CN106967173A - 一种重组嵌合膜蛋白及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组嵌合膜蛋白及其制备和应用。具体地，本发明公开了一种嵌合膜蛋白，所述嵌合膜蛋白包括细胞外结构域、绞链区、跨膜结构域、和细胞内结构域；其中，所述细胞外结构域包括PD‑1的膜外端；所述细胞内结构域包括CD3ζ的信号传导区。实验结果表明，该嵌合膜蛋白可以表达在细胞膜上，可以与PD‑L1/PD‑L2特异性地结合并因此传递刺激信号，激活表达CPR的细胞。

Description

一种重组嵌合膜蛋白及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种新型重组嵌合膜蛋白及其制备和应用。

背景技术

PD-1是一种T淋巴细胞抑制性受体，全称为程序性细胞死亡蛋白1(ProgrammedCell Death Protein 1),主要表达在活化的T淋巴细胞膜表面。PD-1的配体(即PD-L1/PD-L2)主要表达在抗原递呈细胞(如树突状细胞、巨噬细胞等)。在正常生理条件下，PD-1与PD-L1/PD-L2的结合反应主要发挥对免疫功能的钳制作用，以维护机体免疫功能处于正常的平衡状态。所以类似于PD-1及PD-L1/PD-L2的膜蛋白统称为免疫检查点调节蛋白(Checkpointmodulator，CPM)。PD-L1与PD-1/PD-L2结合以后，启动抑制性信号，从而抑制T细胞的功能。许多肿瘤细胞过表达PD-L1/PD-L2，从而通过与PD-1的结合而抑制T细胞对肿瘤细胞的攻击。

针对PD-1及PD-L1/PD-L2的抗体药物研发越来越多。随着美国施贵宝公司及默沙东公司的PD-1抗体药分别被FDA批准上市，从而开启了针对免疫调节靶点开发抗体药的热潮。该类抗体药的主要作用机制是通过阻断肿瘤细胞PD-L1/PD-L2与患者T淋巴细胞的PD-1的结合，从而解除了肿瘤细胞诱导的T淋巴细胞的功能抑制，使得T淋巴细胞发挥对肿瘤细胞的攻击。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组嵌合膜蛋白及其制备和应用。

本发明的第一方面，提供了一种嵌合膜蛋白，所述嵌合膜蛋白包括细胞外结构域、绞链区、跨膜结构域、和细胞内结构域；其中，所述细胞外结构域包括PD-1的膜外端；所述细胞内结构域包括CD3ζ的信号传导区。

在另一优选例中，所述细胞内结构域还包括共刺激信号传导区。

在另一优选例中，所述PD-1的膜外端选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述绞链区选自下组：CD8alpha的绞链区、IgG1的铰链区、IgG4的铰链区等。

在另一优选例中，所述CD8alpha的绞链区选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述跨膜结构域选自下组：CD28的跨膜区、CD8alpha的跨膜区、PD-1的跨膜区等。

在另一优选例中，所述共刺激信号传导区为衍生自选自下组分子的活性肽段：CD28、4-1BB、OX40等。

在另一优选例中，所述共刺激信号传导区包括CD28的胞内区。

在另一优选例中，所述CD28的跨膜区及胞内区选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述CD3ζ的信号传导区选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述嵌合膜蛋白包括PD-1的膜外端、CD8alpha的绞链区、CD28的穿膜区及胞内区、以及CD3ζ的信号传导区。

在另一优选例中，所述嵌合膜蛋白还包括前导序列(信号肽)。

在另一优选例中，所述嵌合膜蛋白包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述嵌合膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示。

本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合膜蛋白。

在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。

在另一优选例中，所述核酸分子还包括编码前导序列(信号肽)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.:9所示。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为Jurkat细胞、NK细胞、或T细胞。

本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的嵌合膜蛋白、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞。

本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的嵌合膜蛋白、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括PD-L1阳性的肿瘤。

本发明的第七方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的嵌合膜蛋白、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、或本发明第五方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。

