KR102527331B1 - 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 신규 에피토프 중합체 및 이의 용도 - Google Patents

밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 신규 에피토프 중합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 신규 에피토프 중합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 IgE에 결합하는 에피토프 기능을 갖는 특정 아미노산 서열이 반복된 형태로 가요성 링커 (flexible linker)에 의해 연결된 에피토프 중합체, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체의 제조방법, 상기 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 포함하는 밀가루 알레르기 진단 키트 및 이를 이용하여 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

Description

밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 신규 에피토프 중합체 및 이의 용도 {Epitope polymer of omega-5-gliadin from Triticum aestivum and use thereof}
본 발명은 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 신규 에피토프 중합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 IgE에 결합하는 에피토프 기능을 갖는 특정 아미노산 서열이 반복된 형태로 가요성 링커 (flexible linker)에 의해 연결된 에피토프 중합체, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체의 제조방법, 상기 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 포함하는 밀가루 알레르기 진단 키트 및 이를 이용하여 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
음식물 알레르기는 유아 및 어린아이들의 약 40% 정도에 아토피 피부염을 일으키는 것으로 알려져 있다 (Sicherer et al., J. Allergy Clin Immunol 1999, 104, 114-122). 우유, 계란, 콩 및 땅콩뿐만 아니라 밀가루 또한 어린이에게 알레르기를 유발하는 주요 음식원으로, 이러한 음식물로부터 흡수된 알레르겐 (allergen)들에 의한 감작 (sensitization)은 피부, 소화기 및 호흡기증에 알레르기 증상을 가져오며, 어른에게도 유사한 증상이 발현되는 것으로 알려져 있다.
밀가루는 인류에게 가장 중요한 영양원 중 하나이지만, 이와 같이 사람에게 알레르기를 유발하는 주요 음식물로 알려져 있다. 밀가루 알레르기를 가진 어린이들 중 50% 이상이 밀가루 섭취 (ingestion)에 의해 알레르기 과민반응 (anaphylaxis)을 겪는 것으로 보고되어 있다 (Pourpak et al., Int Arch Allergy Immunol. 2004, 133, 168-173). 밀가루에서 알레르기를 유발하는 항원 (allergen)들이 알려져 있으며, 이 들 중 ω-5-글리아딘 (Tri a 19), α/β-글리아딘 (Tri a 21) 및 고분자 글루테닌 (Tri a 26)이 밀가루 섭취 후 운동에 의해 유발되는 아나필락시스 (wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WDEIA)의 주요 알레르겐 단백질로 알려져 있다 (Matsuo et al., FEBS J. 2005, 272, 4431-4438; Hofmann et al., Allergy 2012, 67, 1457-1460; Matsuo et al. J. Immunol. 2005, 175, 8116-8122). 이 중 ω-5-글리아딘의 아미노산 서열은 매우 특이하여, 시스테인 (cystein) 잔기가 없으며, 글루타민 (glutamine)과 프롤린 (proline) 함량이 매우 높은 반복 도메인 (repetitive domain)을 가진다. 특히, QPQQ (Gln-Pro-Gln-Gln) 및 PQQP (Pro-Gln-Gln-Pro)의 함량이 각각 23%와 30% 를 차지하는 매우 특이한 서열을 갖는다 (Shewry PR. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 1995, 70, 375-426); Wag et al., Am. J. Plant Sci., 2011, 2, 476-483). 이러한 ω-5-글리아딘의 반복된 서열은 혈중 IgE에 결합하는 에피토프 기능을 하며, QQQLPQQQ (Gln-Gln-Gln-Leu-Pro-Gln-Gln-Gln) 및 QQQFPQQQ (Gln-Gln-Gln-Phe-Pro-Gln-Gln-Gln)가 밀가루 알레르기 환자의 주요한 IgE 결합 에피토프 서열 (IgE-binding epitope sequence)로 보고되어 있다 (Battai et al., Allergy 2005, 60, 815-821; (Hiroaki et al., FEBS J. 2005, 272, 4431-4438).
Tri a 19 (ω-5-글리아딘)의 IgE 결합 에피토프 서열 (QQQLPQQQ, QQQFPQQQ 등) 중합체는 밀가루 특이 IgE 결합 능력을 가질 것으로 사료되며, Tri a 19의 IgE 결합 에피토프 중합체 (Tri a 19-specific IgE binding polymer, TSIBP)는 밀가루 알레르기 진단에 유용하게 이용할 수 있을 것이다.
