CN116917339A - 靶向dr4和/或dr5的多肽以及相关组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
融合蛋白包含连接至DR4和/或DR5抗原结合部分的纳米笼单体或其亚基，其中多个融合蛋白自组装以形成纳米笼。还描述了包含融合蛋白的纳米笼和相关组合物以及用于治疗和/或预防癌症的方法和用途。
Description
领域
本发明涉及多肽。特别地，本发明涉及DR4-和/或DR5-特异性多肽和相关构建体、组合物和方法。
背景
纳米颗粒为各个学科的进步做出了贡献。它们的使用具有赋予靶向递送的潜力，并允许用于催化过程的有序微阵列、缓释和笼状微环境的工程化。
对于含有敏感和亚稳态蛋白质的纳米颗粒的制造，蛋白质自组装是一种有吸引力的方法。事实上，自组装纳米颗粒在生理条件下通过非共价相互作用形成，并可靠地产生均匀且通常对称的纳米胶囊或纳米笼。自组装蛋白质纳米颗粒拥有三个不同的表面：外部、内部和亚基间表面，它们可以被调整以传递另外的功能。
已经描述了包含自组装蛋白的融合蛋白。例如，已知在组装的纳米笼的外表面上展示抗原以用作疫苗。
死亡受体4和5(DR4/DR5)是TNF受体超家族的成员。DR4和DR5在配体结合时通过三聚体化激活。当被激活时，这些受体递送细胞内凋亡信号至细胞。DR4/DR5在各种类型的癌细胞中上调。DR4和DR5代表癌症疗法的有吸引力的靶标。然而，基于靶向DR4和/或DR5的候选治疗剂的功效可能受到诸如以下因素的限制，例如交联细胞膜中的受体的能力不足，以及需要平衡候选治疗剂的效力与其他特性。
需要用于靶向DR4/DR5的改善的组合物和方法。
发明概述
根据一个方面，提供了融合蛋白，其包含连接到DR4和/或DR5抗原结合部分的纳米笼单体或其亚基，其中多个融合蛋白自组装以形成纳米笼。
在一方面，DR4和/或DR5抗原结合部分靶向DR4和/或DR5胞外域。
在一方面，DR4和/或DR5抗原结合部分装饰组装的纳米笼的内表面和/或外表面，优选外表面。
在一方面，DR4和/或DR5抗原结合部分包含抗体或其片段。
在一方面，抗体或其片段包含Fab片段。
在一方面，抗体或其片段包含scFab片段、scFv片段、sdAb片段、VHH域或其组合。
在一方面，抗体或其片段包含Fab片段的重链和/或轻链。
在一方面，融合蛋白包含DR4抗原结合部分。
在一方面，DR4抗原结合部分包含CM005G08、CM059H03、CM084A02、T1014A04、T1014G03、T1014A02、T1014A12、T1014B01、T1014Bll、T1014F08、T1014G04、T1015A02、T1015A07、T1006F07、42/43、44/45，和/或46/47的DR4抗原结合部分。
在一方面，融合蛋白包含DR5抗原结合部分。
在一方面，DR5抗原结合部分包含替加组单抗(Tigatuzumab)、来沙木单抗(Lexatumumab)、曲齐妥单抗(Drozitumab)和/或可那木单抗(Conatumumab)的抗原结合部分。
在一方面，DR5抗原结合部分包含可那木单抗的抗原结合部分。
在一方面，DR4和/或DR5抗原结合部分在纳米笼单体或其亚基的N端或C端处连接，或其中存在在纳米笼单体或其亚基的N端处连接的第一DR4和/或DR5抗原结合部分和在其C端处连接的第二DR4和/或DR5抗原结合部分，其中第一和第二DR4和/或DR5抗原结合部分相同或不同。
在一方面，融合蛋白包含纳米笼单体，并且DR4和/或DR5抗原结合部分在纳米笼单体的N端处连接。
在一方面，融合蛋白包含连接到DR4和/或DR5抗原结合部分的第一纳米笼单体亚基；其中第一纳米笼单体亚基能够与第二纳米笼单体亚基自组装以形成纳米笼单体。
在一方面，DR4和/或DR5抗原结合部分在第一纳米笼单体亚基的N端或C端处连接，或者其中存在在第一纳米笼单体亚基的N端处连接的第一DR4和/或DR5抗原结合部分和在C端处连接的第二DR4和/或DR5抗原结合部分，其中第一和第二DR4和/或DR5抗原结合部分相同或不同。
在一方面，融合蛋白与第二纳米笼单体亚基组合。
在一方面，第二纳米笼单体亚基在N端或C端处连接至生物活性部分。
在一方面，生物活性部分包含Fc片段。
在一方面，Fc片段是IgG1 Fc片段。
在一方面，Fc片段包含一个或多个突变或突变组，其调节融合蛋白的半衰期，例如从几分钟或几小时到几天、几周或几个月。
在一方面，Fc片段包含在L234、L235、G236、G237、M252、I253、S254、T256、P329、A330、M428、N434处或其组合(其中编号根据EU索引)的一个或多个突变，诸如M428L和N434S(“LS”)；M252Y、S254T和T256E(“YTE”)；L234A和L235A(“LALA”)；I253A和/或L234A、L235A和P329G(“LALAP”)、G236R、G237A、A330L或其组合。
在一方面，Fc片段是scFc片段。
在一方面，约3至约100个纳米笼单体，诸如24、32、48或60个单体，或约4至约200个纳米笼单体亚基，诸如4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或更多个，任选地与一种或多种整个纳米笼单体组合，能够自组装以形成纳米笼。
在一方面，纳米笼单体选自铁蛋白、去铁铁蛋白、encapsulin、SOR、二氧四氢喋啶合酶(lumazine synthase)、丙酮酸脱氢酶、羧酶体、穹窿蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P、MS2外壳蛋白、其片段及其变体。
在一方面，纳米笼单体是去铁铁蛋白，任选地人去铁铁蛋白。
在一方面，纳米笼单体是去铁铁蛋白轻链，任选地人去铁铁蛋白轻链。
在一方面，融合蛋白包含第一去铁铁蛋白亚基，任选第一人去铁铁蛋白亚基，并且其中第一去铁铁蛋白亚基能够与第二去铁铁蛋白亚基自组装。
在一方面，第一和第二去铁铁蛋白单体亚基可互换地包含去铁铁蛋白的“N”和“C”区。
在一方面，去铁铁蛋白的“N”区包含与以下序列至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
在一方面，去铁铁蛋白的“C”区包含与以下序列至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
或
在一方面，融合蛋白进一步包含生物活性部分和在纳米笼单体或其亚基与生物活性部分之间的接头。
在一方面，接头是柔性的或刚性的，并且包含约1至约30个氨基酸残基，诸如约8至约16个氨基酸残基。
在一方面，接头包含GGGGS重复，诸如1、2、3、4或更多个GGGGS重复。
在一方面，接头包含与以下序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG。
在一方面，融合蛋白进一步包含C端接头。
在一方面，C端接头包含GGS重复。
在一方面，C端接头包含与以下序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
根据一个方面，提供纳米笼，其包含至少一种本文所述的融合蛋白和至少一种与融合蛋白自组装的第二纳米笼单体或其亚基。
在一方面，融合蛋白包含第一纳米笼单体亚基，第二纳米笼单体或其亚基是第二纳米笼单体亚基，并且第二纳米笼单体亚基与融合蛋白自组装以形成纳米笼单体。
在一方面，每个纳米笼单体包含本文所述的融合蛋白。
在一方面，约1％至约100％，诸如约1％、4％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％至约4％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，诸如约20％至约80％的纳米笼单体或其亚基包含本文所述的融合蛋白。
在一方面，纳米笼包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的DR4和/或DR5抗原结合部分，诸如2或3个不同的DR4和/或DR5抗原结合部分。
在一方面，纳米笼是多价的。
在一方面，纳米笼是多特异性的。
在一方面，至少一个DR4和/或DR5抗原结合部分装饰纳米笼的外表面，并且至少一个Fc片段装饰纳米笼的外表面。
在一方面，至少两个DR4和/或DR5抗原结合部分装饰纳米笼的外表面，并且至少两个Fc片段装饰纳米笼的外表面。
在一方面，纳米笼包含4:1:1比率的融合至第一全长人铁蛋白轻链的可那木单抗的抗原结合部分(诸如Fab片段)；融合至第二全长人铁蛋白轻链的Fc片段(任选scFc片段)；和第三人铁蛋白轻链。
在一方面，纳米笼包含融合至完整铁蛋白单体的N端的至少一个DR4和/或DR5抗原结合部分，融合至N-铁蛋白单体亚基的N端的至少一个DR4和/或DR5抗原结合部分，和融合至C-铁蛋白单体亚基的N端的Fc片段。
在一方面，纳米笼包含2:1:1比率的融合至完整铁蛋白单体的N端的DR4和/或DR5抗原结合部分：融合至N-铁蛋白单体亚基的N端的DR4和/或DR5抗原结合部分：融合至C-铁蛋白单体亚基的N端的Fc片段。
在一方面，纳米笼包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个DR4和/或DR5抗原结合部分。
在一方面，纳米笼包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个生物活性部分。
在一方面，纳米笼携带货物分子(cargo molecule)，例如药剂、诊断剂和/或显像剂(imaging agent)。
在一方面，货物分子不与融合蛋白融合，并且包含在纳米笼内部。
在一方面，货物分子是蛋白质，并且与融合蛋白融合，使得货物分子包含在纳米笼内部。
在一方面，货物分子包含荧光蛋白，诸如GFP、EGFP、Ametrine和/或基于黄素的荧光蛋白，诸如LOV-蛋白，诸如ILOV。
在一方面，纳米笼能够以小于约0.1μg/mL、小于约0.01μg/mL或小于约0.001μg/ml的IC50值杀伤DR4和/或DR-5阳性癌细胞，如在体外细胞杀伤测定中所确定的。
在一方面，纳米笼能够以小于约10pM、小于约1pM或小于约0.1pM的IC50值杀伤DR4和/或DR-5阳性癌细胞，如在体外细胞杀伤测定中所确定的。
在一方面，纳米笼能够以在质量和/或摩尔基础上比相应的IgG更有力至少约10、至少约100、至少约1000、至少约10,000或至少约100,000的IC50值杀伤DR4和/或DR-5阳性癌细胞。
根据一个方面，提供了包含本文所述纳米笼的DR4和/或DR5的治疗性或防治性组合物。
根据一个方面，提供了编码本文所述的融合蛋白的核酸分子。
根据一个方面，提供了包含本文所述的核酸分子的载体。
根据一个方面，提供了包含本文所述载体并产生本文所述融合蛋白的宿主细胞。
根据一个方面，提供了治疗和/或预防癌症的方法，该方法包括施用本文所述的纳米笼或组合物。
在一方面，癌症选自乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤或肺癌。
根据一个方面，提供了本文所述的纳米笼或组合物用于治疗和/或预防癌症的用途。
在一方面，本文所述的纳米笼或组合物用于治疗和/或预防癌症。
本发明的新颖特征对于本领域的技术人员来说，在审查了本发明的以下详细描述后将变得显而易见。然而，应当理解，本发明的详细描述和呈现的具体实施例虽然指示本发明的某些方面，但仅出于说明的目的而提供，因为对于本领域技术人员来说，根据本发明的详细描述和随后的权利要求，在本发明精神和范围内的各种变化和修改将变得显而易见。
附图简述
从下面参考附图的描述将进一步理解本发明，其中：
图1.MultaBody组装展示靶向三聚体受体的Fab。显示与常规IgG(左)相比的Multabody价(valency)(右)的示意性代表。Fab(重链为暗红色且轻链为浅红色)簇集在铁蛋白的三重对称轴(浅青色)上的特写视图。金色的片段代表Fc片段。
图2.亲合力增强针对多种癌细胞系的细胞死亡。Multabody格式的替加组单抗与亲本IgG对多种癌细胞系的相对杀伤能力。
