JP6789112B2 - Ｃｄ４＋ｔリンパ球の検出、調製および枯渇のための向上した方法 - Google Patents

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Description

発明の分野
この発明は、体液または培地での、もしくは体液または培地からのＣＤ４＋Ｔリンパ球の検出、調製または枯渇のための、隣接残基内にチオ酸化還元モチーフを含むクラスＩＩ制限主要組織適合性複合体（major histocompatibility complex：ＭＨＣ）Ｔ細胞エピトープを包含する合成ペプチドに関する。
発明の背景
リンパ球は、外来抗原に対する免疫反応の同化において、および疾患の制御において中心的な役割を果たす。リンパ球のそのような動員および活性化は、病原体に対する反応などにおいて有益となる場合があり、または、自己免疫疾患、アレルゲンへの反応によって、および移植片拒絶において例証されるように不利益となる場合がある。したがって、そのようなリンパ球を検出し、列挙し、精製し、または枯渇させることが有利となるであろう状況が、数多くある。しかしながら、これらの目標を達成するための現在の方法は、不十分である。
リンパ球は、表面分子の存在および機能に従って、いくつかの系統および部分集合に区分される。ＣＤ４系統のリンパ球は、（ＣＤ３と呼ばれる）抗原特異的Ｔ細胞受容体に関連付けられた補助受容体であるＣＤ４分子の存在を特徴とする。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞によるそれらの処理、およびクラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）による提示の後で、抗原を認識する。これは、ＭＨＣクラスＩＩ決定基と、抗原由来ペプチドと、ＣＤ４＋分子の動員によって安定化される分子複合体である抗原特異的Ｔ細胞受容体（T cell receptor：ＴＣＲ）との集合体を通して、免疫シナプスの形成をもたらす。
しかしながら、ＴＣＲによるペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体の認識は親和性が低く、すなわち、抗体のそのエピトープへの結合のためのものより数桁低い。これは、ＴＣＲが、抗体とエピトープとの結合によって作られた大きいエリアとは対照的に、クラスＩＩ ＭＨＣ間隙に結合された９個のアミノ酸残基と、ＭＨＣ分子自体に関する残基とで作られた線形配列に接触する、という事実による。ＴＣＲの低い親和性は、非効率的な検出、特に複雑な体液をもたらす。
これは、可溶型のＭＨＣを使用してペプチド−ＭＨＣ複合体が再構成される方法の開発につながった。通常、可溶性ＭＨＣ分子は、二量体、四量体または五量体の形で多量体化される。これらの多量体の多くの変異体が、近年記載されてきた（デイビス（Davis）ら（２０１１）Nature Rev. Immunol. １１、５５１〜５５８）。しかしながら、これらの多量体の特異性および感度は双方とも著しく増加したものの、これらの検出ツールは、Ｔ細胞頻度が低い状況下では、または、ナイーブ構成のＴ細胞についてなどのようにＴＣＲ親和性が限定因子である場合には、依然として比較的非効率的なままである。
Ｔ細胞エピトープを検出するためのＭＨＣクラスＩＩ多量体は、たとえばネポム（Nepom）（２０１２）J. Immunol. １８８、２４７７〜２４８２で検討されている。この検討はまた、ＣＤ４＋セルのためのＭＨＣクラスＩＩ多量体の限定された親和性、および、この親和性を向上させるためのシトリヌレート化（citrinullated）アミノ酸の使用を指摘している。ウールドリッジ（Wooldridge）ら（２００９）Immunology １２６、１４７〜１６４は、ペプチド−ＭＨＣ複合体と、エピトープＭＨＣ複合体の低い親和性とについて述べている。エピトープ配列に隣接して疎水性アミノ酸を導入することによって、ＭＨＣクラスＩＩ複合体とのＴ細胞エピトープ結合を増加させる試みが、ＷＯ９７０４０８５２に記載されている。
ＷＯ２００８０１７５１７は、細胞溶解性Ｔ細胞集団の生成におけるＴ細胞エピトープと還元酵素モチーフ配列とを有するペプチドを記載している。カルリエ（Carlier）ら（２０１２）PloS ONE ７（１０）、ｅ４５３６６、１〜１４は、ＭＨＣ−ペプチド複合体と同族ＴＣＲとの間に形成されたシナプスが、このタイプのペプチドによって安定化されることを開示している。ここでの実験結果は、Ｔ細胞エピトープ配列と酸化還元モチーフ配列とを含むペプチドが使用される場合、抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との間の二量体形成の数および期間が増加する、ということを実証している。
ほんの数例として挙げられる自己免疫疾患、癌、またはワクチン接種への反応の評価といったさまざまな分野においてＣＤ４＋Ｔ細胞を検出する方法に対する要望の増大と、利用可能な方法の不十分な効率とのコントラストが、そのような方法の向上を急務にしている。
発明の概要
この発明の第１の局面は、試料においてクラスＩＩ制限ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するためのインビトロの方法に関する。これらの方法は、
− 試料を提供するステップと、
− ＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドとの単離された複合体に試料を接触させるステップとを含み、ペプチドは、抗原タンパク質のＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープと、それに直接隣接する、または最大７個のアミノ酸のリンカーによって隔てられた、［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフを有する配列とを含み、前記方法はさらに、
− 試料における細胞との複合体の結合を測定することによってＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップを含み、細胞への複合体の結合は、試料におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を示す。
特定の実施形態では、モチーフはＣｘｘＣである。
特定の実施形態では、リンカーは、最大４個のアミノ酸の長さを有する。
他の実施形態では、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子と前記ペプチドとの複合体が非共有結合複合体であり、前記ペプチドは１２〜２０個のアミノ酸の長さを有する。
試料は、血液試料、組織試料、たとえば関節リウマチ患者からの関節液、たとえば感染性肺炎または結核の患者の胸膜液であってもよい。
試料は、異なるタイプのＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでいてもよい。
試料において検出されるＣＤ４＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、抗原にさらされたＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、誘発Ｔｒｅｇ、治療中またはワクチン接種中に得られたＣＤ４＋Ｔ細胞、または組織内のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの１つ以上であってもよい。
特定の実施形態では、複合体は、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との融合タンパク質である。
特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、細胞溶解物内に、または細胞溶解物の精製断片に存在している。ＭＨＣ分子は、組み換え発現によって得られてもよい。
典型的には、ペプチドにおけるエピトープ配列は、抗原における配列と同一である。また、これに代えて、ＣＤ４＋Ｔ細胞へのペプチドの結合親和性を調整するために、ＭＨＣクラスＩＩ固定残基が、抗原で発生するようなエピトープと比べて修飾される。
四量体、デキストラマーとしての複合体、可溶性複合体、不溶性担体または基質に付着された複合体におけるＭＨＣ分子のように、複合体のさまざまな変形が考えられる。
この発明の方法の実施形態は、複合体に結合されたＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップをさらに含む。
この発明の方法の実施形態は、検出されたＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団を検出または単離するステップをさらに含む。
この発明の方法の実施形態は、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団を検出または単離するステップをさらに含む。
この発明の別の局面は、ＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドとの単離された複合体を含む組成物であって、ペプチドは、抗原タンパク質のＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープと、それに直接隣接する、または最大７個のアミノ酸のリンカーによって隔てられた、［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフを有する配列とを含む、組成物に関する。
典型的な実施形態では、モチーフはＣｘｘＣである。他の典型的な実施形態では、リンカーは、最大４個のアミノ酸の長さを有する。
ペプチドとＭＨＣ分子との複合体は、非共有結合された複合体であってもよく、または共有結合された複合体であってもよい。
複合体はまた、前記ペプチドとのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の融合タンパク質であってもよい。
融合タンパク質以外の、非共有結合複合体または共有結合複合体の典型的な実施形態において、ペプチドは、１２〜２０個のアミノ酸の長さを有する。
複合体は、ビーズまたはプレートなどの担体に付着されてもよい。
