KR20220004115A - 항체로 장식된 자가-조립 단백질 나노케이지(sapna) 및 이의 일부 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중공 사면체 피라미드 구조를 형성할 수 있거나 또는 형성하는 데 유용한 단백질 케이지 폴리펩티드(또는 스캐폴딩 단백질), 및 (a) 하나 이상의 항체 및 (b) 항체를 배열할 스캐폴드를 제공하는 단백질 케이지 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질 조립체인 "항체로 장식된 자가-조립 단백질 나노입자"(SAPNA)를 제공한다. 일부 구현예에서, 항체는 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합할 수 있다.
Description
관련 특허 출원
본 출원은 2019년 4월 25일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제62/838,826호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원 진술
본 발명은 미국 에너지부에 의해 수여된 계약 번호 DE-AC02-05CH11231 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 단백질-기반 항체 스캐폴드 생산 분야에 관한 것이다.
치료용 단일클론 항체는 생물약제학적 산업에서 거대한 영향력을 발휘하지만, 암 면역요법은 집중 연구 분야에서 떠오르고 있다. Ecker 등(5)에 따르면, 2013년에 단일클론 항체 제품은 거의 750억 달러에 상당했고, 모든 생물약제학적 제품의 전체 판매량의 대략 절반에 이르렀다. 이러한 관점에서 보면, 47 개의 단일클론 항체 제품에 대해서만 2014년 말 기준으로 미국 또는 유럽에서의 사용이 승인되었다. 따라서, 성장할 여지가 많이 있고, 대부분의 대형 제약 회사에서는 항체 개발 프로그램이 있을 개연성이 있다. 실제로, 대략 70 개의 신규 단일클론 항체 제품이 2020년까지 시장에 등장하여, 전 세계 시장에서 거의 1250억 달러에 달할 것으로 예상된다(5).
미국 특허 번호 제6,756,039호(Yeates, Padilla, 및 Colovos)는 규칙적인 구조로 자가-조립할 수 있는 융합 단백질을 개시하고 있으며, 여기서 융합 단백질은 예를 들어, 알파 나선형 연결기를 통해 함께 견고하게 연결된 적어도 2 개의 올리고머화 도메인을 포함한다.
미국 특허 번호 제7,608,681호(Dennis, Lowman 및 DeLano)는 IgG 또는 혈청 알부민에 대한 친화성을 갖는 펩티드 리간드를 개시하고 있다.
미국 특허 번호 제8,969,521호(Baker, King, Sheffler 및, Yeates)는 자가-조립 단백질 나노물질을 설계하기 위한 일반적인 방법, 및 다량체성 조립체를 형성할 수 있는 특정한 184 개의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 개시하고 있다.
미국 특허 출원 공개 번호 제20070218547호(Yeates, Padilla, Yoshida, 및 Colovos)는 동종이량체성 구조에 자연적으로 회합하는 제1 올리고머화 도메인 및 동종사량체성 구조에 자연적으로 회합하는 제2 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한, 확장된 물질을 생산하기 위한 자가 조립 단백질을 개시하고 있으며, 여기서 상기 제1 및 제2 올리고머화 도메인은 서로 견고하게 연결되어 있다.
본 발명은 중공 사면체 피라미드 구조를 형성할 수 있거나 또는 형성하는 데 유용한 단백질 케이지 폴리펩티드(또는 스캐폴딩 단백질)를 제공하며, 여기서 단백질 케이지 폴리펩티드, 또는 스캐폴딩 단백질은 항체 또는 이의 일부, 또는 항체, 또는 이의 일부를 포함하는 임의의 키메라 단백질, 분자 또는 화합물에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 구현예에서, 항체의 일부는 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 항체와 같은 항체의 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간, 닭, 마우스, 토끼, 양, 또는 염소 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, IgG 항체는 인간 IgG 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 항체, 또는 이의 일부를 포함하는, 키메라 단백질, 분자 또는 화합물의 일부이다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질, 또는 다른 분자 또는 화합물은 항체의 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체, 또는 이의 일부는 키메라 단백질, 분자 또는 화합물에 공유적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 일부에 대한 단백질 케이지 폴리펩티드, 또는 스캐폴딩 단백질의 결합 친화성 Ka는 107 M-1, 108 M-1, 또는 109 M-1 이상이다.
일부 구현예에서, 단백질 케이지 폴리펩티드는 약 400 내지 약 700 개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 케이지 폴리펩티드는 약 450 내지 약 650 개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 케이지 폴리펩티드는 하기 구조를 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
폴리펩티드 1―AHL―폴리펩티드 2―INSERT A―폴리펩티드 3―INSERT B―폴리펩티드 4 (화학 구조 I);
여기서 AHL은 "알파 나선형 링커"이고, INSERT A 및/또는 INSERT B는 각각 독립적으로 항체 또는 이의 일부에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, INSERT A는 약 17 내지 약 25 개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, INSERT B는 약 28 내지 약 85 개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 일부에 대한 INSERT A 및/또는 INSERT의 결합 친화성 Ka는 각각 독립적으로 107 M-1, 108 M-1, 또는 109 M-1 이상이다. 일부 구현예에서, INSERT A 및/또는 INSERT B는 각각 독립적으로 아미노산 서열 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 케이지 폴리펩티드는 하기 구조를 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
폴리펩티드 1―AHL―폴리펩티드 2―INSERT A―폴리펩티드 3―INSERT B―폴리펩티드 4
(화학 구조 I);
여기서 AHL은 "알파 나선형 링커"이고, INSERT A는 약 17 내지 약 25 개의 아미노산 길이이며 아미노산 서열 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함하고, INSERT B는 약 28 내지 약 85 개의 아미노산 길이이며 아미노산 서열 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함한다. 서열번호:41 및 42는 IgG의 Fc-영역에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 1은 서열번호:1-40 중 임의의 하나의 N-말단에서 최대 AQEAQKQK 서열까지의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 1은 YGTAR, TDD, LXENLGTR, IDV, TGXRT, 및/또는 SA를 포함하는 아미노산 서열을 포함하며; 여기서 X는 임의의 하전된 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 1은 약 278 내지 약 303 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, AHL은 AQEAQKQK를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AHL은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 2는 서열번호:1-40 중 임의의 하나의 AQEAQKQK 서열의 C-단부에서 INSERT A의 N-단부까지의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 2는 LTEVETYVLS(서열번호:43)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 2는 약 30 내지 약 36 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 2는 약 33 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 3은 서열번호:1-40 중 임의의 하나의 INSERT A의 C-단부에서 INSERT B의 N-단부까지의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 3은 FTLTVPSERGLQR(서열번호:44) 및/또는 CATCEQIAD(서열번호:45)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 3은 약 110 내지 약 130 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 3은 약 121 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 4는 서열번호:1-40 중 임의의 하나의 INSERT B의 C-단부로부터의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 4는 EHHHHHH를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 4는 약 5 내지 약 13 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 4는 약 8 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 케이지 폴리펩티드는 서열번호:1-40 중 임의의 하나에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 케이지 폴리펩티드는 도 6에서 별표로 표시된 개별 아미노산 잔기 또는 이의 임의의 하나 이상, 또는 모든 스트레치를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 케이지 폴리펩티드는 도 6에서 "#"로 표시된 상응하는 위치(들)에서 임의의 하나 이상, 또는 모든 하전된 아미노산 스트레치를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 중공 사면체 피라미드 구조로 조립된 본 발명의 12 개의 단백질 케이지 폴리펩티드를 포함하는 중공 사면체 피라미드 구조를 제공하며, 여기서 단백질 케이지 폴리펩티드는 항체 또는 이의 일부에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 중공 사면체 피라미드 구조는 하나 이상의 더 작은 관심 분자를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 더 작은 관심 분자는 치료적이거나 또는 검출가능하다.
본 발명은 (a) 하나 이상의 항체 및 (b) 항체를 배열할 스캐폴드를 제공하는 단백질 케이지 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질 조립체인 "항체로 장식된 자가-조립 단백질 나노입자"(SAPNA)를 제공하며, 여기서 하나 이상의 항체는 단백질 케이지 폴리펩티드의 INSERT A 및/또는 INSERT B에 결합된다.