图3.亲合力增强针对多种癌细胞系的细胞死亡。Multabody格式的可那木单抗与亲本IgG对多种癌细胞系的相对杀伤能力。
图4A是人铁蛋白轻链(hFTL)和示例性N-半铁蛋白(N-hFTL)和C-半铁蛋白(C-hFTL)分子的图解代表。
图4B是一起形成本公开的示例性Multabody的融合多肽的图解代表。
图5是显示携带结肠癌异种移植肿瘤并用媒介物、DR5 IgG或DR5 MB处理的小鼠在第88天的肿瘤体积的图。使用Mann-Whitney检验进行统计分析。
某些方面的详细描述
在配体结合时，死亡受体4和5(DR4和DR5)可以三聚体化并向细胞(例如，癌细胞)递送细胞内凋亡信号。本公开涵盖认识到靶向DR4和/或DR5的分子的增加的价可以对应于候选治疗剂的增加的效力。
本文描述了使用纳米笼靶向DR4和/或DR5的系统，该纳米笼包含多个DR4和/或DR5抗原结合部分，诸如能够结合DR4和/或DR5的Fab片段。在一些方面，还通过纳米笼展示另外的生物活性部分诸如Fc片段。还描述了使用此类纳米笼治疗(例如癌症)的方法。本文公开的系统使用“MultaBody”平台，该平台允许调节纳米笼的结合和药代动力学特征，例如通过控制纳米笼内Fab和Fc分子的数量或比率。纳米笼可以含有与纳米笼中的单体一样多的DR4和/或DR5抗原结合部分和/或生物活性部分，例如在铁蛋白的情况下，为24个。在一些方面，将一些或所有单体分裂，使得多达两倍的DR4和/或DR5抗原结合部分和/或生物活性部分的数量可以装饰纳米笼，例如在铁蛋白的情况下，为48个。可以微调本公开的用于靶向DR4和/或DR5的系统的特征，例如，以平衡效力和其他考虑诸如对非癌细胞的毒性。
在此，证明了在MultaBody平台上DR4和/或DR5靶向Fab的多聚化，通过其独特的3重对称轴，导致交联细胞表面受体DR4和/或DR5的更大能力。因此，与相应的IgG相比，MultaBody显著增强了杀伤癌细胞的细胞信号传导。在一些方面，Multabody增加的效力不一定以1:1的比率增加，其中价的加倍导致效力的加倍。反而，在一些方面，效力协同地增加了至少10倍，并且在一些方面更多。使用各种癌细胞系证实这种工程化分子的治疗剂潜力。
定义
除非另外解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。分子生物学中常用术语的定义可以在BenjaminLewin,Genes V,由Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrewet al.(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。尽管在本发明的测试的实践中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但本文描述的是典型的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应理解，本文所使用的术语仅为了描述特定方面的目的，而非旨在进行限制。本文参考许多专利申请、专利和出版物以帮助理解所描述的方面。这些参考通过其整体引用并入本文。
在理解本申请的范围时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。另外，如本文所用，术语“包含”及其派生词旨在为开放式术语，其指定陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在，但不排除其他未陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在。前述内容也应用于具有类似含义的词语，诸如术语“包括”、“具有”及其派生词。
应当理解，描述为“包含”某些组分的任何方面也可以“由……组成”或“基本上由……组成”，其中“由……组成”具有封闭的或限制性的含义，并且“基本上由……组成”是指包含指定的组分但排除其他组分，除了作为杂质存在的材料、作为用于提供组分的过程的结果而存在的不可避免的材料以及为实现本发明的技术效果以外的目的而添加的成分。例如，使用短语“基本上……组成”定义的组合物涵盖任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载剂等。通常，基本上由一组组分组成的组合物将包含小于5重量％、通常小于3重量％、更典型地小于1重量％且甚至更典型地小于0.1重量％的非指定组分。
应当理解，本文定义为包含的任何组件可以通过但书或否定限制的方式明确地从要求保护的发明中排除。例如，在一些方面，本文所述的纳米笼和/或融合蛋白可以排除铁蛋白重链和/或可以排除铁结合组分。
此外，本文给出的所有范围包含范围的端点以及任何中间范围点，无论是否明确陈述。
如本文所用，诸如“基本上”、“约”和“大约”的程度术语是指修饰的术语的合理偏差量，使得最终结果不会显著改变。这些程度术语应被解释为包含修饰的术语的至少±5％的偏差(如果该偏差不会否定其修饰的词语的含义)。
缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁语exempli gratia，并且在本文中用于指示非限制性示例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”或“诸如”同义。词语“或”旨在包含“和”，除非上下文另有明确指示。
如本文所用，术语“受试者”是指动物界的任何成员，通常是哺乳动物。术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、其他高级灵长类动物、家养和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，诸如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。典型地，哺乳动物是人。
术语“蛋白质纳米颗粒”、“纳米笼”和“Multabody”在本文中可互换使用，是指由多个纳米笼单体制成的基于蛋白质的多面体形状的结构。这些纳米笼单体或其亚基各自由蛋白质或多肽(例如糖基化多肽)构成，并且任选地由以下的单个或多个特征组成：核酸、辅基(prosthetic group)、有机和无机化合物。蛋白质纳米颗粒的非限制性示例包含铁蛋白纳米颗粒(参见例如Zhang,Y.Int.J.Mol.Sci.,12:5406-5421,2011，通过引用并入本文)、encapsulin纳米颗粒(参见例如Sutter et al.,Nature Struct,and Mol.Biol.,15:939-947,2008，通过引用并入本文)、硫加氧酶还原酶(SOR,Sulfur Oxygenase Reductase)纳米颗粒(参见例如Urich et al.,Science,311:996-1000,2006，通过引用并入本文)、二氧四氢喋啶合酶纳米颗粒(参见，例如，Zhang et al.,J.Mol.Biol.,306:1099-1114,2001)或丙酮酸脱氢酶纳米颗粒(参见，例如，Izard et al.,PNAS 96:1240-1245,1999，通过引用并入本文)。铁蛋白、去铁铁蛋白、encapsulin、SOR、二氧四氢喋啶合酶和丙酮酸脱氢酶是自组装成球状蛋白复合物的单体蛋白，在某些情况下，该复合物分别由24、60、24、60和60个蛋白质亚基组成。铁蛋白和去铁铁蛋白在本文中通常可互换使用，并被理解为均适合用于本文所述的融合蛋白、纳米笼和方法。也产生纳米笼的羧酶体、穹窿蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P和MS2外壳蛋白考虑用于本文。此外，完全或部分合成的自组装单体还考虑用于本文。
将理解，每个纳米笼单体可以分成两个或更多个亚基，该亚基将自组装成功能性纳米笼单体。例如，铁蛋白或去铁铁蛋白可以分成N-和C-亚基，例如，通过将全长铁蛋白基本上分成两半而获得的N-和C-亚基，使得每个亚基可以单独地结合至不同的DR4和/或DR5抗原结合部分或生物活性部分(例如Fc片段)，用于随后自组装成纳米笼单体和纳米笼。在一些方面，每个亚基可以在两端处(相同或不同)结合DR4和/或DR5抗原结合部分和/或生物活性部分。“功能性纳米笼单体或其亚基”是指纳米笼单体或其亚基能够与互补单体或亚基自组装成本文所述的纳米笼。
术语“铁蛋白”和“去铁铁蛋白”在本文中可互换使用，并且通常是指能够组装成铁蛋白复合物的多肽(例如铁蛋白链)，该铁蛋白复合物通常包含24个蛋白质亚基。将理解，铁蛋白可以来自任何物种。通常，铁蛋白是人铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白是野生型铁蛋白。例如，铁蛋白可以是野生型人铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白轻链用作纳米笼单体，和/或铁蛋白轻链的亚基用作纳米笼单体亚基。在一些实施方案中，组装的纳米笼不包含任何铁蛋白重链或能够与铁结合的其他铁蛋白组分。
如本文所用，术语“多特异性”是指具有至少两个结合位点的特征，在该结合位点处至少两种不同的结合配偶体(partner)(例如抗原或受体(例如Fc受体)可以结合。例如，包含至少两个Fab片段的纳米笼是“多特异性的”，其中两个Fab片段中的每个结合至不同的抗原。作为另外的示例，包含Fc片段(其能够结合Fc受体)和Fab片段(其能够结合抗原)的纳米笼是“多特异性的”。
如本文所用，术语“多价”是指具有至少两个结合位点的特征，在该结合位点处结合配偶体(例如抗原或受体(例如，Fc受体))可以结合。可以结合到至少两个结合位点的结合配偶体可以相同或不同。
术语“抗体”，在本领域中也称为“免疫球蛋白”(Ig)，在本文中是指由成对的重和轻多肽链构建的蛋白质；存在各种Ig同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG(诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM。将理解，抗体可以来自任何物种，包括人、小鼠、大鼠、猴、美洲驼或鲨鱼。当抗体被正确折叠时，每条链折叠成由更多线性多肽序列连接的多个不同的球状域。例如，在IgG的情况下，免疫球蛋白轻链折叠成可变(VL)和恒定(CL)域，而重链折叠成可变(VH)和三个恒定(CH，CH2，CH3)域。重链和轻链可变域(VH和VL)的相互作用导致抗原结合区(Fv)的形成。每个域具有本领域技术人员所熟悉的得到确认的结构。
轻链和重链可变区负责结合靶抗原，因此可以在抗体之间显示出显著的序列多样性。恒定区显示出较少的序列多样性，并且负责结合大量的天然蛋白质以引发重要的免疫学事件。抗体的可变区含有分子的抗原结合决定簇，因此决定抗体对其靶抗原的特异性。大部分序列变异发生在6个高变区中，每个可变重链和轻链各3个；高变区组合形成抗原结合位点，并且有助于抗原决定簇的结合和识别。抗体对其抗原的特异性和亲和力由高变区的结构以及它们的大小、形状和它们呈递给抗原的表面的化学性质决定。
本文所指的“抗体片段”可以包含本领域已知的任何合适的抗原结合抗体片段。抗体片段可以是天然存在的抗体片段，或者可以通过操作天然存在的抗体或通过使用重组方法获得。例如，抗体片段可以包括但不限于Fv、单链Fv(scFv；由用肽接头连接的VL和VH组成的分子)、Fc、单链Fc、Fab、单链Fab、F(ab')2、单域抗体(sdAb；由单个VL或VH构成的片段)，以及这些中的任一者的多价呈递。如本文所用，“抗原结合部分”是指特异性结合至靶抗原的抗体或抗体的一部分。
如本文所用，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体。该术语还应解释为表示通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，并且该DNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列是使用本领域可获得和熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得的。
