SI23902A - Samosestavljivi polipeptidni poliedri - Google Patents
Samosestavljivi polipeptidni poliedri Download PDFInfo
- Publication number
- SI23902A SI23902A SI201100402A SI201100402A SI23902A SI 23902 A SI23902 A SI 23902A SI 201100402 A SI201100402 A SI 201100402A SI 201100402 A SI201100402 A SI 201100402A SI 23902 A SI23902 A SI 23902A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- polypeptide
- glu
- lys
- leu
- segments
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
Izum se nanaša na polipeptidno verigo, ki se je sposobna sestaviti v polieder s samosestavljanjem, na poliederske nanostrukture, ki se samosestavijo iz ene polipeptidne verige, na postopke za pripravo samosestavljivih poliedrov iz polipeptidnih verig, katere sestavljajo segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice. Segmenti so povezani v točno določenem vrstnem redu, ki omogoča tvorbo dimerov, ki predstavljajo robove polipeptidnih poliedrov iz ene polipeptidne verige. Definirano zaporedje povezanih segmentov omogoča samosestavljanje v definirane poliederske nanostrukture, kot je npr. polipeptidni tetraeder.
Description
Izum se nanaša na polipeptide, ki lahko s samosestavljanjem tvorijo poliederske nanostrukture, na poliedre iz polipeptidov, na fuzijske polipeptide, ki so sestavljeni iz polipeptida, ki se sestavi v polieder, in funcionalnega polipeptida, na DNK, ki kodira za takšne polipeptide ali fuzijske polipeptide, na metodo, s katero tvorimo polipeptidne poliedre, na metodo, ki se nanaša na tretiranje in diagnosticiranje pri človeku in živalih, pri čemer uporabimo te polipeptide, na uporabo takšnih polipeptidov za različne aplikacije.
Ozadje izuma
V zadnjem času večkrat poročajo, da so uspeli s pomočjo DNK manipulacije izgraditi umetne strukture v nanometrskem merilu, pri čemer izkoriščajo preprosto bazno parjenje za nastanek DNK dupleksov. Načrtovane nanostrukture, sestavljene iz prepletenih komplementarnih nukleotidnih segmentov, predstavljajo gradnike, ki nadalje izgradijo takšno strukturo. Strukture, zgrajene iz DNK, vključujejo geometrijska telesa, kot so tetraeder, kocka, oktaeder, dodekaeder ali buckyball, ter dvo-dimenzionalno tetragonalno ali heksagonalno mrežo (He, Ye, Su, Zhang, Ribbe, Jiang in Mao, Nature, 452:198-202,2008), in različne vzorce, pridobljene z DNK origami tehniko.
Opis izuma
Izum omogoča naslednje rešitve za izboljšave glede na objekte, na katere se nanaša:
1. Polipeptid, ki se samosestavi v polieder, pri čemer je polipeptid sestavljen vsaj iz 12 z linkerjem povezanih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice. Pri tem je vsak rob poliedra sestavljen iz para omenjenih segmentov, pri čemer par segmentov tvori ovito vijačnico.
Po možnosti polipeptid tvori zaprto pot preko robov poliedra. Nadalje, povezovalni segment (linker) naj ne tvori heliksa.
Strukture in funkcionalne naprave v naravi pretežno temeljijo na polipeptidih in so veliko bolj kompleksne in tehnološko uporabljive od tistih, ki temeljijo na osnovi nukleinskih kislin. Polipeptidi so bolj stabilni kot nukleinske kisline in so, zaradi dvajsetih različnih aminokislin v
-2primerjavi z le štirimi različnimi nukleotidi, tudi bolj raznovrstni glede na kemijske lastnosti. Zato predstavlja uporaba polipeptidov za samosestavljene nanostrukture prednost, saj imajo lahko pridobljeni nanomateriali lahko dodatne tehnološke lastnosti, kar vključuje večjo stabilnost, raznolikost terciarnih struktur, uvedbo katalitski mest, inženiring posebnih interakcij/prepoznavnih mest, uvedbo posebnih optičnih, električnih ali mehanskih lastnosti.
Vsak par segmentov tvori ovito vijačnico, ki je linearna in rigidna struktura, in kot takšna zelo primerna za izgraditev roba poliedra. Zvitje polipeptida v poliederno strukturo poveča stabilnost strukture v primerjavi z DNK poliedrom. Podobno velja, da je polipeptidni polieder iz ene polipeptidne verige bolj stabilen, kot če je izgrajen iz večih (nepovezanih) polipeptidov, predvsem zaradi kovalentne povezave med segmenti.
Polieder ima definirano strukturo in hidrodinamski premer, saj ima visoko simetrijo. Te strukture lahko tako enostavno očistimo ali ločimo od ostalih molekul zaradi njihovih enotnih fizikalnih in kemijskih lastnosti. Poliedri imajo specifično tridimenzionalno obliko, kar je pomembno pri načrtovanju novih struktur in materialov. Polipeptidni poliedri omogočajo natančno pozicioniranje funkcionalnih skupin, kar je pomembno pri načrtovanju novih katalitskih mest, molekularnem prepoznavanju, in na splošno pri uvedbi novih kemijskih in fizikalnih lastnosti.
Prav tako je možno v takšno poliedersko strukturo ali 'nanokletko' zapreti substance, kot so zdravilne učinkovine. Polieder obdaja točno določen volumen, kar je pomembno za dostavo zdravil in drugih substanc. Tako je možno uporabiti zdravila pri pacientih ali živalih, posebno takrat, ko je takšna zaščita s proteinsko kletko potrebna zaradi zaščite. Ko substanca znotraj strukture doseže tarčno mesto, jo lahko odpremo bodisi z naravno razgradnjo, pri čemer se učinkovina počasi sprosti (skladiščenje), ali z razgradnjo kletke od zunaj (npr. svetlobno povzročena razgradnja polipeptidne verige povzroči aktivacijo substance, ki je vezana na aminokislinski ostanek).
2. Polipeptid iz točke 1, kjer obstaja večja verjetnost, da vsak segment iz para segmentov, ki tvorita ovito vijačnico, tvori ovito vijačnico s segmentom iz para, kot pa s segmentom iz drugega para, ki tvori ovito vijačnico.
Z zahtevo, da se peptidna segmenta iz para, ki tvori ovito vijačnico specifično veže le enkrat v polipeptidni molekuli, zagotovimo formiranje željene poliederske strukture. Če je specifični par prisoten več kot enkrat v polipeptidni molekuli, lahko to vodi do neželjenega zvitja. V tem primeru mora biti položaj posmeznih parov segmentov izbran tako, da se segmenti sterično ne ovirajo.
-33. Polipeptid iz točke 1 in 2, kjer nevijačni povezovalni segmenti (linkerji) predstavljajo fleksibilne povezovalne segmente.
Uporaba fleksibilnih linkerjev omogoča takšno samosestavljanje, kjer so dosegljivi vsi koti med sosednjimi peptidnimi sekvencami, ki tvorijo ovito vijačnico.
4. Polipeptid iz katerekoli točke od 1 do 3, kjer so nevijačni povezovalni segmenti (linkerji) sestavljeni iz vsaj enega aminokislinskega preostanka, pogosto med 1 in 10, bolj pogosto od 2 do 6 aminokislinskih preostankov, najpogosteje 4.
Če je linker prekratek, ne zagotavlja zadostne prostostne stopnje za formacijo poliederske strukture zaradi stričnih ovir ali kotnih omejitev. Če je linker predolg, je možno, da bi prevelika fleksibilnost vodila do neželjenih zvitij ali do formiranja sekundarne strukture s sosednjimi povezovalnimi segmenti, kar bi preprečilo formiranje željene poliederske strukture.
5. Polipeptid iz katerekoli točke od 1 do 4, kjer povezovalni segmenti vsebujejo hidrofilne aminokislinske ostanke, ki prekinejo α-vijačno strukturo.
Tako je zagotovljeno, da lahko povezovalni segment (linker) opravlja svojo funkcijo, ne da bi interagiral s segmenti, ki tvorijo ovito vijačnico, t.j. da prekine vijačnico, ki nastane pri formiranju poliedra.
6. Polipeptid iz katerekoli točke od 1 do 5, kjer linker vsebuje vsaj 50% (številčno) aminokislinskih ostankov iz skupine glicin, serin, treonin, prolin, cistein, histidin, triptofan in tirozin.
Veliko število naštetih aminokislinskih ostankov, to je vsaj polovico števila aminokislinskih ostankov, ki sestavljajo linker, poveča možnost, da linker ne bo tvoril sekundarne strukture, posebno ne nadaljevanja vijačne strukture. Najbolje je izbrati vsaj 75% aminokislinskih ostankov iz omenjene skupine pri sestavljanju povezovalnega segmenta.
7. Polipeptid iz katerekoli točke od 1 do 6, kjer je nevijačni povezovalni segment tetrapeptid z aminokislinsko sekvenco SGPG.
Pri eksperimentih seje pokazalo, da takšen linker zagotavlja željene lastnosti.
8. Polipeptid iz katerekoli točke od 1 do 7, kjer polipeptid vsebuje najmanj en segment, ki tvori ovito vijačnico, in je naveden v zapisih sekvenc SEQ ID NOs. 2,4, 6, 8,10, 12,14,16 in 18.
-4Uporabljeni segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice, omogočajo formacijo poliedra z nizko stopnjo nožnosti nepravilnega zvitja zaradi njihovih specifičnih in ortogonalnih vezalnih lastnosti, t.j. zaradi močne vezave z željenim partnerjem in šibke vezave z drugimi segmenti.
9. Polipeptid iz katerekoli točke od 1 do 8, kjer polipeptid vsebuje najmanj en segment, ki tvori ovito vijačnico, in izhaja iz skupine naravnih proteinov levcinskih zadrg.
Ti naravni segmenti, ki tvorijo ovito vijačnico, so uporabni pri načrtovanju večjih struktur, t.j. v kombinaciji z zgoraj omenjenimi načrtovanimi segmenti, ki tvorijo ovito vijačnico.
10. Polipeptid iz katerekoli točke od 1 do 9, kjer je polieder tetraeder.
Tetraeder je najpreprostejši polieder, ki vsebuje najmanjše število segmentov, ki tvorijo ovito vijačnico, kar omogoča enostavnejše samosestavljanje. Tako je omejena možnost napačnih zvitij.
11. Polipeptid iz točke 10, kjer je polipeptid sestavljen iz 12 segmentov, ki tvorijo ovito vijačnico.
Dvanajst segmentov, ki tvorijo ovito vijačnico, je zadostno število za tvorbo tetraedra. Vsak dodaten par segmentov bi vodil v podaljšek tetraedra (kot antena tetraedra). Vsak dodaten segment, ki tvori ovite vijačnice, bi tudi zmanjšal vezavno selektivnost med načrtovanimi pari peptidnih sekvenc, ki tvorijo ovite vijačnice, kar bi zahtevalo milejše pogoje za samosestavljanje.
12. Polipeptid iz točke 10 ali 11, kjer sta dva od šestih robov tetraedra formirana iz antiparalelnih ovitih vijačnic, štirje robovi pa so sestavljeni iz paralelnih vijačnih dimerov.
Ta možnost je ena od dveh možnih formacij tetraedra iz segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice.
13. Polipeptid iz točke 12, kjer je vrstni red antiparalelnih A in paralelnih P segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, APAP PPPP APAP, ali ena izmed cikličnih permutacij.
14. Polipeptid iz točke 12 ali 13, kjer je vrstni red segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, Aa-Pa-AbPb-Aa'-Pc-Pb'-Pa'-Pd-Pc'-Ab'-Pd', ali njegova ciklična permutacija. Aa in Ab predstavljata segmenta, ki tvorita antiparalelno ovito vijačnico z Aa' in Ab', in Pa do Pd predstavljajo segmente, ki tvorijo paralelno ovito vijačnico z Pa' do Pd'.
Takšna struktura omogoča formacijo stabilnega samosestavljenega tetraedra.
15. Polipeptid iz katerekoli točke od 12 do 14, kjer je vrstni red segmentov, ki tvorijo ovito vijačnico, APH-P3-BCR-GCN-APH-P7-GCN-P4-P5-P8-BCR-P6, in je predstavljen z opisom sekvenc kot SEQ ID NOs 2, 8, 4, 6, 2, 16, 6, 10, 12, 18, 4 in 14, ali njegove ciklične permutacije.
-5V eksperimentih se je polipeptid s takšnim zaporedjem izkazal kot takšen, ki je sposoben tvoriti tetraedersko strukturo. Nadalje, segmente APH-APH in BCR-BCR lahko zamenjamo, prav tako P3P4, P5-P6, P7-P8 in GCN-GCN, pri čemer se obdrži zmožnost tvorbe tetraedra. Npr. v vrstnem redu, ki vsebuje P3 in P4 kot par, ki tvori ovito vijačnico, lahko segment P3 zamenjamo s P7 (ali P8), če istošasno zamenjamo P4 s segmentom P8 (ali P7).
16. Polipeptid iz točke 10 ali 11, kjer so trije od šestih robov tetraedra sestavljeni iz antiparalelnih ovitih vijačnic in trije iz paralelnih.
To je druga od dveh možnosti formacije tetraedra iz polipeptidnih sekvenc, ki tvorijo ovite vijačnice.
17. Polipeptid iz katerekoli točke od 1 do 16, kjer so segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice, sestavljeni iz n heptad z vzorcem a-b-c-d-e-f-g, ki je lahko isti ali različen za vsako heptado, pri čemer je n preferenčno od 3 do 50,
S spreminjanjem n lahko nastavimo velikost tetraedra.
18. Polipeptid iz točke 17, kjer so aminokislinski ostanki na mestih b,cali/in f v heptadi zamenjani, kar omogoči dodtno funkcionalizacijo samosestavljenega polipeptidnega poliedra.
Ker so aminokislinski ostanki na the mestih potrebni za vzdrževanje sekundarne strukture, mora biti zamenjava primerna in ne sme vplivati na terciarno strukturo.
19. Polipeptid iz točke 18, kjer je dodatna funkcija ena izmed naštetih: sprememba naboja ali/in polarnosti, metalna kelacija, vpeljava vezavnih mest pri zdravilih, dodajanje barvil, katalitskih centrov, antigenig determinant, optičnih lastnosti.
Tako lahko dodatno funkcionaliziramo polipeptid.
20. Fuzijski polipeptid polipeptida iz točke 1 dol9, ki tvori polieder, in funkcionalne polipeptidne domene, ki je pripeta na N- ali/in C-terminalni konec segmenta polipeptida, ki tvori polieder.
S tem dosežemo željeno funkcionalnost polipeptida, ki tvori polieder. Ta funkcioanlnost je lahko dosegljiva z biomolekularnimi orodji (npr. ekspresija v celicah).
21. Fuzijski polipeptid iz točke 20, kjer funkcionalna polipeptidna domena ni razcepljena domena.
Uporaba necepljene polipeptidne domene omogoča aktivnost neodvisno od dejanskega stanja zvitja samosestavljivega poliedra.
-622. Fuzijski polipeptid iz točke 20, kjer je funkcionalna polipeptidna domena razcepljena na dva dela, ki sta pripeta na N- in C-terminalni konec polipeptida. Oba dela se pri formaciji tetraedra ponovno sestavita v funkcionalno domeno.
Funkcionalni polipeptid, ki je razcepljen na dva dela, pridobi nazaj svojo funkcionalnost po 5 samosestavitvi poliederske strukture. Uspešno zvitje v poliedersko struktutro tako lahko preverimo s preverbo funkcionalnosti.
23. Fuzijski polipeptid iz točke 22, kjer je funkcionalna polipeptidna domena fluorescirajoč protein, razcepljen na dva dela, ki sta pripeta na N- in C-terminalni konec polipeptida, ki tvori polieder.
Formacijo poliederske strukture lahko preverimo s fluorescenčno spektroskopijo. Tako lahko npr. 10 preverimo, če je tarčna substanca bila uspešno vstavljena v nano-kletko oz. ali ima nano-kletka še pravilno strukturo.