この発明のさらに別の局面は、抗原タンパク質のＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープと、それに直接隣接する、または最大７個のアミノ酸のリンカーによって隔てられた、［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフを有する配列とを含むペプチドの、ＭＨＣクラスＩＩ制限ＣＤ４＋Ｔ細胞への、ＭＨＣクラスＩＩ分子とＴ細胞エピトープを有するペプチドとの複合体の結合親和性を増加させるための使用に関する。
この発明のさらに別の局面は、ＭＨＣクラスＩＩ制限ＣＤ４＋Ｔ細胞への、単離されたＭＨＣクラスＩＩ分子／エピトープ複合体の結合親和性を増加させるための、Ｔ細胞エピトープと［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフ配列とを有するペプチドを生成するための、前記モチーフの使用に関する。
この発明の方法は、たとえば以下の用途において使用可能である：
− 自己免疫疾患の治療を監視するために、自己免疫抗原に対するエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞を検出すること、
− ワクチン接種の有効性を監視するために、ワクチン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出すること、
− 移植前に被移植者のＣＤ４＋Ｔ細胞を除去すること、
− ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を濃縮してから、細胞の前記集団を拡張し、オプションで、ペプチドの存在下で細胞を拡張すること、または、
− ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）における突然変異を同定するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞を異なる時点で単離すること。
この発明の向上した方法および化合物は、それらの用途を、たとえば以下に見出す：
（１） 分析目的：ワクチン接種前のＴ細胞前駆体の頻度の検出、ＭＨＣクラスＩＩ複合体についてのペプチド結合親和性の評価、ワクチン接種の経過中または免疫抑制療法下での特異的Ｔ細胞のフォローアップ、細胞の同定（細胞の生物活性にかかわらない）、疾患のメカニズムに関わる細胞の同定、特異的Ｔ細胞の枯渇、および、臓器生検でのような現場でのＴ細胞の検出；
（２） 調製目的：機能評価のための特異的Ｔ細胞の調製、培養および精製およびＴＣＲシーケンシングのためのＴ細胞の調製；
（３） たとえば細胞療法を目的とする細胞集団の品質管理；
（４） 臓器移植前の特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇を含む、治療目的。
ＭＨＣクラスＩＩ分子の構造は、２０個までのアミノ酸のペプチドがＴ細胞に提示されることを可能にする。コア配列は通常、ＭＨＣクラスＩＩ間隙内に挿入される９個のアミノ酸で作られている。隣接領域は、エピトープのカルボキシ末端およびアミノ末端の双方で突出している。
ＷＯ２００８０１７５１７特許出願は、多くの疾患の治療のための、クラスＩＩ制限エピトープの隣接残基内に挿入された酸化還元酵素モチーフの使用を記載している。カルリエら、PloS ONE ７（１０）、ｅ４５３６６、１〜１４に報告されているように、酸化還元酵素モチーフは、ＭＨＣ−ペプチド複合体と同族ＴＣＲとの間に形成されたシナプスを安定化する、ということが実証されている。そこに記載された増加したシナプス形成は、精製されたＡＰＣとＣＤ４＋Ｔ細胞とを用いた実験に裏付けられ、それらはＡＰＣとＣＤ４＋Ｔ細胞との間の二量体形成の数および期間の増加を示し、それはＣＤ４＋Ｔ細胞のさまざまな機能特性に対する効果をもたらす。ＡＰＣとＣＤ４＋との間の結合親和性に対する効果は、先行技術では述べられていない。
我々は、ＭＨＣ分子が単離された複合体として使用される場合でも、クラスＩＩエピトープの隣接残基内への酸化還元酵素モチーフの添加が、ＣＤ４＋Ｔ細胞とのＭＨＣ−エピトープ複合体の結合親和性を増加させる、という予想外の観察を行なった。これは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出および調製において、ならびに、そのような細胞のあらゆる次の操作のために、Ｔ細胞エピトープ配列と酸化還元モチーフとを有するペプチドを使用することを可能にする。
この発明の方法および組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の特異的でかつ高親和性の検出を可能にする。
この特異性および親和性は、より感度が高く、かつ特異的な診断方法を可能にする。
特異性および親和性はまた、より多い数およびより高い純度でのＣＤ４＋Ｔ細胞の単離を可能にする。
この発明は、無傷の生存細胞上の抗原提示という文脈以外で、単離されたＭＨＣクラスＩＩ分子を使用したＣＤ４＋Ｔ細胞の検出を可能にする。ＡＰＣとＣＤ４＋Ｔ細胞との間に生じるさまざまな相互作用がない場合に、特異的でかつ高親和性のＣＤ４＋Ｔ細胞の結合が得られ得る、という発見が、この発明の主な発見である。
この発明の方法は、組織および体液、ならびにそれらの部分精製断片に対して実行可能である。
この発明の方法は、異なるタイプのＣＤ４＋細胞および異なるタイプのＴ細胞を含む試料に対して実行可能である。
親和性および特異性は、抗体を使用した細胞表面抗原の検出について、または配位子を使用した受容体の検出について公知である手法のレパートリーを使用して、細胞検出および単離を行なうことを可能にする。これらの例は、基質またはビーズ上でのＭＨＣ−ペプチド複合体の不動化および操作、ならびに、発色団または磁気ビーズなどの検出可能な群を用いた複合体の標識付けである。
詳細な説明
定義
ここに使用されるような「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって接続されるアミノ酸配列を含む分子を指すが、ある特定の実施形態では、（たとえば連結有機化合物のような）非アミノ酸構造を含み得る。
この発明の文脈におけるペプチドは少なくとも、ＭＨＣクラスＩＩ Ｔ細胞エピトープ配列と酸化還元モチーフ配列とを含む。これらの２つの特徴は、以下にさらに詳細に説明され、定義される。
本願の方法および生成物では、そのようなペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成する。この複合体は、ペプチドとＭＨＣ分子との非共有結合複合体であってもよく、もしくは、たとえばＳＨ基、ＣＯＯＨ基、ＮＨ２基またはＯＨ基を介してペプチドおよびＭＨＣ分子の官能基を架橋することによる共有結合複合体であってもよい。
上述の複合体では、エピトープ（８、９または１０個のアミノ酸）と酸化還元モチーフ（４個のアミノ酸）とを含むペプチドは典型的には、１２、１３または１４個のアミノ酸〜１６、１７または１８個のアミノ酸の長さを有するであろう。リンカーおよび隣接残基の長さに依存して、ペプチドは、２０、２１、２４、２５または３０個までのアミノ酸の長さを有し得る。
ある特定のタイプの共有結合複合体は、ＭＨＣクラスＩＩ Ｔ細胞エピトープと酸化還元モチーフとを有するペプチドと、ＭＨＣクラスＩＩ分子との融合タンパク質である（さらに「ペプチド−ＭＨＣ融合タンパク質」と呼ばれる）。
この発明に従ったペプチドは、従来の２０個のアミノ酸またはそれらの修飾バージョンのいずれかを含んでいてもよく、もしくは、化学ペプチド合成によって、あるいは化学修飾または酵素修飾によって組込まれた非自然発生アミノ酸を含んでいてもよい。特に興味深いのは、メルカプトバリン、ホモシステイン、もしくはチオール機能を有する他の天然または非天然アミノ酸といったチオール基を有するシステインの修飾バージョンである。
「酸化還元酵素モチーフ」、「酸化還元モチーフ」、「還元酵素モチーフ」または「モチーフ」は、モチーフＣｘｘＸ、ＣｘｘＳ、ＣｘｘＴ、ＳｘｘＣ、ＴｘｘＣを有する４個のアミノ酸の配列を指す。これらの代替物は、［Ｃ］−Ｘ（２）−［ＣＳ］または［ＣＳ］−Ｘ（２）−［Ｃ］と書くことができる。
「エピトープ」という用語は、抗体またはその一部（Ｆａｂ’、Ｆａｂ２’など）、もしくは、ＢまたはＴ細胞リンパ球の細胞表面で提示される受容体によって特異的に認識および結合され、前記結合によって免疫反応を誘発できる、抗原タンパク質の（立体配座エピトープを規定し得る）１つまたはいくつかの部分を指す。
この発明の文脈における「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、優位の、準優位の、または下位のＴ細胞エピトープ、すなわち、Ｔリンパ球の細胞表面での受容体によって特異的に認識および結合される抗原タンパク質の一部を指す。エピトープが優位か、準優位か、または下位かどうかは、そのエピトープに対して誘出される免疫反応に依存する。優位性は、タンパク質の起こり得るすべてのＴ細胞エピトープ中で、そのようなエピトープがＴ細胞によって認識され、それらを活性化できる頻度に依存する。
この発明の文脈における「ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識され、ＭＨＣＩＩ分子の溝に適合する＋／−９個（８、９、または１０ＡＡ）のアミノ酸の配列からなるＴ細胞エピトープを指す。９ＡＡのＴ細胞エピトープを表わすペプチド配列内で、そのエピトープにおけるアミノ酸にはＰ１〜Ｐ９の番号が付けられ、そのエピトープのＮ末端アミノ酸にはＰ−１、Ｐ−２などの番号が付けられ、そのエピトープのＣ末端アミノ酸にはＰ＋１、Ｐ＋２などの番号が付けられる。
ここに使用されるような「抗原」という用語は、巨大分子、典型的には（多糖類を有する、または有さない）タンパク質の構造、もしくは、１個以上のハプテンを含み、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質組成物で作られた構造を指す。ここに使用されるような「抗原タンパク質」という用語は、１個以上のＴ細胞エピトープを含むタンパク質を指す。ここに使用されるような自己抗原または自己抗原タンパク質は、ヒトまたは動物の体内に存在し、そのヒトまたは動物の体内で免疫反応を誘出するタンパク質を指す。