본 발명은 (a) 하나 이상의 항체 및 (b) 항체를 배열할 스캐폴드를 제공하는 조작된 단백질을 포함하는 키메라 단백질 조립체인 SAPNA를 제공한다. 스캐폴딩 단백질은 완충 조건에 기반하여 조립 또는 분해될 수 있는 중공 사면체 피라미드를 형성한다. 스캐폴드는 중공이므로, 시스템은 일단 항체가 SAPNA를 표적에 국소화하면 방출을 위해 더 작은 관심 분자를 캡슐화할 수 있다. 이들 입자는 항체 Fc CH2/CH3 도메인과의 고친화성 상호작용을 통해, 인간 또는 토끼 IgG 항체(또는 Fc 영역 단독)과 같은 임의의 IgG 항체(또는 Fc 영역 단독), 또는 이의 단편에 모듈식으로 결합하고 표시하도록 조작된다. 나노입자 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 항체 또는 Fc 도메인으로부터 물리적으로 제한된 국소화는 항체를 이용할 수 있는 임의의 올리고머화-의존적 수용체-매개 경로의 활성화를 허용한다. 일부 구현예에서, 별도의 로딩 및 혼합을 통해, 상이한 에피토프를 인식하는 항체는 동일한 나노입자에 로딩되어, 다기능성을 부여할 수 있다. 일부 구현예에서, 나노입자는 Fc 수용체 올리고머화가 활성화의 필수 구성요소이므로, 선천성 또는 적응성 면역 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 (1) 사면체 피라미드와 같은 3-차원 조립체로 조립된 하나의 단백질 케이지 폴리펩티드 또는 스캐폴딩 단백질(또는 조작된 단백질 케이지 단백질(PC)), 또는 복수의 단백질 케이지 폴리펩티드 또는 스캐폴딩 단백질(또는 조작된 단백질 케이지 단백질(PC)), (2) 임의적으로 하나 이상의 인간 또는 토끼 IgG 항체, (3) 임의적으로 IgG 결합 루프, 및 (4) 임의적으로, 복수의 폴리펩티드 또는 스캐폴딩 단백질(또는 조작된 단백질 케이지 단백질(PC))이 항체와 함께 3-차원 조립체로 조립될 때, 3-차원 조립체에 의해 제한되거나 또는 둘러싸인 거대분자와 같은 분자 또는 화합물과 같은 관심 화물(cargo)을 포함하는 SAPNA 구조를 제공한다. 본 발명의 일 구현예는 도 1a에 도시되어 있다.
인간 IgG 항체는 다양한 표적을 인식하고 단단하게 결합한다. 일부 구현예에서, 표적은 병원체의 일부이다. 일부 구현예에서, 표적은 천연 세포 구성요소이다. 일부 구현예에서, IgG 결합 루프는 PC에 혼입하고 항체 및 PC 사이의 연결로서 작용하는 단백질의 서열이다. PC는 이에 전념하는 여러 간행물이 있었지만(1-3), 항체와 관련된 어떠한 내용도 없었다. 대부분의 생리학적 조건 하에 PC 구성요소는 그 자체의 12 개의 카피로부터 중공 사면체 피라미드로 자가-조립할 수 있다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 SAPNA가 항체에 의해 국소화되는 어디에나 화물을 전달하거나 또는 운반할 수 있다. 일부 구현예에서, 화물 크기는 약 150 kDa 내지 약 20 kDa 범위이다. 많은 유용한 거대분자가 이 범위에 맞다.
SAPNA 구조는 조립 및 분해될 수 있다. 이 기능성은 처음에 화물을 포획하거나 또는 화물을 방출하는 데 사용될 수 있다. 또한, 많은 종류의 항체가 있기 때문이다. 다양한 항체가 있는 PC를 혼합하여 표면 상에 다양한 항체 세트가 있는 SAPNA를 생성할 수 있다. 항체를 교환하는 능력은 추가 기능성을 제공한다.
일부 구현예에서, 화물을 운반하고 국소화하는 능력 이외에도, SAPNA는 화물 없이 세포 거동을 변경할 수 있다. 세포에 영향을 미치는 외부 자극은 종종 리간드 결합에서 시작하여 막횡단 수용체를 밀접하게 접촉시킨다(올리고머화)(4). 이는 2 개 이상의 수용체를 사이토카인과 같은 리간드에 결합시키는 것을 통해 달성되지만, 많은 수용체에 대한 리간드는 알려져 있지 않거나, 또는 또 다른 세포의 세포 표면으로 제한될 수 있다. 일부 구현예에서, PC 상의 디스플레이를 통해(도 1a, b; 도 7), 임의의 단일 수용체에 대해 개발된 임의의 IgG 항체의 기능적 힘이 유의하게 향상될 것이다. 주로 수용체를 차단하는 것으로 제한되는 대신에, 항체는 세포내 신호전달 경로를 활성화시켜, 세포 활성을 매우 미세하게 제어할 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 종류의 항체가 PC 상에 표시되고 단백질은 다중-쇄 면역 인식 수용체(MIRR)를 통해 작동하는 신호에 영향을 미칠 수 있다. 많은 면역 세포는 세포내 신호전달을 제어하기 위해 MIRR에 의존한다(4). MIRR은 종종 올리고머화 및 후속 활성화를 위해 세포외 리간드에 의한 다중-쇄 개입이 필요하다. 일부 구현예에서, SAPNA는 현재 메커니즘을 차단하는 것으로 제한되는 IgG 항체에 활성화/신호전달 능력을 모듈식으로 부여할 것이다. 이는 세포 신호전달 모듈을 원하는 임의의 질환에 대해 기존 및 새롭게 개발된 인간 IgG 항체에 대한 완전히 새로운 치료 방안을 열 수 있다.
SAPNA는 용도가 단일, 또는 소수의 질환으로 제한되지 않으므로, 엄청난 잠재력을 가지고 있다. 이의 잠재력은 또한 개발된 단일클론 항체 생성물의 수가 증가할수록, SAPNA에 대한 잠재적 용도가 증가하기 때문에 고정되어 있지 않다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 조절될 수 있는 널리 정의된 리간드-수용체 상호작용이 있으므로, 이용가능한 여러 치료 IgG 항체(예컨대, 항-PD-1/PD-L1, 항-CTLA4)와 함께, 면역요법에서 암을 표적하는 데 사용된다. 치료 항체 목록, 이들의 기원 및 이소형, 작용 방법, 및 허가된 적응증에 대해 참고문헌 (6)을 참조한다. 추가로, 암 면역학은 주로 항체-염색 기반 유세포 분석 사용에 기반한 연구 분야이며, 이는 광범위한 전임상 후보의 테스트를 허용할 것이다. 본 발명은 본 발명의 단백질 케이지 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 핵산은 발현 벡터와 같은 벡터이다. 일부 구현예에서, 단백질 케이지 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 숙주 세포에서 단백질 케이지 폴리펩티드를 발현할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 핵산은 숙주 세포에 안정하게 도입되고/되거나 유지될 수 있는 벡터이다.
본 발명은 본 발명의 단백질 케이지 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 숙주 세포에 안정하게 도입되고/되거나 유지될 수 있는 벡터이다.
본 발명은 본 발명의 단백질 케이지 폴리펩티드(또는 스캐폴딩 단백질) 또는 중공 사면체 피라미드 구조를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 단백질 케이지 폴리펩티드(또는 스캐폴딩 단백질) 또는 중공 사면체 피라미드 구조는 항체 또는 이의 일부, 또는 항체, 또는 이의 일부를 포함하는 임의의 키메라 단백질, 분자 또는 화합물에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 (a) 본 발명의 숙주 세포를 제공하는 단계, (b) 단백질 케이지 폴리펩티드가 발현되는 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (c) 임의적으로 단백질 케이지 폴리펩티드을 회수하는 단계를 포함하는, 단백질 케이지 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부를 검출하거나 또는 단리하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 항체가 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합할 수 있는 "항체로 장식된 자가-조립 단백질 나노입자"(SAPNA)를 제공하는 단계; (b) SAPNA가 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 결합하도록, SAPNA를 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; (c) 검출을 통해 SAPNA 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부를 검출하고/하거나, 나머지 샘플에서 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 결합된 SAPNA를 분리하는 단계; 및 (d) 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부의 존재비를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 병원성 생물학적 작용제에 의해 야기된 질환을 앓고 있거나, 이로 진단되거나, 또는 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물 또는 조류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 일반적인 애완동물 또는 가축 동물이다. 일부 구현예에서, 방법은 질환의 효과가 알려져 있거나 또는 치유 또는 완화할 수 있는 대상체에게 치료 유효량의 약제를 투여하는 것과 같은, 질환에 대해 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 약물과 같은 하나 이상의 화학적 화합물과 화학적으로 접합된 다음, 항체-약물 접합체(ADC)와 유사한 방식으로 약물 침착을 위해 생물학적/세포 부위에 표적화되는 SAPNA를 제공한다,
전술한 측면 및 다른 측면은 첨부 도면과 함께 읽을 때 예시적인 구현예의 하기 설명으로부터 당업자에 의해 용이하게 인식될 것이다.
도 1a. SAPNA 모델 및 이의 일부.
도 1b. 다양한 스캐폴드 상태의 예측된 구조의 모델.
도 2a. PerCP-표지된 인간 IgG1 Fc 도메인이 있는 스캐폴드의 SEC 피크 이동 결합 검정. 280 nm에서의 흡광도.
도 2b. PerCP-표지된 인간 IgG1 Fc 도메인이 있는 스캐폴드의 SEC 피크 이동 결합 검정. 482 nm에서의 흡광도.
도 3a. Alexa Fluor®-488-표지된 인간 IgG1 이소형 항체가 있는 스캐폴드의 SEC 피크 이동 결합 검정. 280 nm에서의 흡광도. Alexa Fluor®는 Thermo Fisher Scientific(매사추세츠주 월섬 소재)에서 소유한 등록된 상표명이다.
도 3b. Alexa Fluor®-488-표지된 인간 IgG1 이소형 항체가 있는 스캐폴드의 SEC 피크 이동 결합 검정. 488 nm에서의 흡광도.
도 4a. 인간 IgG1 Fc 도메인이 있는 스캐폴드의 SEC SAXS. SEC-SAXS-MALS로부터 샘플 추적.