24. Polipeptidni polieder, tvorjen iz polipeptida iz katerekoli točke od 1 do 19, in fuzijskega polipeptida iz katerekoli točke 20 do 23.
To predstavlja končni rezultat samosestavljanja polipeptida, ki tvori polieder, in je opisan v izumu.
Ta izum se nadalje nanaša na polipeptidni polieder iz točke 25:
25. Polipeptidne polieder, katerega robovi so sestavljeni iz povezanih demernih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, pri čemer je število segmentov dvakratnik števila robov poliedra. Pri tem polpeptid tvori zaključeno pot okrog robov poliedra, nevijačni povezovalni segmenti pa so vstavljeni med segmente, ki tvorijo ovite vijačnice, in predstavljajo ogliščapoliedra.
26. DNK, ki kodira polipeptid iz katerekoli točke od 1 do 19, fuzijski polipeptid iz katerekoli točke od 20 do 23, ali polipeptidne polieder iz točk 24 in 25.
Uporaba takšne DNK omogoča nastanek polipeptida, ki je predmet izuma.
27. DNK iz točke 26, ki vsebuje regulatorne elemente za produkcijo polipeptida ali fuzijskega polipeptida v živih celicah, preferenčno v bakterijah, ali z in vitro transkripcijo/translacijo.
Regulatorni elementi so običajni in omogočajo produkcijo željenega polipeptida v večjih količinah.
28. Metoda za formiranje polipeptidnega poliedra, kjer se okolje polipeptida iz katerekoli točke od 1 do 19 ali fuzijskega polipeptida iz katerekoli točke od 20 do 23 spreminja iz denaturirajočih pogojev do pogojev, ki omogočijo zvitje polipeptida.
Pod denaturirajočimi pogoji ni formiranih ovitih vijačnic, prisotna je odprta struktura. Ponavadi se pod takšnimi pogoji tvorijo le posamezne naključne sekundarne strukture. Pri spremembi pogojev do pogojev, ugodnih za zvitje, se formirajo vijačne strukture, poteče proces samosestavljanja poliedra.
29. Metoda iz točke 28, kjer je čas, ki je potreben za doseganje pogojev, ugodnih za zvitje, iz denaturacijskih pogojev, najmanj 16 ur in največ 40 ur.
Naraščajoči čas, ki je potreben, da sistem doseže ravnotežno stanje, zmanjšuje verjetnost nastanka nepravilno zvitih struktur. Ponavadi je 40 ur dovolj, in daljši čas ne prispeva k povečanju izkoristka.
30. Metoda iz točk 28 ali 29, kjer je sprememba pogojev iz denaturacijskega stanja do pogojev, ugodnih za zvitje, kontinuirna.
Kontinuimo spreminjanje je željena zaradi možnosti doseganja bližine ravnotežnega stanja v katerikoli točki.
31. Metoda iz točk 28 ali 29, kjer je sprememba pogojev iz denaturacijskega stanja do pogojev, ugodnih za zvitje, izvedena stopenjsko z najmanj petimi koraki, največkrat s 5-imi do 10-imi koraki.
Stopenjsko spremembo je s tehničnega vidika lažje doseči.
32. Metoda iz katerkoli točke od 28 do 31, kjer je v denaturirajočih pogojih prisoten kemijski denaturacijski agens, ki zadovoljivo prepreči nastanek vijačnih struktur tudi najbolj stabilnim parom segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, v pogojih zvitja pa je ta agens prisoten v manjši količini, kot je potrebna, da se tvori vijačna struktura iz najmanj stabilnega para segmentov.
Kemijski denaturacijski agensi so dobro poznani in enostavni za uporabo.
33. Metoda iz katerekoli točke od 28 do 32, kjer je v denaturirajočih pogojih dosežena temperatura, ki zadovoljivo prepreči nastanek vijačnih struktur tudi najbolj stabilnim parom segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, v pogojih zvitja pa je temperature nižja, kot je dovoljena, da se tvori vijačna struktura iz najmanj stabilnega para segmentov.
Metoda termične denaturacije je pogosto uporabljena in je primerna za produkcijo večjih količin produkta, saj je malo stranskih produktov in njihovo čiščenje je lažje.
-834. Metoda za zdravljenje ali diagnosticiranje pri človeku ali živalih, kjer uporabimo zdravilo, ujeto v nano-kletko, ki jo predstavlja polipeptidni polieder iz katerekoli točke od 1 do 19 ali fuzijski protein iz katerekoli točke od 20 do 23, pri čemer se poliederska nano-kletka aplicira na človeku ali živali.
Nano-kletko, ki jo predstavlja polipeptidni polieder, lahko uporabimo kot dostavni sistem za zdravilno učinkovino v telo.
36. Metoda iz točke 35, kjer polipeptid vsebuje vezano tačno-specifično substanco, ki usmeri poliedersko nano-kletko v željeno tkivo.
37. Uporaba polipeptida iz katerekoli točke od 1 do 19, fuzijskega polipeptida iz katerekoli točke 20 do 23, ali polipeptidnega poliedra iz točk 24 ali 25 za dostavo učinkovin, za kemijsko katalizo, uporaba kot nosilec vakcine, antitumorskega ali drugega farmacevtskega agensa, za sestavljanje anorganskih ali organskih spojin na definirana prostorska mesta polipeptidnega poliederskega ogrodja, ali uporaba za diagnostiko.
38. Uporaba iz točke 37, kjer diagnostika temelji na samosestavljanju ali rekonstrukciji razcepljenih proteinskih domen, ki so vstavljene na izbrana mesta polipeptidne poliederske strukture.
Legende slik:
Slika 1: (A,B,C) Nedovoljene povezave med segmenti, prikazane na pimeru ogllišča, v katerem se stikajo štirje robovi. Primer je relevanten tudi za oglišča drugačnega tipa. (D,E, F) Primer dveh tipov dovoljenih povezav v ogliščih, kjer se stikajo štirje (D,E) ali trije robovi (F).
Slika 2: Slika prikazuje dva primera poliedrov, ki sta sestavljena iz ene polipeptidne verige: trigonalna prizma (A) in ortogonalna prizma (B).
Slika 3: (A) Shema polipeptidne verige, ki je sestavljena iz dvanajstih peptidnih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice. (B) Shema strukture, sestavljene iz polipeptidne verige. Polipeptidno verigo sestavlja dvanajst peptidnih segmentov, ki tvorijo ovito vijačnico: šest jih tvori paralelne heterodimere (2-8, 6-10, 9-12), dva tvorita paralelni homodimer (4-7), in štirje tvorijo antiparalelna homodimera (1-5, 3-11). Segmenti se samosestavijo v tetraeder. Puščice označujejo orientacijo segmentov, ki interagirajo v strukturi.
-9Slika 4: Izolacija polipeptida SEQ ID: 20 po ekspresiji z DNK konstruktom SEQ ID: 19: supernatant (linija 2) in netopno frakcijo (inkluzijska telesca, linija 3) po liži celic smo preverili na prisotnost polipeptida. Polipeptid, ki se pretežno nahaja v obliki inkluzijskih telesc (linija 3), smo očistili z afinitetno kromatografijo na Ni-NTA koloni (linija 4) in nadalje z HPLC-RP kromatografijo (linija 5).
Slika 5: Čistost izoliranega polipeptida smo pokazali z gelsko kromatografijo, pri čemer smo uporabili BioSep s2000 kolono (Phenomenex). Separacijo smo izvedli v prisotnosti denaturanta, 6 IVI GdnHCI.
Slika 6: Meritve cirkularnega dikroizma (CD). (A) Sekundarna struktura zvitega polipeptida SEQ ID: 20 je bila izmerjena z merjenjem cirkularnega dikroizma v dalnjem UV območju, in je potrdila tvorbo ovitih vijačnic. (B) Kemijska denaturacijska krivulja je bila dobljena z merjenjem CD222nm signala za polipeptid SEQ ID:20 v raztopini z GdnHCI, koncentracije med 0 M and 6 M. Točka prevoja je pri 3.2 M GdnHCI. Termična stabilnost je bila določena s segrevanjem (C) in ohlajanjem (D, polipeptidne raztopine, koncentracije 0.2 mg/ml. Izračunana točka prevoja reverzibilnega termičnega prehoda je 56°C.
Slika 7: Meritve dinamočnega sipanja svetlobe (Dynamic light scattering , DLS) podajajo številčno porazdelitev velikosti polipeptidneh delcev v raztopini. Hidrodinamski premer denaturiranega polipeptida ob prisotnosti 6 M GdnHCI v pufru je 9.5 nm (A), medtem ko je hidrodinamski premer pod nativnimi pogoji samozvitega polipeptida v raztopini 6.9 nm (B).
Slika 8: Slika, pridobljena s pomočjo transmisijskega elektronskega mikroskopa (Transmission electron microscopy, TEM) samosetavljivega polipeptida SEQ ID: 20 (samozvitje v 16 urah iz 6 M v 0 M GdnHCI pri koncentraciji polipeptida 5 μg/mL). Vzorec smo najprej barvali z nano zlato 2 nm, ki označi histidinske repe v enem oglišču tetraedra, nato pa še z uranil acetatom, in vzorec pogledali pod tramisijskim eletronskim mikroskopom. Zviti tetraedri so primernih dimenzij.
Slika 9: Slika samosestavljivega polipeptida SEQ ID: 20, prodobljena z mikroskopom na atomsko silo (Atomic porced microscopy, AFM): samozvitje v 16 urah iz 6 M v 0 M GdnHCI pri koncentraciji polipeptida 5 gg/mL. Vzorec smo nanesli na podlago (mica) in sliko posneli z mikroskopom Agilent Technologies 5500 Scanning Probe Microscope pri Acoustic alternative current AFM mode using Silicon cantilever PPP-NCH, s konstantno močjo 42 N/m in tipalom polmera manj kot 7 nm (Nanosensors).
Slika 10: (A) Shema polipeptidne verige, ki je sestavljena iz dvanajstih peptidnih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, z dodanim razcepljenim rumenim fluorescirajočim proteinom (YFP , yellow fluorescence protein), katerega dela sta pripeta na oba konca fuzijskega polipeptida. (B, Shema
-10samosestavljenega polipeptida, opisanega v (A). Samo pravilno zvitje omogoči rekonstitucijo fluorescenčnega proteina.
Slika 11: Izolacija polipeptida SEQ ID: 22 po ekspresiji z DNK konstruktom SEQ ID: 21: netopno frakcijo po liži celic (inkluzijska telesca, linija 2) smo testirali na prisotnost polipeptida. Polipeptid smo očistili iz inkluzijskih telesc z afinitetno kromatografijo na Ni-NTA koloni (linija 3).
Slika 12: Merjenje fluorescence po zvitju samosestavljivega polipeptida SEQ ID: 22. Samo pravilno zvitje proteina vodi do rekonstitucije fluorescence proteina, ki smo jo izmerili.
Slika 13: TEM slika samozvitega polipeptida SEQ ID: 22. Vzorec smo najprej označili z nano zlatom 2 nm, ki se veže na hehsahistidinski rep v enem izmed oglišč tetraedra, nato pa z uranil acetatom, in ga pogledali pod mikroskopom. Sestavljen tetraeder ima pričakovane dimenzije.
Slika 14: AFM slika samosestavljenega polipeptida SEQ ID: 22 (zvitje potekalo 16 ur, iz 6 M do 0 M GdnHCI, koncentracija polipeptida 5 pg/mL). Vzorec smo dali na podlago (mica). Slika prikazuje pričakovano obliko strukture, ki jo sestavljata sestavljen tetraeder in rekonstruiran fluorescenčni protein.
Prednosti in uporabnost izuma bodo bolj razvidne iz sledečega opisa, kjer so priložene slike in podrobno opisana načela izuma.
Načrtovanje polipeptidov predstavlja pot do novih struktur z novimi funkcijami, ki dajo materialu lastnosti, kakršnih ne poznamo v naravi. Takšno načrtovanje zahteva zanesljiva pravila, ki povezujejo polipeptidno zaporedje in strukturo/funkcijo. Ker je polipeptidno samosestavljanje zelo zapleteno, saj vključuje veliko število kooperativnih interakcij, bomo obšli problem zvitja z uvedbo novih principov načrtovanja polipeptidnih nanostruktur, pri čemer bomo uporabili polipeptid, sestavljen iz povezanih togih modularnih gradnikov. Za takšen polipeptid lahko zanesljivo napovemo strukturo kot tudi interakcije na podlagi parjenja. To hkrati določa, da se polipeptid samosestavi v zasnovani polieder, katerega robovi predstavljajo pari osnovnih gradnikov.
Ovita vijačnica je eden izmed najpreprostejših motivov super-sekundarne strukture in interakcije, ki urejajo specifičnost nastanka ovite vijačnice, so precej dobro preučene. Izbira uporabe a-ovite vijačnice kot osnovnega gradnika je privlačna, saj so pravila, ki urejajo njeno strukturo, oligomerizacijo in specifičnost parjenja, precej bolj poznana, kot za katerikoli drug proteinski
-11motiv. Dimerne ovite vijačnice se lahko sestavijo v paralelni ali antiparalelni orientaciji, in, odvisno od tega, ali sta polipeptida v paru enaka ali različna, tvorijo heterodimere ali homodimere. Peptidne segmente, ki tvorijo ovite vijačnice, lahko strukturno razdelimo v heptade, ponavljajoče se vzorce, kjer so določeni položaji zasedeni prednostno s hidrofobnimi (položaji a in d) ali nabitimi (položaji e in g) aminokislinskimi ostanki. Ti aminokislinski ostanki sodelujejo v interakcijah s partnerskimi peptidnimi segmenti, pri čemer tvorijo ovite vijačnice. Poleg tega aminokislinski ostanki na položajih b, c in f lahko dodatno prispevajo k nagnjenosti vijačnega zvitja, in jih lahko uporabimo za uvedbo dodatnih željenih lastnosti pri samosestavljeni strukturi.
Peptidne segmente, ki tvorijo ovito vijačnico, lahko smatramo kot toge palice, ki jih lahko povežemo v večje polipeptidne verige s pomočjo fleksibilnega linkerja med njimi. Definirano zaporedje peptidnih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, omogoča nastanek definiranih struktur na podlagi predvidljivih interakcij med segmenti. Na takšen način lahko izgradimo različne poliederske strukture, kjer segmenti ovite vijačnice predstavljajo robove sestavljene strukture.
Kot prikazujemo izumitelji v tej patentni prijavi, se lahko posamezni polieder samosestavi iz ene načrtovane polipeptidne verige, ki je sestavljena iz z linkerjem povezanih peptidnih segmentov, ki tvorijo ovito vijačnico. Število potrebnih segmentov, ki tvorijo ovito vijačnico, je dvakrat večje od števila robov poliedra, medtem ko so robovi sestavljene dimerne ovite vijačnice. Zaporedje segmentov in interakcije med pari segmentov, ki tvorijo ovito vijačnico, morajo biti skrbno izbrani na podlagi pravil, zapisanih v tem izumu. Na primeru tetraedra smo pokazali, da lahko tetraeder zgradimo s samosestavljanjem iz ene polipeptidne verige, ki je sestavljena iz dvanajstih s fleksibilnim linkerjem povezanih peptidnih segmentov, ki tvorijo ovito vijačnico, pri čemer šest segmentov ovitih vijačnic predstavlja šest robov tetraedra.
Izum se nanaša na nanostrukture, samosestavljene iz ene polipeptidne verige, ki obsega definirano zaporedje segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice. Vsak segment s svojim parom znotraj iste verige tvori homodimerne ali heterodimerne ovite vijačnice. Segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice, do dolgi tri do sedem heptadnih ponovitev. Nanostrukture, oblikovane v skladu z izumom, so poliedri, sestavljeni iz rigidnih robov. Primer tega izuma je polipeptidni tetraeder.