「食物または薬物抗原タンパク質」という用語は、食物または医薬品、たとえばワクチンなどに自然に存在する抗原タンパク質を指す。「自然／天然」という用語は、タンパク質またはペプチドまたはその断片を指す場合、配列が自然発生配列と同一であるという事実に関している。この用語は、多型としての野生型配列、および集団内に発生する突然変異体も含む。それとは対照的に、「人工」という用語は、それ自体はタンパク質配列のペプチドまたは断片として自然界に発生しない配列またはペプチドを指す。オプションで、人工配列は、自然発生配列内の１個以上のアミノ酸を変更するなどの限定された修飾によって、もしくは、自然発生配列のＮ末端またはＣ末端にアミノ酸を追加することによって、自然配列から得られる。
この発明の文脈で使用されるエピトープに関連してここに使用されるような「同族体」という用語は、自然発生エピトープとのアミノ酸配列同一性が少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％であり、それにより、エピトープが抗体もしくはＢおよび／またはＴ細胞の細胞表面受容体を結合する能力を維持する、分子を指す。エピトープの同族体の特定の実施形態は、最大で３個、より特定的には最大で２個、最も特定的には１個のアミノ酸において修飾された天然エピトープに対応する。これの特定の実施形態は、ＣＤ４＋Ｔ細胞についての結合親和性が非修飾エピトープに比べてより高い、修飾エピトープである。
この発明のペプチドに関連してここに使用されるような「誘導体」という用語は、少なくともペプチド活性部分を含み（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出可能であり）、それに加えて、たとえばペプチドを安定化する、もしくはペプチドの薬物動態学的または薬理学的特性を変更する、といった異なる目的を有し得る部分を含む、分子を指す。
「免疫障害」または「免疫疾患」という用語は、免疫系の反応が、生物における機能不全または非生理学的状況の原因となる、またはそれを維持する疾患を指す。免疫障害に含まれるのは、とりわけ、アレルギー疾患および自己免疫疾患である。
ここに使用されるような「アレルギー疾患」または「アレルギー障害」という用語は、（花粉、虫刺され、薬品または食物などの）アレルゲンと呼ばれる特定の物質への免疫系の過敏反応を特徴とする疾患を指す。アレルギーとは、個々のアトピー患者が自分が感作されているアレルゲンに遭遇するといつでも観察される徴候および症状の集合であり、それはさまざまな疾患、特に気管支喘息などの呼吸器疾患および症状の発現をもたらす場合がある。さまざまなタイプの分類が存在しており、アレルギー疾患はたいてい、哺乳類の体内のどこにそれが発生するかに依存して異なる名前を有する。「過敏症」とは、個体が感作されるようになった抗原にさらされるとその個体に生じる、望ましくない（有害な、不快感を生み出す、時には致命的な）反応である。「即時型過敏症」はＩｇＥ抗体の生成に依存しており、したがってアレルギーと同等である。
「アレルゲン」とは、罹患しやすい、特に遺伝的に罹患しやすい個々の（アトピー）患者においてＩｇＥ抗体の生成を誘出する物質、通常は巨大分子またはタンパク質組成物として定義される。同様の定義は、リーバーズ（Liebers）ら、（１９９６）Clin. Exp. Allergy ２６、４９４〜５１６に提示されている。アレルゲンの例は、空中アレルゲン、食物アレルゲン、毒物、ダニアレルゲン（たとえば、Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２）である。
「自己免疫疾患」、「自己免疫障害」という用語は、生物がそれ自体の（分子下レベルまでの）構成部分を「自己」として認識できないことによる、生物のそれ自体の細胞および組織に対する異常な免疫反応から生じる疾患を指す。疾患群は、臓器特異的疾患および全身性疾患という２種類に区分され得る。
自己抗原として公知である、自己免疫疾患に係わる抗原の例は、サイログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ＴＳＨ受容体、インスリン（プロインスリン）、グルタミン酸脱炭酸酵素（glutamic acid decarboxylase：ＧＡＤ）、チロシン・ホスファターゼＩＡ−２、ミエリン・オリゴデンドロサイト・タンパク質、熱ショックタンパク質ＨＳＰ６０である。
他の抗原は、細胞内生活環を有するウイルス、バクテリア、マイコバクテリアまたは寄生生物、もしくは、細胞外生活環を有するウイルス、バクテリアおよび寄生生物といった「病原体関連抗原」を含む。
「同種因子（allofactor）」という用語は、同じ種の２つの個体間で比較した場合に多型を示すタンパク質、ペプチドまたは因子（すなわち、任意の分子）、より一般的には、同種因子を受けた患者において（同種反応性の）免疫反応を誘発している任意のタンパク質、ペプチドまたは因子を指す。
同種因子の例は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子およびスタフィロキナーゼを含む、凝固障害または繊維素溶解障害用の補充療法で使用されるタンパク質；成長ホルモンまたはインスリンなどのホルモン；インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなどのサイトカインおよび成長因子；アレルギー疾患における抗ＩｇＥ抗体、移植片拒絶およびさまざまな自己免疫疾患における抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ４抗体、非ホジキンリンパ腫における抗ＣＤ２０抗体、腎不全における赤血球生成促進因子を含む、免疫反応の調整用抗体である。
「同種抗原」という用語は、同じ種の２つの個体間にタンパク質多型によって生成された抗原を指す。その例は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子、副組織適合性抗原、および組織特異的同種抗原である。
「腫瘍関連抗原」という用語は、腫瘍または腫瘍細胞に関連付けられた（腫瘍または腫瘍細胞によって運ばれ、生成され、分泌されるなどの）任意のタンパク質、ペプチドまたは抗原を指す。腫瘍関連抗原は、健康な正常細胞にではなく（ほぼ）もっぱら腫瘍または腫瘍細胞に関連付けられるかもしれず、もしくは、腫瘍または腫瘍細胞において、健康な正常細胞と比べて過剰に（たとえば、１０倍、１００倍、１０００倍またはそれ以上）発現されるかもしれない。より特定的には、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞のＭＨＣ決定基によって（処理された形で）提示可能な抗原である。よって、腫瘍関連抗原は、ＭＨＣ分子を発現する腫瘍または腫瘍細胞にのみ関連付けられるようである。
例は、何らかの黒色腫で同定されたＭＡＧＥなどの癌遺伝子からの抗原；腎臓または副甲状腺などの軟組織癌上に、および多発性骨髄腫において発現されたサイクリンＤ１などの癌原遺伝子；何らかの癌および何らかのホジキンタイプのリンパ腫におけるエプスタイン−バー・ウイルスからのタンパク質といったウイルス由来タンパク質；スルビビンまたはｂｃｌ２などの抗アポトーシス因子である残存因子；濾胞性リンパ腫または多発性骨髄腫におけるＢ細胞受容体に由来するイディオタイプ決定基、またはＴ細胞悪性腫瘍におけるＴ細胞受容体決定基などのクローン型決定基である。
「主要組織適合性抗原」という用語は、ヒトにおけるＨＬＡ系（マウスにおけるＨ２）に属する分子を指し、それらは一般に２つのクラスに区分される。ＭＨＣクラスＩ分子は、３個のドメイン（アルファ１、２および３）を含む単一の多型鎖で作られており、それは細胞表面でベータ２マイクログロブリンと関連している。クラスＩ分子は、ヒトにおいてＡ、ＢおよびＣと呼ばれる３個の座によってコード化される。そのような分子は、ＣＤ８＋部分集合のＴリンパ球にペプチドを提示する。
細胞上に発生するような「クラスＩＩ分子」は、２つの鎖（アルファ１および２、ならびにβ１および２）を各々含む２つの多型鎖からなる膜貫通型タンパク質である。これらのクラスＩＩ分子は、ヒトにおいてＤＰ、ＤＱおよびＤＲという３個の座によってコード化される。この発明の目的のために、ＭＨＣ分子−Ｔ細胞エピトープ複合体がＣＤ４＋Ｔ細胞に結合できることが必要とされ、かつ十分である。
ＭＨＣ分子は、細胞から単離され、または組み換え発現系で生成され得る。
「単離され」とは、ペプチドを有するＭＨＣクラスＩＩタンパク質および複合体を指す場合、溶解物および溶解物の断片を含む、細胞の組み換えプロセスまたは（部分的）精製を介して得られる化合物を指す。
「副組織適合性抗原」という用語は、正常な細胞タンパク質に由来し、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ複合体に属するＭＨＣによって提示されるペプチドを指す。細胞表面でのそのようなペプチドの表示に質的にまたは量的に影響を与える任意の遺伝的多型が、副組織適合性抗原を生じさせ得る。
「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、ＣＤ４糖タンパク質の表面発現を特徴とする。この発明の文脈において適用可能なＣＤ４＋細胞は、以下を含む：
・ 不適切な免疫反応の能動抑制に関わるＴｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）。これらの細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋細胞である；
・ 不適当な免疫反応の抑制に関わる、Ｔｒ１またはＴｈ３ ＣＤ４＋Ｔ細胞などの誘発Ｔｒｅｇ。前記細胞は、Ｌａｇ３ｈｉおよびＣＤ４９ｂ、細胞内ＩＬ−１０およびＴＧＦベータ、ならびにグランザイムＢなどの表面マーカーの任意の組合せを特徴とする；
・ ＣＤ４５ＡおよびＣＤ１９７を発現し、ＣＤ４４の低いまたは中間の発現と、好ましい経路がない低いサイトカイン生成とを有する、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞；
・ 高いＣＤ４４発現と、制限された一組のサイトカインの生成とを有する、極性化ＣＤ４＋細胞；
・ ＷＯ２００９／１０１２０７において詳細に特徴付けられ、とりわけＦｏｘＰ３発現がないことを特徴とする、細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ｃＣＤ４＋Ｔ細胞）。