글리아딘 단백질과 관련된 종래 선행기술문헌으로, 미국 등록특허 제9,702,885호에서는 셀리악병 (Celiac disease) 진단을 위한 글리아딘 융합 단백질의 생산 방법이 개시되어 있고, 미국 공개특허 제2004/0198956호에서는 산 (acid)을 이용하여 글루텐으로부터 글리아딘과 글루테닌 함량이 높은 분획을 제조하는 방법이 개시되어 있으나, Tri a 19 의 IgE 결합 에피토프 서열 중합체 및 이의 발현과 생산에 대한 논문 및 특허는 전무한 상태이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 밀가루 알레르기를 진단할 수 있는 새로운 개념의 항원 단백질 (allergen)로서, IgE에 결합하는 에피토프 기능을 갖는, 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 특정 아미노산 서열이 반복된 형태로 가요성 링커 (flexible linker)에 의해 연결된 에피토프 중합체를 개발하였으며, 상기 밀가루 (Triticum aestivum) 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체가 밀가루 알레르기 진단에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 밀가루 (Triticum aestivum) 유래의 오메가-5-글리아딘의 특정 IgE 결합 에피토프 아미노산 서열이 반복된 형태로 가요성 링커에 의해 연결된 에피토프 중합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 숙주 세포를 이용한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
추가로, 본 발명의 목적은 전술한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 포함하는 밀가루 알레르기 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 키트를 이용한 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 QQXPQQQ (서열번호 1); QQSPEQQ (서열번호 2); 및 가요성 링커 (flexible linker)를 포함하고, 상기 서열번호 1에서 X는 I, L, F 또는 S인, 밀가루 (Triticum aestivum) 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, QQXPQQQ (서열번호 1) 및 QQSPEQQ (서열번호 2)는 각각 상기 가요성 링커에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, QQXPQQQ (서열번호 1) 및 QQSPEQQ (서열번호 2)는 각각 1개씩 배열되거나 또는 2개 내지 4개로 반복되어 배열될 수 있으며, 각 반복 단위체는 가요성 링커에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가요성 링커는 GGGS (서열번호 3) 또는 GGGGS (서열번호 4)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 핵산 분자는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
추가로, 본 발명은 전술한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 전술한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 포함하는, 밀가루 알레르기 진단 키트 및 이를 이용하여 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 전술한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체와 생물학적 시료 내 IgE의 결합을 검출하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 (b)의 검출은 웨스턴 블랏, 닷 블랏, 라인 블랏, ELISA, 샌드위치 ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 면역크로마토그래피 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법 중 어느 하나 이상의 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 확인될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 분리된 생물학적 시료는 전혈, 혈청 또는 혈장일 수 있다.
본 발명은 종래에 밀가루 알레르기를 일으키는 주요한 항원 단백질로 알려진 오메가-5-글리아딘 (Tri a 19)과 상이한 신규 형태의 Tri a 19 특이적 IgE 결합 에피토프 중합체 (Tri a 19-specific IgE binding polymer, TSIBP)를 제공하며, 이는 알레르기 환자의 혈중 IgE에 우수한 결합능을 나타내어 밀가루 알레르기 진단에 효과적으로 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 TSIBP는 숙주 세포에서 대량 생산이 가능하여 진단 키트로서의 상용화에 유리하다.
도 1은 본 발명의 밀가루 유래 Tri a 19의 IgE 결합 에피토프 중합체 (TSIBP)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 밀가루 유래 Tri a 19의 IgE 결합 에피토프 중합체 (TSIBP)의 DNA 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 재조합 TSIBP의 유전자가 클로닝되어 있는 대장균 발현용 플라스미드 (pMAL-TSIBP)의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 재조합 TSIBP의 유전자가 클로닝되어 있는 pMAL-TSIBP로부터 TSIBP 유전자 확인을 위해 1% 아가로즈 겔 전기영동을 실시한 결과를 나타내는 사진으로, 화살표는 발현 TSIBP 유전자 인서트 (insert) 밴드를 나타낸다 (레인 M: 1 kb 래더 DNA 분자량 마커; 및 레인 1: pMAL-TSIBP를 NdeI 및 BamHI으로 반응시킨 후).