Izum se nanaša na polipeptid, ki se samozdružuje v nanostrukturo omenjeno zgoraj, pri čemer je polipeptid sestavljen iz dvanajstih (12) segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, v sledečem vrstnem redu:
peptidni segment APH, ki tvori antiparalelni homodimer - (2) peptidni segment P3, ki tvori paralelni heterodimer - (3) peptide segment BCR, ki tvori antiparalelni homodimer - (4) peptidni
-12segment GCNshort, ki tvori paralelni homodimer - (5) peptidni segment APH, ki tvori antiparalelni homodimer - (6) peptidni segment P7, ki tvori paralelni heterodimer - (7) peptidni segment GCNshort, ki tvori paralelni homodimer - (8) peptidni segment P4, ki tvori paralelni heterodimer (9) peptidni segment P5, ki tvori paralelni heterodimer - (10) peptidni segment P8, ki tvori paralelni heterodimer - (11) peptidni segment BCR, ki tvori antiparalelni homodimer - (12) peptidni segment P6, ki tvori paralelni heterodimer.
Peptidna segmenta APH in BCR, ki tvorita antiparalelne homodimere, tvorita antiparalelne ovite vijačnice (APH-APH, BCR-BCR). Peptidni segment GCNshort, ki tvori paralelni homodimer, pa tvori paralelno homodimerno ovito vijačnico (GCNshort-GCNshort). Segmenti APH, BCR, GCNshort tvorijo dimer izključno z identičnim segmentom, ne pa tudi z drugimi tipi segmentov, ki tvorijo homodimer. Medtem ko peptidni segmenti P3, P5, P7, ki tvorijo paralelne heterodimere, tvorijo paralelne heterodimerne ovite vijačnice s svojimi partnerji P4, P6, P8.
Izum se nanaša na polipeptid, kot je navedeno zgoraj, medtem ko so peptidni segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice, izbrani izmed segmenti naravnih polipeptidov ali načrtovanih polipeptidov in so prednostno izbrani med peptidi SEQ ID: 2, 4, 6,8,10,12,14, 16,18.
Izum se nanaša na polipeptid, kot je navedeno zgoraj, pri čemer so peptidni linkerji (povezovalni peptidi) vstavljeni med segmente, ki tvorijo ovito vijačnico, Dolžina povezovalnega peptida je od ena do 10 aminokislinskih ostankov, navečkrat štiri aminokislinske ostanke. Peptidni repi, t.j. šest histidinskih ostankov, Flag rep, HA rep ali AU rep, se lahko dodajo na N- ali C- terminalnem delu. Takšna vrsta peptidnega repa ne ovira nastajanja ovitih vijačnic in zagotavlja dodatne funkcionalne lastnosti polipeptida, kot so olajšana detekcija, čiščenje, dodatne optične lastnosti, in imunološke, katalitske ali druge kemične ali biološke aktivnosti. Polipeptid, omenjen v izumu, pripravimo z rekombinantno tehnologijo v bakterijah ali v drugih splošno uporabljenih produkcijskih ali z in vitro transkripcijsko / translacijskem sistemom.
Izum se nanaša na DNK, ki kodira zgoraj navedeni polipeptid, in DNK je operativno povezana z regulativnimi elementovi, promotorjem in terminatorjem, ki poganjajo izražanje fuzijskih proteinov v celicah gostitelja.
Izum se nadalje nanaša na postopek za sestavljanje polipeptida v poliedre, ki so navedeni zgoraj. Procesi vključujejo počasen padec koncentracije ali odstranjevanje kemijske spojine za denaturacijo, najpogosteje so to gvanidinijev hidroklorid (GdnHCI), sečnina ali litijev klorid ali drugih kemični agens. Postopek je okarakteriziran s predhodno določitvijo koncentrcijskega območja polipeptidnega razvitja in s kontinuirno izmenjavo topil med dializo, ki poteka počasi,
-13običajno med 16 in 40 ur, pri čemer se koncentracija denaturanta ves čas manjša. Lahko pa izvedemo stopenjsko dializo, pri čemer postopoma zmanjšujemo koncentracijo denaturanta v dializni raztopini, postopek naredimo običajno v petih do desetih korakih. Druga možnost je počasna temperaturna renaturacija polipeptida, pri čemer je začetna temperatura višja od tiste, pri kateri poteka združevanje, kjer nastajajo stabilne ovite vijačnice. Temperaturo počasi znižujemo pod temperaturo najmanj stabilnega dimernega elementa.
Izum se nanaša na uporabo nanostrukture tetraeder, ki je omenjena zgoraj, in uporabo zgoraj omenjenih polipeptidov kot molekularnih prenosnikov, ki 'prenašajo' druge spojine. Le-te se nadalje lahko uporabljajo za različne aplikacije, kot so dostava zdravil, kemijska kataliza v polipeptidni nano-kletki ali na površini sestavljenih nanostruktur, za vezavo specifičnih spojin, kot nosilec cepiv, kot protitumorski ali drugih farmacevtski agensi, lahko se vežejo na polipeptidno ogrodje nanostrukture, za diagnostiko, ki temelji na samozdruževanju ali rekonstituciji cepljenih proteinskih domen, vnešenih na točno določeno mesto poliederske polipeptidne strukture.
Če ni definirano drugače, imajo vsi uporabljeni tehnični in strokovni izrazi isti pomen, kije poznan strokonjakom iz področja izuma. Terminologija, ki jo uporabimo v opisu izuma, ima namen opisati posamezni segment izuma. Vse publikacije, omenjene v opisu izuma, so navedene kot reference. V opisu izuma in v zahtevkih je opis podan v ednini, kar ne izključuje uporabe množine.
V preteklosti je bilo načrtovanje struktur iz polipeptidov omejeno le na uporabo homologov naravnih zvitij. Ta izum omogoča načrtovanje katerekoli umetne tridimenzionalne strukture, ki je sestavljena iz gradnikov.
Osnova izuma je presenetljiva ugotovitev izumiteljev, da se lahko ena polipeptidna veriga, v kateri so samo definirane kombinacije povezanih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, samosestavi v polipeptidni polieder na nanometrski skali. Izumitelji opišejo proseč selekcije the definiranih combinacij. To je pomemben prispevek k razširjenemu načrtovanju polipeptidnih planarnih in tridimenzionalnih nanostruktur, saj doslej raziskovane kombinacije dveh segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, lahko tvirijo le linearne, fibrilarne strukture (US 7,045,537 BI).
Polvpeptide assemblv into polvhedron
Izraz polieder se nanaša na sestav zgrajen iz polipeptidne verige, ki tvori robove poliedra z nanometrskimi dimenzijami med 3 in 100 nm, ter votlo notranjostjo.
• · ·
-14Izraz tetraeder se nanaša na sestav zgrajen iz polipeptid verige, ki tvori robove tetraedra z nanometrskimi dimenzijami med 3 in 100 nm, ter votlo notranjostjo.
Izraz polipeptid veriga ima splošen pomen in se nanaša na zaporedje aminokislin, ki so med seboj povezane s peptidno vezjo.
Izraz segment ima splošen pomen in se nanaša na zaporedje aminokislin polipeptidne verige, ki tvori definirano homogeno strukturno in oblikovno enoto.
Segment ovite vijačnice in peptidni segment, ki lahko tvori ovito vijačnico
Izraz segment ovite vijačnice ima splošen pomen in se nanaša na strukturni polipeptidni motiv, sestavljen iz dveh ali več vijačnic, ki se ovijejo ena okoli druge in tvorijo neprekinjen motiv ovite vijačnice.
Izraz segment, ki lahko tvori ovito vijačnico ima splošen pomen in se nanaša na segment na polipeptidni verigi, ki ima zmožnost tvoriti segment ovite vijačnice v kombinaciji z enim ali več specifičnimi segment, ki lahko tvorijo ovito vijačnico. Segment, ki lahko tvori ovito vijačnico vsebuje heptadne ponovitve, označene kot (a-b-c-d-e-f-g)n, katere predstavljajo približno dva zavoja. Mesti 'a' in 'd' navadno vsebujeta nepolarne, hidrofobne aminokislinske ostanke, kateri se nahajajo neposredno med dvema vijačnicama segmenta, ki lahko tvori ovito vijačnico. Aminokislinski ostanki na mestih 'e' in 'g' so polarni in izpostavljeni topilu ter interagirajo elektrostatično, med tem pa so ostanki na mestih 'b' , 'c' in 'f' hidrofilni in izpostavljeni topilu. Različne aminokisline na položajih 'a-g' segmenta, ki lahko tvori ovito vijačnico, definirajo oligomerizacijsko stanje, določijo orientacijo vijačnice in stabilnost segmenta ovite vijačnice. Natančnejša definicija za izraz segment ovite vijačnice se nanaša na naravne ali načrtovane strukturne motive proteinov v obliki ovite vijačnice, ki imajo običajno 2 - 50 heptad, so paralelno ali antiparalelno orientirani, ter lahko tvorijo homo- in hetero-oligomere.
Segmenti, ki lahko tvorijo ovito vijačnico so izbrani iz naravnih (levcinska zadrga) ali načrtovanih strukturnih motivov proteinov v obliki ovite vijačnice, (predvsem iz SEQ ID: No 2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14,16, 18).
Orientacija verige (segmentov, ki lahko tvorijo ovito vijačnico) v oviti vijačnici je lahko paralelna (vse proteinske verige tečejo v isti smeri) ali antiparalelna (verige tečejo v nasprotni smeri). Načela določanja lastnosti segmentov, ki lahko tvorijo ovito vijačnico, so dobro preučena in kot taka
-15omogočajo raziskovalcem napoved stabilnosti paralelnih segmentov ovite vijačnice iz njihovega zaporedja (Hagemann UB, Mason JM, Mdller KM, Arndt KM., J.Mol.Biol. 381 (1) :73-88, 2008).
Izraz homodimer ima v opisu izuma splošen pomen in se nanaša na sestav zgrajen iz samo ene vrste monomerov (oba elementa sta enaka).
Izraz heterodimer ima v opisu izuma splošen pomen in se nanaša na sestav zgrajen iz različne vrste monomerov (elementa sta si različna med sabo).
Glavna značilnost segmentov, ki lahko tvorijo ovito vijačnico in so izbrani za vključitev v načrtovano polipeptidno verigo je ta, da lahko vsak segment ovite vijačnice preferenčno interagira z izbranim segmentom in enako orientacijo in ne s katerim koli drugim segmentom v reakcijski zmesi. Na primer homodimerni peptid, ki lahko tvori ovito vijačnico, bi moral tvoriti ovito vijačnico le s komplementarnim peptidnim segmentom (enaka aminokislinska sekvenca). Heterodimerni segment, ki lahko tvori ovito vijačnico, bi moral tvoriti ovito vijačnico le z ustreznim heterodimernim peptidnim segmentom (različna sekvenca).
Dizajn polipeptidne verige, ki lahko tvori polieder
Polipeptidno verigo, ki lahko tvori polieder so zasnovali tako, da so med seboj povezali definirano število peptidnih segmentov, ki lahko tvorijo ovito vijačnico v točno določenem vrstnem redu. Posamezne polipeptidne segmente so povezali z izbranim aminokislinskim vezalnim členom. Polipeptidni verigi se lahko vključi dodatna aminokislinska zaporedja, zlasti na C- ali N-končnem delu verige.
Izraz linker se nanaša na krajša zaporedja aminokislin, katerih edina vloga je ločevanje posameznih domen oziroma segmentov proteinov. Izum zajema prisotnost nevijačnih odsekov linkerjev, kateri med segmenti ovitih vijačnic prekinejo vijačnico in zagotavljajo fleksibilnost za povezavo med posameznimi peptidnimi segmenti znotraj iste polipeptidne verige. Linker je običajno dolg med 1 do 8 aminokislinskih ostankov in vsebuje hidrofilne aminokisline, ki prekinejo vijačno strukturo. Pogosto uporabljeni aminokislinski ostanki za linker so glicin, serin, treonin, prolin, cistein, histidin, triptofan, tirozin. Linker, ki je bil uporabljen za oblikovanje polipeptidne verige je bil tetrapeptid Ser-Gly-Pro-Gly.
V nasprotju z fuzijskimi proteini v US Patent No 6756039, kjer so proteinske domene togo povezane s neprožnim linkerjem (npr. vijačnice), vsebuje fuzijski protein navedenega izuma
-16prožno povezana proteinske domene, ki delujejo kot molekularni zglobi, kar omogoča regulirano stopnjo vrtenja togih segmentov ovite vijačnice.
Izraz Dodatna aminokislinska zaporedja se nanaša na aminokislinska zaporedja, ki so dodana polipeptidni verigi na začetnem, končnem ali pa vmesnem segmentu verige, ki tvori ovite vijačnice, niso pa nujna za tvorbo polipeptidnega materiala. Dodatne aminokislinske sekvence omogočajo nove funkcije materiala, kot so vezava kovinskih ionov, vezava fluorescenčnih oznak, intrinzično fluorescenco, katalitično aktivnost, stimulacijo imunskega sistema, ter vezavo molekul proteinov, nukleinskih kislin, polisaharidov, lipidov in zdravil.
Izraz zaporedje oznake se nanaša na zaporedje aminokislin, ki se dodajo proteinu za lažje čiščenje, izolacijo ali detekcijo polipeptidov. Položaja signalnega zaporedje in oznake nista strogo predpisana, vendar pa morata omogočiti funkcionalno izražanje proteinov in ohranjati funkcijo, za katero so bile te aminokislinske sekvence izbrane.
Izraz DNK v opisu se nanaša na zaporedje nukleotidov z odprtim bralnim okvirjem, katero kodira protein, ki je predmet izuma in je operativno povezano z regulatornimi elementi, promotorjem in terminatorjem, kar mu omogoča izražanje proteina v celicah gostitelja. Zaporedja DNK se lahko v dolžino zelo razlikujejo in so odvisna od proteina, ki se izraža.
Dizajn polipeptidnega tetraedra iz ene polipeptidne verige
Peptidne segmente, ki lahko tvorijo ovite vijačnice smatramo kot rigidne palice, katere lahko med seboj povežemo z gibljivimi segmenti. Z uvedbo fleksibilnega linkerja je mogoča tvorba povezav med segmenti z različno orientacijo (antiparalelna). Polipeptidni segmenti, ki lahko tvorijo ovito vijačnico in so skupaj povezani v polipeptidno verigo, so zmožni tvorbe katere koli geometrijske oblike, ki spada med poliedre. Do sedaj so poročali le o enodimenzionalnih objektih, kot so fibrile in palice, ki so bile zgrajene iz ovitih vijačnic (Woolfson DN, Pept. Science. 94(1): 118-127, 2010). V preteklosti smo iznašli način za sestavljanje dvo-in tro-dimenzionalnih objektov s pomočjo polipeptidnih gradbenih elementov, ki so vsebovali tri segmente, ki lahko tvorijo ovito vijačnico. Ti omogočajo nastanek struktur, kot so mreža in kocka (ta je sestavljena iz 6 polipeptidnih verig, ki gradijo 12 robov kocke) Jerala R. et al., patent WO 2011/046521 Al. Na drugi strani pa gradnja geometrijskih objektov iz številnih gradbenih elementov vodi do nastanka heterogenih produktov, poleg tega pa uporaba različnih gradbenih elementov zahteva poznavanje njihove natančno koncentracije in stehiometričnega razmerja. Za to bi bilo zelo primerno, če bi lahko gradili a ·
-17geometrijske objekte iz ene same polipeptidne verige. Tak postopek bi bil neodvisen od natančne koncentracije gradbenih elementov, kot na primer pri DNK origami (Rothemund PWK., Nature. 440: 297-302, 2006).
Ugotovili smo, da moramo za pripravo stabilne oblike poliedrov iz polipeptidne verige, ki pri tvorbi struktur sledi točno določeni poti zaporedja stranic, zadostiti določenim pravilom.