术语“表位”是指抗原决定簇。表位是分子上的特定化学基团或肽序列，其具有抗原性，即，其引发特异性免疫应答。抗体特异性结合例如多肽上的特定抗原表位。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置(juxtaposed)的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位典型地在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位典型地在用变性溶剂处理时丢失。表位典型地以独特的空间构象包含至少3个、更通常至少5个、约9个、约11个或约8至约12个氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如Methods in Molecular Biology中的“Epitope Mapping Protocols”,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed(1996)。
如本文所用，术语“抗原”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可以牵涉抗体产生或特定免疫活性(immunologically-competent)细胞的激活，或两者兼有。本领域技术人员将理解，任何大分子，包含几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组DNA或基因组DNA。本领域技术人员将理解，任何DNA，包括编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码本文所用术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本文所述的方面包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列可以以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成或衍生自生物样品。此类生物样品可包括但不限于组织样品、细胞或生物流体。
“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的固有性质，以充当在生物过程中其他聚合物和大分子合成的模板，该其他聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(例如rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列，以及由此产生的生物学性质。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)均可称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。
如本文所用，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“分离的”是指改变或脱离自然状态。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯的形式存在，或者可以存在于诸如例如宿主细胞的非天然环境中。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包含所有互为简并形式(degenerate version)且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。短语编码蛋白质的核苷酸序列或RNA也可以包含内含子，其程度是编码蛋白质的核苷酸序列可以以某些形式包含内含子。
如本文所用，术语“调节”是指相比于不存在治疗或化合物的受试者中的应答水平，和/或相比于其他方面相同但未治疗的受试者中的应答水平，介导受试者中应答水平的可检测的增加或降低。该术语涵盖干扰和/或影响天然信号或应答，从而在受试者(通常是人)中介导有益的治疗应答。
术语“可操作地连接”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。
组合物的“胃肠外”施用包含例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。还包含吸入和鼻内施用。
如本文所用，术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸的一般知识，多核苷酸可以被水解为单体“核苷酸”。单体核苷酸可以被水解为核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域中可获得的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于重组手段，即使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，以及通过合成手段。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语指短链和长链，短链在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物，以及长链，其在本领域中通常称为蛋白质，其中有许多类型。“多肽”包含例如生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包含天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用，对于抗体的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，特异性结合至来自一个物种的抗原的抗体也可以结合至来自一个或多个物种的抗原。但是，此类跨物种反应性本身并不改变抗体作为特异性的分类。在另一个示例中，特异性结合至抗原的抗体也可以结合至抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不改变抗体作为特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用，意指该相互作用依赖于该化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合至特定的蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在含有标记的表位“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将减少结合至抗体的标记的A的量。
如本文所用，“治疗”状况(例如，本文所述的状况诸如癌症)或状况的“治疗”是用于获得有益或期望结果(诸如临床结果)的方法。有益或期望结果可以包括但不限于一种或多种症状或状况的减轻或改善；疾病、病症或状况的程度减轻；疾病、病症或状况的稳定(即不恶化)状态；预防疾病、病症或状况的扩散；推迟或减缓疾病、病症或状况的进展；疾病、病症或状况的改善或缓和；以及无论可检测到或不可检测的缓解(无论部分或全部)。“缓和”疾病、病症或状况是指与治疗不存在的程度或时间进程相比，疾病、病症或状况的程度和/或不希望的临床表现减少和/或进展的时间进程减缓或延长。如本文所用，术语“预防或“防治”是指获得或发展疾病或病症(例如癌症)的风险的减少，或疾病或病症(例如癌症)的复发的减少或抑制。因此，DR4-和/或DR-5治疗性或防治性组合物是指包含如本文所述的组装的纳米笼或如本文所述的能够组装成纳米笼的融合蛋白的组合物，当施用于受试者时，该组合物能够治疗和/或预防其中涉及DR4和/或DR5的疾病和/或状况，诸如癌症。
术语“治疗有效量”、“有效量”或“足够量”是指当施用于受试者(包括哺乳动物，例如人)时，足以达到期望结果的量，例如有效引起细胞死亡(例如癌细胞死亡)的量。本文所述的化合物的有效量可以根据诸如分子、个体的年龄、性别、物种和重量等因素而变化。如本领域技术人员所理解的，可以调整剂量或治疗方案以提供最佳治疗应答。例如，在一些方面，本文所述的融合蛋白治疗有效量的施用足以治疗和/或预防癌症。此外，使用治疗有效量的受试者的治疗方案可以由单次施用组成，或者替代地包含一系列的应用。治疗期的频率和长度取决于多种因素，诸如分子、受试者的年龄、药剂的浓度、患者对药剂的应答性或其组合。还将理解，在特定治疗方案的进程中，用于治疗的药剂的有效剂量可以增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定，可以导致剂量变化并变得明显。在一些方面，本文所述的融合蛋白可以在用常规疗法治疗所讨论疾病或病症之前、期间或之后施用。例如，本文所述的融合蛋白可以发现与癌症的常规治疗组合的特定用途。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源性核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包含原代主题细胞及其子代。
如本文所用，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”是指启动子相对于多核苷酸在正确的位置和方向，以控制通过RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
“载体”是物质的组合物，其包含分离的核酸并可以用于将分离的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包含自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包含促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，诸如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
与一种或多种进一步的治疗剂“组合”施用包括以任何顺序同时(并行)和连续施用。
术语“药学上可接受的”是指该化合物或化合物的组合与药用配制剂的其余成分相容，并且根据既定的政府标准(包含美国食品和药物管理局颁布的那些)，其对于施用于人通常是安全的。
术语“药学上可接受的载剂”包括但不限于溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和/或吸收延迟剂等。药学上可接受的载剂的使用是众所周知的。
“变体”是由于在比较序列中一个或多个氨基酸残基的插入、缺失、修饰和/或取代而具有与比较序列不同的氨基酸序列的生物活性融合蛋白、抗体或其片段。变体通常与比较序列具有小于100％的序列同一性。然而，通常地，生物活性变体的氨基酸序列与比较序列具有至少约70％氨基酸序列同一性，诸如至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。变体包括至少10个氨基酸的肽片段，其保留了一定水平的比较序列的生物活性。变体还包括其中在比较序列的N端或C端或比较序列内添加一个或多个氨基酸残基的多肽。变体还包括其中许多氨基酸残基缺失和/或任选被一个或多个氨基酸残基取代的多肽。变体也可以被共价修饰，例如通过用不同于天然存在的氨基酸的部分取代或通过修饰氨基酸残基以产生非天然存在的氨基酸。
“氨基酸序列同一性百分比”在本文中定义为在对齐序列并引入缺口(如果需要)以实现最大百分比的序列同一性，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与感兴趣序列(诸如本发明的多肽)中的残基相同的氨基酸残基的百分比。候选序列中的N端、C端或内部延伸、缺失或插入均不应被解释为影响序列同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的，诸如“BLAST”。
用于本文目的的“活性”或“活性的”是指本文所述融合蛋白的生物学和/或免疫学活性，其中“生物学”活性是指由融合蛋白引起的生物学功能(无论抑制性或刺激性)。