도 5는 pMAL-TSIBP가 도입된 대장균 형질전환체에 IPTG를 첨가하여 배양함으로써 유도된 TSIBP을 SDS-PAGE로 분석한 사진으로, 화살표는 발현 유도된 TSIBP 밴드를 나타낸다 (레인 M: 단백질 분자량 마커; 레인 1: IPTG 유도 전; 및 레인 2: IPTG 유도 후 4시간).
도 6은 정제한 TSIBP를 SDS-PAGE로 분석한 사진으로, 화살표는 정제한 TSIBP 밴드를 나타낸다 (레인 M: 단백질 분자량 마커; 레인 1: TSIBP 봉입체 용해액 (정제 전); 레인 2: MBPTrap, 통과액 (Flow-through) 분획; 레인 3: MBPTrap, 세척 분획; 레인 4: MBPTrap, 용출 분획 1; 및 레인 5: MBPTrap, 용출 분획 2).
도 7은 본 발명의 재조합 TSIBP를 이용하여 검사 대상의 밀가루 알레르기 존재 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 밀가루 알레르기를 진단할 수 있는 새로운 개념의 항원 단백질 (allergen)로서, IgE에 결합하는 에피토프 기능을 갖는, 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 특정 아미노산 서열이 반복된 형태로 가요성 링커 (flexible linker)에 의해 연결된 에피토프 중합체를 개발하였으며, 상기 밀가루 (Triticum aestivum) 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체가 밀가루 알레르기 진단에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 기존의 오메가-5-글리아딘 (Tri a 19)과 상이한 신규 형태의 Tri a 19 특이적 IgE 결합 에피토프 중합체 (Tri a 19-specific IgE binding polymer, TSIBP)에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 TSIBP는 QQXPQQQ (서열번호 1); QQSPEQQ (서열번호 2); 및 가요성 링커 (flexible linker)를 포함하고, 상기 서열번호 1에서 X는 I, L, F 또는 S인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 재조합 TSIBP는 밀가루 (Triticum aestivum)로부터 유래한 것으로, 보다 상세하게는 밀가루 섭취 후 운동에 의해 유발되는 아나필락시스 (wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis)의 주요 알레르겐 (allergen)으로 알려진 Tri a 19 (오메가-5-글리아딘)의 IgE 결합 능력을 갖는 일부 에피토프로서, QQXPQQQ (서열번호 1); 및 QQSPEQQ (서열번호 2)를 포함한다.
이때, QQXPQQQ (서열번호 1) 및 QQSPEQQ (서열번호 2)는 각각 가요성 펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있으며, 바람직하게는 QQXPQQQ (서열번호 1) 및 QQSPEQQ (서열번호 2)가 각각 1개씩 배열되거나, 또는 2개 내지 4개로 반복되어 배열될 수 있고, 각 반복 단위체 사이에는 가요성 펩타이드 링커가 연결될 수 있다.
본 발명의 재조합 TSIBP에 있어서, 상기 가요성 펩타이드 링커는 통상적으로 사용되는 글라이신 (G) 및 세린 (S) 잔기가 반복된 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 GGGS (서열번호 3) 또는 GGGGS (서열번호 4)일 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어 "가요성 링커 (flexible linker)"는 각 반복 단위체 사이를 연결하기 위한 수단을 제공하는 충분한 길이의 폴리펩타이드 서열로 사용된다. 링커는 별개의 반복 단위체 사이의 분자내 상호작용을 허용하여, 생물학적 기능을 최적화하는 3차원 입체배열의 형성을 허용하는 방식으로 길이가 다를 수 있다.
본 발명의 재조합 TSIBP에 있어서, 상기 서열번호 1에서 정의될 수 있는 QQIPQQQ, QQLPQQQ, QQFPQQQ 및 QQSPQQQ는 각각 1개씩 배열되거나 또는 2개 내지 4개씩 반복해서 배열될 수 있다. 이때, 각 반복 단위체 사이에는 1개 내지 3개의 가요성 펩타이드 링커로 연결될 수 있다. 바람직하게는 각 반복 단위체 사이가 모두 가요성 펩타이드 링커로 연결될 수 있으며, 다르게는 반복 단위체가 2개 이상 연속으로 배열된 후 가요성 펩타이드 링커로 연결될 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 TSIBP에 있어서, 서열번호 1에서 정의될 수 있는 QQIPQQQ, QQLPQQQ, QQFPQQQ 및 QQSPQQQ와 서열번호 2의 QQSPEQQ의 배열 순서는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 재조합 TSIBP를 재조하였다. 본 발명의 구체적인 일실시예에 따른 TSIBP는 상기 서열번호 1에서 정의될 수 있는 QQIPQQQ, QQLPQQQ, QQFPQQQ 및 QQSPQQQ가 각각 2개씩 반복되고, 서열번호 2의 QQSPEQQ가 2개씩 반복되며, 각 반복 단위체 사이는 서열번호 3의 GGGS 또는 서열번호 4의 GGGGS가 연결된다.