Polipeptidna veriga lahko vsak rob poliedra prečka natanko dvakrat. Prepovedane poti polipeptidne verige po robovih poliedra so sledeče: pot verige ne sme takoj za ogliščem zaviti za 180 ° in tvoriti antiparalelnega dimera s segmentom, kije takoj pred omenjenim segmentom (Slika 1A), ter v vsakem oglišču, katerega prečka veriga, ta ne sme tvoriti dimera z verigo, ki prečka ista tri oglišča v obeh smereh (Slika IB). Na podlagi teh pravil lahko pripravimo poti polipeptidnih verig, ki lahko tvorijo različne poliedre ali komplekse, kot je primer trigonalna prizme (Slika 2A) ali kocka (Slika 2B). Najbolj enostavno tridimenzionalno telo je tetraeder, ki je sestavljen iz 6 ploskev, pri katerih od vsake 3 robovi povezujejo 4 oglišča. Iznašli smo postopek za načrtovanje in pripravo stabilnega tetraedra iz samostojne polipeptidne verige, katera potuje čez vsak rob natanko dvakrat in vse skupaj povezuje.
Analizirali smo potencialne razporeditve poti polipeptidne verige po robovih tetraedra in ugotovili, da ni mogoče pripraviti tetraedra iz polipeptidne verige, ki je sestavljena iz segmentov, kateri tvorijo antiparalelne enote. Ravno tako ne moremo pripraviti tetraedra iz polipeptidne verige, kije sestavljena samo iz segmentov, ki tvorijo paralelne enote, ki tvorijo robove tetraedra. Edina možna topologija za oblikovanje tetraedra je sestavljena iz paralelnih in antiparalelnih segmentov, ki tvorijo stranice polipeptidnega poliedra. Rešitve te topologije, katero smo pripravili so naslednje: a) tetraeder, katerega stranice so sestavljeni iz 4 paralelnih, ter 2 antiparalelnih robov in b) tetraeder, katerega stranice so sestavljeni iz 3 paralelnih, ter 3 antiparalelnih dimernih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice.
Analiza odkritih rešitev nam je pokazala, da se začetek in konec poti polipeptidne verige vedno srečata na istem oglišču tetraedra. Iz tega lahko izhajamo, da dodatna aminokislinska zaporedja na C- in N-koncu verige pridejo skupaj na istem oglišču. To lastnost lahko uporabimo pri izbranih proteinih, ki so razcepljeni na dva dela, ob pravilnem zvitju tetraedra, pa se razcepljen protein ob oglišču ponovno združi in postane funkcionalen. To lahko izkoristimo za več potencialno uporabnih aplikacij, kot so: detekcija pravilnega zlaganja tetraedra z aktivacijo encimske aktivnosti ali pa z rekonstitucijo fluorescentnega proteina.
-18Poleg tega lahko dodana aminokislinska zaporedja povečajo tehnološko uporabnost struktur, kot so encimska aktivnost, svetlobna fluorescenca, absorbanca, aktivacija imunskega odziva, aktivacija celičnega signaliziranja, celičnega sporočanja, celičnega transporta, biomineralizacijo, vezavo kovin, tvorbe območij z hidrofobnimi skupinami in tvorba proteinskih struktur, kot pri naravnih strukturah proteinov.
Za oblikovanje tetraedra je zelo pomemben natančen vrstni red paralelnih in antiparalelnih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, ker ta definira pravilno orientacijo segmentov, kar vodi do pravilnega parjenja paralelnih in antiparalelnih segmentov v robovih in nastanka želene poliederske topologije. V primeru samo-sestavljivega tetraedra smo uporabili naslednjih devet peptidnih segmentov, ki lahko tvorijo ovite vijačnice, ki so bili izbrani iz zbirke naravnih in umetno pripravljenih peptidnih segmentov, ki lahko tvorijo ovite vijačnice: SEQ ID: 2, 4, 6, 8, 10,12,14,16, 18. Poleg naštetih zaporedij, bi lahko z dobrim poznavanjem principov tvorjenja ovitih vijačnic, uporabili še številne druge polipeptidne sekvence.
Začetek in konec poti polipeptidne verige, ki teče po robovih poliedra vedno sovpada v istem oglišču. Na podlagi tega sklepamo, da z uporabo ciklične permutacije lahko pripravimo različno zaporedje sekvenc znotraj polipeptidne verige. S pomočjo cirkularne permutacije lahko prestavljamo enega ali več polipeptidnih segmentov, ki lahko tvorijo ovite vijačnice, iz enega konca verige na drugi konec verige (prestavljena sekvenca ohrani svoje zaporedje členov).
Tehnologija rekombinantnih nukleinskih kislin
V izumu so bile uporabljene standardne metode molekularne biologije, ki so tudi sicer splošno znane strokovnjakom na tem področju (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning: laboratorij priročnik, 2nd ed., Cold Spring Harbor, NY, Ausubel et al. Current protocols of molecular biology, Green Publishing Associates, Inc in John Wiley & Sons, Inc, NY).
Nov polipeptidni material lahko sintetiziramo preko procesa izražanja DNK, katera kodira zapis za proteine v ustreznem gostiteljskem organizmu.
DNK vključimo v primeren ekspresijski vektor, med katere sodijo: plazmidi, virusni vektorji in drugi. Ekspresijski vektorji, ki so kompatibilni s celicami gostiteljskega organizma, vsebujejo mesta za ustrezno nadziranje transkripcije in translacije zaporedja nukleinskih kislin. Tipični ekspresijski vektor nosi ekspresijsko območje, ki v smeri 5' do 3' vsebuje promotor, kodirajočo zaporedje
-19fuzijskega proteina, terminator, ki vsebuje stop kodon za RNA polimerazo in poliadenilacijski signal za poliadenilazo.
Ekspresijske vektorje lahko uporabljamo za izražanje v evkariontskih in prokariontskih celicah. Največkrat se uporablja prokariontske celice bakterij, kot na primer Escherichia coli.
V naši inovaciji uporabljamo prokariontske celice za pridobivanje zadostnih količin nukleinskih kislin. Ekspresijski vektor običajno vsebuje delujoče kontrolne elemente, ki so funkcijsko povezani z DNK zaporedji, katera kodirajo proteine našega izuma.
Kontrolni elementi so tako izbrani, da lahko sprožijo dovolj učinkovito in tkivno specifično izražanje proteina. Promotor je lahko konstitutiven ali inducibilen, odvisno od želenega načina izražanja proteina. Promotor je lahko tudi normalno prisoten v celicah, ali pa uporabimo promotor iz tujih celica, bodisi naravnega ali pa sintetičnega izvora.
Promotor izberemo tako, da uspešno deluje v tarčnih celicah gostiteljskega organizma, poleg tega sekvenca vsebuje iniciacijsko zaporedje, ki skrbi za uspešno translacijo fuzijskega proteina. To je sestavljeno iz ATG in pripadajočega zaporedja. Vektor, ki se uporablja v inovaciji ima lahko več bralnih okvirjev, zato morajo biti ti neodvisno povezani z regulacijskimi mehanizmi in uporabljeni glede na želen protein.
Primeri bakterijskih ekspresijskih vektorjev: pET vektorji, pRSET vektorji in ostali. Ko uporabljamo te vektorje v bakterijskih celicah, imajo ti regulacijske mehanizme bakterijskega izvora.
Primeri sesalskih ekspresijskih vektorjev: pcDNA (Invitrogen), pFLAG (Sigma) in ostali.
Ko uporabljamo ekspresijske vektorje v sesalskih celicah, so regulacijski mehanizmi večinoma virusnega izvora, na primer: adenovirus 2, citomegalovirus, virus Simian 40.
Postopek za pridobivanje proteinskega materiala, ki lahko tvori poliedre
Iznajdba vključuje tudi proces priprave polipeptidnega materiala. Ta zajema vnos ustrezne DNK, ki kodira protein v gostiteljske celice, pripravo in rast gostiteljskih celic pod ustreznimi pogoji za izražanje proteina, izolacijo in čiščenje proteina z običajnimi biokemijskimi metodami, kot je na primer kromatografija.
-20V iznajdi smo zapisali, da lahko gostiteljski organizem sintetizira fuzijski protein, zapisan v heterologni nukleinski kislini, katera kodira protein na podlagi univerzalnega genskega koda. Nov fuzijski protein uporabimo za pripravo polipeptidnih nanomaterialov.
Kot je bilo prej omenjeno je običajno zaporedje heterologne nukleinske kisline vključeno v ekspresijski vektor (virusni ali nevirusni).
V izumu je opisano, kako lahko gostiteljski organizmi sintetizirajo fuzijski protein, na podlagi vnesene tuje DNK, ki kodira fuzijski protein. Ta fuzijski protein je nato osnova za pripravo polipeptidnih materialov. Fuzijski protein lahko tudi povežemo s signalnim zaporedjem, ki ga kodirajo nukleinske kisline.
Običajno vnesemo nukleinsko kislino, ki nima izvora v gostiteljskih celicah, v ekspresijski vektor, ki je lahko virusnega ali nevirusnega izvora z metodami, ki so bile že opisane.
Izum vključuje gostiteljske organizme in organizme, ki imajo nukleinske kisline (v prehodni ali stabilni obliki), katere kodirajo fuzijske proteine. Navedeni gostiteljski organizmi, ki so lahko evkarionti ali prokarionti, so dobro preučeni in znani na področju molekularne biologije.
Za prenos vektorja v gostiteljske celice se uporablja konvencionalne metode, ki se splošno uporabljajo na področju molekularne biologije in so bile že opisane.
Vnesena DNK se lahko izraža v prehodni ali stalni obliki. Prehodna oblika ekspresije je posledica vnosa vektorja, ki se ne vgradi v genom gostiteljske celice. Vgradnjo stalne oblike DNK v celicah lahko dosežemo s prisotnostjo različnih markerjev. Sekvence DNK, ki vsebujejo markerje običajno kodirajo odpornost na različne substance, kot so na primer antibiotiki. Ti markerji so lahko vključeni skupaj z ostalimi sekvencami, ali pa so v ločenem vektorju.
Samosestavljanje v tetraeder
Sestavljanje tetraedra smo dosegli s postopkom, pri katerem smo raztopljen denaturiran polipeptidni material izpostavili specifičnim pogojem, ki povzročijo nastanek nanostruktur.
Strukture, ki so ustrezno načrtovane, predstavljajo najbolj stabilno obliko, v katero se zvije polipeptidna veriga, ostali možni sestavi pa so manj stabilni. Pri strukturah, ki so sestavljene iz večjega števila komponent je energetska razlika med najbolj stabilno in ostalimi manj stabilnimi strukturami razmeroma nizka, zato potrebuje sistem daljši čas, da doseže najbolj stabilno obliko.
-21To je mogoče doseči z ohranjanjem sistema pod pogoji dinamične izmenjave med nesestavljenimi (razvite verige) in sestavljenimi delu (pravilno tvorjene strukture). Izumitelji smo odkrili postopek za izboljšanje sestavljanje polipeptidnih nanostruktur, ki omogoča dovolj časa za sestavljanje najbolj stabilnih struktur z zelo počasnim zmanjšanjem koncentracije denaturanta. Denaturiran polipeptid, ki lahko tvori nanostrukture pogojev (prizačetnih pogojih je razvit in nesestavljen) dializiramo na način, da počasi zmanjšujemo koncentracijo denaturanta v dializni mešanici tako, da počasi dodajamo pufer v dializno raztopino v prisotnosti hitrega mešanja. Refolding in sestava nanostrukture se torej zgodi v obdobju več kot 16 ur, običajno med 16 in 40 ur. Razpon med začetno in končno koncentracijo dializne raztopine se določi s pomočjo spektroskopske analize stabilnosti sekundarne in terciarne strukture preiskovane polipeptidne verige v prisotnosti različnih koncentracij denaturanta. Stabilnost lahko merimo tudi za vsak posamezni sestavni del, ki tvori ovito vijačnico in je del stranice polipeptidnega poliedra. Za ta postopek lahko uporabimo različne denaturante, kot so gvanidinijev hidroklorid, urea, LiBr ali pa druge kemične snovi, ki porušijo sekundarno strukturo segmentov ovitih vijačnic pri visokih koncentracijah teh snovi, običajno 4-5 M GdnHCI. Pri renaturaciji se sestava nanostruktur pojavi pri nižjih koncentracijah, navadno manj kot 1 M GdnHCI.
Primeri uporabe, katere bomo podrobneje opisali so zasnovani tako, da čim bolje opišejo izum. Ti opisi nimajo namena omejevati področja izuma in njegove uporabnosti, ampak so samo namenjeni boljšemu razumevanju izuma in njegove uporabnosti.
Eksperimentalno delo
Primer 1: Izbor peptidov, ki tvorijo ovite vijačnice
Najpomemnejše interakcije, ki vodijo združevanje ovitih vijačnic so dobro poznane strokovnjakom s tega področja. Za nastanek stabilnih nanostruktur v skladu s tem izumom, morajo biti segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice med seboj ortogonalni. Posamezni segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice, morajo biti sposobni dimerizacije izključno z določenim dimerizacijskim partnerjem in ne z drugimi peptidi, ki tvorijo ovite vijačnice, prisotnimi v reakcijski mešanici. Pari peptidov, ki tvorijo ovite vijačnice so bili izbrani med naravnimi (BCR, Taylor CM. and Keating AE., Biochem., 44:1624616256, 2005; GCN, Harbury PB. et al., Science, 262(5138): 1401-1407, 1993) in de novo • · » • · ·
-22zasnovanimi (ΑΡΗ, Gurnon DG. et al., JACS, 125:7518-7519, 2003; P3-P8, Jerala R. and Gradišar H., J. Pept. Science, 17:100-106, 2011) ovitimi vijačnicami. Pri zasnovi polipeptidne verige, ki zavzame obliko tetraedra, so bili uporabljeni peptidi, ki tvorijo heterodimerne paralelne ovite vijačnice (P3, P4, P5, P6, P7, P8), homodimerne paralelne (GCNshort) in peptide, ki tvorijo homodimerne antiparalelne ovite vijačnice (APH, BCR). Sekvence teh peptidov so navedene v Tabeli 1.
Tabela 1: Sekvence peptidov, ki tvorijo ovite vijačnice, uporabljenih pri zasnovi polipeptidne verige. Antiparalelna homodimerna ovita vijačnica BCR in paralelna homodimerna ovita vijačnica GCNshort (skrajšan GCN) se pojavljata v naravi, antiparalelna homodimerna ovita vijačnica APH in paralelni heterodimerni pari P3-P4, P5-P6, P7-P8 so de novo zasnovani na osnovi principov dimerizacije ovitih vijačnic.
| APH | MKQLEKELKQLEKELQAIEKQLAQLQWKAQARKKKLAQLKKKLQA | SEQ ID: 2 |
| BCR | DIEQELERAKASIRRLEQEVNQERSRMAYLQTLLAK | SEQID:4 |
| GCNshort | QLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVG | SEQID: 6 |
| P3 | SPEDKIAQLKEKNAALKEKNQQLKEKIQALKYG | SEQID:8 |
| P4 | SPEDKIAQLKQKIQALKQENQQLEEENAALEYG | SEQID: 10 |
| P5 | SPEDENAALEEKIAQLKQKNAALKEEIQALEYG | SEQID: 12 |
| P6 | SPEDKNAALKEEIQALEEENQALEEKIAQLKYG | SEQID: 14 |
| P7 | SPEDEIQALEEKNAQLKQEIAALEEKNQALKYG | SEQID: 16 |
| P8 | SPEDKIAQLKEENQQLEQKIQALKEENAALEYG | SEQID: 18 |
Primer 2: Zasnova polipeptidne verige, sestavljene iz dvanajstih peptidnih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice
Izumitelji so odkrili, da lahko samo dve od vseh možnih kombinacij dvanajstih peptidnih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, znotraj ene polipeptidne verige, vodita v sestavljanje tetraedra. Taki sta kombinacija štirih paralelnih in dveh antiparalelnih ovitih vijačnic in kombinacija treh paralelnih ter treh antiparalelnih ovitih vijačnic.