도 4b. 인간 IgG1 Fc 도메인이 있는 스캐폴드의 SEC SAXS. P(r) 함수 히스토그램.
도 5a. 토끼 항-GFP 항체가 있는 스캐폴드의 SEC SAXS. SEC-SAXS-MALS로부터 샘플 추적.
도 5b. 토끼 항-GFP 항체가 있는 스캐폴드의 SEC SAXS. P(r) 함수 히스토그램.
도 6. 보존된 SAPNA 서열. 범례: 보존된/유지된 284 개의 잔기(284/456 = 62%); "*" = 진화에 기반한 보존된 올리고머화 계면 잔기 및 고도로 보존된 잔기(다중 서열 정렬); 또한 삽입/결실을 허용하지 않는 것으로 결정된 잔기를 포함한다. 이는 시도된 삽입(굵게 표시된 *)의 한쪽 측면에 있는 잔기를 포함한다; "$" = 이들 잔기 사이에 허용되고 용인된 삽입; "^" = 다양한 길이의 대체 삽입이 허용된 결실(첫번째 부위: 17 내지 25 개의 잔기 길이이며 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함해야 하고 두번째 부위: 28 내지 85 개의 잔기 길이이며 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함해야 함); "#" = 음에서 양으로 허용되는 단일 전하 교환 돌연변이와 같은 점 돌연변이; "@" = 길이 조정을 용인할 수 있는 2 개의 도메인을 연결하는 알파-나선; " " = 잔기 위의 공백 공간은 비-보존을 의미하며, 임의의 아미노산일 수 있다.
도 7. SAPNA는 최대 12 개의 항체가 로딩될 수 있다.
도 8. 동적 광 산란은 토끼-항-ROBO1 항체가 로딩된 SAPNA를 나타낸다.
도 9. T 세포 면역학적 시냅스에서 수용체 클러스터링을 강화하는 SAPNA의 개략도.
도 10. 판독값으로 유세포 분석을 사용하여 14 일에 걸쳐 혈액 공여자-유래 T 세포를 자극하고 확장하는 데 사용되는 항-CD3/항-CD28 항체가 로딩된 SAPNA. 이들 데이터는 2 가지 시중 기술인 ThermoFisher의 Dynabead CD3/CD28, 및 StemCell의 ImmunoCult CD3/CD28에 비해 우수한 1차 T 세포 확장 능력을 입증한다.
도 11. 비드에 결합된 SAPNA는 T 세포 집단을 단리(음성으로 선택)할 수 있다.
도 12. SAPNA는 Alexa Fluor®-488과의 화학적 접합 후 이의 구조를 유지한다.
도 13. Alexa Fluor®-488 표지된 SAPNA는 HeLa 자궁경부암 세포의 표면을 표적으로 하는 토끼-항-ROBO1 항체에 결합한다.
도 1a. SAPNA 모델 및 이의 일부.
도 1b. 다양한 스캐폴드 상태의 예측된 구조의 모델.
도 2a. PerCP-표지된 인간 IgG1 Fc 도메인이 있는 스캐폴드의 SEC 피크 이동 결합 검정. 280 nm에서의 흡광도.
도 2b. PerCP-표지된 인간 IgG1 Fc 도메인이 있는 스캐폴드의 SEC 피크 이동 결합 검정. 482 nm에서의 흡광도.
도 3a. Alexa Fluor®-488-표지된 인간 IgG1 이소형 항체가 있는 스캐폴드의 SEC 피크 이동 결합 검정. 280 nm에서의 흡광도. Alexa Fluor®는 Thermo Fisher Scientific(매사추세츠주 월섬 소재)에서 소유한 등록된 상표명이다.
도 3b. Alexa Fluor®-488-표지된 인간 IgG1 이소형 항체가 있는 스캐폴드의 SEC 피크 이동 결합 검정. 488 nm에서의 흡광도.
도 4a. 인간 IgG1 Fc 도메인이 있는 스캐폴드의 SEC SAXS. SEC-SAXS-MALS로부터 샘플 추적.
도 4b. 인간 IgG1 Fc 도메인이 있는 스캐폴드의 SEC SAXS. P(r) 함수 히스토그램.
도 5a. 토끼 항-GFP 항체가 있는 스캐폴드의 SEC SAXS. SEC-SAXS-MALS로부터 샘플 추적.
도 5b. 토끼 항-GFP 항체가 있는 스캐폴드의 SEC SAXS. P(r) 함수 히스토그램.
도 6. 보존된 SAPNA 서열. 범례: 보존된/유지된 284 개의 잔기(284/456 = 62%); "*" = 진화에 기반한 보존된 올리고머화 계면 잔기 및 고도로 보존된 잔기(다중 서열 정렬); 또한 삽입/결실을 허용하지 않는 것으로 결정된 잔기를 포함한다. 이는 시도된 삽입(굵게 표시된 *)의 한쪽 측면에 있는 잔기를 포함한다; "$" = 이들 잔기 사이에 허용되고 용인된 삽입; "^" = 다양한 길이의 대체 삽입이 허용된 결실(첫번째 부위: 17 내지 25 개의 잔기 길이이며 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함해야 하고 두번째 부위: 28 내지 85 개의 잔기 길이이며 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함해야 함); "#" = 음에서 양으로 허용되는 단일 전하 교환 돌연변이와 같은 점 돌연변이; "@" = 길이 조정을 용인할 수 있는 2 개의 도메인을 연결하는 알파-나선; " " = 잔기 위의 공백 공간은 비-보존을 의미하며, 임의의 아미노산일 수 있다.
도 7. SAPNA는 최대 12 개의 항체가 로딩될 수 있다.
도 8. 동적 광 산란은 토끼-항-ROBO1 항체가 로딩된 SAPNA를 나타낸다.
도 9. T 세포 면역학적 시냅스에서 수용체 클러스터링을 강화하는 SAPNA의 개략도.
도 10. 판독값으로 유세포 분석을 사용하여 14 일에 걸쳐 혈액 공여자-유래 T 세포를 자극하고 확장하는 데 사용되는 항-CD3/항-CD28 항체가 로딩된 SAPNA. 이들 데이터는 2 가지 시중 기술인 ThermoFisher의 Dynabead CD3/CD28, 및 StemCell의 ImmunoCult CD3/CD28에 비해 우수한 1차 T 세포 확장 능력을 입증한다.
도 11. 비드에 결합된 SAPNA는 T 세포 집단을 단리(음성으로 선택)할 수 있다.
도 12. SAPNA는 Alexa Fluor®-488과의 화학적 접합 후 이의 구조를 유지한다.
도 13. Alexa Fluor®-488 표지된 SAPNA는 HeLa 자궁경부암 세포의 표면을 표적으로 하는 토끼-항-ROBO1 항체에 결합한다.
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 달리 나타내지 않는 한, 본 발명은 특정 서열, 발현 벡터, 효소, 숙주 미생물, 또는 과정으로 제한되지 않으며, 그 자체가 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기재하려는 목적을 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다.