본 발명의 재조합 TSIBP는 아미노산의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 한 아미노산의 동일한 유형의 기능성 기 또는 측쇄를 보유하는 다른 아미노산, 예를 들면, 지방족 (aliphatic) 아미노산, 방향족 (aromatic) 아미노산, 양으로 하전된 (positively charged) 아미노산, 음으로 하전된 (negatively charged) 아미노산으로 치환되는 것과 관련된다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환은 본 발명의 기술분야에 널리 공지되어 있다.
아래의 6가지 그룹은 각각 서로에 대하여 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);
2) 아스파르트산 (D), 글루타민산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 그리고
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).
본 발명은 또한, 전술한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 재조합 TSIBP를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 일 특정예에서는 최소 90%의 상동성, 다른 특정예에서는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함되며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.
구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드 (예: pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 이에 대한 구체적인 방법은 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli (예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터)가 조절부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스 (EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스 (RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 재조합 벡터는 그로부터 발현되는 재조합 TSIBP의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Amersham Pharmacia Biotech, USA); 말토오스 결합 단백질 (NEB, USA); FLAG (IBI, USA); 6x His (hexahistidine; Qiagen, USA), Pre-S1, c-Myc와 같은 태그 서열; ompA, pelB와 같은 선도서열 등이 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및/또는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또한, 전술한 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 및 바실러스 츄린겐시스 (B. thuringensis)와 같은 바실러스 속 균주 (Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas) (예를 들면, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) (예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스 (Staphylococus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주세포는 자낭균문 (Phylum Ascomycota)에 속하는 아스페츠길루스 속 (Aspergillus spp.) 및 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) 등의 다세포성 곰팡이 (multicellular fungi)와 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마세스 (Schizosaccharomyces)와 같은 효모를 포함하는 단세포성 곰팡이 (unicellular fungi), 그 밖의 하등 진핵세포, 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포, 그리고 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포를 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 숙주 세포에 목적하는 유전자를 도입하는 것을 말하며, "형질감염"과 동일한 의미로 사용된다. 따라서, 숙주세포로의 "형질전환" 및/또는 "형질감염"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 전술한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, (a) 전술한 재조합 TSIBP를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입시키는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 발현 벡터로 세포를 형질전환시키는 단계; (c) 형질전환 세포를 배양하여 재조합 TSIBP를 생합성 하는 단계; 및 (d) 상기 생합성된 재조합 TSIBP를 수득 및 정제하는 단계를 포함하는 재조합 TSIBP 의 생합성 방법을 제공한다.
본 발명의 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체의 제조방법에 있어서, 바람직하게는 단계 (a)는 발현 유도제 (예컨대 IPTG 등) 존재 하에서 실시될 수 있다.
본 발명의 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체의 제조방법에 있어서, 본 발명의 재조합 TSIBP 과발현용 형질전환 세포의 배양은 당업계에 공지된 적당한 배지와 배양 조건에 따라 배양될 수 있으며, 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다.
동물세포 배양에 사용하는 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글라이세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 그리고 아세트산과 같은 유기산을 포함한다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃ 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다.
숙주세포를 배양하여 수득한 재조합 TSIBP는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 재조합 TSIBP의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에서 선택할 수 있다.