Izumitelji so pripravili primer polipeptidne verige sestavljene iz naslednje kombinacije dvanajstih peptidnih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice (Slika 3A), in se lahko samosestavi v tetraeder (Slika 3Β):
(1) peptidni segment ΑΡΗ, ki tvori antiparalelno homodimerno ovito vijačnico - (2) peptidni segment P3, ki tvori paralelno heterodimerno ovito vijačnico - (3) peptidni segment BCR, ki tvori antiparalelno homodimerno ovito vijačnico - (4) peptidni segment GCNshort, ki tvori paralelno homodimerno ovito vijačnico - (5) peptidni segment APH, ki tvori antiparalelno homodimerno ovito vijačnico - (6) peptidni segment P7, ki tvori paralelno heterodimerno ovito vijačnico - (7) peptidni segment GCNshort, ki tvori paralelno homodimerno ovito vijačnico - (8) peptidni segment P4, ki tvori paralelno heterodimerno ovito vijačnico - (9) peptidni segment P5, ki tvori paralelno heterodimerno ovito vijačnico - (10) peptidni segment P8, ki tvori paralelno heterodimerno ovito vijačnico - (11) peptidni segment BCR, ki tvori antiparalelno homodimerno ovito vijačnico - (12) peptidni segment P6, ki tvori paralelno heterodimerno ovito vijačnico pri čemer para peptidnih segmentov APH in BCR, ki tvorita antiparalelne homodimere, oblikujeta antiparalelne homodimerne ovite vijačnice (APH-APH, BCR-BCR) in peptidni segment GCNshort, ki tvori paralelni homodimer, oblikuje paralelno homodimerno ovito vijačnico (GCNshort-GCNshort). Segmenti APH, BCR in GCNshort oblikujejo dimere izključno z identičnim segmentom in ne z drugimi segmenti, ki tvorijo homodimere. Peptidni segmenti P3, P5, P7, ki tvorijo paralelne heterodimere, oblikujejo ovite vijačnice izključno s svojimi partnerji P4, P6, P8, v navedenem zaporedju. Gre za primer za kombinacije štirih paralelnih in dveh antiparalelnih ovitih vijačnic, ki oblikujejo šest robov tetraedra.
Za pridobitev tetraedra, morajo biti domene razporejene v definiranem vrstnem redu. Vse domene polipeptidne verige so peptidni segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice, in vsak od teh oblikuje ovito vijačnico izključno s svojim peptidnim partnerjem iz iste polipeptidne verige. Zaporedja, ki tvorijo ovite vijačnice so bila izbrana med sekvencami navedenimi v Tabeli 1: SEQ ID: 2, 4, 6, 8,10, 12,14,16,18.
Za nastanek tetraedra ali katerega drugega poliedra morajo biti linkerji med peptidnimi segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice, sposobni proste rotacije. V ta namen je bil med vse peptidne segmente, ki tvorijo ovite vijačnice, uveden polipeptidni linker, ki mora izpolnjevati več nalog: mora preprečevati nastanek kontinuiranega heliksa iz dveh zaporednih peptidnih segmentov, ki tvorita ovito vijačnico, mora nuditi prosto rotacijo in mora omogočati prekrižanje dveh ali več linkerjev polipeptidne verige na vsakem od oglišč. V ta namen je bil izbran tetrapeptid Ser-Gly-Pro-Gly (SGPG), ki vsebuje tri amnokislinske ostanke, ki prekinjajo heliks (glicin in prolin), so fleksibilni, majhni in hidrofilni.
-24Za lažjo detekcijo in čiščenje proteina je bil dodan heksahistidinski proteinski označevalec na Nkonec polipeptidne verige, izbrani bi lahko bili tudi drugi proteinski označevalci npr. Flag, HA ali AU.
Na N- in C- konce polipeptida se lahko doda dodatne aminokislinske segmente. Dodan je bil rumeni fluorescirajoči protein (YFP), N-YFP na N-konec in C-YFP na C-konec polipeptida (Slika 10A). Hkrati s sestavljanjem v tetraeder pride do rekonstitucije proteina YFP in posledično detekcije fluorescence (Slika 10B). Fluorescence ne bi zaznali v primeru nepravilnega sestavljanja polipeptida.
Primer 3: Zasnova in priprava DNA konstruktov
Aminokislinsko zaporedje celotne polipeptidne verige sestavljene iz dvanajstih peptidnih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, heksahistidinskega peptidnega označevalca in opcijsko dodatno aminokislinsko zaporedje za rumeni fluorescirajoči protein (YFP) je bilo reverzno prevedeno v nukleotidno zaporedje, z optimizirano rabo kodona za bakterije, kjer je bilo producirano v rekombinantni obliki.
Strokovnjaki iz tega področja bi lahko uporabili druge produkcijske organizme, kot na primer kvasovke, sesalske celice ali druge evkariontske celice za produkcijo polipeptida, ki zavzame obliko tetraedra, pri čemer bi ustrezno optimizirali rabo kodonov, uporabljeni bi bili ustrezni vektorji in ustrezne metode kloniranja.
DNK sekvence za polipeptidne domene, ki je bila že opisana, so bile dizajnirane iz aminokislinskih sekvenc izbranih polipeptidov s pomočjo programskega orodja Gene Designer iz DNA2.0 Inc. (http://www.biocompare.com/ProductDetails/505315/Gene-Designer.html), ki omogoča uporabniku dizajn DNK fragmentov in optimizacijo ekspresije proteina v želenem gostitelju (na primer E. coli) z optimizacijo kodonov. Geni so bili naročeni pri podjetju MR.Gene GmbH (Im Gewerbepark B32, D-93059 Regensburg). Nato so bili z z endonukleazami (restrikcijskim encimom) izrezani iz naročenega vektorja in klonirani v primerne vektorje, ki so vsebovali ustrezna regulacijska mesta. Uporabljen je bil komercialni vektor pSBlA2 (pSBlA2 http://partsregistry.0rg/Part:pSBlA2), ki nosi vse potrebne reguklatorne signale, odpornost na antibiotike in začetno mesto replikacije ter multiplo klonimo mesto.
Pripravljen je bil DNK konstrukt (SEQ ID: 19), ki kodira za polipeptidno verigo (SEQ ID: 20) sestavljeno iz naslednjega vrstnega reda dvanajstih peptidnih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice:
• 9
-25APH-P3-BCR-GCNshort-APH-P7-GCNshort-P4-P5-P8-BCR-P6. Pripravljen je bil DNK konstrukt (SEQ ID: 21), ki kodira za enako polipeptidno verigo z dodanimi segmenti razcepljenega rumenega fluorescenčnega proteina (YFP) na N- in C- koncu (SEQ ID: 22).
Za pripravo DNK konstruktov so bile uporabljene molekularne biološke metode (DNK fragmentacija z restrikcijskimi endonukleazami, DNK pomnoževanje z polimerazno verižno PCR reakcijo, PCR ligacijo, detekcijo DNK koncentracije, agarozno gelsko elektroforezo, čiščenjem fragmentov DNK iz agaroznega gela, ligacije DNK fragmentov v vektor, transformacija kompetentnih celic E.coli DH5a, izolacija plazmidne DNK z komercialno dostopnimi kiti, opazovanje in selekcija). Vsi postopki so bili izvajani v sterilnih pogojih (aseptična tehnika). DNK segmenti so bili okarakterizirani z restrikcijsko analizo in sekveniranjem.
Vse naštete uporabljene metode so podrobneje opisane v molekularno biološkem priročniku (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1659 p.).
Primer 4: Priprava rekombinantnega polipeptida SEQ ID NO 20, ki tvori tetraeder
DNK konstrukt (SEQ ID: 19) kodira za polipeptid (SEQ ID: 20), ki smo ga pripravili, da bi pokazali njogovo zmožnost tvorbe tetraedra s samosestavljanjem. Polipeptid je sestavljen iz štirih segmentov, ki tvorijo antiparalelne homodimere, dveh, ki tvorita paralelni homodimer, in šestih segmentov, ki tvorijo paralelne heterodimere v procesu samosestavljanja polipeptida v tetraeder, ki vsebuje šest robov.
Plazmidi, ki kodirajo odprt bralni okvir fuzijskih proteinov iz Slik 3A, 10A so bili transformirani v kompetentne celice E. coli BL21 (DE3) pLysS. Transformirane celice so bile gojene na LB ploščah z antibiotikom ampicilinom. Izbrane kolonije so bile inokulirane v 100 ml LB rastnega medija z antibiotikom in inkubirane čez noč na 37°C in 160 obratih stresalnika. Naslednji dan je bila prekonočna kultura celic razredčena 20-50 krat v LB mediju, da je dosegla optično gostoto 600 (OD600) med 0.1 in 0.2. Nato smo bakterijsko kulturo gojili do OD600 = 0.7, ko je bila sprožena indukcija proteina z dodatkom IPTG (1 mM). Štiri ure po indukciji proizvodnje proteina je bila kultura centrifugirana, dobljen je bil pelet bakterijskih celic. Ta je bil resuspendiran v pufru za lizo (Tris pH 8.0, 0.1% deoksiholat, z dodano mešanico proteinaznih inhibitorjev) in zmrznjen na -80°C. Lizirana suspenzija celic je bila naprej obdelana s procesom soniciranja, nato pa še centrifugirana. Precipitat (ostanek neliziranih celic in inkluzijska telesa) in supernatant sta bila preverjena, če je v
-26njih prisoten proteinski konstrukt s pomočjo SDS-PAGE elektroforeze (Slika 4) ali po potrebi z Western blot metodo z uporabo primarnih anti-His-tag protiteles. Proizveden rekombinantni protein je bil v večini primerov prisoten v netopni frakciji (inkluzijska telesca), ki vsebujejo več kot 80% izraženega proteina. Raztopina inkluzijskih telesc v 6 M GdnHCI pH 8.0 je bila nanešena na ΝΪ2+-ΝΤΑ kolono (Quiagen, GE). Sledilo je čiščenje proteina pod denaturajočimi pogoji, v skladu z navodili proizvajalca prečiščevalne kolone. Po eluciji z 250 mM imidazolom pH 5.8 so bile zbrane in združene frakcije, ki so vsebovale želen protein. Združene frakcije so bile dvakrat dializirane proti MilliQ vodi. Frakcije ki so vsebovale protein so bile preverjene s SDS-PAGE in Western blot metodo. Ker so bili po čiščenju z afinitetno kromatografijo detektirani razgradni produkti, je bil protein dodatno očiščen še s tekočinsko kromatografijo z obrnjeno fazo (HPLC-RP). Čistost proteina je bila preverjena še z gelsko filtracijo, in je bila > 90 % (Slika 5).
Primer 5: Priprava rekombinantnega polipeptida SEQ ID NO 22, ki tvori tetraeder
Kot je navedeno v Primeru 4 , smo tudi DNK konstrukt (SEQ ID NO 21), ki kodira za fuzijski polipeptid, sestavljen iz domene, ki kodira polipeptid za tvorbo tetraedra in domeno, ki kodira za protein split YFP (SEQ. ID NO 22). Precipitat (preostanek nezliziranih celic, inkluzijska telesca) in supematant smo preverili za produkcijo polipeptida z SDS-PAGE (Slika 11).
Primer 6: Zvitje polipeptida SEQ ID NO: 20
Ošiščen polipeptid SEQ ID NO: 20 iz Primera 4 v 6 M gvanidinijevem hidrokloridu (GdnHCI) smo redčili do koncentracije 5 pg/ml v 6 M GdnHCI v 20 mM Hepes pufru, pH 8.5,150 mM NaCI. 50 ml te raztopine smo dali v dializno cev z membrano, ki prepušča delce manjše od 3.5 kDa (MWC0 3.5 kDa), potopili cev v pufer 20 mM Hepes pufru, pH 8.5,150 mM NaCI. Ob rahlem mešanju 500 rpm je dializa potekala 20 ur pri 4°C. Po dializi smo vzorec koncentrirali s koncentratorjem z MWC0 30 kDa, nato pa še s koncentratorjem MWC0 100 kDa, da smo odstranili večje agregate.
Primer 7: Kontrolirano zvitje polipeptida SEQ ID NO: 20
Podobno, kot je opisano v Primeru 6, smo očiščen polipeptid SEQ ID NO: 20 iz Primera 4 v 6 M GdnHCI redčili do koncentracije 5 gg/ml v istem pufru s 6 M GdnHCI. Raztopino vzorca smo dali v dializno cev z membrano MWC0 3.5 kDa in jo potopili v razopino s 6M GdnHCI. Pufrsko raztopino 20 mM HEPES, pH 8.5, 150 mM NaCI brez GdnHCI smo počasi dodajali s črpalko. Pretoke smo
-27predhodno programirali. Dializa je potekala 20 ur, v tem času je koncentracija GdnHCI padla na 0.5 M.
Primer 8: Zvitie polipeptida SEQ ID NO: 22
Očiščem polipeptid SEQ ID NO: 22 iz Primera 5 v 6 M gvanidinijevem kloridu (GdnHCI) smo redčili do koncentracije 2 mg/ml v 6 M GdnHCI v 50 mM Tris pufru (pH 8.0), 300mM NaCI, 5 mM MgCI2, 2 mM β-merkaptoetanol. 50 ml raztopine smo položili v dializno cev z membrano MWC0 3.5 kDa, in jo postavili v pufer 50 mM Tris (pH 8.0), 300mM NaCI, 5 mM MgCI2, 2 mM β-merkaptoetanol. Ob rahlem mešanju 500 rpm je dializa potekala 20 ur pri 4°C. Po dializi smo vzorec koncentrirali s koncentratorjem z MWC0 30 kDa, nato pa še s koncentratorjem MWC0 100 kDa, da smo odstranili večje agregate.
Primer 9: Določanje lastnosti polipeptida SEQ ID: 20
Meritve spektrov cirkularnega dikroizma (CD) v območju od 260 do 200 nm na CD spektrometru Applied Photophysics (Slika 6A) polipepetida SEQ ID: 20 so pokazale prisotnost velikega deleža ahelične sekundarne strukture.
Očiščen polipeptid SEQ ID: 20 v 6M gvanidinijevim hidrokloridu je bil razredčen na končno koncentracijo 0.1 mg/ml v pufru 20 mM HEPES pH 8.5 z različnimi koncentracijami gvanidinijevega hidroklorida, v razponu od 6M GvdHCI do raztopine brez tega denaturanta. Sekundarna struktura polipeptida pri različnih koncentracijah GvdHCI je bila določena s pomočjo meritev CD spektrov (Slika 6B).
Krivulje temperaturne denaturacije (Slika 6C) in nato renaturacije (Slika 6D) so bile pridobljene za polipeptid v raztopini brez prisotnosti denaturanta z merjenjem cirkularnega dikroizma pri 222 nm, v intervalih 1 °C/min. Temperaturna denaturacija je bila reverzibilna.
Velikost polipeptida SEQ ID: 20 v raztopini denaturanta (6 M GdnHCI, Slika 7A) in po ponovnem zvitju polipeptida (0 M GdnHCI, Slika 7B) je bila izmerjena na ZetasizerNano (Malvern, UK). Meritve so potrdile, da je hidrodinamski radij (Hd) denaturiranega proteina (9.45 nm) večji od Hd polipeptida pod nativnimi pogoji (6.88 nm), kar je v skladu z računalniškim modelom.
Vzorec z samosestavljenimi nanostrukturami je bil analiziran še z transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM). Vzorec pridobljen z ponovnim zvitjem polipeptida SEQ ID: 20, je bil nanešen
-28na mrežico za TEM analizo in senčen z uranil acetatom. Drugi način barvanja je tak, da se vzorec pred senčenjem z uranil acetatom inkubira z reagentom Nanogold 2nm (Nanoprobes, Yaphank, NY, USA). Mikrografi pridobljeni z TEM so pokazali prisotnost tetraedrov z robovi dolgimi od 5 nm do 10 nm (Slika 8). Ob uporabi Nanogold reagenta, so bile na eni od stranic tetraedra vidne 2 nm pike, kar je v skladu s tem, da se reagent kot pričakovano veže na heksahistidinski rep polipeptida.