본 명세서 및 하기의 청구범위에서, 하기 의미를 갖도록 정의될 다수의 용어를 참조할 것이다:
본원에 사용된 바와 같은 "임의적" 또는 "임의적으로"는 후속적으로 기재된 특징 또는 구조가 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있거나, 또는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 또는 발생할 수 없고, 설명이 특정한 특징 또는 구조가 존재하는 경우 및 특징 또는 구조가 없는 경우, 또는 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형은 달리 문맥상 명확하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩티드"에 대한 언급은 폴리펩티드 분자 뿐만 아니라 특이적 아미노산 서열의 복수의 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "임의적" 또는 "임의적으로"는 후속적으로 기재된 특징 또는 구조가 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있거나, 또는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 또는 발생할 수 없고, 설명이 특정한 특징 또는 구조가 존재하는 경우 및 특징 또는 구조가 없는 경우, 또는 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않은 한, 해당 값의 상한치 및 하한치 사이의 각각의 중간 값이 하한치 단위의 10분의 1까지 또한 구체적으로 개시됨이 이해된다. 명시된 범위에서 임의의 명시된 값 또는 중간 값 또는 해당 명시된 범위에서 임의의 다른 명시된 값 또는 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명 내에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 범위에 포함되거나 또는 제외될 수 있고, 더 작은 범위에서 어느 하나의 제한이 포함되거나, 두 제한이 포함되지 않거나, 또는 둘 다 포함되는 각 범위는 또한 명시된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 제한에 따라 본 발명 내에 포함된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 어느 하나 또는 둘 다를 제외한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
용어 "약"은 명시된 값보다 10% 더 크고 명시된 값보다 10% 더 작은 값을 포함하는 값을 지칭한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스팅에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용된 것과 관련한 방법 및/또는 재료를 개시하고 기재하기 위해 본원에 참조로 포함된다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터의 삽입을 통해 형질전환될 수 있는 살아있는 생물학적 세포를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 숙주 세포를 형질도입하거나, 형질전환하거나, 또는 감염시켜, 세포가 세포에 고유한 것들 이외에, 또는 세포에 고유하지 않은 방식으로 핵산 및/또는 단백질을 발현하는 화합물 및/또는 조성물을 지칭한다. "발현 벡터"는 숙주 세포에 의해 발현될 핵산(보통 RNA 또는 DNA)의 서열을 함유한다. 임의적으로, 발현 벡터는 또한 바이러스, 리보솜, 단백질 코팅 등과 같은 숙주 세포 내로 핵산의 진입을 달성하는 데 도움이 되는 물질을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위해 고려되는 발현 벡터는 임의의 바람직하거나 또는 필요한 작동 요소과 함께, 핵산 서열이 삽입될 수 있는 것들을 포함한다. 추가로, 발현 벡터는 숙주 세포 내로 전달되고 그 안에서 복제될 수 있는 것이어야 한다. 특정 발현 벡터는 플라스미드, 특히 잘 문서화되어 있고 핵산 서열의 전사에 바람직하거나 또는 필요한 작동 요소를 함유하는 제한 부위가 있는 것들이다. 이러한 플라스미드, 뿐만 아니라 다른 발현 벡터는 당업자에게 널리 알려져 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 상호교환가능하게 사용되고 5'에서 3' 단부로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중 가닥 중합체를 지칭한다. 본 발명의 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이지만, 일부 경우에, 예를 들어, 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포포로아미다이트 연결을 포함하는 대체 백본(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press 참조); 양성 백본; 비이온성 백본, 및 비-리보스 백본을 가질 수 있는 핵산 유사체가 사용될 수 있다. 따라서, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 폴리머라제에 의해 정확한 판독을 허용하는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 개별 단일 가닥 또는 이중체로서 핵산의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의하며; 따라서 본원에 기재된 서열은 또한 서열의 보체를 제공한다. 달리 나타낸 바와 같이, 특정 핵산 서열은 또한 이의 변이체(예를 들어, 축퇴된 코돈 치환) 및 상보적 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 암시적으로 포함한다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘 다, RNA 또는 하이브리드일 수 있으며, 이때 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 하이포크산틴, 이소사이토신, 이소구아닌 등을 포함한, 염기의 조합을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 세포에서 DNA 서열의 전사를 구동할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 작제물에서 사용되는 프로모터는 유전자의 전사 시기 및/또는 속도를 조절하거나 또는 조정하는 데 수반되는 시스- 및 트랜스- 작용 전사 제어 요소 및 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 인핸서, 프로모터, 전사 종결인자, 복제 기점, 염색체 통합 서열, 5' 및 3' 비번역 영역, 또는 인트론 서열을 포함하는, 시스- 작용 전사 제어 요소일 수 있으며, 이는 전사 조절에 수반된다. 이러한 시스-작용 서열은 전형적으로 단백질 또는 또는 다른 생체분자와 상호작용하여 유전자 전사를 수행한다(켜기/끄기, 조절, 조정 등). 프로모터는 전사된 유전자의 5'에 위치하고, 본원에 사용된 바와 같이, 번역 시작 코돈(즉, mRNA의 5' 비번역 영역 포함, 전형적으로 100-200 bp 포함)으로부터 서열 5'을 포함한다. 대부분 종종 코어 프로모터 서열은 번역 시작 부위의 1-2 kb 이내, 보다 종종 1 kbp 이내 및 종종 번역 시작 부위의 500 bp 이내에 있다. 관례상, 프로모터 서열은 일반적으로 제어하는 유전자의 코딩 가닥 상의 서열로 제공된다. 본 출원의 맥락에서, 프로모터는 전형적으로 발현을 자연적으로 조절하는 유전자의 이름으로 지칭된다. 본 발명의 발현 작제물에 사용되는 프로모터는 유전자의 이름에 의해 지칭된다. 이름에 의한 프로모터에 대한 언급은 야생형, 천연 프로모터 뿐만 아니라 발현을 유도하는 능력을 보유하는 프로모터의 변이체를 포함한다. 이름에 의한 프로모터에 대한 언급은 특정 종으로 제한되지 않을 뿐만 아니라, 다른 종에서 상응하는 유전자로부터의 프로모터를 포함한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA) 세그먼트 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 이는 전사 조절 서열과 전사된 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열은 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 DNA 또는 RNA 서열의 전사를 자극하거나 또는 조절하는 경우 DNA 또는 RNA 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사된 서열에 물리적으로 인접하며, 즉, 이들은 시스-작용한다. 그러나, 인핸서와 같은 일부 전사 조절 서열은 이들이 전사를 향상시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 또는 매우 근접하게 위치할 필요가 없다.
용어 "세포" 또는 "세포들"은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 단세포 유기체에서 포유동물 세포에 이르는 임의의 유기체의 임의의 세포를 지칭한다.
본 발명의 방법에 따른 다양한 방법에 의해 본원에 교시된 임의의 단백질 케이지 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현을 변형시킬 수 있다. 당업자는 증가하는 유전자 카피 수, 리보솜 결합 부위 강도, 프로모터 강도, 및 다양한 전사 조절인자를 이용하여 단백질 발현 수준을 변경시킬 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명은 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다(이는 기재된 바와 같이 연구 맥락에서 도구로서, 또는 임상 설정에서 치료제로서 사용될 수 있음): 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 인간 또는 연구 모델에서 세포-표면 및 가용성 수용체/리간드를 결합/차단함으로서 면역계를 조절할 수 있는 치료 또는 연구 도구이다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 외부 세포-표면 수용체/리간드 올리고머화의 시행을 통해 하나 이상의 내부 세포 경로를 활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 예컨대 형광 염료 또는 표지를 사용하여 표지되고, 면역형광 또는 유세포 분석에서와 같이, 세포-표면 표적화 항체를 시각화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 형광 염료는 Alexa Fluor® 형광 염료이다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 살아있는 유기체에서 세포 변화 또는 생리학적 반응에 영향을 미치기 위해 인간/토끼 IgG 항체의 임의의 조합을 사용하는 것의 실행가능성을 테스트/스크리닝하는 도구이다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 생체내 순환 및 침입 입자의 옵소니화에 유용하다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 수성 또는 반-수성 환경에서 바이러스들/바이러스 입자를 표적화 및 조작할 수 있다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 화물을 캡슐화할 수 있으며, 후속으로 세포-표면에 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 화물이 있거나 또는 없이(세포내 이입의 개시 및 조절), 세포내 이입을 통해 내부 세포 환경에 대한 접근을 획득할 수 있다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 백신 또는 백신 애쥬번트(adjuvant)이다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 시험관내 면역 세포 활성화 도구이다. 일부 구현예에서, SAPNA 구조는 동일한 스캐폴드 상에 항-형광 항체 및 항-케라틴 항체를 표시함으로써 모발 및 피부에서 형광 단백질을 케라틴에 결합시키는 생분해성 미적 생성물이다. 일부 구현예에서, 항체가 로딩된 SAPNA 분자는 세포의 혼합된 풀로부터 세포 집단을 양성으로 또는 음성으로 선택할 수 있다.
본 발명에 대한 임상 등가물은 없다. 페리틴을 조작하는 또 다른 작동 그룹이 있지만(7), 페리틴 분자의 간격으로 인해, 항체 점유를 예측하기가 훨씬 어려울 수 있고, 따라서 항체 표시를 통해 면역학적 조절을 위한 나노케이지는 더 나쁠 것이다. 이는 본 발명자들이 조작하고 있는 SAPNA 나노케이지에서의 더 큰 기공으로 인해 소분자의 더 나은 운반체일 가능성이 있다. 이 그룹은 또한 페리틴 케이지를 사용하여 화물을 세포에 전달하는 데 더 집중하는 것처럼 보인다(8, 9). 2 가지 상이하지만 경쟁하는 유형의 기술은 조작된 Fc 영역이 있는 항체 및 이중특이적 항체이다.
많은 항체가 임상 시험에 실패하여(10), 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 향상시키는 연구로 이어졌다. 그러나, 이러한 노력은 주로 Fc 돌연변이를 통해 항체 Fc 영역에 대한 Fc-감마 수용체 결합을 향상시키는 것을 목표로 한다. ADCC는 SAPNA가 물리적으로 시행하는 Fc 결합을 통해 Fc-감마 수용체 응집을 필요로 하므로, SAPNA 나노케이지는 이러한 방법보다 우수할 것이다. 추가로, SAPNA는 이러한 노력의 이점을 취할 수 있고, 실제로 치료 효능을 추가로 증가시키기 위해 돌연변이된 Fc가 로딩될 수 있다.
본질적으로 2 개 이상의 상이한 항원 인식 영역을 함유하는 항체인 이중-/다중-특이적 항체(11-15)는 다양한 방식으로 연결되어 있다(14, 15). 이중-/다중-특이적 항체가 큰 잠재력을 가지고 있지만, 각각은 거의 임의의 상업적으로 이용가능한 IgG 항체에 의한 사용이 모듈식이고 이용가능한 SAPNA와 비교하여, 개별적으로 설계되고, 테스트되고, 최적화되어야 한다. SAPNA가 보유한 주요 이점은 다른 비-항체 분자가 항체와 동시에 표시될 수 있다는 점이다. 상이한 항체의 혼합물을 미리 제형화하고 비로딩된 SAPNA 케이지를 후속으로 추가하는 것은 동일한 나노케이지에 여러(~2~12 개) 상이한 항체의 로딩을 허용할 것이다. 그런 다음 이는 현재 다중-특이적 항체에 비해 큰 이점인 큰 다중-특이적 나노입자로서 작용할 수 있다. SAPNA의 모듈식 속성 및 다중-기능성은 차세대 생물학적 치료제에서 매우 바람직한 특성이다.