本发明的第八方面，提供了一种筛选抗PD-L1/PD-L2抗体的方法，包括步骤：

将表达本发明第一方面所述的嵌合膜蛋白的Jurkat细胞与表达PD-L1/PD-L2的肿瘤细胞混合培养，加入待筛选的抗体，培养后进行如下检测分析：1)CD69表达分析；2)IL-2分泌检测分析；和/或3)IFN-g分泌检测分析；

如果待筛选的抗体可以与肿瘤细胞的PD-L1/PD-L2结合并封闭PD-L1/PD-L2与PD-1的结合位点，那么当在混合细胞培养中加入该抗体以后，则可以抑制肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2的分泌和/或IFN-g的分泌；

如果待筛选的抗体不能封闭PD-L1/PD-L2与PD-1的结合位点，则不能阻断肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2的分泌和/或及IFN-g的分泌；

从而筛选抗PD-L1/PD-L2抗体。

在另一优选例中，所述方法中还包括设置阳性对照组和/或阴性对照组的步骤。

本发明的第九方面，提供了一种筛选抗PD-1抗体的方法，包括步骤：

将表达本发明第一方面所述的嵌合膜蛋白的Jurkat细胞与表达PD-L1/PD-L2的肿瘤细胞混合培养，加入待筛选的抗体，培养后进行如下检测分析：1)CD69表达分析；2)IL-2分泌检测分析；和/或3)IFN-g分泌检测分析；

如果待筛选的抗体可以与PD-1结合并封闭PD-1与PD-L1/PD-L2的结合位点，那么当在混合细胞培养中加入该抗体以后，则可以抑制肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2及IFN-g的分泌；

如果待筛选的抗体不能封闭PD-1与PD-L1/PD-L2的结合位点，则不能阻断肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2及IFN-g的分泌；

从而筛选出抗PD-1抗体。

在另一优选例中，所述方法中还包括设置阳性对照组和/或阴性对照组的步骤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CPR结构示意图。

图2显示了CPR核苷酸及氨基酸序列。

图3显示了CPR表达分析。其中A图显示了Jurkat细胞的CPR表达；B图显示了单克隆Jurkat细胞的CPR表达。

图4显示了CPR分子功能分析，A图显示了诱导CD69的高表达；B图显示了CPR-Jurkat细胞中CD69的诱导。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种基因重组嵌合膜蛋白，即嵌合PD-1受体蛋白(Chimeric PD-1 Receptor,CPR)，该嵌合蛋白包括PD-1的膜外端、CD8 alpha的绞链区、CD28的穿膜区及胞内区、以及CD3ζ的信号传导区，实验结果表明，该嵌合膜蛋白可以表达在细胞膜上，可以与PD-L1/PD-L2特异性地结合并因此传递刺激信号，激活表达CPR的细胞。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

具体地，本发明中公开了一种基因重组嵌合膜蛋白，即嵌合PD-1受体蛋白(Chimeric PD-1 Receptor,CPR)，该嵌合蛋白由PD-1的膜外端、CD8alpha的绞链区、CD28的穿膜区及胞内区、以及CD3ζ的信号传导区等组成。通过细胞株筛选，本发明制备了稳定表达CPR的人T淋巴细胞株(Jurkat细胞)。实验研究发现，该细胞能与PD-1特异性抗体结合，可以与PD-L1/PD-L2结合，与PD-L1/PD-L2结合以后一定时间内可以启动信号传导并激活Jurkat细胞表达CD69及分泌IL-2。

因此，该嵌合蛋白具有以下用途：1)可以用于CAR-T细胞治疗，即表达该嵌合蛋白(CPR)的T淋巴细胞可以攻击PD-L1/PD-L2阳性的肿瘤细胞，其原理，一是与PD-L1/PD-L2结合以后可以直接激活表达嵌合蛋白的T淋巴细胞，另一种途径是：表达嵌合蛋白的T淋巴细胞通过与PD-L1/PD-L2结合，阻断了PD-L1/PD-L2与其它T淋巴细胞的结合，从而最大化地激活患者的T细胞。2)表达嵌合蛋白的Jurkat细胞株可以用于PD-1/PD-L1/PD-L2抗体药物的筛选。