Vzorec s samosestavljeni nanostrukturami tetraedra je bil analiziran z mikroskopom na atomsko silo (AFM), kar je pokazalo prisotnost nanodelcev, manjših od 10 nm (Slika 9), kar je v skladu z napovedmi za samosesatavljen tetraeder s stranicami iz ovitih vijačnic.
Primer 10: Določanje lastnosti polipeptida SEQ ID: 22
Pravilno samosestavljanje polipeptida SEQ ID: 22 je bilo dokazano z merjenjem fluorescence YFP, rekonstruiranega iz dveh segmentov tega proteina , ki sta bila dodana na N- in C- konec polipeptida, ki tvori tetraeder. Vzorcu je bila izmerjena fluorescenca, kar potrjuje, da začetek in konec polipeptida, ki tvori tetraeder, sovpadata v pravilno zvito nanostrukturo.
Vzorec z samosestavljeno nanostrukturo je bil analiziran s TEM. Vzorec z polipeptidom SEQ ID: 22 je bil nanešen na mrežico za TEM analizo in po inkubaciji z reagentom Nanogold 2 nm, senčen z uranil acetatom. Slike pridobljene s TEM so pokazale prisotnost tetraedrov s stranicami od 5 nm do 10 nm (Slika 13). Na eni od stranic tetraedrov so bile opazne črne pike velikosti 2 nm, kar je v skladu s tem, da se reagent Nanogold veže na heksahistidinski označevalec na polipeptidu.
Vzorec z samosestavljeni nanostrukturami tetraedra je bil analiziran z mikroskopom na atomsko silo (AFM), kar je pokazalo prisotnost nanodelcev, velikosti okoli 20 nm (Slika 14). Oblike nanostruktur so bile v skladu z napovedmi, in sicer tetraedrične z dodanim YFP na enem oglišču.
-29Tehnološka in farmacevtska uporabnost
Nano-tetraedri iz polipeptidov imajo veliko možnosti za uporabo v različnih tehnologijah. Lahko se jih uporabi za obdajanje nanodelcev v različne namene, kot so dostava zdravil, kemijska kataliza znotraj tetraedra ali na površini za vezavo specifičnih spojin, kot nosilec cepiv, proti tumorskih ali farmacevtskih učinkovin, združevanje anorganskih ali organskih spojin na definiranih mestih polipeptidnega tetradera, za diagnostiko na osnovi samosestavljanja ali rekonstitucije razcepljenih proteinskih domen dodanih na izbrana mesta znotraj poliedrične polipeptidne strukture.
SEZNAM SEKVENC <110> Kemijski inštitut, Ljubljana; Jerala, Roman; Gradišar,
Helena; Doles, Tibor; Božič, Sabina <120> Samosestavijivi polipeptidni tatraedri <160> 22 <210> 1 <211> 135 <212> DNA <213> synthetic sequence <220>
<221> CDS <222> (1)..(135) <223> APH <400> 1 atg aaa cag ctg gaa aaa gag ctg aaa cag tta gaa aaa gaa ctg caa 48
Met Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu Gin 15 10 15 gca att gaa aaa cag ctg gca cag ctg caa tgg aaa gca cag gca cgt 96
Ala Ile Glu Lys Gin Leu Ala Gin Leu Gin Trp Lys Ala Gin Ala Arg 20 25 30 aaa aaa aaa ctg gcc cag ctg aaa aaa aaa ctt cag gcc 135
Lys Lys Lys Leu Ala Gin Leu Lys Lys Lys Leu Gin Ala 35 40 45 <210> 2 <211> 45 <212> PRT
<213> synthetic sequence <220>
<223> APH, coiled-coil-forming segment <400> 2
| Met | Lys | Gin | Leu | Glu | Lys | Glu | Leu | Lys | Gin | Leu | Glu | Lys | Glu | Leu | Gin |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ala | Ile | Glu | Lys | Gin | Leu | Ala | Gin | Leu | Gin | Trp | Lys | Ala | Gin | Ala | Arg |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Lys | Lys | Lys | Leu | Ala | Gin | Leu | Lys | Lys | Lys | Leu | Gin | Ala | |||
| 35 | 40 | 45 |
<210> 3 <211> 111 <212> DNA <213> synthetic protein <220>
<221> CDS <222> (1)..(111) <223> BCR <400> 3 atg gat att gaa cag gaa ctg gaa cgc gca aaa gca agc att cgt cgt 48
Met Asp Ile Glu Gin Glu Leu Glu Arg Ala Lys Ala Ser Ile Arg Arg 15 10 15 ctg gaa cag gaa gtt aat caa gaa cgt agc cgt atg gca tat ctg caa 96
Leu Glu Gin Glu Val Asn Gin Glu Arg Ser Arg Met Ala Tyr Leu Gin 20 25 30 acc ctg ctg gca aaa
111
-32Thr Leu Leu Ala Lys 35 <210> 4 <211> 37 <212> PRT <213> synthetic protein <220>
<223> BCR, coiled-coil-forming segment <400> 4
| Met | Asp | Ile | Glu | Gin | Glu | Leu | Glu | Arg | Ala | Lys | Ala | Ser | Ile | Arg | Arg |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Leu | Glu | Gin | Glu | Val | Asn | Gin | Glu | Arg | Ser | Arg | Met | Ala | Tyr | Leu | Gin |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Leu | Ala | Lys |
<210> 5 <211> 84 <212> DNA <213> Synthetic sequence <220>
<221> CDS <222> (1)..(84) <223> GCNshort <400> 5 cag tta gaa gac aaa gtt gaa gaa ctg ctg agc aag aac tac cat ctg 48
Gin Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu 5
-33gaa aat gaa gtt gcc cgt ctg aaa aaa ctg gtt ggt
Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly 20 25 <210> 6 <211> 33 <212> PRT <213> Synthetic <220>
<223> GCN short, coiled-coil-forming segment <400> 6
Gin Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu 15 10 15
Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly
25 <210> 7 <211> 99 <212> DNA <213> Synthetic <220>
<221> CDS <222> (1)..(99) <223> P3 <400> 7
| tcc | ccg | gaa | gat | gag | ate | cag | caa | ctg | gaa | gaa | gaa | ate | gct | cag | ctg |
| 48 | |||||||||||||||
| Ser | Pro | Glu | Asp | Glu | Ile | Gin | Gin | Leu | Glu | Glu | Glu | Ile | Ala | Gin | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 |
-34gaa cag aaa aac gca gcg ctg aaa gag aaa aac cag gcg ctg aaa tac 96
Glu Gin Lys Asn Ala Ala Leu Lys Glu Lys Asn Gin Ala Leu Lys Tyr 20 25 30 ggt
Gly <210> 8 <211> 33 <212> PRT <213> Synthetic <220>
<223> P3, coiled-coil-forming segment <400> 8
| Ser | Pro | Glu | Asp | Glu | Ile | Gin | Gin | Leu | Glu | Glu | Glu | Ile | Ala | Gin | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Glu | Gin | Lys | Asn | Ala | Ala | Leu | Lys | Glu | Lys | Asn | Gin | Ala | Leu | Lys | Tyr |
| 20 | 25 | 30 |
Gly <210> 9 <211> 99 <212> DNA <213> Synthetic <220>
<221> CDS <222> (1)..(99) <223> P4
-35<400> 9
| agc 48 | ccg | gaa | gat | aaa | att | gct | cag | ctg | aaa | caa | aaa | ate | caa | gcg | ctg |
| Ser 1 | Pro | Glu | Asp | Lys 5 | Ile | Ala | Gin | Leu | Lys 10 | Gin | Lys | Ile | Gin | Ala 15 | Leu |
| aaa 96 | cag | gaa | aac | cag | cag | ctg | gaa | gag | gaa | aac | gcc | gca | ctg | gaa | tat |
| Lys | Gin | Glu | Asn | Gin | Gin | Leu | Glu | Glu | Glu | Asn | Ala | Ala | Leu | Glu | Tyr |
25 30 ggt
Gly <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Synthetic <220>
<223> P4, coiled-coil-forming segment <400> 10
| Ser | Pro | Glu | Asp | Lys | Ile | Ala | Gin | Leu | Lys | Gin | Lys | Ile | Gin | Ala | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Lys | Gin | Glu | Asn | Gin | Gin | Leu | Glu | Glu | Glu | Asn | Ala | Ala | Leu | Glu | Tyr |
| 20 | 25 | 30 |
Gly <210> 11 <211> 99 <212> DNA <213> Synthetic
| <220> | ||
| <221> <222> <223> | CDS | |
| (D .. P5 | . (99 | |
| <400> | 11 |
tct cct
Ser Pro aaa caa gaa gac gaa aac gca get
Glu Asp Glu Asn Ala Ala 5 aag aac gcg gca ctg aaa ctg gaa
Leu Glu gag aaa
Glu Lys att gca caa ctg
Ile Ala Gin Leu gaa gaa att caa gca ctg gaa
Lys Gin Lys Asn Ala Ala Leu Lys Glu Glu Ile Gin Ala Leu Glu Tyr ggc
Gly <210> 12 <211> 33 <212> PRT <213> Synthetic <220>
<223> P5, coiled-coil-forming segment <400> 12
Ser Pro Glu Asp Glu Asn Ala Ala Leu Glu Glu Lys Ile Ala Gin Leu 15 10 15
Lys Gin Lys Asn Ala Ala Leu Lys Glu Glu Ile Gin Ala Leu Glu Tyr
25 30
Gly
| -37- | • · · · · · · | ||||||||||||
| <210> | 13 | ||||||||||||
| <211> | 99 | ||||||||||||
| <212> | DNA | ||||||||||||
| <213> | Synthetic | ||||||||||||
| <220> | |||||||||||||
| <221> | CDS | ||||||||||||
| <222> | (D · | (99) | |||||||||||
| <223> | P6 | ||||||||||||
| <400> | 13 | ||||||||||||
| agc ccg 48 | gaa | gat aaa | aac | gcc | get | ctg | aaa | gag | gaa | ate | cag | gcg | ctg |
| Ser Pro | Glu | Asp Lys | Asn | Ala | Ala | Leu | Lys | Glu | Glu | Ile | Gin | Ala | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||
| gaa gaa 96 | gaa | aac cag | get | ctg | gaa | gag | aaa | ate | gca | cag | ctg | aaa | tat |
| Glu Glu | Glu | Asn Gin | Ala | Leu | Glu | Glu | Lys | Ile | Ala | Gin | Leu | Lys | Tyr |
| 20 | 25 | 30 |
ggt
Gly <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> Synthetic <220>
<223> P6, coiled-coil-forming segment <400> 14
Ser Pro Glu Asp Lys Asn Ala Ala Leu Lys Glu Glu Ile Gin Ala Leu
| 1 | 5 | 10 | 15 |
| Glu Glu Glu Asn | Gin Ala Leu Glu Glu | Lys | Ile Ala Gin Leu Lys Tyr |
| 20 | 25 | 30 | |
| Gly |
| <210> | 15 | ||||||||||||
| <211> | 99 | ||||||||||||
| <212> | DNA | ||||||||||||
| <213> | Synthetic | ||||||||||||
| <220> | |||||||||||||
| <221> | CDS | ||||||||||||
| <222> | (D · · | . 09) | |||||||||||
| <223> | P7 | ||||||||||||
| <400> | 15 | ||||||||||||
| tcc ccg | gag | gat gag | ate | cag | gcg | ctg | gaa | gaa | aag | aac | gcc | cag | ctg |
| 48 | |||||||||||||
| Ser Pro | Glu | Asp Glu | Ile | Gin | Ala | Leu | Glu | Glu | Lys | Asn | Ala | Gin | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||
| aag cag | gaa | att gcg | gca | ctg | gaa | gag | aag | aac | cag | gcc | ctg | aag | tac |
| 96 | |||||||||||||
| Lys Gin | Glu | Ile Ala | Ala | Leu | Glu | Glu | Lys | Asn | Gin | Ala | Leu | Lys | Tyr |
| 20 | 25 | 30 |
ggt
Gly <210> 16 <211> 33 <212> PRT <213> Synthetic <220>
-39<223> Ρ7, coiled-coil-forming segment <400> 16
| Ser | Pro | Glu | Asp | Glu | Ile | Gin | Ala | Leu | Glu | Glu | Lys | Asn |
| 1 | 5 | 10 | ||||||||||
| Lys | Gin | Glu | Ile | Ala | Ala | Leu | Glu | Glu | Lys | Asn | Gin | Ala |
| 20 | 25 |
Gly
Ala
Leu
Gin Leu
Lys Tyr <210> 17 <211> 99 <212> DNA <213> Synthetic <220>
<221> CDS <222> (1)..(99) <223> P8 <400> 17
| tcc 48 | ccg | gaa | gac | aaa | ate | gct | cag | ctg | aaa | gaa | gaa | aac | cag | cag | ctg |
| Ser 1 | Pro | Glu | Asp | Lys 5 | Ile | Ala | Gin | Leu | Lys 10 | Glu | Glu | Asn | Gin | Gin 15 | Leu |
| gaa 96 | caa | aag | att | cag | gcc | ctg | aag | gag | gaa | aac | gca | gct | ctg | gaa | tac |
| Glu | Gin | Lys | Ile | Gin | Ala | Leu | Lys | Glu | Glu | Asn | Ala | Ala | Leu | Glu | Tyr |
25 30 ggc
Gly <210> 18
-40<211> 33 <212> PRT <213> Synthetic <220>
<223> Ρ8, coiled-coil-forming segment <400> 18
Ser Pro Glu Asp Lys Ile Ala Gin Leu Lys Glu Glu Asn Gin Gin Leu 15 10 15
Glu Gin Lys Ile Gin Ala Leu Lys Glu Glu Asn Ala Ala Leu Glu Tyr
25 30
Gly <210> 19 <211> 1380 <212> DNA <213> Synthetic sequence <220>
<221> CDS <222> (1)..(1380) <223> TET12 <400> 19 atg aaa cag ctg gaa aaa gaa ctg aaa cag tta gag aaa gag ctg caa 48
Met Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu Gin 1 5
-41gcc att gaa aaa cag 96
Ala Ile Glu Lys Gin 20 aaa aag aaa ctg gcc 144
Lys Lys Lys Leu Ala 35 ggt tca ccg gaa gat 192
Gly Ser Pro Glu Asp 50 ctg aaa gag aaa aac 240
Leu Lys Glu Lys Asn 65 tat ggt agt ggt ccg 288
Tyr Gly Ser Gly Pro 85 gca agc att cgt cgt 336
Ala Ser Ile Arg Arg 100 atg gca tat ctg caa 384
Met Ala Tyr Leu Gin 115 gaa gac aaa gtt gaa 432 ctg gca cag ctg caa tgg
Leu Ala Gin Leu Gin Trp 25 cag ctg aaa aaa aag ctg
Gin Leu Lys Lys Lys Leu 40 aaa att gca cag ctg aaa
Lys Ile Ala Gin Leu Lys 55 cag caa ctg aaa gaa aag
Gin Gin Leu Lys Glu Lys 70 75 ggt gat att gaa caa gaa
Gly Asp Ile Glu Gin Glu 90 ctg gaa caa gaa gtt aat
Leu Glu Gin Glu Val Asn
105 acc ctg ctg gca aaa tca
Thr Leu Leu Ala Lys Ser 120 gaa ctg ctg agc aag aac aaa gca cag gca cgt
Lys Ala Gin Ala Arg 30 caa gca agc ggt ccg
Gin Ala Ser Gly Pro 45 gaa aaa aat gca gcc
Glu Lys Asn Ala Ala 60 att cag gcg ctg aaa
Ile Gin Ala Leu Lys 80 ctg gaa cgt gca aaa
Leu Glu Arg Ala Lys 95 caa gaa cgt agc cgc
Gin Glu Arg Ser Arg 110 ggt ccg ggt cag tta
Gly Pro Gly Gin Leu 125 tac cat ctg gaa aat