일부 구현예에서, 단백질 케이지 폴리펩티드(또는 스캐폴딩 단백질)은 항체 또는 이의 일부, 또는 항체, 또는 이의 일부를 포함하는 임의의 키메라 단백질, 분자 또는 화합물에 특이적으로 결합하며; 여기서 항체 또는 이의 일부는 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 사면체 피라미드 구조는 항체 또는 이의 일부, 또는 항체, 또는 이의 일부를 포함하는 임의의 키메라 단백질, 분자 또는 화합물에 특이적으로 결합하며; 여기서 항체 또는 이의 일부는 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, SAPNA 분자는 항원성 단백질 또는 이러한 작용제에 특이적인 다른 표면 분자에 대한 하나 이상의 항체와 함께 SAPNA 분자를 로딩함으로써, 바이러스, 박테리아, 및 임의의 인간/포유동물 질환에 연루된 잘못 접힌 단백질(예컨대 프리온 및 다른 아밀로이드)을 포함하나 이에 제한되지 않는 병원성 생물학적 작용제에 대한 다가 검출 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 검출 적용은 병원성 작용제에 대한 존재비(즉, 감염 심각도)의 단리 및 결정으로 확장된다. 이전에 언급된 바와 같이, 분석 목적을 위해, SAPNA 분자는 검출을 위한 형광단과 같은 분자로 공유적으로 표지될 수 있지만, 다가 His-태그(최대 12 개 카피)는 다양한 항원-결합 분획을 조작하고 단리하는 데 사용될 수 있다. 인간 이외에, 분석될 병원성 작용제는 인간 건강 및 복지에 관심이 있는 동물(예를 들어 일반적인 애완동물, 가축 등)에 영향을 미치는 것까지 확장된다. 일부 구현예에서, 일반적인 애완동물은 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 햄스터, 마우스 등이다. 일부 구현예에서, 가축은 소, 말, 돼지, 양, 또는 염소와 같은 포유동물, 또는 닭, 오리, 또는 거위와 같은 조류이다.
바이러스 및 박테리아의 표면은 숙주 세포 부착 및 숙주 진입, 및 가혹한 조건 하에 생존을 포함한, 생물학적 기능에 필요한 단백질 또는 다른 분자로 코팅되거나 또는 장식된다. 증식의 중요성으로 인해, 이러한 분자, 또는 이러한 분자의 일부는 바이러스 또는 박테리아의 주어진 종 또는 균주에 대해 보존되는 경향이 있다. 결과적으로, 이러한 분자는 식별을 위한 강력한 표적으로 역할을 할 수 있다. 이러한 분자는 또한 상이한 바이러스 및 박테리아에 특이적이고 구별되며, 따라서 진단 적용 시 동일성의 특별한 지정에 적합하다. 표면 분자, 또는 때때로 용해에 의해 생성된 분자에 결합하는 항체에 의해 특이적 바이러스 및 박테리아를 인식하는 능력은 이해되고 실제로 광범위하게 적용된다. 일부 구현예에서, SAPNA 분자는 결합에 대한 특이적 인식 프로파일을 부여하는 선택된 항체를 표시하는 SAPNA의 다가 및 모듈 능력, 및 예를 들어 형광에 의한 단리 및 리포터 판독을 위한 화학적 특징의 지원으로 인해 바이러스 및 박테리아를 식별 및 단리하기 위한 뚜렷하고 유리한 특징을 제공한다.
본 발명의 상이한 구현예는 SAPNA 분자 상의 하나 초과의 별개 유형의 항체를 제시할 수 있다. 예를 들어, SAPNA 분자는 한 유형의 바이러스 또는 박테리아의 상이한 균주 또는 하위유형에 특이적인 항체를 동시에 제시할 수 있다. 이는 집단에서 알려진 변이체 또는 하위유형이 있는 바이러스의 용이하고 효과적인 식별을 제공할 것이다. 인플루엔자 바이러스는 널리 이해되는 예이다. 이는 바이러스의 변이체 균주의 검출을 위한 상이한 시약을 설계할 필요성을 제거할 것이다. 하나 초과 유형의 항체의 제시는 또한 부분적으로 중첩하는 표면 항원의 세트를 발현하는 병원체(예를 들어, 상이한 박테리아) 사이를 구별하는 데 가치가 큰 이점을 제공할 수 있다. 예로서, 박테리아 A가 표면 단백질 X 및 Y를 발현하고, 박테리아 B가 단백질 Y 및 Z를 발현하고, 박테리아 C가 단백질 X 및 Z를 발현하면, 단백질 Y 및 Z에 대해 지시된 항원을 제시하는 SAPNA 분자는 결합력 효과에 의해, 우선적으로 박테리아 B를 식별할 것이다. 물론, 표면 항원 조합의 우선적 검출을 위한 다른 시나리오가 가능할 것이며, 이는 박테리아 및 바이러스 둘 다에 해당한다.
본 발명의 상이한 구현예는 SAPNA 코어에 비해 상이한 화학량론적 양으로 항체의 부가에 의해 달성된, SAPNA 분자 상에 제시된 단일 유형의 항체의 상이한 수를 가질 수 있다. 분자 결합 시 다가 정도는 결합 결합력에 강하게 영향을 미치는 것으로 이해되기 때문에, SAPNA 분자 상에 제시된 항체의 수를 맞추는 능력은 최종 결합 친화성(즉 조정가능성)에 대해 가치가 큰 제어를 부여할 수 있다. 이러한 제어는 의도된 표적 분자의 양성 결합에 대한 가장 바람직한 검출 창을 갖는 시약을 생성하는 데 가치를 제공하지만, 여전히 의도된 검출 표적과 상이한 정도로 유사할 수 있는 비-동종체 분자에 대한 음성 결합 판독값을 제공한다. 표적 특이성에 대한 친화성의 좁은 범위는 박테리아 표적 식별에 사용되는 이전 1가 또는 낮은 원자가 시약에 대한 일반적인 도전과제이다.
본 발명의 상이한 구현예는 상이한 바이러스, 박테리아, 및 아밀로이드 마커 단백질에 특이적일 것이다. 가능한 표적 목록은 광범위하고, 신규 병원체의 발견과 함께 지속적으로 증가하며, 단지 특이적 항체가 알려져 있거나 또는 관심 마커 단백질(오늘날 산업에서 일상적으로 입증되는 능력)에 대해 확립될 수 있을 필요가 있다. 의학적 긴급 바이러스 중에서, SARS-CoV, SARS-CoV-2, 및 MERS-CoV를 포함한 다양한 코로나바이러스의 스파이크(S) 단백질은 식별을 위한 예시적인 표적일 수 있다. gp120 당단백질은 HIV 바이러스에 대한 예시적인 식별 표적이다. GP 표면 단백질은 에볼라(Ebola) 바이러스에 대한 예시적인 표적이다. 헤마글루티닌(HA) 단백질은 인플루에자 바이러스에 대한 예시적인 표적이며, 상이한 바이러스 하위유형이 상이한 HA 변이체에 의해 식별가능하다. 박테리아 표적의 경우, 예시적인 구현예는 다양한 표면 단백질 및 다당류 분자에 대해 지시될 것이다. 인간 병인론에서 가치가 있는 특이적 예는 헤모필루스(Haemophilus) 인플루엔자 유형 b(Hib) 또는 그룹 B 스트렙토코쿠스(Streptococcus)로부터의 협막 다당류(CPS)에 대한 항체를 보유하는 SAPNA 분자, 또는 협막 다당류 코트가 있는 임의의 수의 다른 병원체를 포함할 것이다. 추가의 예는 다음에 대한 항체를 갖는 SAPNA 분자일 것이다: 라임병의 원인 인자(보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 또는 관련 종)의 외부 표면 단백질(OspA), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)의 폴리 D-글루탐산 캡슐 항원, 또는 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)의 헤파린 결합 항원(NHBA). 프리온 및 다른 아밀로이드 질환은 종종 신경변성이고, 인간 및 동물 둘 다에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 병리학에서, 달리 천연 단백질은 잘못 접힌 다음 응집하여 세포독성 아밀로이드 응집체를 형성하며, 이는 전신으로 분포하고, 다양한 장기 시스템에 축적되어 질환으로 이어질 수 있다. 본 발명의 이 구현예와 관련하여, 프리온/아밀로이드 단백질의 잘못 접힌/응집된 독성 형태는 단백질의 선천적으로 접힌 형태와 상이한 형태를 가지며, 이러한 병원성 작용제의 독성 형태를 항체에 의해 구별할 수 있게 한다. 병원성 단백질이 SAPNA 분자를 사용하여 겸출될 수 있는 프리온 질환의 예는 인간의 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jokob Disease) 및 소의 소 해면형 뇌증("광우병")이다. 병원성 단백질의 검출은 다음의 다른 아밀로이드 단백질로 확장될 것이다: A-베타(알츠하이머병에 관련됨), tau 단백질(다양한 타우병증에 관련됨), 알파-시누클레인(파킨슨병에 관련됨), 트랜스타이레틴(전신 아밀로이드증에 관련됨), 및 기타. 이들은 선택된 예만을 나타낸다.