本文所述的融合蛋白可以包含修饰。此类修饰包括但不限于与效应子分子的缀合。修饰进一步包括但不限于与可检测的报告物部分的缀合。还包含延长半衰期的修饰(例如聚乙二醇化)。还包含用于去免疫化的修饰。蛋白质和非蛋白质剂可以通过本领域已知的方法缀合至融合蛋白。缀合方法包括直接连接、通过共价附接的接头连接和特异性结合对成员(例如抗生物素蛋白-生物素)。此类方法包括，例如，通过Greenfield et al.,CancerResearch 50,6600-6607(1990)描述的，其通过引用并入本文，以及通过Amon et al.,Adv.Exp.Med.Biol.303,79-90(1991)和通过Kiseleva et al,MoI.Biol.(USSR)25,508-514(1991)描述的那些，这两篇通过引用并入本文。
融合蛋白
本文描述了融合蛋白。融合蛋白包含连接至DR4和/或DR5抗原结合部分的纳米笼单体或其亚基。多个融合蛋白可以自组装以形成纳米笼。以这种方式，DR4和/或DR5抗原结合部分可以装饰组装的纳米笼的内表面、组装的纳米笼的外表面或两者。在一些实施方案中，DR4和/或DR5抗原结合部分装饰组装的纳米笼的外表面。
DR4和/或DR5抗原结合部分通常是结合至DR4和/或DR5的抗体或其片段。虽然DR4和/或DR5抗原结合部分可以靶向DR4和/或DR5受体的任何部分，但它典型地靶向胞外域。
将理解，抗体或其片段可以包含例如Fab片段的重链和/或轻链，或由例如Fab片段的重链和/或轻链组成。例如，抗体或其片段可以包含scFab片段、scFv片段、sdAb片段、纳米抗体和/或VHH区或由scFab片段、scFv片段、sdAb片段、纳米抗体和/或VHH区组成。将理解，任何抗体或其片段可以用于本文所述的融合蛋白中。
通常，本文所述的融合蛋白与Fab轻链和/或重链缔合，该Fab轻链和/或重链可以单独地或与融合蛋白连续地产生。
在一些方面，融合蛋白包含DR4抗原结合部分。DR4抗原结合部分可以包含，例如，CM005G08、CM059H03、CM084A02、T1014A04、T1014G03、T1014A02、T1014A12、T1014B01、T1014Bll、T1014F08、T1014G04、T1015A02、T1015A07、T1006F07、42/43、44/45和/或46/47的抗原结合部分。
在一些方面，融合蛋白包含DR5抗原结合部分。DR5抗原结合部分可以包含例如替加组单抗、可那木单抗、曲齐妥单抗和/或来沙木单抗的抗原结合部分。在一些情况下，这些抗原结合部分在本文中可互换地称为例如可那木单抗、Cona或可那木单抗IgG。
在某些方面，本文所述的纳米笼单体包含连接至DR4和/或DR5抗原结合部分或生物活性基序(motive)(例如Fc片段)的第一纳米笼单体亚基。第一纳米笼单体亚基能够与第二纳米笼单体亚基自组装以形成完整的纳米笼单体，多个纳米笼单体自组装以形成纳米笼，从而允许多个DR4和/或DR5抗原结合部分或其他部分自组装成一个纳米笼。通过控制基因和表达比率来控制每种不同组分的量。这些纳米笼单体亚基可以单独或组合使用。
例如，DR4和/或DR5抗原结合部分或生物活性部分(例如Fc片段)可以连接到分开的去铁铁蛋白单体(N-或C-亚基，其各自典型地为全长去铁铁蛋白单体的约一半)。与DR4和/或DR5抗原结合部分或生物活性部分(例如Fc片段)融合的每个亚基自组装成去铁铁蛋白单体，该单体转而与其他去铁铁蛋白单体(完整的去铁铁蛋白或由N-和C-亚基形成的组装的去铁铁蛋白)自组装以形成纳米笼。
在一些方面，DR4和/或DR5抗原结合部分或生物活性部分(例如Fc片段)在纳米笼单体或其亚基的N端或C端处连接。在一些方面，存在在纳米笼单体或其亚基的N端处连接的第一DR4和/或DR5抗原结合部分和在C端处连接的第二DR4和/或DR5抗原结合部分，其中第一和第二DR4和/或DR5抗原结合部分相同或不同。
例如，在一些方面，融合蛋白包含纳米笼单体，并且DR4和/或DR5抗原结合部分在纳米笼单体的N端处连接。在其他方面，融合蛋白包含连接至DR4和/或DR5抗原结合部分的第一纳米笼单体亚基；其中第一纳米笼单体亚基能够与第二纳米笼单体亚基自组装以形成纳米笼单体。在其他方面，DR4和/或DR5抗原结合部分在第一纳米笼单体亚基的N端或C端处连接，或者存在在第一纳米笼单体或其亚基的N端处连接的第一DR4和/或DR5抗原结合部分和在C端处连接的第二DR4和/或DR5抗原结合部分。如将理解的，第一和第二DR4和/或DR5抗原结合部分可以相同或不同。
在一些方面，本文所述的第一纳米笼单体亚基与第二纳米笼单体亚基组合提供，其中第一纳米笼单体亚基能够与该第二纳米笼单体亚基自组装。第二纳米笼单体亚基可以是或可以不是融合蛋白。在一些方面，第二纳米笼单体亚基连接至生物活性部分，诸如Fc片段，任选地其中Fc片段是IgG1 Fc。
例如，在一些方面，融合蛋白包含连接至DR4和/或DR5抗原结合部分的第一纳米笼单体亚基。在使用中，第一纳米笼单体亚基与第二纳米笼单体亚基自组装以形成纳米笼单体。如上所述，多个纳米笼单体自组装以形成纳米笼。纳米笼单体亚基可以单独或组合提供，并且可以具有与其融合的相同或不同的DR4和/或DR5抗原结合部分或本文所述的另一生物活性部分。
除了一个或多个DR4和/或DR5抗原结合部分外，由本文所述的纳米笼单体和/或纳米笼单体亚基制成的纳米笼可以包含生物活性部分。生物活性部分可以是能够成为融合蛋白的一部分的任何部分，并且通常是蛋白质。通常，生物活性部分包含抗体或其片段、抗原、可检测部分、药剂、诊断剂或其组合。
例如，生物活性部分可以包含Fc片段的一条或两条链。在制备仅含有Fc片段的一条链的融合蛋白的情况下，纳米笼自组装将典型地导致功能性Fc片段的组装。在融合Fc片段的两条链的情况下，两条链典型地通过柔性接头连接以允许Fc片段的折叠。
Fc片段可以衍生自任何类型的抗体，如将理解的，但通常是IgG1 Fc片段。Fc片段可以进一步包含一个或多个突变，该突变调节所述融合蛋白和/或所得到的包含融合蛋白的组装的纳米笼的半衰期和/或效应子功能。例如，Fc片段可以在L234、L235、G236、G237、M252、I253、S254、T256、P329、A330、M428、N434或其组合(其中编号根据EU索引)的一个或多个处具有突变。例如，在一些实施方案中，Fc片段包含L234A、L235A、M252Y、I253A、S254T、T256E、P329G、M428L或N434S突变或其组合。在一些实施方案中，Fc片段包含突变组，诸如：M428L和N434S(“LS”)；M252Y、S254T和T256E(“YTE”)；L234A和L235A(“LALA”)；I253A和/或L234A、L235A和P329G(“LALAP”)、G236R、G237A、A330L或其组合。例如，包含如本文所述的一个或多个突变的Fc片段的半衰期可以是几分钟、几天、几周或甚至几个月的规模。
此外，考虑了本文所述的融合蛋白和纳米笼中的其他取代，包括Fc序列修饰和其他剂(例如人血清白蛋白、人血清白蛋白肽序列和靶向人血清白蛋白抗体诸如Fab和/或纳米抗体)的添加，其允许生物利用度的变化并且将被技术人员理解。此外，本文所述的融合蛋白和纳米笼可以在序列中进行调节，或通过添加其他剂以减弱免疫原性和抗药物应答(治疗剂，例如将序列与宿主匹配，或添加免疫抑制疗法[例如，诸如甲氨蝶呤，当施用英利昔单抗(infliximab)用于治疗类风湿性关节炎或诱导新生儿耐受时，这是减少抗FVIII抑制剂发生率的主要策略(综述于：DiMichele DM,Hoots WK,Pipe SW,Rivard GE,Santagostino E.International workshop on immune tolerance induction:consensusrecommendations.Haemophilia.2007；13:1–22，其通过引用整体并入本文])。
在抗体或其片段包含两条链的情况下，诸如在Fc片段情况下的第一链和第二链，或者重链和轻链，这两条链任选地通过接头分开。接头可以是柔性的或刚性的，但其通常是柔性的以允许链适当地折叠。接头通常足够长，以赋予融合蛋白一定的柔性，尽管将理解，接头长度将依赖纳米笼单体或其亚基和生物活性部分序列以及融合蛋白的三维构象而变化。因此，接头通常来自约1至约130个氨基酸残基，诸如约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120约125至约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130个氨基酸残基，诸如约50至约90个氨基酸残基，诸如70个氨基酸残基。
接头可以是任何氨基酸序列，并且在一个典型的实例中，接头包含一系列的G和S氨基酸，诸如一系列的GS重复、GGS重复、GGGS重复和/或GGGGS重复。典型地，接头包含GGGGS和/或GGGS重复，更典型地，接头包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个GGGS和/或GGGGS重复，诸如约5个GGGS重复和/或约14个GGGGS重复。在具体方面，接头包含与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
在典型的方面，抗体或其片段特异性结合至与DR4和/或DR5缔合的抗原。通常，抗原与DR4和/或DR5的胞外域缔合。
在具体实例中，抗体或其片段包含与以下序列的一个或多个至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下序列的一个或多个至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
Fc链1：
Fc链2：
可那木单抗轻链：
可那木单抗Fab重链：
或其组合。
在进一步的方面，融合蛋白与进一步的部分，诸如可检测部分(例如小分子、荧光分子、放射性同位素或磁性颗粒)、药剂、诊断剂或其组合缀合或缔合，并且可以包含例如抗体-药物缀合物。
在其中进一步的部分是可检测部分的方面，可检测部分可以包含荧光蛋白，诸如GFP、EGFP、Ametrine和/或基于黄素的荧光蛋白，诸如LOV-蛋白，诸如ILOV。
在其中进一步的部分是药剂的方面，药剂可以包含例如小分子、肽、脂质、碳水化合物或毒素。
在典型的方面，由本文所述的融合蛋白组装的纳米笼包含约3至约100个纳米笼单体，其中无一、一些或全部可以作为二分(bipartite)纳米笼单体亚基提供，诸如约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、55、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96或98至约4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、55、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98或100个纳米笼单体，诸如24、32或60个单体。纳米笼单体或其亚基可以是任何已知的天然、合成或部分合成的纳米笼单体，并且在一些方面选自铁蛋白、去铁铁蛋白、encapsulin、SOR、二氧四氢喋啶合酶、丙酮酸脱氢酶、羧酶体、穹窿蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P、MS2外壳蛋白、其片段及其变体。通常，纳米笼单体或其亚基是铁蛋白或去铁铁蛋白或其亚基。
当选择去铁铁蛋白作为纳米笼单体并且选择以亚基形式提供纳米笼单体时，典型地第一和第二纳米笼单体亚基可互换地包含去铁铁蛋白的“N”和“C”区。将理解，其他纳米笼单体可以被分成非常类似于本文所述的去铁铁蛋白的二分亚基，使得亚基自组装并且各自易于与生物活性部分融合。
典型地，去铁铁蛋白的“N”区包含与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
典型地，去铁铁蛋白的“C”区包含与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