추가로, 본 발명은 전술한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 포함하는 밀가루 알레르기 진단 키트 및/또는 이를 이용하여 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 밀가루 알레르기 질환의 존재 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 밀가루 알레르기 진단 키트는 재조합 TSIBP 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 도구 또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 웨스턴블랏, 닷 블랏, 라인 블랏 ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역 확산법, 면역형광분석법, 면역 블롯, 오우크레로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전분석법, 보체 고정 분석법, 면역크로마토그래피 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제, 및 안정화제 등을 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 및 반응 정지제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는, 재조합 TSIBP는 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정 또는 코팅될 수 있으며, 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 PBS, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 금속, 유리, 글래스 비드, 또는 자성 입자 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형 (비드), 원통형 (시험관 또는 웰 내면), 평면형 (시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 (호스라디시 퍼옥시다제 등), 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제, 루시퍼라아제 등을 사용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
효소 발색 기질로서, 예를 들어 효소 표지로서 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP) 를 선택한 경우에는 기질로 3-아미노-9-에틸카르바졸, 5-아미노살리실산, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산), 3,3-디아미노벤지딘, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, o-디아니시딘, 또는 3,3-디메톡시벤지딘 포함 용액을 사용할 수 있다. 또한, 효소 표지로서 알칼라인 포스파타아제를 선택한 경우에는 기질로 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 니트로블루 테트라졸륨, 또는 p-니트로페닐 포스페이트 포함 용액을 사용할 수 있다. 또한, 효소 표지로서 β-D-갈락토시다제를 선택한 경우에는 기질로 o-니트로페닐-β-D-갈락토시드 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-β-D-갈락토피라노시드 포함 용액을 사용할 수 있다. 이 외에도 당업계에 알려진 다양한 효소 및 효소 발색 기질을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 다음의 단계로 수행될 수 있다:
(a) 본 발명의 전술한 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체와 생물학적 시료 내 IgE의 결합을 검출하는 단계.
본 발명에서, 용어 "분리된 생물학적 시료"는, 전혈, 혈장, 혈청 등을 포함하며, 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 재조합 TSIBP와 접촉시켜 밀가루 특이적 IgE, 보다 구체적으로 오메가-5-글리아딘에 대한 특이 IgE와의 반응을 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어 "개체"는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유 동물, 조류 등을 포함하며, 밀가루 알레르기 존재 여부를 확인하고자 하는 개체는 제한 없이 포함된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
TSIBP 발현용 플라스미드의 구축
본 발명에서 합성한 TSIBP 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, TSIBP 유전자가 클로닝 되어 있는 pGEM Teasy-TSIBP (Promega, 미국)와 MBP 융합형의 발현벡터인 pMAL-c5X (NEB, 미국)를 NdeI 및 BamHI으로 각각 이중 절단 (double digestion)한 후, 서열번호 1로 기재되는 159개 아미노산 잔기를 암호화하는 약 500 bp 크기의 DNA 단편과 NdeI 및 BamHI로 이중 절단 한 pMAL-c5X를 아가로즈 전기영동한 다음 DNA 용출 키트로 각각 분리하였다. 상기 DNA 단편과 pMAL-c5X 플라스미드를 접합 (ligation)시켜 pMAL-TSIBP (도 3)로 명명하고 E. coli BL21-CodonPlus RIL 균주 (Agilent, 미국)를 형질전환 하였다.
구체적으로, 형질전환용 세포(competent cell) E. coli BL21-CodonPlus RIL 100 ul에 발현 벡터 pMAL-TSIBP 0.1 내지 0.5 ug을 첨가하여 얼음에 30 분간 방치한 후 42℃에서 45 초 간 열 충격을 주고, 0.5 ml 의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 앰피실린 (50 ug/ml), IPTG 및 X-gal이 첨가된 LB 아가 평판 배지에 도말하고 37℃ 에서 16 시간 동안 배양하여 형질전환체를 수득하였다. 형질 전환된 대장균은 앰피실린이 첨가된 LB 액체 배지에 접종하여 배양하고, 그 배양액의 일부를 취하여 플라스미드 정제 키트 (Qiagen, 미국)를 사용하여 플라스미드를 추출하여 클로닝된 부위의 제한효소로 절단하여 유전자가 도입되었는지를 확인하였다 (도 4).
대장균에서 재조합 TSIBP 단백질 유도 및 SDS-PAGE 분석
상기 실시예 1에서 재조합 플라스미드 pMAL-TSIBP로 형질전환된 E. coli BL21-CodonPlus RIL을 암피실린 (50 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 배지에 접종하여 37℃ 에서 밤새 배양하여 종균으로 사용하였다. 암피실린을 포함하는 100 ㎖의 LB 배지 (500 ㎖ 삼각 플라스크)에 상기 종균 1 ㎖을 취하여 접종한 후, 600 nm에서 흡광도가 0.6 내지 0.8에 도달할 때까지 키웠다.