-42Glu gaa
480
Glu
145 caa
528
Gin gag
576
Glu aag
624
Lys cct
672
Pro caa
720
Gin
225 tet
768
Ser
Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn 130 135 140 gtt gcc cgt ctg aaa aaa ctg gtt ggt tet ggt ccg ggt atg aag
Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Ser Gly Pro Gly Met Lys 150 155 160 tta gaa aaa gag tta aaa caa ctg gaa aaa gag tta cag gcc ate
Leu Glu Lys Glu Leu Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu Gin Ala Ile
165 170 175 aaa cag tta gca cag tta cag tgg aaa gcc cag get cgc aaa aaa
Lys Gin Leu Ala Gin Leu Gin Trp Lys Ala Gin Ala Arg Lys Lys
180 185 190 tta gcc caa ctg aag aag aaa tta cag gca tca ggt cct ggt agc
Leu Ala Gin Leu Lys Lys Lys Leu Gin Ala Ser Gly Pro Gly Ser
195 200 205 gaa gat gaa ate cag gca ctg gaa gaa aaa aac gcg cag ctg aaa
Glu Asp Glu Ile Gin Ala Leu Glu Glu Lys Asn Ala Gin Leu Lys
210 215 220 gaa att gcc gca tta gag gaa aaa aac cag gca ctg aaa tac ggt
Glu Ile Ala Ala Leu Glu Glu Lys Asn Gin Ala Leu Lys Tyr Gly
230 235 240 ggt cct ggt caa ctg gaa gat aag gtg gaa gaa tta ctg teg aaa
Gly Pro Gly Gin Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys
245
250
255
-43aac tat
816
Asn Tyr agc ggt 864
Ser Gly ate cag 912
Ile Gin
290 gca ctg 960
Ala Leu
305 gcc tta 1008
Ala Leu aaa gag
1056 Lys Glu gag gac
1104 Glu Asp cat tta gaa aac gaa gtg gca cgc ctg aaa aag tta gtt ggt
His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly
260 265 270 cca ggt agt cca gaa gat aaa ate gcc cag tta aaa cag aaa
Pro Gly Ser Pro Glu Asp Lys Ile Ala Gin Leu Lys Gin Lys
275 280 285 gcc ctg aaa caa gag aat cag cag ctg gaa gag gaa aat gca
Ala Leu Lys Gin Glu Asn Gin Gin Leu Glu Glu Glu Asn Ala
295 300 gaa tat ggc agc ggt cct ggc tet ccc gaa gat gaa aac gct
Glu Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Glu Asp Glu Asn Ala
310 315 320 gaa gag aaa att gcg caa ctg aag cag aag aat gcc gca ctg
Glu Glu Lys Ile Ala Gin Leu Lys Gin Lys Asn Ala Ala Leu
325 330 335 gaa att cag gcc ctg gaa tac ggc tca ggt cca ggt tet cct
Glu Ile Gin Ala Leu Glu Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro
340 345 350 aaa ate gca caa tta aaa gaa gaa aac caa cag ctg gaa cag
Lys Ile Ala Gin Leu Lys Glu Glu Asn Gin Gin Leu Glu Gin
355 360
365
-44aaa att caa gcc tta aaa gaa gag aac get gcc ctg gaa tat ggt tet 1152
Lys Ile Gin Ala Leu Lys Glu Glu Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Gly Ser 370 375 380 ggc cct ggc gat ate gaa caa gaa tta gaa aga gcc aaa gcc agt ate 1200
Gly Pro Gly Asp Ile Glu Gin Glu Leu Glu Arg Ala Lys Ala Ser Ile
385 390 395 400 cgt cgt tta gaa caa gag gta aac caa gag cgt tca cgt atg gca tat
1248
Arg Arg Leu Glu Gin Glu Val Asn Gin Glu Arg Ser Arg Met Ala Tyr 405 410 415 tta cag aca ctg ctg gcc aaa agt ggt cct ggc tcc cca gag gat aaa 1296
Leu Gin Thr Leu Leu Ala Lys Ser Gly Pro Gly Ser Pro Glu Asp Lys 420 425 430 aat gcc get tta aaa gag gaa ate caa gcc tta gaa gag gaa aac cag 1344
Asn Ala Ala Leu Lys Glu Glu Ile Gin Ala Leu Glu Glu Glu Asn Gin 435 440 445 gcg tta gag gaa aag att get cag ctg aag tat ggt
1380
Ala Leu Glu Glu Lys Ile Ala Gin Leu Lys Tyr Gly 450 455 460
| <210> | 20 |
| <211> | 460 |
| <212> | PRT |
| <213> | Synthetic seguence |
<220>
-45<223> ΤΕΤ12, tetrahedron-forming polypeptide seguence <400> 20
Met Lys Gin 1
Ala Ile Glu
Lys Lys Lys 35
Gly Ser Pro 50
Leu Lys Glu 65
Tyr Gly Ser
Ala Ser Ile
Met Ala Tyr 115
Glu Asp Lys 130
Glu Val Ala
145
Gin Leu Glu
Glu Lys Gin
Lys Leu Ala 195
Pro Glu Asp 210
Gin Glu Ile
225
Ser Gly Pro
Asn Tyr His
Leu Glu Lys Glu 5
Lys Gin Leu Ala 20
Leu Ala Gin Leu
Glu Asp Lys Ile 55
Lys Asn Gin Gin 70
Gly Pro Gly Asp 85
Arg Arg Leu Glu 100
Leu Gin Thr Leu
Val Glu Glu Leu
135
Arg Leu Lys Lys 150
Lys Glu Leu Lys 165
Leu Ala Gin Leu
180
Gin Leu Lys Lys
Glu Ile Gin Ala
215
Ala Ala Leu Glu
230
Gly Gin Leu Glu 245
Leu Glu Asn Glu 260
Leu Lys Gin 10
Gin Leu Gin
Lys Lys Lys 40
Ala Gin Leu
Leu Lys Glu
Ile Glu Gin
Gin Glu Val
105
Leu Ala Lys 120
Leu Ser Lys
Leu Val Gly
Gin Leu Glu
170
Gin Trp Lys 185
Lys Leu Gin 200
Leu Glu Glu
Glu Lys Asn
Asp Lys Val 250
Val Ala Arg 265
Leu Glu Lys
Trp Lys Ala
Leu Gin Ala
Lys Glu Lys 60
Lys Ile Gin 75
Glu Leu Glu
Asn Gin Glu
Ser Gly Pro 125
Asn Tyr His 140
Ser Gly Pro 155
Lys Glu Leu
Ala Gin Ala
Ala Ser Gly 205
Lys Asn Ala 220
Gin Ala Leu
235
Glu Glu Leu
Leu Lys Lys
Glu Leu Gin
Gin Ala Arg 30
Ser Gly Pro
Asn Ala Ala
Ala Leu Lys 80
Arg Ala Lys 95
Arg Ser Arg 110
Gly Gin Leu
Leu Glu Asn
Gly Met Lys 160
Gin Ala Ile
175
Arg Lys Lys 190
Pro Gly Ser
Gin Leu Lys
Lys Tyr Gly 240
Leu Ser Lys 255
Leu Val Gly 270
-46Ser Gly Pro Gly Ser Pro 275
Ile Gin Ala Leu Lys Gin 290
Ala Leu Glu Tyr Gly Ser 305 310
Ala Leu Glu Glu Lys Ile
325
Lys Glu Glu Ile Gin Ala 340
Glu Asp Lys Ile Ala Gin 355
Lys Ile Gin Ala Leu Lys 370
Gly Pro Gly Asp Ile Glu 385 390
Arg Arg Leu Glu Gin Glu
405
Leu Gin Thr Leu Leu Ala
420
Asn Ala Ala Leu Lys Glu 435
Ala Leu Glu Glu Lys Ile 450
Glu Asp Lys Ile Ala 280
Glu Asn Gin Gin Leu
295
Gly Pro Gly Ser Pro 315
Ala Gin Leu Lys Gin 330
Leu Glu Tyr Gly Ser 345
Leu Lys Glu Glu Asn 360
Glu Glu Asn Ala Ala
375
Gin Glu Leu Glu Arg 395
Val Asn Gin Glu Arg 410
Lys Ser Gly Pro Gly 425
Glu Ile Gin Ala Leu
440
Ala Gin Leu Lys Tyr 455
Gin Leu Lys Gin Lys 285
Glu Glu Glu Asn Ala
300
Glu Asp Glu Asn Ala 320
Lys Asn Ala Ala Leu 335
Gly Pro Gly Ser Pro 350
Gin Gin Leu Glu Gin
365
Leu Glu Tyr Gly Ser 380
Ala Lys Ala Ser Ile 400
Ser Arg Met Ala Tyr 415
Ser Pro Glu Asp Lys 430
Glu Glu Glu Asn Gin
445
Gly
460 <210> 21 <211> 2112 <212> DNA <213> Synthetic sequence <220>
<221> CDS <222> (1)..(2112) <223> TET12 split YFP
-47<400> 21 gat aaa cag aaa aat ggc ate aaa gtg aac ttc aaa ate ege cac 48
Asp Lys Gin Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His 15 10 15 ate gag gat ggt agt gta caa ctg gcc gat cac tat caa caa aac 96
Ile Glu Asp Gly Ser Val Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin Gin Asn 20 25 30 ccg att ggt gac ggg ccg gtt ctg ctg cct gat aac cat tat ctg 144
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu 35 40 45 tat caa tet gcc ctg tcc aaa gat ccg aac gag aaa cgt gac cac 192
Tyr Gin Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His 50 55 60 gta ctg ctg gaa ttt gtg act get gcc ggt att acc ctg ggt atg 240
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met 65 70 75 gaa ctg tat aaa atg aaa cag ctg gaa aaa gaa ctg aaa cag tta 288
Glu Leu Tyr Lys Met Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu Lys Gin Leu 85 90 95 aaa gag ctg caa gcc att gaa aaa cag ctg gca cag ctg caa tgg 336
Lys Glu Leu Gin Ala Ile Glu Lys Gin Leu Ala Gin Leu Gin Trp aac
Asn acc
Thr tca
Ser atg
Met gac
Asp gag
Glu aaa
Lys
100
105
110
-48gca cag gca cgt aaa aag aaa ctg gcc cag ctg aaa aaa aag ctg 384
Ala Gin Ala Arg Lys Lys Lys Leu Ala Gin Leu Lys Lys Lys Leu 115 120 125 gca agc ggt ccg ggt tca ccg gaa gat aaa att gca cag ctg aaa 432
Ala Ser Gly Pro Gly Ser Pro Glu Asp Lys Ile Ala Gin Leu Lys 130 135 140 aaa aat gca gcc ctg aaa gag aaa aac cag caa ctg aaa gaa aag 480
Lys Asn Ala Ala Leu Lys Glu Lys Asn Gin Gin Leu Lys Glu Lys 145 150 155 cag gcg ctg aaa tat ggt agt ggt ccg ggt gat att gaa caa gaa 528
Gin Ala Leu Lys Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Asp Ile Glu Gin Glu 165 170 175 gaa cgt gca aaa gca agc att cgt cgt ctg gaa caa gaa gtt aat 576
Glu Arg Ala Lys Ala Ser Ile Arg Arg Leu Glu Gin Glu Val Asn 180 185 190 gaa cgt agc cgc atg gca tat ctg caa acc ctg ctg gca aaa tca 624
Glu Arg Ser Arg Met Ala Tyr Leu Gin Thr Leu Leu Ala Lys Ser 195 200 205 ccg ggt cag tta gaa gac aaa gtt gaa gaa ctg ctg agc aag aac 672
Pro Gly Gin Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn 210 215 220 cat ctg gaa aat gaa gtt gcc cgt ctg aaa aaa ctg gtt ggt tet 720 caa
Gin gaa
Glu att
Ile
160 ctg
Leu caa
Gin ggt
Gly tac
Tyr ggt
His Leu 225 ccg ggt 768
Pro Gly tta cag 816
Leu Gin gct cgc 864
Ala Arg ggt cct 912
Gly Pro 290 gcg cag
960
Ala Gin
305 ctg aaa 1008 Leu Lys tta ctg 1056
Leu Leu
-49Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu 230 atg aag caa tta gaa aaa gag
Met Lys Gin Leu Glu Lys Glu 245 gcc ate gag aaa cag tta gca
Ala Ile Glu Lys Gin Leu Ala 260 265 aaa aaa aag tta gcc caa ctg
Lys Lys Lys Leu Ala Gin Leu 275 280 ggt agc cct gaa gat gaa ate
Gly Ser Pro Glu Asp Glu Ile
295 ctg aaa caa gaa att gcc gca
Leu Lys Gin Glu Ile Ala Ala
310 tac ggt tet ggt cct ggt caa
Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gin
325 tcg aaa aac tat cat tta gaa
Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu
340 345
Lys Lys Leu Val Gly Ser Gly 235 240 tta aaa caa ctg gaa aaa gag
Leu Lys Gin Leu Glu Lys Glu 250 255 cag tta cag tgg aaa gcc cag
Gin Leu Gin Trp Lys Ala Gin
270 aag aag aaa tta cag gca tca
Lys Lys Lys Leu Gin Ala Ser
285 cag gca ctg gaa gaa aaa aac
Gin Ala Leu Glu Glu Lys Asn
300 tta gag gaa aaa aac cag gca
Leu Glu Glu Lys Asn Gin Ala
315 320 ctg gaa gat aag gtg gaa gaa
Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu
330 335 aac gaa gtg gca cgc ctg aaa
Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
350
-50aag tta 1104 Lys Leu tta aaa
1152 Leu Lys
370 gag gaa
1200
Glu Glu
385 gat gaa 1248 Asp Glu aat gcc 1296
Asn Ala cca ggt 1344 Pro Gly cag ctg 1392
Gin Leu gtt ggt agc ggt cca ggt agt cca gaa gat aaa ate gcc
Val Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Glu Asp Lys Ile Ala 355 360 365 cag aaa ate cag gcc ctg aaa caa gag aat cag cag ctg
Gin Lys Ile Gin Ala Leu Lys Gin Glu Asn Gin Gin Leu
375 380 aat gca gca ctg gaa tat ggc agc ggt cct ggc tet ccc
Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro
390 395 aac gct gcc tta gaa gag aaa att gcg caa ctg aag cag
Asn Ala Ala Leu Glu Glu Lys Ile Ala Gin Leu Lys Gin
405 410 415 gca ctg aaa gag gaa att cag gcc ctg gaa tac ggc tca
Ala Leu Lys Glu Glu Ile Gin Ala Leu Glu Tyr Gly Ser
420 425 430 tet cct gag gac aaa ate gca caa tta aaa gaa gaa aac
Ser Pro Glu Asp Lys Ile Ala Gin Leu Lys Glu Glu Asn
435 440 445 gaa cag aaa att caa gcc tta aaa gaa gag aac gct gcc
Glu Gin Lys Ile Gin Ala Leu Lys Glu Glu Asn Ala Ala
450 cag
Gin gaa
Glu gaa
Glu
400 aag
Lys ggt
Gly caa
Gin ctg
Leu
455
460
-51gaa tat 1440 Glu Tyr 465 aaa gcc
1488 Lys Ala cgt atg 1536 Arg Met cca gag
1584
Pro Glu gag gaa
1632
Glu Glu
530 tcc gga 1680 Ser Gly 545 ggt tet
Gly Ser agt ate
Ser Ile gca tat
Ala Tyr 500 gat aaa
Asp Lys 515 aac cag
Asn Gin act agt
Thr Ser ggc cct
Gly Pro 470 cgt cgt
Arg Arg 485 tta cag
Leu Gin aat gcc
Asn Ala gcg tta
Ala Leu ggt acc
Gly Thr 550 ggc gat
Gly Asp tta gaa
Leu Glu aca ctg
Thr Leu get tta
Ala Leu
520 gag gaa
Glu Glu
535 gta tcc
Val Ser ate gaa
Ile Glu caa gag
Gin Glu
490 ctg gcc
Leu Ala
505 aaa gag
Lys Glu aag att
Lys Ile aaa ggt
Lys Gly caa gaa
Gin Glu
475 gta aac
Val Asn aaa agt
Lys Ser gaa ate
Glu Ile get cag
Ala Gin
540 gaa gag
Glu Glu
555 tta gaa
Leu Glu caa gag
Gin Glu ggt cct
Gly Pro 510 caa gcc
Gin Ala
525 ctg aag
Leu Lys ctg ttt
Leu Phe aga gcc
Arg Ala 480 cgt tca
Arg Ser 495 ggc tcc
Gly Ser tta gaa
Leu Glu tat ggt
Tyr Gly act ggt
Thr Gly 560 gtt gta ccg att 1728
Val Val Pro Ile ttt tcc gtg tet 1776 ctg gtt gaa ctg gac
Leu Val Glu Leu Asp 565 ggc gag ggt gaa ggc ggt gac gta aat
Gly Asp Val Asn 570 gac gcg acc tac ggc cac
Gly His 575 ggt aaa aag
Lys ctg
-52Phe Ser acc ctg 1824
Thr Leu acc ctg 1872
Thr Leu
610 ccg gac
1920 Pro Asp 625 ggc tat 1968 Gly Tyr aag acc
2016 Lys Thr att gag 2064
Ile Glu cac aaa
2112 His Lys