或
在一些方面，本文所述的融合蛋白进一步包含非常类似于上述接头的纳米笼单体或其亚基与DR4和/或DR5抗原结合部分之间的接头。同样，接头可以是柔性的或刚性的，但典型地是柔性的，以允许生物活性部分保持活性并允许纳米笼单体或其亚基保持自组装特性。接头通常足够长，以赋予融合蛋白一定的柔性尽管将理解，接头长度将根据纳米笼单体或其亚基和DR4和/或DR5序列以及融合蛋白的三维构象而变化。因此，接头通常来自约1至约30个氨基酸残基，诸如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或9至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基，诸如约50至约90个氨基酸残基，诸如70个氨基酸残基。
接头可以是任何氨基酸序列的，并且在一个典型的实例中，接头包含一系列的G和S氨基酸，诸如一系列的GS重复、GGS重复、GGGS重复和/或GGGGS重复。典型地，接头包含GGGGS和/或GGGS重复，更典型地，接头包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个GGGS和/或GGGGS重复，诸如约5个GGGS重复和/或约14个GGGGS重复。在具体方面，接头包含与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
类似地，融合蛋白可以进一步包含用于改善融合蛋白的一种或多种属性的C端接头。在一些方面，C端接头，像上述接头一样，典型地包含一系列的G和S氨基酸，诸如一系列的GS重复、GGS重复、GGGS重复和/或GGGGS重复。典型地，接头包含GGS重复，并且更典型地，接头包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个GGS重复，诸如约8个GGS重复。在具体方面，C端接头包含与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
本文还描述了上述融合蛋白对，其中每对自组装以形成纳米笼单体，其中第一和第二纳米笼单体亚基与本文所述的不同DR4和/或DR5抗原结合部分和/或其他生物活性部分融合。这向由亚基对组装的单个纳米笼单体提供了多价性和/或多特异性。
纳米笼
本文还公开了包含至少一种本文所公开的融合蛋白的纳米笼，其中纳米笼由至少一种融合蛋白和另外的融合蛋白和/或纳米笼单体或其亚基，诸如铁蛋白链(例如人铁蛋白轻链)自组装。
本文还描述了纳米笼，其包含至少一种本文所述的融合蛋白和至少一种纳米笼单体或其亚基，该纳米笼单体或其亚基与融合蛋白自组装以形成纳米笼。此外，本文描述了融合蛋白对，其中该对自组装以形成纳米笼单体，并且其中第一和第二纳米笼单体亚基融合至不同的生物活性部分。
将理解，纳米笼可以由多个相同的融合蛋白、由多个不同的融合蛋白(并且因此是多价的和/或多特异性的)、由融合蛋白与野生型蛋白的组合、以及其任何组合自组装。例如，纳米笼可以用本文所述的融合蛋白的至少一种与至少一种抗DR4和/或DR5抗体组合进行内部和/或外部装饰。在一些方面，至少一个DR4和/或DR5抗原结合部分和至少一个Fc片段装饰纳米笼的外表面。在一些方面，至少两个DR4和/或DR5抗原结合部分和至少两个Fc片段装饰纳米笼的外表面。
在典型的方面，约20％至约80％的纳米笼单体或其亚基包含本文所述的融合蛋白。鉴于本文所述的模块化方案，纳米笼理论上可以包含多达两倍于纳米笼中单体的生物活性部分，因为每个纳米笼单体可以分为两个亚基，其中每个可以独立地结合至不同的生物活性部分。将理解，可以利用这种模块性来实现本文所述的生物活性部分的任何期望比率，在具体实例中至四种不同生物活性部分的4:2:1:1比率。
在一些实例中，本文所述的纳米笼可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个或更多个相同或基本相同或功能等同的DR4和/或DR5抗原结合部分的拷贝。在另外或替代实例中，本文所述的纳米笼可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个或更多个相同或基本相同或功能等同的生物活性部分诸如Fc片段的拷贝。在另外或替代实例中，本文所述的纳米笼可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个不同的DR4和/或DR5抗原结合部分和/或其他生物活性部分。以这种方式，纳米笼可以是多价的和/或多特异性的，并且其程度可以用本文所述的系统相对容易地控制。在一些实施方案中，纳米笼是多价的和多特异性的。
在一些方面，本文所述的纳米笼可以进一步包含至少一个整个纳米笼单体，其任选地融合至生物活性部分，生物活性部分可以与本文所述的连接至纳米笼单体亚基的生物活性部分相同或不同。
在一些方面，本文所述的纳米笼包含第一和第二融合蛋白，其各自包含融合至纳米笼单体或其亚基的不同DR4和/或DR5抗原结合部分，以及任选地第三融合蛋白，其包含融合至纳米笼单体或其亚基融合的生物活性部分，诸如Fc片段。
在一些实施方案中，第一、第二和第三融合蛋白各自包含融合至N-半铁蛋白或C-半铁蛋白的DR4和/或DR5抗原结合部分或生物活性部分或其一部分，其中第一、第二和第三融合蛋白的至少一种融合至N-半铁蛋白，并且第一、第二、第三融合蛋白的至少一种融合至C-半铁蛋白。
在一些实施方案中，第一和第二融合蛋白各自包含融合至完整去铁铁蛋白的DR4和/或DR5抗原结合部分。类似地，在一些实施方案中，第三蛋白包含融合至完整去铁铁蛋白的生物活性部分。将理解，设想完整纳米笼单体和纳米笼单体的亚基的组合用于本文所述的模块化纳米笼中。
尽管蛋白质可以包含任何数量或比率的融合蛋白，但在一些实施方案中，本文所述的纳米笼包含以下三种蛋白，任选以4:1:1的比率：
a.可那木单抗、替加组单抗、曲齐妥单抗、来沙木单抗、CM005G08、CM059H03、CM084A02、T1014A04、T1014G03、T1014A02、T1014A12、T1014B01、T1014Bll、T1014F08、T1014G04、T1015A02、T1015A07、T1006F07、42/43、44/45或46/47的DR4和/或DR5抗原结合部分，诸如Fab，诸如单链Fab(scFab)片段，其融合至第一全长人铁蛋白轻链；
b.Fc片段(任选地单链Fc(scFc)片段)，其融合至第二全长人铁蛋白轻链；
c.第三人铁蛋白轻链
在一些实施方案中，本文所述的纳米笼包含以下三种蛋白质，任选以2:1:1的比率：
a.可那木单抗、替加组单抗、曲齐妥单抗、来沙木单抗、CM005G08、CM059H03、CM084A02、T1014A04、T1014G03、T1014A02、T1014A12、T1014B01、T1014Bll、T1014F08、T1014G04、T1015A02、T1015A07、T1006F07、42/43、44/45或46/47的第一DR4和/或DR5抗原结合部分，诸如Fab片段，其融合至第一全长人铁蛋白轻链；
b.Fc片段(任选地单链Fc(scFc)片段)，其融合至人铁蛋白轻链的C-半。
C.可那木单抗、替加组单抗、曲齐妥单抗、来沙木单抗、CM005G08、CM059H03、CM084A02、T1014A04、T1014G03、T1014A02、T1014A12、T1014B01、T1014Bll、T1014F08、T1014G04、T1015A02、T1015A07、T1006F07、42/43、44/45或46/47的第二DR4和/或DR5抗原结合部分，诸如Fab，诸如单链Fab(scFab)片段，其融合至人铁蛋白轻链的N-半。在一些实施方案中，第二DR4和/或DR5抗原结合部分与第一DR4和/或DR5部分相同。在一些实施方案中，第二DR4和/或DR5抗原结合部分不同于第一DR4和/或DR5部分。
在一些方面，本文所述的纳米笼包含与以下序列的一个或多个至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由以下序列的一个或多个至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成，其中铁蛋白亚基为粗体且接头加下划线。虽然这些情况中的每一种中显示了完整铁蛋白单体(MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHD)，将理解，N-或C-铁蛋白或其他单体或其部分可以用于它的替代(在N-铁蛋白的情况下为MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEW且在C-铁蛋白的情况下为GKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHD)。
可那木单抗-hFerr:
/>
或
替加组单抗-hFerr
/>
或
来沙木单抗-hFerr
/>
或
曲齐妥单抗-hFerr
/>
或
CM005G08-hFerr
/>
或
CM059H03-hFerr
/>
或
CM084A02-hFerr
/>
或
T1014A04-hFerr
/>
或
T1014G03-hFerr
/>
或
T1014A02-hFerr
/>
或
T1014A12-hFerr
/>
或
T1014B01-hFerr
/>
或
T1014Bll-hFerr
或
T1014F08-hFerr
或
T1014G04-hFerr
或
T1015A02-hFerr
或
T1015A07-hFerr
或
T1006F07-hFerr
或
42/43-hFerr
或
44/45-hFerr
或
46/47-hFerr
或
Fc-hFerr LALAP I253A
或
hFerr
/>
或
本文还描述了包含纳米笼的组合物，诸如治疗性或防治性组合物。还描述了用于治疗和/或预防癌症的相关方法和用途，其中方法或用途包括将本文所述的纳米笼或组合物施用于有此需要的受试者。
一些方面，纳米笼能够以小于约0.1μg/ml、小于约0.01μg/ml、或小于约0.001μg/ml的IC50值杀伤DR4-和/或DR-5-阳性癌细胞，如在体外细胞杀伤测定中所确定的。在一些方面，纳米笼能够杀伤DR4-和/或DR-5-阳性癌细胞，具有小于约10pM，小于约5pM，小于约2pM、小于约1pM、小于约0.5pM、小于约0.4μM、小于约0.35pM、小于约0.25pM、小于约0.2pM、小于约0.15pM、小于约0.1pM或小于约0.05pM的IC50值，如在体外细胞杀伤测定中所确定的。
在另外或替代的方面，纳米笼能够以作为比参考分子(例如，对应的IgG)的IC50值低至少约10倍、至少约100倍、至少约1000倍、至少约2,000倍、至少约5,000倍、至少约10,000倍、至少约15,000倍、至少约20,000倍、至少约50,000倍、至少约75,000倍、至少约100,000倍、至少约150,000倍、至少约200,000倍、至少约250,000倍、至少约300,00倍或至少约400,000倍的IC50值杀伤DR4-和/或DR5-阳性癌细胞。换句话说，纳米笼以在质量和/或摩尔基础上比参考分子(例如，对应的IgG)更有力至少约10、至少约100、至少约1000、至少约2,000、至少约5,000、至少约10,000，至少约15,000、至少约20,000、至少约50,000、至少约75,000、至少约100,000、至少约150,000、至少约200,000、至少约250,000或至少约400,000倍。
将理解，还设想了与本文所述的那些基本上相同的多肽。基本上相同的序列可以包含一个或多个保守氨基酸突变。本领域已知，对参考序列的一个或多个保守氨基酸突变可以产生与参考序列相比在生理、化学或功能特性上没有实质性变化的突变肽；在此类情况下，参考和突变序列将被认为是“基本上相同的”多肽。保守氨基酸突变可以包含氨基酸的添加、缺失或取代；保守氨基酸取代在本文中定义为用具有相似化学特性(例如大小、电荷或极性)的另一氨基酸残基取代一个氨基酸残基。