「ウイルスベクタータンパク質」という用語は、ここに使用される場合、ウイルスベクター自体に由来し、そのベクターの主鎖によってコード化される、あらゆるタンパク質またはペプチドを指す。それは、ウイルスベクターにおいてクローン化される治療用タンパク質自体を意味しない。ウイルスタンパク質がウイルスベクターにおいてクローン化されるであろう例外的事象において、このタンパク質は依然として、ウイルスベクタータンパク質としてではなく、治療用タンパク質として分類される。典型的には、そのようなウイルスベクタータンパク質は抗原性であり、Ｔ細胞エピトープなどのエピトープを１つ以上含む。
ベクターの主鎖において生じるタンパク質の例は、ガンマ−レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのＲＮＡウイルスから得られたもの、ならびに、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスなどのＤＮＡウイルスから得られたものである。
「同種反応性」という用語は、被移植者とドナーとの対立する違いへと向けられる免疫反応を指す。同種反応性は、抗体およびＴ細胞に当てはまる。この発明はもっぱらＴ細胞同種反応性に依存しており、それは、ペプチド−ＭＨＣ複合体としてのＭＨＣ決定基の文脈で提示された同種抗原のＴ細胞認識に基づいている。
この発明の文脈における「複合体」は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子とエピトープを含むペプチドとの関連付けに関している。この関連付けは、塩橋、水素橋および疎水性接触を介した、ＭＨＣ分子とのペプチドの自発的結合による非共有結合性の関連付けであってもよい。この関連付けはまた、架橋剤および二官能分子を使用した化学的架橋を介した共有結合性の関連付けであってもよい。
ある特定のタイプの複合体では、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびペプチドは、組み換え融合タンパク質（いわゆるペプチド−ＭＨＣ融合タンパク質）である。
アミノ酸配列の「モチーフ」は、プロサイト（Prosite）のフォーマットに従ってここに書かれている。記号Ｘは、任意のアミノ酸が受入れられる位置について使用される。所与の位置について受入れ可能なアミノ酸を大括弧（［］）内に列挙することによって、代替物が示される。たとえば、［ＣＳＴ］は、Ｃｙｓ、ＳｅｒまたはＴｈｒから選択されるアミノ酸を表わす。代替物として除外されるアミノ酸は、それらを中括弧（｛｝）内に列挙することによって示される。たとえば、｛ＡＭ｝は、ＡｌａおよびＭｅｔ以外の任意のアミノ酸を表わす。モチーフにおける異なる要素は、ハイフン（−）によって互いに隔てられる。モチーフ内の同一要素の繰り返しは、その要素の後ろに数値または数値範囲を括弧内に入れて配置することによって示すことができる。たとえば、Ｘ（２）はＸ−Ｘに対応し、Ｘ（２、４）は、Ｘ−Ｘ、またはＸ−Ｘ−Ｘ、またはＸ−Ｘ−Ｘ−Ｘに対応し、Ａ（３）はＡ−Ａ−Ａに対応する。
この発明は、Ｔ細胞エピトープと還元活性を有するペプチド配列とを含むペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞を検出できる、という発見に基づいている。
したがって、その最も広い意味で、この発明は、チオ還元酵素配列モチーフを有するペプチドに結合されたＣＤ４＋Ｔ細胞ＴＣＲと相互作用する可能性を有する（自己または非自己）抗原の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチドの方法および組成物に関する。オプションで、Ｔ細胞エピトープと酸化還元モチーフ配列とは、リンカー配列によって隔てられる。さらに別のオプションの実施形態では、ペプチドは、追加の「隣接」配列を追加で含む。
この発明の方法および組成物で使用されるペプチドの典型的な実施形態は、隣接配列−エピトープ−リンカー−モチーフ−隣接配列、または隣接配列−モチーフ−リンカー−エピトープ−隣接として概略的に表わすことができ、ここで「エピトープ」は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＴＣＲと反応する可能性を有する（自己または非自己）抗原のＴ細胞エピトープを表わし、「リンカー」は、０〜７個のアミノ酸のオプションのリンカーを表わし、「モチーフ」は、４個のアミノ酸の酸化還元酵素モチーフを表わし、「隣接配列」は、オプションの追加のアミノ酸を表わす。還元活性は、スルフヒドリル基を還元するその能力について、インスリンの溶解度が還元時に、または蛍光標識インスリンを用いて変更されるインスリン溶解度分析などで分析され得る。また、これに代えて、還元活性は、ペプチドが還元後に酸化基質遊離蛍光を用いてインキュベートされる蛍光分析で評価され得る。酸化還元酵素を有するペプチドは、Ｔ細胞エピトープのアミノ末端側で、またはＴ細胞エピトープのカルボキシ末端で結合されてもよい。還元活性を有するペプチド断片は、グルタレドキシン 、ヌクレオレドキシン 、チオレドキシンおよび他のチオール／ジスルフィド酸化還元酵素を含む小型ジスルフィド還元酵素であるチオ還元酵素において生じる（ホルムグレン（Holmgren）（２０００）Antioxid Redox Signal ２、８１１〜８２０；ジャコット（Jacquot）ら（２００２）Biochem Pharm ６４、１０６５〜１０６９）。それらは多機能で、どこにでもあり、多くの原核生物および真核生物に見られる。それらは、保存された活性ドメイン共通配列であるＣ−Ｘ（２）−Ｃ、Ｃ−Ｘ（２）−Ｓ、Ｃ−Ｘ（２）−Ｔ、Ｓ−Ｘ（２）−Ｃ、Ｔ−Ｘ（２）−Ｃ（Ｘは任意のアミノ酸を表わす）内で、酸化還元活性システインを通して、タンパク質（酵素など）に対してジスルフィド結合用の還元活性を発揮する（フォメンコ（Fomenko）ら（２００３）Biochemistry ４２、１１２１４〜１１２２５；フォメンコら（２００２）Prot. Science １１：２２８５〜２２９６）。そのようなドメインは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（protein disulfide isomerase：ＰＤＩ）およびホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣなどのより大型のタンパク質でも見つかる。
還元活性を有するために、モチーフ内に存在するシステインは、シスチン・ジスルフィド架橋の一部として発生すべきではない。また、この発明で使用されるペプチドにおいては、システインのメチル化バージョンが考えられる。
さらに詳細に説明されるように、ペプチドは、非天然アミノ酸の取込みを可能にする化学合成によって作成可能である。したがって、還元化合物のモチーフでは、Ｃは、メルカプトバリン、ホモシステイン、もしくはチオール機能を有する他の天然または非天然アミノ酸といったチオール基を有するシステインまたは他のアミノ酸を表わす。還元活性を有するために、モチーフ内に存在するシステインは、シスチン・ジスルフィド架橋の一部として発生すべきではない。
［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフにおけるアミノ酸Ｘは、Ｓ、Ｃ、またはＴを含む任意の天然アミノ酸であってもよく、または非天然アミノ酸であってもよい。特定の実施形態では、Ｘは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒなどの小型側鎖を有するアミノ酸である。さらに別の特定の実施形態では、［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフにおける少なくとも１つのＸは、Ｈｉｓ、ＰｒｏまたはＴｙｒである。他の実施形態は、一方または双方のＸがシステインではないモチーフを有するペプチドを指す。他の実施形態は、たとえばテトラシステインタグにおけるように、システインが、連続する２、３または４個のシステインとして発生しない、ペプチドを指す。
さらに別の実施形態は、［Ｃ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［Ｃ］モチーフの１個または２個のシステインが、ペプチドの非エピトープ部分における唯一のシステインである、ペプチドを指す。より具体的には、エピトープとモチーフとの間のリンカーは、システインを含まない。
エピトープ配列自体がシステイン残基を含まないある実施形態では、酸化還元モチーフの１個または２個のシステインが、ペプチドにおける唯一のシステインである。
上述のモチーフを還元化合物として含むペプチドでは、モチーフは、エピトープがＭＨＣ溝内に適合するとモチーフがＭＨＣ結合溝の外側にとどまるように位置する。モチーフは、ペプチド内でエピトープ配列に直接隣接して配置され（すなわち、エピトープ配列と酸化還元酵素モチーフとの間にアミノ酸はない）（「０個のアミノ酸のリンカー」）、または、リンカーによってＴ細胞エピトープから隔てられている。より特定的には、リンカーは、７個以下のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。より特定的には、リンカーは、１、２、３または４個のアミノ酸を含む。また、これに代えて、リンカーは、５、６または７個のアミノ酸を含んでいてもよい。モチーフ配列がエピトープ配列に隣接している場合、これは、エピトープ配列と比較して、位置Ｐ−１〜Ｐ−４、またはＰ＋１〜Ｐ＋４として示される。
ペプチドはさらに、Ｔ細胞エピトープと還元化合物（モチーフ）とを含む（人工）配列のＮまたはＣ末端に追加の短いアミノ酸配列を含んでいてもよい。このようなアミノ酸配列は、ここに概して「隣接配列」と呼ばれる。さらに別の実施形態では、ペプチドにおける還元化合物および／またはエピトープ配列のＮおよび／またはＣ末端に、短いアミノ酸配列が存在していてもよい。より特定的には、隣接配列は、１〜７個のアミノ酸の配列であり、最も特定的には２個のアミノ酸の配列である。
理解され得るように、ＭＨＣ分子との非共有結合複合体におけるペプチドの長さは、少なくともアミノ酸１２〜１４個分である（８〜１０ＡＡエピトープ＋４ＡＡ酸化還元モチーフ）。しかしながら、長さは、一端（追加の７ＡＡ）または両端（追加の１４ＡＡ）での隣接配列およびリンカー配列（追加の７ＡＡ）の存在とともに増加する。典型的には、配列は、１２〜２０または２５個のアミノ酸の長さで使用される。