단백질의 합성을 유도하기 위하여 IPTG (Sigma, 미국)를 1 mM이 되도록 첨가한 다음, 4 시간 동안 배양 후 배양액 0.2 ㎖을 취하여 단백질 분석을 위한 시료 제조를 위하여 사용하였다. 배양액으로부터 얻어진 균체를 SDS-PAGE 시료 처리 용액 (0.05 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 M DTT, 2% SDS, 10% 글리세롤 및 0.1% 브로모페놀 블루) 200 ㎕에 현탁하여 100℃에서 5 분간 가열하여 세포를 파괴한 후 단백질 분석을 위하여 사용하였다. 단백질 전기영동은 램리 등의 방법 (Laemmli Nature 1970, 227, 680-685)으로 수행하였다. 일정한 전기장에서 분리가 끝난 젤은 쿠마시 브릴리언트 블루 용액 (Coomassie brilliant blue)에 넣어 1시간 정도 염색한 후 탈색 용액 (30% 메탄올, 10% 아세트산)에 옮겨 탈색하여 생산된 단백질을 확인하였다. 그 결과, IPTG 유도에 의해 시간이 지남에 따라 본 발명의 TSIBP의 발현이 유도됨을 확인하였다 (도 5).
재조합 TSIBP 단백질의 정제
3-1. (1 단계) 세포 파쇄
상기 실시예 2의 방법으로 배양한 pMAL-TSIBP/E. coli BL21-CodonPlus RIL을 원심분리 (6,000 rpm, 10 분)하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체 1 g 당 20배 부피의 PBS (phosphate buffered saline) 용액을 가하여 잘 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기 (Sonics, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄 조건은 30 초간 파쇄 후 2 분간 휴식을 주고, 이러한 과정을 20 번 반복하여 세포를 파쇄하였다.
3-2. (단계 2) 봉입체 용해
세포 파쇄액을 원심분리 (12,000 rpm, 30 분)하여 봉입체 (inclusion body) 를 회수하였다. 회수한 봉입체 1 g 당 20 배 부피의 8 M Urea 용액을 가하여 잘 현탁시킨 후, 4℃ 에서 12 시간 정도 교반해 주면서 봉입체를 용해하였다. 봉입체 용해액을 원심분리 (12,000 rpm, 30 분)하여 침전물을 제거하고 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액은 0.2 um 멤브레인 (membrane) 여과 (Sartorius, 독일) 하여 정제 원액으로 사용하였다.
3-3. (단계 3) 단백질 정제 : 친화성 크로마토그래피
5 ml MBPTrap (GE health, 미국)를 평형 버퍼 (20 mM Tris-Cl, pH 7.4/0.2 M NaCl/1 mM EDTA)로 평형시킨 후, 상기 (단계 2)에서 제조한 봉입체 용해액을 칼럼에 부가하였다. 280 nm의 흡광도가 거의 0 이 될 때까지 동일 완충액으로 세척한 후, 용출 용액 (20 mM Tris-Cl, pH 7.4/0.2 M NaCl/1 mM EDTA/10 mM 말토오스) 100 mM 글리신-염산(pH 3.0)으로 결합된 단백질을 용출하고 SDS-PAGE를 이용하여 용출 단백질을 분석하였다. 그 결과 약 70 kDa 위치에서 밴드가 나타남으로써 재조합 MBP-TSIBP 단백질이 정제되었음을 확인하였다 (도 6).
IgE 결합능 분석
4-1. (단계 1) 항원 코팅
상기 실시예 3에서 정제한 재조합 MBP-TSIBP를 이용하여 밀가루에 알레르기를 가진 환자의 IgE와 반응 효능을 측정하였다. 재조합 MBP-TSIBP를 코팅 버퍼 (10 mM 인산나트륨, pH 7.2)에 15 ug/ml부터 3 배씩 순차 희석하여 사용하였다.
4-2. (단계 2) 활성 측정
① 알레르겐 (allergen) 측정 패널에 조제된 세척용액 300 μL를 분주 후 5분 간 교반하여 알레르겐 흡착 멤브레인을 적셔주고 세척용액은 제거한다.