在非限制性实例中，保守突变可以是氨基酸取代。此类保守氨基酸取代可以另一相同基团取代碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸。术语“碱性氨基酸”是指具有pK值大于7的侧链的亲水性氨基酸，其通常在生理pH带正电荷。碱性氨基酸包含组氨酸(His或H)、精氨酸(Arg或R)和赖氨酸(Lys或K)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)是指具有在生理pH不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，但其具有至少一个键，该键中由两个原子共同享有的电子对被其中一个原子结合得更紧密。极性氨基酸包含丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)。术语“疏水性氨基酸”(也称为“非极性氨基酸”)是指包含根据Eisenberg(1984)的标准化共识疏水性等级显示大于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包含脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(Ile或I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)和甘氨酸(Gly或G)。
“酸性氨基酸”是指具有pK值小于7的侧链的亲水性氨基酸，其通常在生理pH带负电荷。酸性氨基酸包含谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。
序列同一性用于评估两个序列的相似性；其通过计算当两个序列为了残基位置之间的最大对应性对齐时的相同残基的百分比来确定。可以使用任何已知的方法来计算序列同一性；例如，计算机软件是可用的以计算序列同一性。在不希望是限制性的情况下，序列同一性可以通过软件计算，诸如由Swiss Institute of Bioinformatics维护的NCBIBLAST2服务(并且可以在ca.expasy.org/tools/blast/找到)、BLAST-P、BLAST-N或FASTA-N，或本领域已知的任何其他合适的软件。
本发明的基本上相同的序列可以至少85％相同；在另一实例中，基本上相同的序列可以在氨基酸水平上与本文所述的序列至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％(或其间的任何百分比)相同。在具体的方面，基本上相同的序列保留参考序列的活性和特异性。在非限制性实施方案中，序列同一性的差异可以是由于保守氨基酸突变所致。
本发明的多肽或融合蛋白还可以包含其他序列以帮助其表达、检测或纯化。可以使用本领域技术人员已知的任何此类序列或标签。例如，且在不希望是限制性的情况下，融合蛋白可以包含靶向或信号序列(例如，但不限于ompA)、检测标签、示例性标签盒(tagcassette)包含Strep标签，或其任何变体；参见，例如，美国专利No.7,981,632、His标签、具有序列基序DYKDDDDK的Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、SBP标签、Softag1、Softag3、V5标签、CREB-结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、绿色荧光蛋白(GFP)、硫氧还蛋白标签，或其任何组合；纯化标签(例如，但不限于His5或His6)，或其组合。
在另一实例中，另外的序列可以是生物素识别位点，诸如Cronan等在WO 95/04069中或Voges等在WO/2004/076670中所描述的。如本领域技术人员还已知的，接头序列可以与另外的序列或标签结合使用。
更具体地，标签盒可以包含能够以高亲和力或亲合力特异性结合至抗体的细胞外组分。在单链融合蛋白结构内，标签盒可以位于(a)紧接连接头区的氨基端，(b)插入在接头模块之间并连接接头模块，(c)紧接结合域的羧基端，(d)插入在结合域(例如scFv或scFab)与效应子域之间并连接结合域(例如scFv或scFab)至效应子域，(e)插入在结合域的亚基之间并连接结合域的亚基，或(f)单链融合蛋白的氨基端处。在某些实施方案中，一个或多个连接氨基酸可以配置在标签盒与疏水部分之间并将其连接，或配置在标签盒与连接头区之间并将其连接，或配置在标签盒与接头模块之间并将其连接，或配置在标签盒与结合域之间并将其连接。
本文还涵盖使用各种方法固定化在表面上的分离或纯化的融合蛋白、多肽或其片段；例如，并且在不希望是限制性的情况下，多肽可以通过His-标签偶联、生物素结合、共价结合、吸附等连接或偶联到表面。固体表面可以是任何合适的表面，例如但不限于微量滴定板的孔表面、表面等离子体共振(SPR)传感器芯片的通道、膜(membrane)、珠(诸如基于磁性或基于琼脂糖的珠或其他层析树脂)、玻璃、薄膜(film)或任何其他有用的表面。
在其他方面，融合蛋白可以连接至货物分子；融合蛋白可将货物分子递送至期望位点，并可使用本领域已知的任何方法(重组技术、化学缀合、螯合等)连接至货物分子。货物分子可以是任何类型的分子，例如治疗剂或诊断剂。
在一些方面，货物分子是蛋白质并且融合至融合蛋白，使得货物分子含在纳米笼内部。在其他方面，货物分子不融合至融合蛋白，并且含在纳米笼内部。货物分子通常是蛋白质、小分子、放射性同位素或磁性颗粒。
本文所述的融合蛋白特异性结合到其靶标。抗体特异性，是指抗体对抗原的特定表位的选择性识别，本文所述抗体或片段的抗体特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。亲和力，由抗原与抗体解离的平衡常数(KD)表示，其测量抗原决定簇(表位)与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间结合强度的测量。抗体通常以10-5至10- 11M的KD结合。任何大于10-4M的KD通常被认为指示非特异性结合。KD值越小，抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度越强。在一些方面，本文所述的抗体具有小于10-4M、10-5M、10- 6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M或10-15M的KD。
本文还描述了编码本文所述融合蛋白和多肽的核酸分子，以及包含核酸分子的载体和包含载体的宿主细胞。
编码本文所述融合蛋白的多核苷酸包含具有与本发明的多核苷酸的核酸序列基本上相同的核酸序列的多核苷酸。“基本上相同”的核酸序列在本文中定义为当两个序列最佳对齐(具有适当的核苷酸插入或缺失)并比较以确定两个序列之间核苷酸的精确匹配时，与另一核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％同一性的序列。
编码抗体片段的多核苷酸的合适来源包含表达全长抗体的任何细胞，诸如杂交瘤和脾细胞。如上所述，片段本身可以用作抗体等同物，或者可以重组成等同物。本小节所述的DNA缺失和重组可以通过已知方法进行，诸如上面标题为“抗体的功能等同物”的小节中列出的公开专利申请中所述的那些和/或其他标准重组DNA技术，诸如下面所述的那些。DNA的另一来源是由噬菌体展示文库产生的单链抗体，如本领域已知的。
另外，提供了表达载体，其含有先前所述的可操作地连接到表达序列、启动子和增强子序列的多核苷酸序列。已经开发用于在原核(诸如细菌)和真核系统(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养系统)中高效合成抗体多肽的多种表达载体。本发明的载体可以包含染色体、非染色体和合成DNA序列的区段。
可以使用任何合适的表达载体。例如，原核克隆载体包含来自大肠杆菌(E.coli)的质粒，诸如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体还包含噬菌体DNA的衍生物，诸如Ml3和其他丝状单链DNA噬菌体。在酵母中有用的载体的示例是2μ质粒。用于哺乳动物细胞中表达的合适载体包含众所周知的SV-40的衍生物、腺病毒、逆转录病毒衍生的DNA序列和衍生自功能性哺乳动物载体(诸如上述那些)与功能性质粒和噬菌体DNA的组合的穿梭载体。
另外的真核表达载体是本领域已知的(例如，P J.Southern&P.Berg,J.Mol.Appl.Genet,1:327-341(1982)；Subramani et al,Mol.Cell.Biol,1:854-864(1981)；Kaufman&Sharp,"Amplification And Expression of Sequences Cotransfectedwith a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene,"J.Mol.Biol,159:601-621(1982)；Kaufman&Sharp,Mol.Cell.Biol,159:601-664(1982)；Scahill etal.,"Expression And Characterization Of The Product Of AHuman ImmuneInterferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells,"Proc.Nat'l Acad.Sci USA,80:4654-4659(1983)；Urlaub&Chasin,Proc.Nat'l Acad.Sci USA,77:4216-4220,(1980)，其中所有通过引用并入本文)。
表达载体通常含有至少一个表达控制序列，该表达控制序列与待表达的DNA序列或片段可操作地连接。将控制序列插入载体中以控制和调节克隆DNA序列的表达。有用的表达控制序列的示例是lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵基因(operator)和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、酵母的糖酵解启动子(例如用于3-磷酸甘油酸激酶的启动子)、酵母酸性磷酸酶的启动子(例如Pho5)、酵母α-交配因子的启动子和衍生自多瘤、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子，例如早期和晚期启动子或SV40，和已知控制原核或真核细胞及其病毒的基因表达的其他序列，或其组合。
本文还描述了含有先前描述的表达载体的重组宿主细胞。本文所述的融合蛋白可以在不同于杂交瘤的细胞系中表达。包含编码根据本发明多肽的序列的核酸可以用于合适的哺乳动物宿主细胞的转化。
基于感兴趣蛋白的高水平表达、组成型表达和来自宿主蛋白的最小污染来选择特别优选的细胞系。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包含许多永生化(immortalized)细胞系，例如但不限于HEK 293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和许多其他的。合适的另外真核细胞包含酵母和其他真菌。有用的原核宿主包含，例如，大肠杆菌，诸如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB 101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRC1、大肠杆菌T7 shuffle、假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和链霉菌(Streptomyces)。