인용된 참고문헌:
본 발명은 이의 바람직한 특정 구현예와 함께 기재되었지만, 전술한 설명은 예시하기 위한 것으로 의도되며 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내의 다른 측면, 이점, 및 변형은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명이 기재된, 하기 실시예는 제한하려는 것이 아니라, 예시의 방식으로 본 발명을 예시하기 위해 제공된다.
실시예 1
재료 및 방법
항체로 장식된 자가-조립 단백질 나노입자(SAPNA)의 설계. SAPNA에 대한 작업 흐름은 다음의 반복적인 과정이었다: DNA 작제물 세트를 조작하고, 단백질 발현을 시도하고, 단백질이 발현되는 경우, 상기 작제물을 특성화하고 이를 인간 Fc(hFc) 결합에 대해 테스트한다. 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 합성된 DNA 단편을 주형 스캐폴드(pET22b+ 벡터로 클로닝됨)에 혼입하고, 임의의 신규 작제물에 대한 후속 돌연변이를 만들었다. 자가-조립 사면체 단백질 케이지인 스캐폴드 주형은 UCLA의 Yeates 실험실에서 작업이 시작되었다(1-3). 최근 협력을 통해, 본 발명자들의 그룹에 의해 개발된 고처리량 소각 X-선 산란(HT-SAXS) 빔라인의 고유한 능력을 사용하여 용액의 다양한 염 및 pH 조건 하에 2 개의 스캐폴드 변이체를 구조적으로 특성화하였다(4). 이러한 2 가지 스캐폴드 변이체를 추가 기능 조작을 위한 주형으로 사용하였다. 본 발명자들은 가능한 많은 용도를 마음에 두고 항체를 표시하기 위해 스캐폴드를 기능화하는 것을 목표로 하였다(상기 참조). 주형 스캐폴드의 이용가능한 구조 및 진화적으로 관련된 상동체의 다중 서열 정렬의 관점을 통해, 본 발명자들은 돌연변이유발을 위한 잠재적인 부위를 식별하였다. 정확한 서열의 서열분석 검증 시, 작제물을 동시에 발현하고 정제하였다. 하기 완충액을 정제에 사용하였다: 1. 용해(50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸), 2. 세척(50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 100 mM 이미다졸), 3. 용출(50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸), 4. 겔 여과(20 mM Tris pH 7.4 또는 8.0, 100 mM NaCl, 또는 PBS pH 7.4, 또는 PBS pH 7.4, 0.05% Triton-X100). Ni-NTA 비드로부터 His-태그된 단백질의 용출 시, 흡광도 및 이론적 흡광 계수를 통해 농도를 측정하였다. 작제물의 높은 원자가로 인해(12 개의 단량체, 각각 His-태그가 있음), Ni-NTA 비드에 대한 증가된 친화성은 상대적으로 순수한 분획을 생성하였다. 따라서, 기준선을 초과하는 단백질의 임의의 상당한 농도는 적절하게- 내지 반-접힌 돌연변이체 스캐폴드인 것으로 예측되었다. 상기 단백질을 생성한 이러한 작제물을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 추가로 정제하고, hFc 결합에 대해 피크-이동 검정으로 테스트하였다. 이러한 돌연변이유발 과정을 상당한 양의 스캐폴드 올리고머를 형성하지 않고 hFc에 결합된 구성이 발견될 때까지 반복하였다(표 2). 가장 최적의 구성 세트를 구조적 기술 다각 광 산란에 커플링된 크기 배재 크로마토그래피 소각 X-선 산란(SEC-SAXS-MALS)을 통해 추가로 특성화하였다.
관련 연구
Fc-III [DCAWHLGELVWCT]로 명명된, IgG 항체의 Fc 영역에 결합하도록 조작된 원래 작은 펩티드 모티프는 2000년에 처음 기재되었다(5). 모티프는 거대분자 결합 상호작용을 선택하는 반복 방식인 펩티드 파지 디스플레이의 사용을 통해 발견되었다. Fc-III은 Fc-III-4C [CDCAWHLGELVWCTC]로 명명된 사이클릭 펩티드 형태의 안정화 아미노산의 부가를 통해 추가로 향상되었다(6). 2012년에, Fc-III 펩티드를 페리틴 단백질 케이지의 루프에 혼입하였고 항체에 결합하고 표적하는 능력을 입증하였다(7). 이 페리틴 단백질 케이지는 개시된 것으로 보인다(WO2013055058A9). 하기 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 Fc-III 및 Fc-III-4C 서열을 이전에 언급된 스캐폴드 주형에서 여러 부위로 조작하였으며, 본 발명자들은 용액에서 인간 및 토끼 IgG 항체에 재현가능하게 결합하고 표시할 수 있음을 입증한다.
결과
본 발명자들은 항체에 결합하고 표시하는 자가-조립 단백질-기반 스캐폴드를 성공적으로 조작하였다. 도 1에서 SAPNA 구조는 인간 또는 토끼 IgG Fc 도메인 또는 항체에 결합할 때 동적 시스템이 용액에서 샘플링할 수 있는 예측된 구조의 대표적인 모델이다. 본 발명의 스캐폴드 분자의 항체/Fc 결합 능력을 생화학적으로 입증하기 위해, 형광 단백질에 접합된 인간 IgG1 Fc인 PerCP(Fc-PerCP)를 스캐폴드에 첨가하고 SEC 상에서 실행하였다(도 2a 및 2b). 단백질에 대한 판독값인 280 nm에서의 피크 흡광도(A280)(도 2a)는 체류 부피 13.2 mL에서 12.9 mL로 이동되며, 이는 스캐폴드의 크기 증가를 나타낸다. 추가로, PerCP의 형광에 대한 판독값인 482 nm에서의 피크 흡광도(A482)는 12.9 mL에서 보이며, 이는 스캐폴드의 크기 증가가 Fc-PerCP의 결합에 기인함을 시사한다. 유사하게, Alexa Fluor®-488 표지된 인간 IgG1 이소형 항체(hIgG1 항체-488)를 사용한 피크 이동 검정을 스캐폴드로 수행하였다(도 3a 및 3b). A280 피크(도 3a)는 체류 부피 13.2 mL에서 12.3 mL로 이동되며, 이는 스캐폴드의 크기 증가를 나타낸다. Alexa Fluor®-488 형광 염료의 형광에 대한 판독값인 흡광도 488(A488) 피크는 12.3 mL에서 보이며, 이는 스캐폴드의 크기 증가가 hIgG1 항체-488의 결합에 기인함을 시사한다. 본 발명자들이 항체/Fc에 형광단 및 형광 단백질의 화학적 접합(아마도 광범위하게 사용된 1차 아민 방법을 통해)이 기능화된 스캐폴드에 결합하는 항체/Fc의 능력을 감소시킬 수 있음을 시사하는 증거를 가지고 있다는 점에 유의하여야 한다. 이로 인해, 본 발명자들은 이들 데이터를 반영하는 도 2b 및 도 3b에서 큰 A482 및 A488 피크를 기대하지 않는다.
Fc 및 항체 결합에 대한 스캐폴드를 구조적으로 평가하기 위해, 본 발명자들은 용액 기술 SEC-SAXS-MALS을 사용하였다(각각 도 4a, 4b, 5a 및 5b). 스캐폴드, hFc, 및 스캐폴드-hFc 복합체의 샘플 피크 영역을 추가 산란 분석을 위해 선택하였다(도 4a). 모든 분자/복합체를 산란 입자의 배향적으로 평균 거리의 히스토그램인 P(r) 함수를 사용하여 도 4b에서 비교한다(8). 따라서, 이러한 히스토그램 아래의 면적이 클수록, 분자 내에서 '분자 가장자리 대 분자 가장자리' 거리의 규모 및 수가 더 커진다. 따라서, hFc 및 항체 분자의 부가를 통해 증가된 스캐폴드의 직경은 P(r) 함수를 통해 용이하게 명백할 것이다. 도 4b에서 도 4a의 스캐폴드-hFc 피크에 따라 다양한 스캐폴드 상태(X, Y, Z)가 스캐폴드에 hFc 분자의 로딩을 나타내는 것이 명백하다. 이러한 로딩 경향은 또한 표 1에서 회전 반경(Rg) 및 최대 치수(Dmax)의 증가에서 볼 수 있다. 스캐폴드에 hFc 로딩에 대한 추가 지원은 표 1의 MALS 데이터에 있으며, 여기서 피크의 MALS 평균 분자량은 스캐폴드에 hFc를 부가하여 764 kDa에서 1020 kDa로 증가하였다. 유사한 결과를 도 5a 및 5b에서 SEC-SAXS-MALS를 사용하여 스캐폴드에 이중클론 IgG 토끼 항-GFP 항체의 결합(스캐폴드-R-항-GFP)을 특성화할 때 발견하였다. 스캐폴드-R-항-GFP 피크의 단일 영역 분석은 P(r) 함수(도 5b), 및 Rg, Dmax, 및 피크의 MALS 평균 분자량(표 1)에서 증가를 입증한다.
표 1. hFc(IgG1) 및 R-항-GFP 항체(IgG)가 있는 스캐폴드의 특성화.
표 2. 현재까지 설계되고 실험적으로 테스트된 스캐폴드 변이체의 서열.