特定の実施形態では、モチーフは、エピトープからのＮ末端に位置する。他の実施形態では、モチーフは、エピトープからのＮ末端およびＣ末端双方に位置する。
ペプチド内に存在するモチーフが１個のシステインを含むさらに別の特定の実施形態では、このシステインはエピトープから離れた位置でモチーフ内に存在し、このため、モチーフは、エピトープのＮ末端にＣ−Ｘ（２）−ＴまたはＣ−Ｘ（２）−Ｓとして発生し、もしくは、エピトープのＣ末端にＴ−Ｘ（２）−ＣまたはＳ−Ｘ（２）−Ｃとして発生する。
この発明のある実施形態では、１つのエピトープ配列とモチーフ配列とを含むペプチドが提供される。さらに別の特定の実施形態では、モチーフは、ペプチドにおいて数回（１回、２回、またはさらには３回）、たとえば１個以上のアミノ酸によって互いに離間され得るモチーフの繰り返し（たとえば、ＣＸＸＣ Ｘ ＣＸＸＣ Ｘ ＣＸＸＣ）として、もしくは、配列ＣＸＸＣＸＸＣＸＸＣでのように互いに重複する繰り返しとして発生する。また、これに代えて、１個以上のモチーフが、Ｔ細胞エピトープ配列のＮ末端およびＣ末端の双方に設けられる。
したがって、ペプチドは、還元化合物に加えて、抗原に由来したＴ細胞エピトープを含み、抗原は典型的には、用途に依存して、アレルゲンまたは自己抗原、病原体関連抗原、ウイルスベクター抗原、腫瘍関連抗原、同種因子または同種抗原である。以下に説明するように、タンパク質配列におけるＴ細胞エピトープは、機能的分析および／または１つ以上のコンピュータ予測分析によって同定可能である。Ｔ細胞エピトープ配列におけるアミノ酸は、ＭＨＣタンパク質の結合溝におけるそれらの位置に従って番号が付けられる。特定の実施形態では、この発明のペプチド内に存在するＴ細胞エピトープは、８〜２０個のアミノ酸からなり、さらにより特定的には８〜１６個のアミノ酸からなり、さらに最も特定的には８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸からなる。より特定的な一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、８、９または１０個のアミノ酸の配列からなる。Ｔ細胞エピトープ配列は、ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープとしても公知であるＭＨＣＩＩタンパク質の間隙内に適合するエピトープ配列である。
この発明のペプチドのＴ細胞エピトープは、タンパク質の天然エピトープ配列に対応可能であり、または、修飾Ｔ細胞エピトープが、天然Ｔ細胞エピトープ配列と同様に、ＭＨＣ間隙内に結合するその能力を保持するならば、その修飾バージョンであってもよい。
修飾Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣタンパク質についての結合親和性を天然エピトープと同じだけ有し得るものの、より低い、またはより高い親和性も有し得る。特定の実施形態では、修飾ペプチドの結合親和性は、元のペプチドの１０分の１未満、より特定的には５分の１未満しかない。この発明の発見は、この発明のペプチドが、ｐＭＨＣと相補的ＴＣＲとの間に形成されたタンパク質複合体に対して安定化効果を有するということである。したがって、ペプチド−ＭＨＣ複合体の安定化効果は、ＭＨＣ分子についての修飾エピトープの低下した親和性を補償する。この一例は、Ｄｅｒ ｐ ２ペプチドｐ２１−３５のＩｌｅ２８Ａｓｎ置換であり、ＭＨＣ ＩＩ間隙についての低い親和性にもかかわらず、天然Ｄｅｒ ｐ ２ペプチドｐ２１−３５と同じＴ細胞反応を誘出できる。
上述のように、特定の実施形態では、この発明のペプチドは、Ｔ細胞エピトープ配列に連結された、ここに説明されるような還元モチーフを含む。ある特定の実施形態によれば、これらのペプチドは、生来の自然配列内に、酸化還元特性を有するアミノ酸配列を、対象のエピトープの近傍（すなわち、１１個のＮまたはＣ末端アミノ酸の配列内）で含まないタンパク質、より具体的には、生来の自然配列内に、チオレドキシン、グルタレドキシン、もしくはチオ還元酵素またはその同族体の共通配列を、対象のエピトープの近傍で含まないタンパク質からのペプチドである。
抗原タンパク質におけるエピトープの近傍での還元酵素モチーフの存在は、非常にまれである。いくつかの実施形態では、エピトープとモチーフとを有するペプチドは、自然発生タンパク質の断片である。大抵の実施形態では、ペプチドは人工ペプチドであり、エピトープの周りの配列は、少なくとも酸化還元モチーフを導入するために修飾されている。
上述の方法において説明されたようなペプチドの生成で使用するための抗原タンパク質の好適なＴ細胞エピトープの同定を、以下に詳述する。
この発明の文脈で使用するためのそのような抗原タンパク質からのＴ細胞エピトープの同定および選択は、当業者には公知である。天然でない（または修飾された）Ｔ細胞エピトープはさらにオプションで、ＭＨＣクラスＩＩ分子へのそれらの結合親和性について検査され得る。これは、異なるやり方で行なうことができる。たとえば、可溶性ＨＬＡクラスＩＩ分子が、所与のクラスＩＩ分子についてホモである細胞の溶解によって得られる。後者は、親和性クロマトグラフィーによって精製される。可溶性クラスＩＩ分子は、そのクラスＩＩ分子についてのその強い結合親和性に従って生成されたビオチン標識基準ペプチドを用いてインキュベートされる。次に、クラスＩＩ結合について評価すべきペプチドが異なる濃度でインキュベートされ、そのクラスＩＩ結合から基準ペプチドを置換するそれらの能力が、ニュートラアビジンの添加によって計算される。方法は、たとえばテキシアー（Texier）ら（２０００）J. Immunol. １６４、３１７７〜３１８４に見つけることができる。
これに加えて、および／またはこれに代えて、抗原タンパク質内のＴ細胞エピトープ配列を同定するために、１つ以上のインビトロアルゴリズムを使用できる。好適なアルゴリズムは、以下のウェブサイトで見つかるものを含むものの、それらに限定されない：
− http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/predBalbc/；
− http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/predBalbc/；
− http://www.imtech.res.in/raghava/mhcbn/；
− http://www.syfpeithi.de/home.htm；
− http://www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/SVMHC；
− http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html；
− http://www.jenner.ac.uk/MHCPred/。
より特定的には、そのようなアルゴリズムは、ＭＨＣＩＩ分子の溝内に適合するであろう１つ以上のノナペプチド配列の抗原タンパク質内での予測を可能にする。
ペプチドおよびタンパク質は、バクテリア、酵母、昆虫細胞、植物細胞または哺乳類細胞において、組み換えＤＮＡ技術を使用して生成可能である。長さが限定されたペプチドは、化学ペプチド合成によって調製可能であり、ここでペプチドは、異なるアミノ酸を互いに結合することによって調製される。化学合成は、たとえばＤ−アミノ酸、非自然発生側鎖を有するアミノ酸、またはメチル化システインなどの修飾側鎖を有する天然アミノ酸の含有にとって特に好適である。
化学ペプチド合成方法は十分に説明されており、ペプチドは、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）および他の会社などの会社から注文可能である。ペプチド合成は、固相ペプチド合成（solid phase peptide synthesis：ＳＰＰＳ）として、または対照的に液相ペプチド合成として実行可能である。最もよく知られているＳＰＰＳ方法は、ｔ−ＢｏｃおよびＦｍｏｃ固相化学である。ペプチド合成中、いくつかの保護基が使用される。たとえば、ヒドロキシル官能価およびカルボキシル官能価はｔ−ブチル基によって保護され、リジンおよびトリプトファンはｔ−Ｂｏｃ基によって保護され、アスパラギン、グルタミン、システインおよびヒスチジンはトリチル基によって保護され、アルギニンはｐｂｆ基によって保護される。特定の実施形態では、合成後、そのような保護基はペプチド上に残され得る。
また、これに代えて、ペプチド、および特にペプチドとＭＨＣ分子との融合タンパク質は、コード化ヌクレオチド配列を含む適切な発現ベクターにおいてこの発明のペプチドをコード化する核酸分子を使用することによって合成可能である。そのようなＤＮＡ分子は、自動ＤＮＡ合成装置および遺伝コードの周知のコドンとアミノ酸との関係を使用して、容易に調製されてもよい。そのようなＤＮＡ分子はまた、オリゴヌクレオチドプローブと従来の混成法とを使用して、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとして得られてもよい。そのようなＤＮＡ分子は、バクテリア、たとえば大腸菌、酵母細胞、動物細胞または植物細胞といった好適な宿主におけるＤＮＡの発現およびポリペプチドの生成に適している、プラスミドを含む発現ベクターへと組込まれてもよい。
対象のペプチドが、この発明について定義されるような用途での使用にとって好適であるかどうかを判断するために、そのペプチドの物理的および化学的特性（たとえば溶解性、安定性）が検査される。典型的には、これは、ペプチドの配列を調節することによって最適化される。オプションで、ペプチドは合成後に、当該技術分野で公知の手法を使用して修飾可能である（たとえば、官能基を追加／削除する化学修飾）。
ペプチドは、クラスＩＩ ＭＨＣ分子上に装填される。一実施形態では、関連するＭＨＣクラスＩＩ分子を提示する細胞が、ペプチドを用いてインキュベートされる。これらの細胞は次に、同族ＴＣＲを結合するために、ｆａｃｓ分析が続く可溶相において、もしくは、プレート上またはビーズ上での不溶化の後で、そのようなものとして使用される。これらの手法は、当該技術分野において十分に説明されている。代替的な一実施形態では、細胞が溶解され、たとえばクロマトグラフィによって、ペプチドが装填されたＭＨＣクラスＩＩ分子が調製される。次に、標識を有する、または標識のないｐＭＨＣ複合体が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団と相互作用するために可溶相において使用されてもよく、もしくは、プレートまたはビーズ、またはＣＤ４＋Ｔ細胞の検出用の任意の好適な固相支持体上で不溶化されてもよい。