通过在允许多肽表达的条件下培养细胞并从宿主细胞或宿主细胞周围的培养基中纯化多肽，这些重组宿主细胞可用于生产融合蛋白。通过在感兴趣抗体-编码基因的5’末端处插入信号或分泌前导肽-编码序列，可以促进表达的多肽在重组宿主细胞中分泌的靶向(参见，Shokri et al,(2003)Appl Microbiol Biotechnol.60(6):654-664,Nielsen etal,Prot.Eng.,10:1-6(1997)；von Heinje et al.,Nucl.Acids Res.,14:4683-4690(1986)，其中所有通过引用并入本文)。这些分泌前导肽元件可以衍生自原核或真核序列。因此，适当地使用分泌前导肽，其是连接到多肽的N端末端的氨基酸，以指导多肽移动出宿主细胞胞质溶胶(cytosol)并分泌到培养基中。
本文所述的融合蛋白可以融合至其他氨基酸残基。例如，此类氨基酸残基可以是肽标签以促进分离。还设想了用于将抗体归巢至特定器官或组织的其他氨基酸残基。
将理解，Fab-纳米笼可以例如通过质粒的共转染来产生，一个编码包含融合至铁蛋白链(例如铁蛋白轻链)的Fab重链的融合蛋白，另一个编码Fab轻链。替代地，可以使用仅需要转染一种质粒的单链Fab-铁蛋白纳米笼(例如，使用编码包含Fab轻链、Fab重链和铁蛋白链(例如，铁蛋白轻链)的融合蛋白的质粒)。这可以用Fab轻链和Fab重链之间的不同长度的接头(例如60或70个氨基酸)来完成。当使用单链Fab时，可以确保重链和轻链是成对的。标签(例如Flag、HA、myc、His6x、Strep等)也可以在构建体的N端处或接头内添加，以便于如上所述的纯化。此外，当不同的Fab-纳米颗粒质粒被共转染时，使用串行/附加亲和层析步骤，可以使用标签系统以确保许多不同的Fab存在于相同的纳米颗粒上。这对纳米颗粒提供多特异性。如果期望，可以插入蛋白酶位点(例如TEV、3C等)以在表达和/或纯化后切割接头和标签。
可以使用任何合适的方法或途径以施用本文所述的融合蛋白。施用途径包含例如口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用。
应当理解，在为了防治或治疗目的在哺乳动物中使用的情况下，本文所述的融合蛋白将以另外包含药学上可接受的载剂的组合物的形式施用。合适的药学上可接受的载剂包含，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等的一种或多种，以及其组合。药学上可接受的载剂可以进一步包含少量的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强结合蛋白的保存期或有效性。如本领域众所周知的，可以配制注射的组合物以便在施用于哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
尽管本文所述的融合肽和Multabody对于施用于人特别有用，但它们也可以施用于其他哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”旨在包括但不限于人、实验室动物、家养宠物和农场动物。
以上公开概括地描述了本发明。通过参考以下具体实施例可以获得更完整的理解。除非另有说明，否则这些实施例仅出于说明目的提供，而不意图限制。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
以下实施例不包含常规方法的详细描述，常规方法诸如在载体和质粒的构建、将编码多肽的基因插入此类载体和质粒或将质粒引入宿主细胞中所采用的那些。此类方法是本领域普通技术人员公知的，并且在许多出版物中进行了描述，包含ambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press，其通过引用并入本文。
在没有进一步描述的情况下，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实施例来制备和利用本发明的化合物，并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出本发明的典型的方面，并且不被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例
实施例1：抗体多聚化增强DR5可那木单抗和替加组单抗抗体针对不同肿瘤细胞的细胞毒性能力，达到ng/ml(pM)范围的IC50值。
材料和方法
Multabody(MB)的蛋白表达和纯化
所有基因由GeneArt(Life Technologies)合成并克隆到pcDNA3.4表达载体中。使用ExpiFectamine CHO(Thermo Fisher Scientific)以4:1:1的比率(scFab-人轻链去铁铁蛋白：scFc-humab轻链去铁铁蛋白：人轻链去铁铁蛋白)，在6x106个细胞/mL的密度(每100mL的细胞具有60μg DNA)的ExpiCho-S细胞(ThermoFisherScientific)中瞬时表达Multabody。在分裂铁蛋白MB的情况下，通过缺失人去铁铁蛋白轻链的残基1至90(C-铁蛋白)和91至175(N-铁蛋白)生成编码连接至一半去铁铁蛋白的scFab和scFc片段的基因。
通过以2:1:1的比率混合67.5μg的质粒scFab-人轻链去铁铁蛋白：scFc-人C-人轻链去铁铁蛋白：scFab-N-人轻链去铁铁蛋白，获得Expicho-S细胞(Thermo FisherScientific)细胞中分裂MB的瞬时转染。过滤DNA混合物并在室温下与67.5μl的ExpiFectamine CHO(Thermo Fisher Scientific)温育，然后添加到细胞培养物。转染后一天，向细胞中添加24ml的ExpiCHO Feed和0.6ml的ExpiFectamine增强剂，并在MultitronPro振动器(Infors HT)中在37℃、8％CO2和80％湿度下以125rpm振荡再培养7天。使用ExpiCHO表达培养基(Thermo Fisher Scientific)和开口型无挡板锥形摇瓶(Corning)。通过在5000xg离心15分钟收获细胞悬浮物，并通过0.22μm Steritop过滤器(EMD Millipore)过滤上清液。
IgG通过以1:2的比率共转染90μg的LC和HC进行瞬时表达，并用100mM甘氨酸pH2.2作为洗脱缓冲液使用HiTrap Protein A HP柱(GE Healthcare)进行纯化。洗脱的级分立即用1M Tris-HCl(pH 9.0)中和，并使用Superdex 200Increase尺寸排阻柱(GEHealthcare)进一步纯化。使用HiTrap Protein A HP柱(GE Healthcare)用3M MgCl2 10％甘油通过亲和层析纯化MultaBody，并将洗脱的部分装载到在20mM磷酸钠pH 8.0、150mMNaCl中的Superose 6 10/300GL尺寸排阻柱(GE Healthcare)上。
细胞存活力测定
NCI-H2122、NIC-H2228和Colo205 11细胞系在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Sigma)中生长。MBA-MB-231、HT29和HT15细胞系在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco，Invitrogen)中生长。SW948细胞系在补充有10％胎牛血清的Leibovitz’s L-15培养基中生长(100％空气)。Capan-1细胞系在补充有20％胎牛血清的Iscove的改良的Dulbecco’s培养基中生长。
将100μl培养基中的5,000个细胞/孔的每个癌细胞系与100μl的MultaBody或IgG的10倍连续稀释物在37℃下共培养。温育24小时后，通过向200μl的含有细胞的培养基中添加50μl的CellTiter-Glo 2.0试剂(Promega)监测细胞存活力。温育10分钟后，将100μl转移至96孔黑色板(Sigma-Aldrich)，以使用Synergy NeO2多模式测定微孔板读取器(BiotekInstruments)测量以相对光单位(RLU)计的发光。
结果
如图1所示，MultaBody组装展示靶向三聚体受体的Fab。显示与常规可那木单抗IgG(左)相比的Multabody价(右)的示意性代表。Fab(重链为暗红色且轻链为浅红色)簇集在铁蛋白的三重对称轴(浅青色)上的特写视图。金色的片段代表Fc片段。替加组单抗MB以4:1:1比率的以下组分通过DNA共转染生成：scFab-人轻链去铁铁蛋白：scFc-humab轻链去铁铁蛋白：humab轻链去铁铁蛋白。如图2A所示，scFab和scFc均融合至完整人轻链去铁铁蛋白的N端。
可那木单抗MB以2:1:1比率的以下组分通过DNA共转染产生：scFab-人轻链去铁铁蛋白：scFc-人C-人轻链去铁铁蛋白：scFab-N-人轻链去铁铁蛋白。如图3A所例示，scFab融合至完整和N半的人轻链去铁铁蛋白的N端，并且scFc融合至人轻链去铁铁蛋白的C半的N端。此设计确保scFab将始终围绕自组装的去铁铁蛋白的三重轴，并因此最佳地接合三聚体受体。
如图2、3和表1所示，亲合力增强针对多种癌细胞系的细胞死亡。以Multabody形式的可那木单抗和替加组单抗与亲本IgG对多种癌细胞系的相对杀伤能力汇总于表1中。值得注意的是，测试的大多数癌细胞对替加组单抗IgG杀伤具有抗性(测试的IC50值>10μg/mL)。然而，当替加组单抗的Fab区在MB中多聚化时，在肺癌细胞系NCI-H2122的情况下达到低至0.00013ng/mL(0.06pM)的IC50值。与亲本IgG相比，MB导致多于27,000倍的效力增强(以质量计)和多于418,000倍的效力增强(以摩尔计)。在可那木单抗Multabody的情况下，在癌细胞系组间获得相似的IC50值。亲本可那木单抗IgG总体上显示出比替加组单抗IgG更高的效力。
表1
实施例2：DR5靶向多抗体在异种移植小鼠模型中的治疗效果
在结肠癌异种移植模型中评价示例性Multabody的治疗效果。将5x106个人结肠癌细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠的胁腹(每组n＝12)。具有已建立肿瘤的小鼠经由每周一次的腹膜内(i.p.)注射接受治疗或媒介物对照，持续两周。使用卡尺每周两次测量肿瘤体积。图5显示了研究开始后第88天的肿瘤体积。用DR5 MB治疗显著抑制已建立肿瘤的肿瘤生长。DR5 MB比DR5 IgG更强地抑制肿瘤生长。
序列表
融合序列内的下划线表示接头序列。
融合序列内的粗体表示铁蛋白或铁蛋白亚基序列。
加框和加粗残基表示相对于参考分子(例如相对于IgG1 Fc)突变的残基。
hFTL
N_hFTL
C_hFTL
IgG1 Fc
IgG1 scFc
Cona LC
Cona HC
Cona scFab
/>
Claims (68)
1.融合蛋白，其包含连接至DR4和/或DR5抗原结合部分的纳米笼单体或其亚基，其中多个所述融合蛋白自组装以形成纳米笼。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述DR4和/或DR5抗原结合部分靶向所述DR4和/或DR5胞外域。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述DR4和/或DR5抗原结合部分装饰所述组装的纳米笼的内表面和/或外表面，优选地外表面。
4.权利要求1至3中任一项的融合蛋白，其中所述DR4和/或DR5抗原结合部分包含抗体或其片段。
5.权利要求4的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包含Fab片段。
6.权利要求4的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包含scFab片段、scFv片段、sdAb片段、纳米抗体、VHH域或其组合。
7.权利要求4的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包含Fab片段的重链和/或轻链。
8.权利要求4至7中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含DR4抗原结合部分。