嵌合膜蛋白

本发明提供了包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域的嵌合膜蛋白。胞外结构域包括靶-特异性的结合元件PD-1的膜外端。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在胞外结构域和跨膜结构域之间，或在胞内结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供了经过基因工程改造以表达所述嵌合膜蛋白的细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其显示显著的抗肿瘤性质。

在本发明的一个较佳的实施方式中，根据本发明的嵌合膜蛋白包含SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列。

在本发明的一个较佳的实施方式中，根据本发明的嵌合膜蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示。

如本文所用，术语“嵌合膜蛋白”还包括具有上述活性的SEQ ID NO：10序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述嵌合膜蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供本发明嵌合膜蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO:10所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

PD-1的膜外端

如本文所用，所述“PD-1的膜外端”是指衍生自PD-1分子的膜外部分，该部分具有特异性的结合PD-L1/PD-L2的功能。

在一个优选地实施方式中，所述的PD-1氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

SEQ ID NO:1(PD-1氨基酸序列)

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTD KLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTA HPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL

在一个优选地实施方式中，PD-1的膜外端序列如SEQ ID NO.:2所示：

LDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLP NGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQ(SEQ IDNO.:2)。

绞链区和跨膜结构域

对于绞链区和跨膜结构域(跨膜区)，嵌合膜蛋白可被设计以包括融合至胞外结构域的绞链区和跨膜结构域。

优选地，本发明的嵌合膜蛋白中的绞链区为CD8α的绞链区。

在本发明的一个优选的实施方式中，CD8α的氨基酸序列如下：

SEQ ID NO:3(CD8alpha氨基酸序列)

MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIAS QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV

在本发明的一个优选的实施方式中，CD8α的绞链区氨基酸序列如下：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO.:4)

在一个实施方式中，使用天然与嵌合膜蛋白中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))。

在另一优选例中，所述跨膜结构域为CD28的跨膜区。

胞内结构域

本发明的嵌合膜蛋白的胞内结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已表达嵌合膜蛋白的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

在一个实施方式中，本发明的嵌合膜蛋白中的胞内结构域被设计以包括CD3ζ的信号传导结构域。

在本发明的一个优选的实施方式中，CD3ζ的氨基酸序列如下：

SEQ ID NO:7(CD3zeta氨基酸序列)

MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNL GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA LHMQALPPR。

在本发明的一个优选的实施方式中，CD3ζ的胞内信号结构域氨基酸序列如下：

RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.:8)。

在另一个实施方式中，所述胞内结构域还包括共刺激信号传导区，优选地，共刺激信号传导区为CD28的胞内信号结构域。

在另一个优选的实施方式中，CD28的的氨基酸序列如下：

SEQ ID NO:5(CD28alpha氨基酸序列)

MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFW VLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

在另一个优选的实施方式中，所述嵌合膜蛋白包括CD28的穿膜区及胞内区，其氨基酸序列如下：

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO.:6)

载体

本发明包括包含嵌合膜蛋白序列的DNA构建体。编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的嵌合膜蛋白DNA的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常通过可操作地连接编码嵌合膜蛋白多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码嵌合膜蛋白的天然或合成核酸的表达。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

这些载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

治疗性应用

本发明包括用慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，NK细胞、T细胞)。在一些例子中，转导的T细胞可引起嵌合膜蛋白-介导的T-细胞应答。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达嵌合膜蛋白的T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中NK细胞或T细胞被基因修饰以表达本发明的嵌合膜蛋白，和将修饰的细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。

本发明的嵌合膜蛋白-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

施用给患者的治疗剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将约1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

抗体筛选

在本发明的一个实施方式中，提供了一种筛选抗PD-L1/PD-L2抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