別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、細胞トランスフェクションまたは形質導入を使用して、ｃＤＮＡ技術によって生成される。ｃＤＮＡ構築物は、表面固定および上述のような細胞の使用のためにその膜内配列を有する、または分泌のために膜内配列を有さない、完全長のクラスＩＩ分子を含み得る。そのような分泌されたクラスＩＩ分子は、可溶型で、もしくはプレートまたはビーズなどの固体表面上での不溶化の後で、上述のように精製され、使用され得る。
ＷＯ２０１１１４７８９４は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質のアルファ鎖およびベータ鎖のキメラタンパク質、リンカー、ならびに対象のエピトープを開示しており、エピトープはリンカーを介してα鎖に連結されている。
ＭＨＣ分子のアルファ鎖とベータ鎖とを接続するために、塩基性ロイシンジッパー、システイン架橋（たとえばＷＯ２０１１１０１６８１を参照）、または化学架橋を使用できる。
ＷＯ２０１１１０１６８１には、膜貫通ドメインがない組み換えバージョンも記載されている。２個のＭＨＣ分子を組み合わせた融合タンパク質が、エピトープ配列を有する融合タンパク質としてオプションで記載されている（ＷＯ２０１１１４７８９４）。ＷＯ１９９８００６７４９は、ＭＨＣＩＩ分子の細胞外結合ドメインと二量化ドメインとの融合タンパク質を記載している。
ＭＨＣ分子はさらに、結合部（Ｈｉｓタグなどのペプチドタグ、ビオチンなどの結合部、ＧＳＴ、ＭＢＰなどの結合タンパク質、ＨＡタグなどの抗体タグ）によって修飾され得る。
ＭＨＣ分子はまた、発色団などの検出可能な標識、放射性標識、磁気ビーズで修飾され得る。
さらに別の実施形態では、クラスＩＩ ＭＨＣ分子を包含するｃＤＮＡ構築物はまた、改変分子が構造的にペプチドをＭＨＣ分子との融合で発現するように、ペプチドの配列を含む。この実施形態では、クラスＩＩ分子の間隙内へのペプチドの適切な折り畳みおよび提示を可能にするように、クラスＩＩ分子の配列とペプチドの配列との間にリンカーを含むことが有利である。これらのリンカーは典型的には、エピトープがベータ鎖上につながるための十分な可撓性を提供するためにセリンおよび／またはグリシンを有する、約１５個のアミノ酸のポリペプチド配列である。リンカーはさらに、発現および折畳みの後でペプチドがその正常な構成で提示されるように、（たとえばトロンビン用の）プロテアーゼ特異的認識部位を含み得る。
ペプチドの装填の前または後の可溶型のＭＨＣクラスＩＩ分子、もしくは構造的にペプチドを発現する分子は、いくつかの分子を互いに反応させることによって、もしくは、ビーズまたはプレートなどの固相上でそのような分子を不溶化することによって、二量体または重合体の形で使用され得る。これらの方法は、当該技術分野において説明されている。
ＭＨＣ分子は、（上に引用されたネポムで検討された）四量体、またはデキストラマー（マッシラマニー（Massilamany）（２０１１）BMC Immunol. １２、４０）などの多量体として発生し得る。
この発明のＴ細胞エピトープは、チオ還元酵素モチーフとＣＤ４分子との間にジスルフィド架橋を作ることによって、それらの特性を発揮すると考えられる。この作用機構は実験データによって立証される（以下の実施例を参照）が、この発明をこの特定の作用機構に制限する意図はない。
この発明の方法およびツールは、診断目的、表現型評価または機能評価、もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）クローニングのための、抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出、調製または枯渇といったさまざまな用途で使用可能である。我々の技術で得られるＣＤ４＋細胞はまた、高いシーケンシングＲＮＡ、プロテオミクスのために、およびＴ細胞受容体の結晶化用の材料を調製するために、機能し得るであろう。
実施例
実施例１：ナイーブヒトＴ細胞レパートリーにおけるＭＯＧ特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球の検出のためのＭＨＣクラスＩＩ分子の四量体の使用
多発性硬化症は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（myelin oligodendrocytic glycoprotein：ＭＯＧ）などの自己抗原に向けて重要な役割を果たす、慢性脱髄疾患である。脳−血液障壁を通るエフェクター細胞の移動は、脳組織破壊を誘出する。
そのようなエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ複合体内でＭＯＧエピトープを提示する抗原提示細胞との同族相互作用の後で、末梢血ナイーブＴ細胞から生成される。ＭＯＧ特異的ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を列挙すること（すなわち、同定し定量すること）はしたがって、疾患転帰を予測する。しかしながら、ナイーブＴ細胞の頻度およびＭＯＧエピトープについての親和性は低く、それは、従来技術による、たとえばＭＯＧエピトープが装填されたＭＨＣクラスＩＩ分子の可溶性四量体としてのそれらの検出を防止する。
ＭＯＧのそのような主要ＭＨＣクラスＩＩエピトープのうちの１つは、共通のＤＲＢ１＊１５０１対立遺伝子が多発性硬化症を患う患者の±７５％に発現している、クラスＩＩ ＤＲ２ハプロタイプの分子によって提示される。
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、当該技術分野において説明されているように、ＣＤ４（−）細胞および記憶細胞を除去するために磁気ビーズを使用して、ＤＲＢ１＊１５０１の末梢レパートリー＋多発性硬化症にかかりやすい患者から調製される。フィコエリスリン（Ficoerythrin）などの蛍光標識を含む、ＤＲＢ１＊１５０１の四量体が、当該技術分野において公知であるように作られる（カスプロウィッツ（Kasprowicz）Ｖら（２００６）J. Virol. ８０、１１２０９〜１１２０１７）。合成ペプチドが生成され、それは、対応するクラスＩＩ制限ＭＯＧ Ｔ細胞エピトープと、ＭＯＧタンパク質のアミノ酸残基４７−５８に対応するチオ還元酵素モチーフＣＧＰＣＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ Ｄ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］とを包含する。
当該技術分野において公知であるような適切な緩衝液条件で室温で一晩かけて、四量体にＳＥＱ ＩＤ １のペプチドが装填される。次に、装填された四量体は洗浄され、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて３７℃で２時間インキュベートされる。次に、懸濁液が蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting：ｆａｃｓ）システムで読まれ、ＭＯＧペプチドに特異的なナイーブ細胞の割合が評価される。チオ還元酵素モチーフＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２］を有さない同じペプチドを有するＭＨＣ複合体を用いて、対照実験が行なわれる。
この実験から、チオ還元酵素モチーフ（ＳＥＱ ＩＤ １）を含むペプチドを有するＭＨＣ複合体のみが、ＭＯＧ３７−５２配列に特異的なナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を検出できる、ということがわかる。
実施例２：ワクチン接種中の、およびワクチン接種戦略の調整のための、特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のフォローアップのためのＭＨＣクラスＩＩ分子の四量体の使用
感染症用のワクチン接種の有効性は、そのようなワクチン接種によって活性化され得るＣＤ４＋Ｔ細胞の数に依存する。成功したワクチン接種の初期のおよび予測的徴候は、ワクチン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加に見出すことができ、それは、たとえばワクチン投与数を増加させることによって、ワクチン接種戦略を修正すべきかどうか決定するための有用なパラメータである。
インフルエンザウイルス・ワクチン接種は、特異抗体の濃度と保護の頑強性との間に単に緩やかな相関がある限りにおいて、顕著な一例である。
このウイルスの主要ＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープは、血球凝集素タンパク質に位置する。配列ＣＧＨＣＫＹＶＫＱＮＴＬＫＨＥＭＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のペプチドがしたがって生成され、実施例１で説明されたようにＭＨＣクラスＩＩ四量体上に装填される。同じエピトープを有するもののチオ還元酵素モチーフＫＹＶＫＱＮＴＬＫＨＥＭＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含まないペプチドが装填された四量体を用いて、対照実験が行なわれる。インフルエンザワクチン投与の前および３週間後に、患者の末梢血からＣＤ４＋Ｔ細胞が調製される。そのような細胞は、ＳＥＱ ＩＤ ３のペプチドが装填された蛍光標識ＭＨＣクラスＩＩ四量体を用いてインキュベートされる。次に、蛍光標識によって同定された１００万個あたりの細胞の数が、ｆａｃｓ装置を使用してカウントされる。
ＭＨＣクラスＩＩ四量体にＳＥＱ ＩＤ ３のペプチドが装填される場合、ＳＥＱ ＩＤ ４のペプチドが装填される場合よりも多い数のＣＤ４＋Ｔ細胞が末梢血で検出される、ということがわかる。さらに、ワクチン接種開始の３週間後に得られた特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が求められ、そのようなワクチン接種開始の８週間後に、血球凝集素特異抗体の濃度が測定される。ＳＥＱ ＩＤ ３のペプチドが装填された四量体を使用して検出されたＣＤ４＋Ｔ細胞の数と、血球凝集素特異抗体の濃度との間には、密接な関係が観察される。