9.权利要求8的融合蛋白，其中所述DR4抗原结合部分包含CM005G08、CM059H03、CM084A02、T1014A04、T1014G03、T1014A02、T1014A12、T1014B01、T1014Bll、T1014F08、T1014G04、T1015A02、T1015A07、T1006F07、42/43、44/45和/或46/47的DR4抗原结合部分。
10.权利要求4至9中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含DR5抗原结合部分。
11.权利要求10的融合蛋白，其中所述DR5抗原结合部分包含替加组单抗、来沙木单抗、曲齐妥单抗和/或可那木单抗的抗原结合部分。
12.权利要求11的融合蛋白，其中所述DR5抗原结合部分包含可那木单抗的抗原结合部分。
13.权利要求1至12中任一项的融合蛋白，其中所述DR4和/或DR5抗原结合部分在所述纳米笼单体或其亚基的N端或C端处连接，或者其中存在在所述纳米笼单体或其亚基的N端处连接的第一DR4和/或DR5抗原结合部分和在C端处连接的第二DR4和/或DR5抗原结合部分，其中所述第一和第二DR4和/或DR5抗原结合部分相同或不同。
14.权利要求13的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含纳米笼单体，并且所述DR4和/或DR5抗原结合部分在所述纳米笼单体的N端处连接。
15.权利要求1至14中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含连接至所述DR4和/或DR5抗原结合部分的第一纳米笼单体亚基；其中所述第一纳米笼单体亚基能够与第二纳米笼单体亚基自组装以形成所述纳米笼单体。
16.权利要求15的融合蛋白，其中所述DR4和/或DR5抗原结合部分在所述第一纳米笼单体亚基的N端或C端处连接，或者其中存在在所述第一纳米笼单体亚基的N端处连接的第一DR4和/或DR5抗原结合部分和在C端处连接的第二DR4和/或DR5抗原结合部分，其中所述第一和第二DR4或/和DR5抗原结合部分相同或不同。
17.权利要求15或16的融合蛋白，其与所述第二纳米笼单体亚基组合。
18.权利要求15至17中任一项的融合蛋白，其中所述第二纳米笼单体亚基在N端或C端处连接至生物活性部分。
19.权利要求18的融合蛋白，其中所述生物活性部分包含Fc片段。
20.权利要求19的融合蛋白，其中所述Fc片段是IgG1 Fc片段。
21.权利要求19或20的融合蛋白，其中所述Fc片段包含一个或多个突变或突变组，所述一个或多个突变或突变组调节所述融合蛋白的半衰期例如从数分钟或数小时至数天、数周或数月。
22.权利要求21的融合蛋白，其中所述Fc片段包含在L234、L235、G236、G237、M252、I253、S254、T256、P329、A330、M428、N434或其组合(其中编号是根据EU索引)的一个或多个处的突变，诸如M428L和N434S(“LS”)；M252Y、S254T和T256E(“YTE”)；L234A和L235A(“LALA”)；I253A和/或L234A、L235A和P329G(“LALAP”)、G236R、G237A、A330L或其组合。
23.权利要求19至22中任一项的融合蛋白，其中所述Fc片段是scFc片段。
24.权利要求19的融合蛋白，其中所述Fc片段包含与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
25.权利要求1至24中任一项的融合蛋白，其中约3至约100个纳米笼单体，诸如24、32、48或60个单体，或约4至约200个纳米笼单体亚基，诸如4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或更多个亚基，任选地与一个或多个整个纳米笼单体组合，能够自组装以形成纳米笼。
26.权利要求1至25中任一项的融合蛋白，其中所述纳米笼单体选自铁蛋白、去铁铁蛋白、encapsulin、SOR、二氧四氢喋啶合酶、丙酮酸脱氢酶、羧酶体、穹窿蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P、MS2外壳蛋白、其片段及其变体。
27.权利要求26的融合蛋白，其中所述纳米笼单体是去铁铁蛋白，任选地人去铁铁蛋白。
28.权利要求26的融合蛋白，其中所述纳米笼单体是去铁铁蛋白轻链，任选地人去铁铁蛋白轻链。
29.权利要求27或28的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含第一去铁铁蛋白亚基，任选地第一人去铁铁蛋白亚基，并且其中所述第一去铁铁蛋白亚基能够与第二去铁铁蛋白亚基自组装。
30.权利要求29的融合蛋白，其中所述第一和第二去铁铁蛋白单体亚基可互换地包含去铁铁蛋白的“N”区和“C”区。
31.权利要求30的融合蛋白，其中所述去铁铁蛋白的“N”区包含与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEG VSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEW。
32.权利要求30或31的融合蛋白，其中所述去铁铁蛋白的“C”区包含与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
GKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHD或
GKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD。
33.权利要求1至32中任一项的融合蛋白，其进一步包含生物活性部分和在所述纳米笼单体或其亚基与所述生物活性部分之间的任选接头。
34.权利要求33的融合蛋白，其中所述接头是柔性的或刚性的，并且包含约1至约30个氨基酸残基，诸如约8至约16个氨基酸残基。
35.权利要求33或34的融合蛋白，其中所述接头包含GGGGS重复，诸如1、2、3、4或更多个GGGGS重复。
36.权利要求35的融合蛋白，其中所述接头包含与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG。
37.权利要求1至36中任一项的融合蛋白，其进一步包含C端接头。
38.权利要求37的融合蛋白，其中所述C端接头包含GGS重复。
39.权利要求38的融合蛋白，其中C端接头包含与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列或由与以下至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列组成：
GGSGGSGGSGGSGGGSGGSGGSGGSG。
40.纳米笼，其包含至少一个权利要求1-39中任一项的融合蛋白和至少一个与所述融合蛋白自组装的第二纳米笼单体或其亚基。
41.权利要求40的纳米笼，其中所述融合蛋白包含第一纳米笼单体亚基，所述第二纳米笼单体或其亚基是第二纳米笼单体亚基，并且所述第二纳米笼单体亚基与所述融合蛋白自组装以形成所述纳米笼单体。
42.权利要求40或41的纳米笼，其中每个纳米笼单体包含权利要求1-39任一项的融合蛋白。
43.权利要求40至42中任一项的纳米笼，其中约1％至约100％，诸如约1％、4％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％至约4％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，诸如约20％至约80％的所述纳米笼单体或其亚基包含权利要求1至38中任一项的融合蛋白。
44.权利要求40至43中任一项的纳米笼，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的DR4和/或DR5抗原结合部分，诸如2或3个不同的DR4和/或DR5抗原结合部分。
45.权利要求40至44中任一项的纳米笼，其中所述纳米笼是多价的。
46.权利要求40至45中任一项的纳米笼，其中所述纳米笼是多特异性的。
47.权利要求40至46中任一项的纳米笼，其中至少一个DR4和/或DR5抗原结合部分装饰所述纳米笼的外表面，并且至少一个Fc片段装饰所述纳米笼的外表面。
48.权利要求47的纳米笼，其中至少两个DR4和/或DR5抗原结合部分装饰所述纳米笼的外表面，并且至少两个Fc片段装饰所述纳米笼的外表面。
49.权利要求40至48中任一项的纳米笼，其包含4:1:1比率的融合至第一全长人铁蛋白轻链的可那木单抗的抗原结合部分，诸如Fab片段；融合至第二全长人铁蛋白轻链的Fc片段(任选地scFc片段)；和第三人铁蛋白轻链。
50.权利要求40至49中任一项的纳米笼，其包含融合至完整铁蛋白单体的N端的至少一个DR4和/或DR5抗原结合部分、融合至N-铁蛋白单体亚基的N端的至少一个DR4和/或DR5抗原结合部分，以及融合至C-铁蛋白单体亚基的N端的Fc片段。
51.权利要求50的纳米笼，其包含2:1:1比率的融合至所述完整铁蛋白单体的N端的所述DR4和/或DR5抗原结合部分：融合至所述N-铁蛋白单体亚基的N端的所述DR4和/或DR5抗原结合部分：融合至所述C-铁蛋白单体亚基的N端的所述Fc片段。
52.权利要求40至51中任一项的纳米笼，其包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个DR4和/或DR5抗原结合部分。
53.权利要求40至52中任一项的纳米笼，其包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个生物活性部分。
54.权利要求40至53中任一项的纳米笼，其携带货物分子，诸如药剂、诊断剂和/或显像剂。
55.权利要求54的纳米笼，其中所述货物分子不与所述融合蛋白融合，并且包含在所述纳米笼内部。
56.权利要求54的纳米笼，其中所述货物分子是蛋白质，并且融合至所述融合蛋白，使得所述货物分子包含在所述纳米笼内部。
57.权利要求54至56中任一项的纳米笼，其中所述货物分子包含荧光蛋白，诸如GFP、EGFP、Ametrine和/或基于黄素的荧光蛋白，诸如LOV-蛋白诸如iLOV。
58.权利要求40至57中任一项的纳米笼，其中所述纳米笼能够以小于约0.1μg/ml、小于约0.01μg/ml或小于0.001μg/ml的IC50值杀伤DR4和/或DR-5阳性癌细胞，如体外细胞杀伤测定中确定的。
59.权利要求40至58中任一项的纳米笼，其中所述纳米笼能够以小于约10pM、小于约1pM或小于约0.1pM的IC50值杀伤DR4和/或DR-5阳性癌细胞，如体外细胞杀伤测定中确定的。
60.权利要求40至59中任一项的纳米笼，其中所述纳米笼能够以在质量和/或摩尔基础上比相应的IgG更有力至少约10、至少约100、至少约1000、至少约10,000或至少约100,000的IC50值杀伤DR4-和/或DR-5阳性癌细胞。
61.DR4和/或DR5治疗性或防治性组合物，其包含权利要求40-60中任一项的纳米笼。
62.核酸分子，其编码权利要求1至39中任一项的融合蛋白。
63.载体，其包含权利要求62的核酸分子。
64.宿主细胞，其包含权利要求63的载体，并产生权利要求1至39中任一项的融合蛋白。
65.用于治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括施用权利要求40至60中任一项的纳米笼或权利要求61的组合物。
66.权利要求65的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤或肺癌。
67.权利要求40至60中任一项的纳米笼或权利要求60的组合物用于治疗和/或预防癌症的用途。
68.权利要求40至60中任一项的纳米笼或权利要求61的组合物，其用于治疗和/或预防癌症。
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