将表达嵌合膜蛋白的Jurkat细胞与表达PD-L1/PD-L2的肿瘤细胞按照一定比例混合在一起，将细胞转入到细胞培养板中(24孔、12孔、6孔培养板均可以)，然后在不同的细胞培养孔中分别加入待筛选的PD-L1/PD-L2抗体、阳性对照抗体、阴性对照抗体等。将培养板放置于细胞培养箱中48-72小时，取出细胞进行如下检测分析：1)用流式细胞仪进行CD69表达分析；2)用ELISA进行IL-2分泌检测分析；3)用ELISA进行IFN-g分泌检测分析。

当表达PD-L1/PD-L2的肿瘤细胞与表达嵌合膜蛋白的Jurkat细胞混合培养48-72小时以后，可以可以通过与嵌合膜蛋白的结合而诱导Jurkat细胞高表达CD69、分泌IL-2及IFN-g，如果待筛选的PD-L1/PD-L2抗体可以与肿瘤细胞的PD-L1/PD-L2结合并封闭PD-L1/PD-L2与PD-1的结合位点，那么当在混合细胞培养中加入该抗体以后，则可以抑制肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2及IFN-g的分泌。反之，如果待筛选的PD-L1/PD-L2抗体不能封闭PD-L1/PD-L2与PD-1的结合位点，则不能阻断肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2及IFN-g的分泌。所以据此可以筛选PD-L1/PD-L2抗体。

在本发明的另一个实施方式中，提供了一种筛选抗PD-1抗体的方法，包括步骤：

将表达嵌合膜蛋白的Jurkat细胞与表达PD-L1/PD-L2的肿瘤细胞按照一定比例混合在一起，将细胞转入到细胞培养板中(24孔、12孔、6孔培养板均可以)，然后在不同的细胞培养孔中分别加入待筛选的PD-1抗体、阳性对照抗体、阴性对照抗体等。将培养板放置于细胞培养箱中48-72小时，取出细胞进行如下检测分析：1)用流式细胞仪进行CD69表达分析；2)用ELISA进行IL-2分泌检测分析；3)用ELISA进行IFN-g分泌检测分析。

当表达PD-L1/PD-L2的肿瘤细胞与表达嵌合膜蛋白的Jurkat细胞混合培养48-72小时以后，可以通过与嵌合膜蛋白的结合而诱导Jurkat细胞高表达CD69、分泌IL-2及IFN-g，如果待筛选的PD-1抗体可以与PD-1结合并封闭PD-1与PD-L1/PD-L2的结合位点，那么当在混合细胞培养中加入该抗体以后，则可以抑制肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2及IFN-g的分泌。反之，如果待筛选的PD-1抗体不能封闭PD-1与PD-L1/PD-L2的结合位点，则不能阻断肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2及IFN-g的分泌。所以据此可以筛选PD-1抗体。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的嵌合膜蛋白可以成功表达在细胞膜上；

(2)本发明的嵌合膜蛋白可以与PD-L1/PD-L2特异性地结合并因此传递刺激信号，激活表达CPR的细胞。

(3)用本发明的嵌合膜蛋白制备的Jurkat细胞可以作为一个筛选平台用于PD-1抗体药物研发。

(4)用本发明的嵌合膜蛋白制备的Jurkat细胞可以作为一个筛选平台用于PD-L1/PD-L2抗体药物研发。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料和方法

1、嵌合PD-1受体(CPR)蛋白表达载体构建

CPR的DNA编码序列由苏州省心生物技术有限公司合成(Project ID:T1509090661-T3970)，合成好的序列由该公司亚克隆至pMac-Fc载体(Macroimmune Inc,USA)。

2、细胞转染及稳定细胞株筛选

用Xfect^TM Transfection Reagent转染试剂(CLONTECH)将CPR质粒DNA转染到人T淋巴细胞株(Jurkat，中国科学院上海生命科学研究院)。具体方法参照转染试剂说明书进行操作。转染后的24小时，将G418(0.8mg/ml)(Cat#10131-035,Thermo Fisher)加入到细胞孔中，在随后的培养过程中，根据细胞生长状况，每隔3天递增G418浓度，直至未转染的对照孔细胞全部死亡。筛选后的细胞经过稀释加入到5个96孔细胞培养板中，每孔含有0.5-1个细胞。将培养板放置于细胞培养箱中培养2-3周，待细胞长到一定数量，将单克隆细胞进行放大培养，并用PD-1特异性抗体分析CPR的表达情况。

