单克隆抗体或权利要求6所述的抗RAD21新表位单克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的基因组中整合有权利要求7所述的核酸分子；

优选地，所述重组细胞中含有权利要求8所述的重组载体。