초기 공개된 주형:
SAPNA_1
SAPNA_2
SAPNA_3
SAPNA_4
SAPNA_5
SAPNA_6
SAPNA_7
SAPNA_8
SAPNA_9
SAPNA_10
SAPNA_11
SAPNA_12
SAPNA_13
SAPNA_14
SAPNA_15
SAPNA_16
SAPNA_17
SAPNA_18
SAPNA_19
SAPNA_20
SAPNA_21
SAPNA_22
SAPNA_23
SAPNA_24
SAPNA_25
SAPNA_26
SAPNA_27
SAPNA_28
SAPNA_29
SAPNA_30
SAPNA_31
SAPNA_32
SAPNA_33
SAPNA_34
SAPNA_35
SAPNA_36
SAPNA_37
SAPNA_38
SAPNA_39
실시예 1에 인용된 참고문헌:
실시예 2
재료 및 방법
항체의 SAPNA 결합의 동적 광 산란(DLS) 분석. 샘플을 PBS pH 7.4에서 희석하고 DynaPro 플레이트 판독기 III에서 실행하였다. DLS 획득 시간은 5 초였고 샘플 당 5 개 획득을 취하였다. 온도는 20℃였다.
1차 인간 T 세포 확장 검정. 무작위 공여자의 말초 혈액(PB) 단핵 세포(MNC)로부터 단리된 1차 인간 pan-T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포 뿐만 아니라 일부 감마/델타 T 세포 서브셋 포함)를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 삼중 웰을 다양한 비의 항-CD3/항-CD28 항체가 로딩된 가용성 SAPNA로 처리하거나, 또는 1 일에 경쟁 기술로 처리하였다. 외인성 재조합 인간 IL-2를 함유하는 신선한 무이종(xeno-free) 배지를 3-4 일마다 첨가하였다. T 세포를 다음으로 염색하였다: Live/Dead 착색제, 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CCR7, 항-CD45RA, 및 항-CD95 항체. T 세포 분화를 다음의 문헌-지원 T 세포 서브셋 식별 염색 반응식을 사용하여 유세포 분석을 통해 평가하였다: TCM(CCR7+ CD45RA-), TEM(CCR7- CD45RA-), TEMRA(CCR7- CD45RA+), TSCM(CD45RA+ CCR7+ → CD95+), T미처리(CD45RA+ CCR7+ → CD95-). 샘플을 LSR Fortessa X20 분석기 유세포 분석계에서 실행하고, FlowJo 10.6.1을 사용하여 데이터를 분석하였다.
자기 비드-결합된 SAPNA를 사용한 CD8+ T 세포 단리. 14-일 확장된 1차 인간 pan-T 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. SAPNA를 먼저 자기 Ni-NTA(mag) 비드와 함께 실온에서 5 분 동안 배양한 다음, 토끼-항-CD8 항체를 첨가하고 추가 20 분 동안 배양하였다. 혼합물로부터 SAPNA를 억제하여 대조군을 제조하였다. 대조군 및 mag-SAPNA-CD8 비드를 삼중 웰에 첨가하고 플레이트를 1 시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 되돌렸다. 세포-비드 용액을 재현탁하고 2 분 동안 자석에 두었다. 비드-결합된 구성요소를 자석에 부착한 채로, 세포 현탁액을 함유하는 상청액을 유세포 분석 염색을 위한 새 플레이트로 옮겼다. 세포를 염색하고 "1차 인간 T 세포 확장 검정" 섹션에서와 동일하게 평가하였다.
면역형광 현미경법. HeLa 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하고, 커버슬립에 시딩하였다. 세포를 PBS + 0.2% Triton X-100 중 4% 파라포름알데하이드에 고정시켰다. 그런 다음 이들을 PBS + 0.5% Triton X-100(PBST)에서 30 분 동안 투과시켰다. 투과된 세포를 PBST(+5% FBS)에서 30 분 동안 차단하였다. 대조군 염색은 토끼-항-ROBO1 항체 및 염소-항-토끼-A488 2차 항체를 사용하여 수행하였다. 실험 그룹의 경우, SAPNA를 Alexa Fluor®-488로 화학적으로 표지하고, 토끼-항-ROBO1과 함께 적어도 30 분 동안 배양하였다. 그런 다음 로딩된 SAPNA 분자를 PBST(+5% FBS)에서 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 커버슬립을 PBST로 세척한 다음, PBS로만 세척하였다. 커버슬립을 DNA 얼룩을 함유하는 안티페이드(antifade) 장착 배지인 DAPI를 사용하여 장착시켰다.
결과
SAPNA 분자는 12 개의 잠재적인 항체 Fc 결합 부위를 가지며, 임의의 인간 또는 토끼 IgG에 장착할 수 있다(도 7). 본 발명자들은 토끼-항-ROBO1 항체에 결합하는 SAPNA의 능력의 예를 입증한다(도 8). 본 발명자들은 SAPNA가 세포-표면 수용체를 매우 근접하게 물리적으로 강제할 수 있으며, 이는 T 세포의 활성화 및 확장 시 필요한 단계라는 것을 가정하였다(도 9).
SAPNA를 평가하고 벤치마킹하기 위해, 본 발명자들은 임상적으로 관련된 공여자-유래 말초 혈액 T 세포를 사용하여 14-일 T 세포 확장을 수행하였다(도 10). 이들 데이터는 SAPNA가 가장 많은 수의 세포독성 CD8+ T 세포를 함유하는 T 세포 생성물을 생산하며(도 4 - 왼쪽 상단 패널), 이는 암 세포를 표적으로 하는 것을 의미하는 키메라 항원 수용체(CAR)로 조작하기 위해 의도된 세포임을 입증한다. SAPNA는 경쟁 기술에 비해 CD4+ T 세포 확장에 대해 상위 2 위로 수행되며(도 10 - 왼쪽 하단 패널); 이는 최종 CAR T 세포 생성물의 중요한 구성요소이다1. 추가로, 기억 줄기(TSCM) T 세포와 같은, 보다 줄기-유사 표현형을 가진 T 세포 서브셋은 생체 내에서 가장 큰 장기 항-암 효능을 갖는 것으로 나타났으며, 따라서 최종 확장된 CAR T 세포 생성물에 존재하는 이들의 수를 증가시키는 것은 치료적으로 매우 가치가 있다(Turtle, C.J. et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. J. Clin. Invest. 126, 2123-2138 (2016); Gattinoni, L. et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nat. Med. 15, 808-813 (2009)). SAPNA 기술은 확장 동안 가장 많은 수의 CD4+ 및 CD8+ TSCM 세포를 생산한다(도 10 - 오른쪽 상단 및 하단 패널). 종합하면, 이러한 데이터는 SAPNA가 기술적으로 우수하고, 보다 효과적인 항-암 활성을 갖는 가장 많은 수의 CAR T 세포를 생성할 잠재력이 있음을 입증한다.
SAPNA 분자 상의 12 개의 his-태그로 인해(각 단량체 상에서 1 개), 본 발명자들은 자기 니켈 비드에 결합하면서, 또한 항체에 결합하고 표시할 수 있다고 가정하였다. 이러한 이중 작용을 통해, 본 발명자들은 SAPNA를 사용하여 세포의 혼합된 그룹에서 CD8과 같은 특정한 세포-표면 마커로 세포 집단을 단리(또는 음성 선택)할 수 있음을 입증한다(도 11).
SAPNA가 암 세포의 표면에 표적화될 수 있는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 면역형광 현미경법을 이용하였다. 소각 X-선 산란(SAXS)을 사용하여 Alexa Fluor®-488로 SAPNA를 화학적으로 표지하는 것이 구조에 거의 영향을 미치지 않았다는 것을 검증한 후(도 12), 본 발명자들은 도 8에서 DLS에 사용된 것과 동일한 토끼-항-ROBO1 항체로 로딩하여 HeLa 자궁경부암 세포의 표면에 표지된 나노입자를 표적화하였다. 488-표지된 SAPNA는 세포의 표면에 특이적으로 표적화되었다(도 13).
본 발명은 이의 구체적 구현예를 참조하여 기재되었지만, 다양한 변화가 이루어질 수 있고 등가물이 본 발명의 진정한 취지 및 범위를 벗어나지 않고 대체될 수 있음이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 목적, 취지 및 범위에 특정한 상황, 재료, 물질 조성, 과정, 과정 단계 또는 단계들을 조정하기 위한 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 여기에 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
모든 인용된 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 각각 구체적으로 포함된다.