ＳＥＱ ＩＤ ３を有する（すなわち、還元モチーフがない）ペプチドを有する四量体がＣＤ４＋細胞を定量するために使用される場合には、ＣＤ４＋細胞と血球凝集素特異抗体との間のそのような相関は観察されない。
３週目でのＣＤ４＋細胞と８週目での血球凝集素特異抗体との間のこの相関により、ワクチン接種後の初期段階で、十分な血球凝集素特異抗体が後で形成されるかどうかを予測することが可能になる。
したがって、３週目でのＣＤ４＋Ｔ細胞の数が少なすぎる患者は、さらにワクチンを注射される。この方法により、２回目のワクチン接種を、事実上再ワクチン接種を必要としている個人に制限できるようになる。
実施例３：骨髄移植を向上させるための、宿主レパートリーからのドナー特異的な特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇
骨髄拒絶は、被移植者からのＣＤ４＋Ｔリンパ球がドナー骨髄からの同種抗原に対して反応する場合に発生する。このプロセスにはＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞が双方とも関わっているが、ＣＤ４細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するために必要とされる。したがって、被移植者のＣＤ４＋Ｔ細胞をなくすことが、移植の成功を可能にするであろう。同種抗原に対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の除去は、そのような細胞の頻度が低いために、高性能の親和性吸着を必要とする。
先行技術のＭＨＣ−Ｔ細胞エピトープ複合体は、関連するＣＤ４＋細胞を検出し、単離するための必要な親和性を有していない。
マウスモデルでは、Ｄｂｙタンパク質が主な役割を果たすＨ−Ｙコード化抗原の認識により、オスの骨髄は同種のメスによって拒絶される。ＣＤ４＋Ｔ細胞の大半は、Ｈ−Ｙ染色体によってコード化されるネズミＤｂｙ抗原の残基ＦＮＳＮＲＡＮＳＳで作られたエピトープを認識する。
チオ還元酵素モチーフを有するこのクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープで作られた合成ペプチドが、ＣＨＧＣＦＮＳＮＲＡＮＳＳ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５］に対応して生成され、天然構成の対応するＤｂｙペプチドが、対照標準、すなわち、ＣＨＧＣＦＮＳＮＲＡＮＳＳ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６］として生成される。
雌のＨ−２ｂマウスの脾臓からのリンパ球が、磁気ビーズ選別によって調製される。細胞は次に、クラスＩＩ Ｈ−２ｂ分子でコーティングされたビーズの懸濁液を用いてインキュベートされ、ＳＥＱ ＩＤ ５またはＳＥＱ ＩＤ ６のペプチドが装填される。ビーズ上に保持されないすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞とを含むリンパ球Ｔ細胞を使用して、ＲＡＧ２ ＫＯマウスを再構成し、次に、それらに同種のオスのドナーの骨髄を移植する。ＲＡＧ２ ＫＯマウスは機能的な適応免疫系を有しておらず、したがって移植片を拒絶できない。それにより、拒絶は、受身移入された集団内に存在する細胞にのみ依存している。
Ｄｂｙ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇したマウスは骨髄を受け入れ、一方、Ｄｂｙ特異的ＣＤ４＋細胞が枯渇せずに再構成されたＲＡＧ２ ＫＯマウスは骨髄を強く拒絶する、ということが示される。ＳＥＱ ＩＤ ６の対照ペプチドでコーティングされたビーズを用いたＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は、移植片受容の向上を示さない。
したがって、チオ還元酵素モチーフを含むペプチドでコーティングされたビーズによるＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は、同種骨髄への宿主反応を制御する上ではるかにより効率的である、ということが結論付けられる。
実施例４：細胞療法のための特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の調製
細胞療法は、ドナーから細胞を単離し、関連する細胞集団をインビトロで精製および拡張し、ドナーに自分自身の細胞を再投与することにある。そのようなアプローチの成功は、細胞を単離するために使用される方法の有効性に大きく依存する。
インスリン依存性糖尿病（insulin-dependent diabetes mellitus：ＩＤＤＭ）では、ＧＡＤ６５抗原が重要な病因的役割を果たす。ＷＯ２００８０１７５１７に記載されているように、ＧＡＤ６５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の特性を修飾することは、ランゲルハンスベータ細胞に対する有害反応を抑制することを可能にする。
ＮＯＤ（non-obese diabetic：非肥満性糖尿病）マウスは、インスリンを生成するランゲルハンス島細胞の漸進的破壊によって、自然に糖尿病を発症する。ＮＯＤマウスは、ヒトＩＤＤＭの代表的な前臨床モデルと考えられる。ＧＡＤ６５に対するエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞は、病気の動物の脾臓から、まず非ＣＤ４＋細胞を枯渇させることによって調製される。次に、ＣＤ４＋細胞が、隣接残基内にチオ酸化還元モチーフを包含するＧＡＤ６５クラスＩＩ制限エピトープが装填されたクラスＩＩ四量体を用いてインキュベートされる。
ペプチドの配列はしたがって、ＣＲＬＣＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭ（ＧＡＤ６５ ５２４−５４３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）である。チオ還元酵素モチーフのないＧＡＤ６５のペプチドが、対照実験ＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭのために調製される。
細胞が次に、ペプチド装填四量体のそれらの結合に従って、ｆａｃｓによって選別される。陽性細胞が次に培養で維持され、ＳＥＱ ＩＤ ７のペプチドが装填されたＡＰＣで刺激されて、ＷＯ２００８０１７５１７特許出願に記載されているように、細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞を生成する。ＳＥＱ ＩＤ ８のペプチドの代わりにＳＥＱ ＩＤ ７のペプチドが使用されると、ＧＡＤ６５特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞の産出が著しく増加する、ということが観察される。
ＧＡＤ６５特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞の産出はまた、ＮＯＤマウスの脾臓から得られたＴ細胞にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７を有するペプチドが追加された、ＷＯ２００８０１７５１７に開示された方法での産出より多い。
インビトロで拡張され、細胞溶解性を取得した細胞が、ＮＯＤマウスでの細胞移入に使用され、ＩＤＤＭの発症を防止または抑制するように示される。
実施例５：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シーケンシングのためのＣＤ４＋Ｔ細胞の調製
病気発症についての危険因子のうちの１つは、末梢血において使用可能なＴ細胞のレパートリーとリンクしている。しかしながら、現在、病気が明白な場合、すなわち、特異的Ｔ細胞の十分な拡張がすでに発生している場合に限り、ＴＣＲファミリーの使用と病気を発症するより高い危険との関連が同定され、それにより、現在使用可能な方法を使用する検出を可能にする。病気の発症前にそのような細胞を検出することは非常に興味深く、加えて、上述の実施例３で説明されたように、そのような細胞をレパートリーから除去する可能性を提供できるであろう。一例が、インスリンの９−２３領域に位置するエピトープを認識する生殖細胞系列構成のＴ細胞によって提供される（中山ら（２０１２）、Diabetes ６１、８５７〜８６５、２０１２年）。
さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞に関する免疫反応の経過中、自然疾患の枠内であろうと、またはワクチン接種の結果であろうと、より高い天然親和性を有するＴ細胞クローンの選択から、およびＴＣＲの超可変部分に導入された突然変異から生じるＴＣＲ親和性の増加がある。多くの状況において、そのようなＴＣＲの使用および／または突然変異に従うことが有利であろう。このため、弱い抗原を用いたワクチン接種中のＴ細胞レパートリーの成熟は、保護を予測する。さらに、自己免疫疾患では、突然変異によるＴＣＲ親和性の変化は、病気の悪化を予測し得る。
ＴＣＲファミリーの使用およびＴＣＲ突然変異の検出は受容体シーケンシングを必要とし、それは、十分な数得られた、非常に精製された細胞に対してのみ実行可能である。
この発明は、以下の例によって例示されるような方法を可能にする。ヒトＤＱ８ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、アミノ酸配列９−２３内のインスリンのベータ鎖に位置する、インスリンの主要エピトープへの反応性に関連付けられている。ヒト末梢血ナイーブＴ細胞レパートリーは、さまざまなベータ鎖配列に関連する、Ｔｒａｖ１３−１と呼ばれる、生殖細胞系列がコード化されたアルファ鎖配列を発現する細胞を含むことが多いが、それらは、ＤＱ８によって提示される場合、Ｂ９−２３インスリンエピトープに低い親和性反応を与えるのに十分である。