② 알레르겐 흡착 멤브레인이 포함된 패널에 시료희석용액 250 μL 를 분주한다.
③ 검사하고자 하는 검체 (혈청 또는 혈장) 50 μL를 패널에 분주하고 상온에서 45분 간 교반 반응 (Shaking incubation) 한다.
④ 패널에 있는 검체를 제거하고 미리 제조된 세척용액으로 2회 세척한다. 매회 세척 시, 300 μL의 세척 용액을 분주하고 상온에서 5분 간 교반 반응 후 세척 용액이 남지 않도록 제거한다.
⑤ 250 μL 의 항체 용액 (biotinlyated anti-human IgE)을 패널에 분주하고 상온에서 30분 간 교반 반응한다.
⑥ 멤브레인을 ④번 과정과 동일하게 세척한다.
⑦ 250 μL의 효소접합용액 (Streptavidin-alakline phophatase)을 패널에 분주하고 상온에서 30분 간 교반 반응한다.
⑧ 멤브레인을 ④번 과정과 동일하게 세척한다.
⑨ 250 μL의 발색 용액 (NBT/BCIP)을 분주하고 상온 암소에서 20분 간 교반 반응한다.
⑩ 패널에 있는 발색용액을 제거하고 250 μL의 정제수 (deionized water) 로 남아있는 발색 용액을 1회 세척한다.
⑪ 멤브레인을 공기 중이나 드라이어 등으로 말린 후, 발색 정도를 확인한다.
그 결과, MBP-TSIBP의 코팅 농도에 따라 IgE 발색이 비례적으로 발색됨을 확인할 수 있으며, 밀가루 알레르기 양성 혈청 (양성 18, 24 및 30) 위치에서 밴드가 나타남으로써 재조합 MBP-TSIBP 단백질이 정제되었음을 확인하였으며, 음성 혈청 (음성 1, 2 및 3) 및 블랭크 (blank)에서는 발색이 나타나지 않음을 확인하였다 (도 7).
이상의 결과를 바탕으로, 본 발명의 재조합 TSIBP는 밀가루 알레르기 양성 환자의 검체와 반응함을 확인함으로써, 밀가루 알레르기 진단 표지로서 효율적으로 활용할 수 있음을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING <110> ProteomeTech Inc. <120> Epitope polymer of omega-5-gliadin from Triticum aestivum and use thereof <130> 1068436 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> IgE-binding epitope sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is I, L, F or S. <400> 1 Gln Gln Xaa Pro Gln Gln Gln 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant TSIBP <400> 2 Gln Gln Ser Pro Glu Gln Gln 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Flexible linker <400> 3 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Flexible linker <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant TSIBP <400> 5 Gln Gln Ile Pro Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gln Gln Ile Pro Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Ser Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gln Ser Pro Glu Gln Gln Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gln Ser Pro Glu Gln Gln Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gln Ser Pro Gln Gln Gln Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gln Ser Pro Gln Gln Gln 145 150 155 <210> 6 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant TSIBP <400> 6 ccgcagcagc agggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gccagcagct gccgcagcag 60 cagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agccagcagc tgccgcagca gcagggcggc 120 ggcggcagcg gcggcggcag ccagcagttt ccgcagcagc agggcggcgg cggcagcggc 180 ggcggcggca gccagcagtt tccgcagcag cagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 240 agccagcaga gcccggaaca gcagggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagccagcag 300 agcccggaac agcagggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagccagca gagcccgcag 360 cagcagggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagccagc agagcccgca gcagcag 417

Claims (11)

  1. 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진, 밀가루 (Triticum aestivum) 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체.
  2. 삭제
  3. 제1항의 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 코딩하는 핵산 분자.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 핵산 분자.
  5. 제3항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제5항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  7. 제6항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체의 제조방법.
  8. 제1항의 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 포함하는 밀가루 알레르기 진단 키트.
  9. (a) 제1항의 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체를 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 밀가루 유래의 오메가-5-글리아딘의 에피토프 중합체와 생물학적 시료 내 IgE의 결합을 검출하는 단계;
    를 포함하는, 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 검출은 웨스턴 블랏, 닷 블랏, 라인 블랏, ELISA, 샌드위치 ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 면역크로마토그래피 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법 중 어느 하나 이상의 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 확인하는, 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 분리된 생물학적 시료는 전혈, 혈청 또는 혈장인, 밀가루 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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