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<212> PRT
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<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_1
<400> 1
Met Pro Phe Ile Thr Val Gly Gln Glu Asn Ser Thr Ser Ile Asp Leu
1 5 10 15
Tyr Tyr Glu Asp His Gly Thr Gly Thr Pro Val Val Leu Ile His Gly
20 25 30
Phe Pro Leu Ser Gly His Ser Trp Glu Arg Gln Ser Ala Ala Leu Leu
35 40 45
Asp Ala Gly Tyr Arg Val Ile Thr Tyr Asp Arg Arg Gly Phe Gly Gln
50 55 60
Ser Ser Gln Pro Thr Thr Gly Tyr Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Ala Asp
65 70 75 80
Leu Asn Thr Val Leu Glu Thr Leu Asp Leu Gln Asp Ala Val Leu Val
85 90 95
Gly Phe Ser Met Gly Thr Gly Glu Val Ala Arg Tyr Val Ser Ser Tyr
100 105 110
Gly Thr Ala Arg Ile Ala Ala Val Ala Phe Leu Ala Ser Leu Glu Pro
115 120 125
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_2
<400> 2
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<213> Artificial Sequence
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_3
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_7
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_8
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_10
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<213> Artificial Sequence
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_11
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<213> Artificial Sequence
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_16
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_17
<400> 17
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1 5 10 15
Tyr Tyr Glu Asp His Gly Thr Gly Thr Pro Val Val Leu Ile His Gly
20 25 30
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50 55 60
Ser Ser Gln Pro Thr Thr Gly Tyr Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Ala Asp
65 70 75 80
Leu Asn Thr Val Leu Glu Thr Leu Asp Leu Gln Asp Ala Val Leu Val
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Phe Phe Asp Gly Ile Val Ala Ala Val Lys Ala Asp Arg Tyr Ala Phe
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210 215 220
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450 455 460
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<210> 18
<211> 478
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_18
<400> 18
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195 200 205
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<210> 19
<211> 478
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_19
<400> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_20
<400> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_21
<400> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_22
<400> 22
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<211> 478
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_23
<400> 23
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<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_24
<400> 24
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<210> 25
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_25
<400> 25
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<213> Artificial Sequence
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_26
<400> 26
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_27
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_28
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_30
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_31
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<211> 475
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_32
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<213> Artificial Sequence
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_37
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<223> Engineered Self-Assembling Protein Nanocage SAPNA_39
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260 265 270
Leu Ala Phe Leu Ala Lys Ala Gln Glu Ala Gln Lys Gln Lys Leu Leu
275 280 285
Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro Ser Gly Pro Leu
290 295 300
Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe Ala Gly Lys Asn
305 310 315 320
Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr Arg Pro Ile Leu
325 330 335
Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val
340 345 350
Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val Gln Asn Ala Leu
355 360 365
Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala Val Lys Leu Tyr
370 375 380
Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala Lys Glu Ile Ser
385 390 395 400
Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met Gly Leu Ile Tyr
405 410 415
Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe Gly Leu Val Cys
420 425 430
Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg Ser His Arg Gln
435 440 445
Leu Glu His His His His His His
450 455
<210> 41
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide capable of binding to the Fc-region of IgG
<400> 41
Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide capable of binding to the Fc-region of IgG
<400> 42
Gly Cys Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Cys
1 5 10 15
Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide engineered for Polypeptide 2
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1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide engineered for Polypeptide 3
<400> 44
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1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide engineered for Polypeptide 3
<400> 45
Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp
1 5
Claims (38)
- 중공 사면체 피라미드 구조를 형성할 수 있거나 또는 형성하는 데 유용하며, 항체 또는 이의 일부에 특이적으로 결합할 수 있는, 단백질 케이지 폴리펩티드, 또는 스캐폴딩 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 케이지 폴리펩티드, 또는 스캐폴딩 단백질이 구조: 폴리펩티드 1―AHL―폴리펩티드 2―INSERT A― 폴리펩티드 3―INSERT B―폴리펩티드 4 (화학 구조 I)를 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 여기서 AHL은 "알파 나선형 링커"이고, INSERT A 및/또는 INSERT B는 각각 독립적으로 항체 또는 이의 일부에 특이적으로 결합할 수 있는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드, 또는 스캐폴딩 단백질.
- 제2항에 있어서, 상기 INSERT A가 약 17 내지 약 25 개의 아미노산 길이를 갖고/갖거나 INSERT B가 약 28 내지 약 85 개의 아미노산 길이를 갖는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드, 또는 스캐폴딩 단백질.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 INSERT A 및/또는 INSERT B가 각각 독립적으로 아미노산 서열 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드, 또는 스캐폴딩 단백질.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 케이지 폴리펩티드가 구조: 폴리펩티드 1―AHL―폴리펩티드 2―INSERT A― 폴리펩티드 3―INSERT B―폴리펩티드 4 (화학 구조 I)를 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 여기서 AHL은 "알파 나선형 링커"이고, INSERT A는 약 17 내지 약 25 개의 아미노산 길이를 갖고 아미노산 서열 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함하고, INSERT B는 약 28 내지 약 85 개의 아미노산 길이를 갖고 아미노산 서열 DCAWHLGELVWCT(서열번호:41) 또는 GCDCAWHLGELVWCTCG(서열번호:42)를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 1이 서열번호:1-40 중 임의의 하나의 N-말단에서 최대 AQEAQKQK 서열까지의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 1이 YGTAR, TDD, LXENLGTR, IDV, TGXRT, 및/또는 SA를 포함하는 아미노산 서열을 포함하며; 여기서 X는 임의의 하전된 아미노산 잔기인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 1이 약 278 내지 약 303 개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AHL이 AQEAQKQK를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AHL이 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 2가 서열번호:1-40 중 임의의 하나의 AQEAQKQK 서열의 C-단부에서 INSERT A의 N-단부까지의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 2가 LTEVETYVLS(서열번호:43)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 2가 약 30 내지 약 36 개의 아미노산 잔기를 포함하고, 일부 구현예에서, 폴리펩티드 2가 약 33 개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 3이 서열번호:1-40 중 임의의 하나의 INSERT A의 C-단부에서 INSERT B의 N-단부까지의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 3이 FTLTVPSERGLQR(서열번호:44) 및/또는 CATCEQIAD(서열번호:45)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 3이 약 110 내지 약 130 개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 3이 약 121 개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 4가 서열번호:1-40 중 임의의 하나의 INSERT B의 C-단부로부터의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 4가 EHHHHHH를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 4가 약 5 내지 약 13 개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 4가 약 8 개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 케이지 폴리펩티드가 서열번호:1-40 중 임의의 하나에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제22항에 있어서, 상기 단백질 케이지 폴리펩티드가 도 6에서 별표로 표시된 개별 아미노산 잔기 또는 이의 임의의 하나 이상, 또는 모든 스트레치를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 단백질 케이지 폴리펩티드가 도 6에서 "#"로 표시된 상응하는 위치(들)에 임의의 하나 이상, 또는 모든 하전된 아미노산 스트레치를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 케이지 폴리펩티드가 약 400 내지 약 700 개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제25항에 있어서, 상기 단백질 케이지 폴리펩티드가 약 450 내지 약 650 개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG 항체인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 일부가 IgG 항체의 Fc 영역인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 IgG 항체가 인간 IgG 항체인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 IgG 항체가 Fc 키메라 단백질의 일부인, 단백질 케이지 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 일부에 대한 단백질 케이지 폴리펩티드, 또는 스캐폴딩 단백질의 결합 친화성 Ka가 107 M-1, 108 M-1, 또는 109 M-1 이상인, 단백질 케이지 폴리펩티드, 또는 스캐폴딩 단백질.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 케이지 폴리펩티오드, 또는 스캐폴딩 단백질이 항체 또는 이의 일부, 또는 항체, 또는 이의 일부를 포함하는 임의의 키메라 단백질, 분자 또는 화합물에 특이적으로 결합하며; 여기서 항체 또는 이의 일부는 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합하는 것인, 단백질 케이지 폴리펩티오드, 또는 스캐폴딩 단백질.
- 사면체 피라미드 구조로서 조립된 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 12 개의 단백질 케이지 폴리펩티드를 포함하는 중공 사면체 피라미드 구조.
- (a) 하나 이상의 항체 및 (b) 항체를 배열할 스캐폴드를 제공하는 단백질 케이지 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질 조립체인 "항체로 장식된 자가-조립 단백질 나노입자"(SAPNA)로, 여기서 하나 이상의 항체는 단백질 케이지 폴리펩티드의 INSERT A 및/또는 INSERT B에 결합되는 것인, SAPNA.
- 제34항에 있어서, 상기 항체가 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합할 수 있는 것인, SAPNA.
- 하기를 포함하는, "항체로 장식된 자가-조립 단백질 나노입자"(SAPNA) 구조: (1) 3-차원 조립체로 조립된 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 하나의 단백질 케이지 폴리펩티드 또는 스캐폴딩 단백질, 또는 이의 복수의 것, (2) 임의적으로 하나 이상의 인간 또는 토끼 IgG 항체, (3) 임의적으로 IgG 결합 루프, 및 (4) 임의적으로, 복수의 폴리펩티드 또는 스캐폴딩 단백질(또는 조작된 단백질 케이지 단백질(PC))이 3-차원 조립체로 조립될 때, 3-차원 조립체에 의해 제한되거나 또는 둘러싸인 관심 화물.
- 제36항에 있어서, 상기 3-차원 조립체가 사면체 피라미드인, SAPNA 구조.
- 하기 단계를 포함하는, 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부를 검출 또는 단리하는 방법: (a) "항체로 장식된 자가-조립 단백질 나노입자"(SAPNA)를 제공하는 단계로, 여기서 항체는 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합할 수 있는 것인, 단계; (b) SAPNA가 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 결합하도록, SAPNA를 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; (c) 검출을 통해 SAPNA 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부를 검출하고/하거나, 나머지 샘플에서 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부에 결합된 SAPNA를 분리하는 단계; 및 (d) 병원성 생물학적 작용제, 또는 이의 일부의 존재비를 결정하는 단계.
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