3、CPR表达检测

收集细胞，经PBS洗涤后，用荧光标记的鼠抗人CD279抗体(Cat#557946,BDBioscience)进行染色，然后用流式细胞仪分析不同亚克隆细胞对CPR的表达情况。

4、混合细胞培养及Jurkat-CPR细胞的激活

将CPR阳性的Jurkat细胞与PD-L1阳性的肿瘤细胞(HCC827，中国科学院上海生命科学研究院)按照5:1的比例混合在一起，将细胞加入到24-孔培养板中，每孔0.5ml。实验设置四组，第一组细胞孔只含有Jurkat-CPR细胞，第二组为Jurkat-CPR细胞及加入的CD3、CD28抗体(阳性对照)，第三组为混合细胞(Jurkat-CPR细胞、HCC827细胞)，第四组为混合细胞及加入的PD-1特异性抗体(10ug/ml)。培养24小时候，收集细胞，用荧光标记的鼠抗人CD69抗体(Cat#555531,BD Bioscience)进行染色分析。

实施例1 CPR表达载体构建

CPR的设计结构如图1所示，由PD-1的膜外端(PD-1ECD)、CD8alpha绞链区、CD28的穿膜区及胞内区、以及CD3ζ的信号传导区等所组成。CPR的基因编码序列由1161个核苷酸组成(图2A)，其中信号肽编码序列57个核苷酸(1-57)、PD-1ECD 429个核苷酸(58-486)、CD8alpha绞链区135个核苷酸(487-621)、CD28的穿膜区及胞内区204个核苷酸(622-825)、CD3ζ的信号传导区336个核苷酸(826-1161)。相应的氨基酸序列如图2B所示。

实施例2 细胞株筛选及CPR表达分析

Jurkat细胞经过G418筛选，能明显检测到CPR的表达(图3A)。该细胞群经过细胞亚克隆筛选，筛选出6株阳性细胞克隆，分别为1C8、2F4、2G10、2D11、4G10、及3F4。其中以1C8细胞株对CPR的表达水平最高(图3B)。

实施例3 CPR分子功能分析

利用流式细胞仪及ELISA方法分别分析了CPR分子信号所诱导的CD69的表达及IL-2的分泌。由于CPR的膜内端是CD28及CD3的信号传导区域，当CPR与PD-L1结合以后可以启动信号传导，从而激活表达CPR的细胞。

将Jurkat-CPR细胞与PD-L1阳性细胞(HCC827)一起混合培养，24小时候收集细胞，用CD69特异性抗体分析Jurkat-CPR细胞在不同培养条件下对CD69的表达。结果表明(图4A、B)，当肿瘤细胞与Jurkat-CPR一起培养时，前者可以显著诱导CD69的表达，表达水平明显高于由CD3/CD28抗体所诱导的表达水平。当PD-1中和抗体(Nivolumab)加入以后，则可以显著抑制肿瘤细胞诱导的CD69的表达，说明CPR分子与PD-L1结合以后可以传递刺激信号，刺激Jurkat-CPR细胞高表达CD69。

用ELISA分析了细胞培养上清中IL-2的分泌水平。结果显示，肿瘤细胞可显著诱导Jurkat-CPR细胞分泌IL-2，而PD-1中和抗体则可以抑制IL-2的分泌。实验结果再次表明，CPR与PD-L1结合以后，可以通过CD28及CD3的信号传导区域传递刺激信号，从而激活Jurkat细胞高表达CD69及分泌IL-2。