チオ還元酵素モチーフと１つのアミノ酸グリシンリンカーとを有するＢ９−２３エピトープの配列を包含するペプチド、すなわち、ＣＧＨＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ ＩＮＳ９−２３（ＳＥＱ ＩＤ ９）が生成され、チオ還元酵素モチーフとリンカーとを有さない対照ペプチドＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ ＩＮＳ９−２３（ＳＥＱ ＩＤ １０）が生成される。
ＤＱ８の四量体が生成され、ＳＥＱ ＩＤ ９またはＳＥＱ ＩＤ １０のペプチドの各１つが装填される。装填された四量体は、ヒト末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いてインキュベートされる。細胞は洗浄され、ｆａｃｓによって分析され、選別される。細胞は次に四量体から洗浄され、対応するプライマーを使用したＴＣＲアルファ鎖シーケンシングのために使用される。（チオ還元酵素モチーフを含む）ＳＥＱ ＩＤ ９のペプチドが装填された四量体によって調製された細胞のみが、ＴＣＲシーケンシングを可能にするのに十分な数得られる、ということが示される。
したがって、チオ還元酵素モチーフを含むＴ細胞エピトープは、ＴＣＲシーケンシングを可能にするのに十分な数の所与のＴＣＲを担持する細胞を検出し、調製するのに有用である、ということが結論付けられる。
本願で開示された配列：
ＣＧＰＣＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤ（ＭＯＧ４７−５８）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］
ＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤ（ＭＯＧ４７−５８）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２］
ＣＧＨＣＫＹＶＫＱＮＴＬＫＨＥＭＡＧＧ（インフルエンザ血球凝集素）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３］
ＫＹＶＫＱＮＴＬＫＨＥＭＡＧＧ（インフルエンザ血球凝集素）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４］
ＣＨＧＣＦＮＳＮＲＡＮＳＳ（Ｄｂｙ）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５］
ＦＮＳＮＲＡＮＳＳ（Ｄｂｙ）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６］
ＣＲＬＣＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭ（ＧＡＤ６５ ５２４−５４３）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７］
ＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭ（ＧＡＤ６５ ５２４−５４３）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８］
ＣＧＨＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ（ＩＮＳ９−２３）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８］
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ（ＩＮＳ９−２３）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８］

Claims (22)

  1. 試料においてクラスＩＩ制限ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するためのインビトロの方法であって、
    − 試料を提供するステップと、
    − 単離されたＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドとの複合体に試料を接触させるステップとを含み、前記ペプチドは、抗原タンパク質のＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープと、それに直接隣接する、または最大７個のアミノ酸のリンカーによって隔てられた、［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−ＣまたはＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフを有する配列とを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、ここにおいて［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−ＣまたはＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフ中のシステインは、前記ペプチドの非エピトープ部分における唯一のシステインであり、前記方法はさらに、
    − 前記試料における細胞との前記複合体の結合を測定するステップを含み、細胞への複合体の結合は、前記試料におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を示す、方法。
  2. モチーフはＣ−Ｘ（２）−Ｃである、請求項１に記載の方法。
  3. リンカーは、最大４個のアミノ酸の長さを有する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＭＨＣクラスＩＩ分子と前記ペプチドとの複合体が非共有結合複合体であり、前記ペプチドは１２〜２０個のアミノ酸の長さを有する、請求項１に記載の方法。
  5. 複合体は、前記ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  6. 試料は、血液試料、もしくは、関節リウマチ患者からの関節液または感染性肺炎の患者の胸膜液である組織試料である、請求項１に記載の方法。
  7. ＣＤ４＋細胞は、Ｔｒｅｇ、Ｔｒ１またはＴｈ３などの誘発Ｔｒｅｇ、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、極性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、および細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の方法。
  8. 試料は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、抗原にさらされたＣＤ４＋Ｔ細胞、治療中またはワクチン接種中に得られたＣＤ４＋Ｔ細胞、組織内のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの１つ以上を含む試料である、請求項１に記載の方法。
  9. ペプチドのエピトープ配列は、抗原タンパク質のエピトープ配列と同一である、請求項１に記載の方法。
  10. ＣＤ４＋細胞へのエピトープの結合親和性を調整するために、ペプチドのエピトープ配列のＭＨＣクラスＩＩ固定残基が、抗原タンパク質のエピトープ配列と比べて修飾される、請求項１に記載の方法。
  11. 複合体におけるＭＨＣ分子は、多量体である、請求項１に記載の方法。
  12. 複合体は、可溶性複合体であり、もしくは、複合体は、不溶性担体または基質に付着されている、請求項１に記載の方法。
  13. 前記複合体に結合されているＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  14. 検出または単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団を検出または単離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  15. − ＭＨＣクラスＩＩ分子と、
    − ペプチドと、の単離された複合体であって、
    前記ペプチドは、抗原タンパク質のＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープと、それに直接隣接する、または最大７個のアミノ酸のリンカーによって隔てられた、［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−ＣまたはＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフを有する配列とを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、ここにおいて［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−ＣまたはＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフ中のシステインは、前記ペプチドの非エピトープ部分における唯一のシステインである、複合体。
  16. モチーフはＣ−Ｘ（２）−Ｃである、請求項１５に記載の複合体。
  17. リンカーは、最大４個のアミノ酸の長さを有する、請求項１５に記載の複合体。
  18. ペプチドとＭＨＣ分子との複合体は、非共有結合された複合体であり、または、ペプチドとＭＨＣ分子との複合体は、共有結合された複合体である、請求項１５に記載の複合体。
  19. 複合体は、前記ペプチドとのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の融合タンパク質である、請求項１５に記載の複合体。
  20. 融合タンパク質以外の、非共有結合複合体または共有結合複合体における前記ペプチドは、１２〜２０個のアミノ酸の長さを有する、請求項１５に記載の複合体。
  21. 前記複合体は、担体に付着されている、請求項１５に記載の複合体。
  22. 複合体は、検出可能な標識を含む、請求項１５に記載の複合体。
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