讨论

本发明的研究表明，根据本发明的嵌合PD-1受体是一种新型基因重组膜蛋白(CPR)，可以表达在细胞膜上，可以与PD-L1特异性地结合并因此传递刺激信号，激活表达CPR的细胞。因此，把CPR表达在免疫细胞(比如人T淋巴细胞及NK细胞)，当输入到体内以后即可识别追踪肿瘤细胞，一旦与肿瘤细胞的PD-L1结合，即可激活表达CPR的免疫细胞从而发挥对肿瘤细胞的攻击。同时，当表达CPR的细胞与肿瘤细胞的PD-L1结合以后，又可以阻断肿瘤细胞的PD-L1与所有表达PD-1细胞(主要是T淋巴细胞)的结合，从而解除了肿瘤细胞对T淋巴细胞的钳制作用，使得包括CPR阳性细胞在内的所有T淋巴细胞对肿瘤细胞进攻击，以达到消灭肿瘤细胞的效果。

相比于单链抗体，本发明的CPR具有以下优势：1)CPR的氨基酸成分均来自于人体内天然的氨基酸，不具有免疫源性反应；2)本发明的CPR针对肿瘤细胞的PD-L1,可以用于实体瘤；3)本发明的CPR具有PD-1抗体的效应，进入体内以后可以阻断肿瘤细胞的PD-L1与T淋巴细胞的PD-1的结合；4)由CPR制备的NK细胞株可以作为通用产品对所有的患者使用；5)由CPR制备的NK细胞株没有明显的细胞因子风暴。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种嵌合膜蛋白，其特征在于，所述嵌合膜蛋白包括细胞外结构域、绞链区、跨膜结构域、和细胞内结构域；其中，所述细胞外结构域包括PD-1的膜外端；所述细胞内结构域包括CD3ζ的信号传导区。

2.如权利要求1所述的嵌合膜蛋白，其特征在于，所述嵌合膜蛋白包括PD-1的膜外端、CD8alpha的绞链区、CD28的穿膜区及胞内区、以及CD3ζ的信号传导区。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合膜蛋白。

4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求4所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求3所述的核酸分子。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1所述的嵌合膜蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、或权利要求5所述的细胞。

7.权利要求1所述的嵌合膜蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、或权利要求5所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。

8.一种治疗疾病的方法，其特征在于，包括给需要治疗的对象施用适量的权利要求1所述的嵌合膜蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的细胞、或权利要求6所述的药物组合物。

9.一种筛选抗PD-L1/PD-L2抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

将表达权利要求1所述的嵌合膜蛋白的Jurkat细胞与表达PD-L1/PD-L2的肿瘤细胞混合培养，加入待筛选的抗体，培养后进行如下检测分析：1)CD69表达分析；2)IL-2分泌检测分析；和/或3)IFN-g分泌检测分析；

如果待筛选的抗体可以与肿瘤细胞的PD-L1/PD-L2结合并封闭PD-L1/PD-L2与PD-1的结合位点，那么当在混合细胞培养中加入该抗体以后，则可以抑制肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2的分泌和/或IFN-g的分泌；

如果待筛选的抗体不能封闭PD-L1/PD-L2与PD-1的结合位点，则不能阻断肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2的分泌和/或及IFN-g的分泌；

从而筛选抗PD-L1/PD-L2抗体。

10.一种筛选抗PD-1抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

将表达权利要求1所述的嵌合膜蛋白的Jurkat细胞与表达PD-L1/PD-L2的肿瘤细胞混合培养，加入待筛选的抗体，培养后进行如下检测分析：1)CD69表达分析；2)IL-2分泌检测分析；和/或3)IFN-g分泌检测分析；

如果待筛选的抗体可以与PD-1结合并封闭PD-1与PD-L1/PD-L2的结合位点，那么当在混合细胞培养中加入该抗体以后，则可以抑制肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2及IFN-g的分泌；

如果待筛选的抗体不能封闭PD-1与PD-L1/PD-L2的结合位点，则不能阻断肿瘤细胞诱导的CD69的高表达、IL-2及IFN-g的分泌；

从而筛选出抗PD-1抗体。