690
Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys 580 585 590 aaa ttc ate tgt act act ggc aaa ctg ccg gtt ccg tgg
Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp 595 600 605 gtg acc acc ttc ggc tat ggc ctg caa tgt ttc gcg cgt
Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Gin Cys Phe Ala Arg
615 620 cac atg aag cag cac gac ttc ttc aag tcc gcg atg cca
His Met Lys Gin His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro
630 635 gtt cag gaa cgc acc att ttt ttc aag gat gat ggt aac
Val Gin Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn
645 650 655 cgc gct gaa gtg aaa ttc gaa ggc gac acc ctg gtt aac
Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn
660 665 670 ctg aaa ggc att gac ttc aaa gag gac ggt aac att ctg
Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu
675 680 685 ctg gaa tat aat tac aat tcc cat aac gtc tat att atg
Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met
695
Leu cca
Pro tac
Tyr gag
Glu
640 tac
Tyr cgc
Arg ggc
Gly gcc
Ala
700
-53<210> 22 <211> 704 <212> PRT <213> Synthetic sequence <220>
<223> ΤΕΤ12 split YFP, tetrahedron-forming polypeptide sequence bound to split-YFP via C-terminal and N-terminal, respectively <400>
Asp Lys 1
Ile Glu
Pro Ile
Tyr Gin
Val Leu
Glu Leu
Lys Glu
Ala Gin
Ala Ser
130 Lys Asn 145
Gin Ala
Glu Arg
Glu Arg
Gin Lys
Asp Gly
Gly Asp 35
Ser Ala
Leu Glu
Tyr Lys
Leu Gin
100 Ala Arg 115
Gly Pro
Ala Ala
Leu Lys
Ala Lys
180 Ser Arg
Asn Gly 5
Ser Val
Gly Pro
Leu Ser
Phe Val
Met Lys 85
Ala Ile
Lys Lys
Gly Ser
Leu Lys 150
Tyr Gly 165
Ala Ser
Met Ala
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His 10 15
Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin Gin Asn 25 30
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu 40 45
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His
60
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met
Gin Leu Glu Lys Glu Leu Lys Gin Leu 90 95
Glu Lys Gin Leu Ala Gin Leu Gin Trp 105 110
Lys Leu Ala Gin Leu Lys Lys Lys Leu 120 125
Pro Glu Asp Lys Ile Ala Gin Leu Lys
135 140
Glu Lys Asn Gin Gin Leu Lys Glu Lys
155
Ser Gly Pro Gly Asp Ile Glu Gin Glu 170 175
Ile Arg Arg Leu Glu Gin Glu Val Asn 185 190
Tyr Leu Gin Thr Leu Leu Ala Lys Ser
Asn
Thr
Ser
Met
Asp
Glu
Lys
Gin
Glu
Ile
160
Leu
Gin
Gly
-54195
Pro Gly Gin Leu Glu 210
His Leu Glu Asn Glu 225
Pro Gly Met Lys Gin 245
Leu Gin Ala Ile Glu
260
Ala Arg Lys Lys Lys 275
Gly Pro Gly Ser Pro 290
Ala Gin Leu Lys Gin 305
Leu Lys Tyr Gly Ser 325
Leu Leu Ser Lys Asn 340
Lys Leu Val Gly Ser 355
Leu Lys Gin Lys Ile 370
Glu Glu Asn Ala Ala
385
Asp Glu Asn Ala Ala 405
Asn Ala Ala Leu Lys 420
Pro Gly Ser Pro Glu 435
Gin Leu Glu Gin Lys 450
Glu Tyr Gly Ser Gly 465
Lys Ala Ser Ile Arg 485
200
Asp Lys Val Glu Glu Leu 215
Val Ala Arg Leu Lys Lys 230 235
Leu Glu Lys Glu Leu Lys
250
Lys Gin Leu Ala Gin Leu 265
Leu Ala Gin Leu Lys Lys 280
Glu Asp Glu Ile Gin Ala 295
Glu Ile Ala Ala Leu Glu
310 315
Gly Pro Gly Gin Leu Glu
330
Tyr His Leu Glu Asn Glu 345
Gly Pro Gly Ser Pro Glu 360
Gin Ala Leu Lys Gin Glu 375
Leu Glu Tyr Gly Ser Gly 390 395
Leu Glu Glu Lys Ile Ala
410
Glu Glu Ile Gin Ala Leu
425
Asp Lys Ile Ala Gin Leu 440
Ile Gin Ala Leu Lys Glu 455
Pro Gly Asp Ile Glu Gin 470 475
Arg Leu Glu Gin Glu Val
490
205
Leu Ser Lys Asn Tyr 220
Leu Val Gly Ser Gly 240
Gin Leu Glu Lys Glu 255
Gin Trp Lys Ala Gin 270
Lys Leu Gin Ala Ser 285
Leu Glu Glu Lys Asn 300
Glu Lys Asn Gin Ala 320
Asp Lys Val Glu Glu 335
Val Ala Arg Leu Lys 350
Asp Lys Ile Ala Gin 365
Asn Gin Gin Leu Glu
380
Pro Gly Ser Pro Glu 400
Gin Leu Lys Gin Lys 415
Glu Tyr Gly Ser Gly 430
Lys Glu Glu Asn Gin 445
Glu Asn Ala Ala Leu
460
Glu Leu Glu Arg Ala 480
Asn Gin Glu Arg Ser 495
-55Arg Met Ala Tyr Leu 500
Pro Glu Asp Lys Asn 515
Glu Glu Asn Gin Ala
530
Ser Gly Thr Ser Gly 545
Val Val Pro Ile Leu
565
Phe Ser Val Ser Gly 580
Thr Leu Lys Phe Ile 595
Thr Leu Val Thr Thr
610
Pro Asp His Met Lys 625
Gly Tyr Val Gin Glu 645
Lys Thr Arg Ala Glu 660
Ile Glu Leu Lys Gly 675
His Lys Leu Glu Tyr 690
Gin Thr Leu Leu Ala
505
Ala Ala Leu Lys Glu 520
Leu Glu Glu Lys Ile 535
Thr Val Ser Lys Gly 550
Val Glu Leu Asp Gly 570
Glu Gly Glu Gly Asp 585
Cys Thr Thr Gly Lys 600
Phe Gly Tyr Gly Leu 615
Gin His Asp Phe Phe 630
Arg Thr Ile Phe Phe 650
Val Lys Phe Glu Gly 665
Ile Asp Phe Lys Glu 680
Asn Tyr Asn Ser His 695
Lys Ser Gly Pro Gly Ser 510
Glu Ile Gin Ala Leu Glu
525
Ala Gin Leu Lys Tyr Gly 540
Glu Glu Leu Phe Thr Gly 555 560
Asp Val Asn Gly His Lys
575
Ala Thr Tyr Gly Lys Leu 590
Leu Pro Val Pro Trp Pro 605
Gin Cys Phe Ala Arg Tyr 620
Lys Ser Ala Met Pro Glu 635 640
Lys Asp Asp Gly Asn Tyr
655
Asp Thr Leu Val Asn Arg 670
Asp Gly Asn Ile Leu Gly 685
Asn Val Tyr Ile Met Ala
700
Claims (19)
1. Polipeptid, ki se lahko samosestavi v polieder, označen s tem, da vsebuje najmanj 12 segmentov, ki lahko tvorijo ovito vijačnico, ki so med seboj povezani s povezovalnimi segmenti, pri čemer je vsak rob poliedra sestavljen iz para segmentov, ki lahko tvorita ovite vijačnice in vsak tak par segmentov tvori strukturo iz ovitih vijačnic.
2. Polipeptid po zahtevku 1, označen, da ima vsak segment, ki lahko tvori ovite vijačnice, v paru segmentov, ki lahko tvorita ovite vijačnice, večjo verjetnost, da tvori strukturo iz ovite vijačnice samo s parnim segmentom, kot pa s katerimkoli drugim segmentom znotraj polipeptida.
3. Polipeptid, po zahtevkih 1 do 2, označen s tem, da vsebuje nevijačne povezovalne segmente, ki so zgrajeni iz najmanj enega aminokislinskega preostanka, prednostno iz 1 do 10 aminokislinskih preostankov, še bolj prednostno 2 do 6 aminokislinskih preostankov, najbolj prednostno 4 aminokislinskih preostankov.
4. Polipeptid, po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da vsebuje nevijačne povezovalne segmente, ki so tetrapeptidni segmenti z aminokislinsko sekvenco SGPG.
5. Polipeptid, po zahtevkih od 1 do 4, označen s tem, da vsebuje vsaj enega izmed segmentov, ki lahko tvorijo ovite vijačnice, izmed navedenih segmentov pod SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 in 18.
6. Polipeptid, po zahtevkih od 1 do 5, označen s tem, da vsebuje vsaj enega izmed segmentov, ki lahko tvorijo ovite vijačnice in izhajajo iz proteinov, ki se nahajajo v naravi in tvorijo motiv levcinske zadrge.
7. Polipeptid, po zahtevkih od 1 do 6, označen s tem, da je polieder, ki ga tvori tetraeder.
8. Polipeptid, po zahtevku 7, označen s tem, da vsebuje zaporedje segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice in si sledijo v razporedu Aa-Pa-Ab-Pb-Aa'-Pc-Pb'-Pa'-Pd-Pc'-Ab'-Pd' ali pa njihovih cikličnih permutacij, pri čemer Aa in Ab predstavljata segmenta, ki lahko tvorita antiparalelne ovite vijačnice s segmentoma Aa' in Ab' v navedenem vrstnem redu, in Pa do Pd predstavljajo segmente, ki lahko tvorijo paralelne ovite vijačnice s segmenti Pa' do Pd' v navedenem vrstnem redu.
Sl
9. Polipeptid po zahtevkih 7 ali 8, označen s tem, da vsebuje urejeno zaporedje segmentov, ki lahko tvorijo ovite vijačnice, v sledečem redu: APH-P3-BCR-GCN-APH-P7-GCN-P4-P5-P8BCR-P6 navedene kot sekvence s SEQ ID NOs 2, 8, 4, 6, 2, 16, 6, 10, 12, 18, 4 in 14 in v istem vrstnem redu ali pa njihove ciklične permutacije.
10. Polipeptid po zahtevku 7, označen s tem, da so tri stranice tetraedra od šestih sestavljene iz antiparalelnih dimerov ovitih vijačnic, ostale tri pa iz paralelnih dimerov ovitih vijačnic.
11. Fuzijski polipeptid sestavljen iz polipeptida po 6zahtevkih 1-10, označen s tem, da vsebuje funkcionalno polipeptidno domeno, pritrjeno na N- ali C- končni del polipeptidna, ki lahko tvori polieder.
12. Fuzijski polipeptid, po zahtevku 11, označen s tem, da je funkcionalna polipeptidna domena razcepljena na dva dela, od katerih je en del pritrjen na N-konec, drugi del pa na Ckonec polipeptidne verige, pri čemer se razcepljena dela funkcionalne polipeptidne domene, ko se polipeptidna veriga samosestavi v tetraeder, ponovno sestavita in pridobita funkcijo.
13. Fuzijski polipeptid, po zahtevku 12, označen s tem, da vsebuje funkcionalno polipeptidno domeno, ki je fluorescenčni protein razdeljen na dva dela, od katerih je en del pritrjen na Nkonec, drugi del pa na C-konec polipeptidne verige.
14. Polipeptidni polieder zgrajen iz polipeptida, kot je to navedeno v zahtevah 1 do 10, ali pa fuzijskega proteina, kot je navedeno v zahtevkih od 11 do 13.
15. Polipeptidni polieder, katerega robovi so zgrajeni iz povezanih dimernih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, vsebuje toliko segmentov, kot je dvokratnik števila robov poliedra, pri čemer polipeptidna veriga tvori zaprto pot okoli robov poliedra, povezovalni segmenti pa se nahajajo med dimernimi segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice in predstavljajo oglišča poliedra.
16. DNK, ki kodira zapis za polipeptid, po zahtevkih od 1 do 10, za fuzijski polipeptid, kot je navedeno v zahtevah 11 do 13, ali polipeptidni polieder, kot je navedeno v zahtevkih 14 ali
15.
17. DNK, po zahtevku 16, označena s tem, da vsebuje regulatorne elemente, ki so potrebni za produkcijo polipeptida ali fuzijskega proteina v živih celicah, kot so na primer bakterije, ali z in vitro transkripcijo in translacijo.
18. Polipeptidne poliederske nano-kletke, v katera se zapre zdravila z uporabo polipeptidov po zahtevkih od 1 do 10 ali fuzijskih proteinov po zahtevkih od 11 do 13, za uporabo za zdravljenje in diagnosticiranje pri ljudeh in živalih.
19. Polipeptidne poliederske nano-klete po zahtevku 18, označene s tem, da polipeptidi lahko vsebujejo tarčno specifične substance, ki usmerjajo nano-kletko k tarčnem tkivu.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI201100402A SI23902A (sl) | 2011-10-07 | 2011-10-07 | Samosestavljivi polipeptidni poliedri |
| US14/350,254 US20160311859A1 (en) | 2011-10-07 | 2012-07-29 | Self-assembling polypeptide polyhedra |
| PCT/SI2012/000052 WO2013052015A1 (en) | 2011-10-07 | 2012-08-29 | Self-assembling polypeptide polyhedra |
| EP12791872.0A EP2764018B1 (en) | 2011-10-07 | 2012-08-29 | Self-assembling polypeptide polyhedra |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI201100402A SI23902A (sl) | 2011-10-07 | 2011-10-07 | Samosestavljivi polipeptidni poliedri |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI23902A true SI23902A (sl) | 2013-04-30 |
Family
ID=47258059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI201100402A SI23902A (sl) | 2011-10-07 | 2011-10-07 | Samosestavljivi polipeptidni poliedri |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160311859A1 (sl) |
| EP (1) | EP2764018B1 (sl) |
| SI (1) | SI23902A (sl) |
| WO (1) | WO2013052015A1 (sl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201306634D0 (en) * | 2013-04-11 | 2013-05-29 | Univ Bristol | Cage-like particles |
| WO2020220044A2 (en) * | 2019-04-25 | 2020-10-29 | Hodge Curtis D | Self-assembling protein nanocage decorated with antibodies (sapna) and parts thereof |
| US11911482B2 (en) | 2020-08-25 | 2024-02-27 | The Regents Of The University Of California | Self assembling protein nanoparticles as carrier molecules |
| EP4267167A2 (en) * | 2020-12-28 | 2023-11-01 | New York University | Crosslinked helix dimer mimics of sos and methods of using same |
| WO2023009529A2 (en) * | 2021-07-28 | 2023-02-02 | Trustees Of Boston University | Novel polypeptides and uses thereof |
| WO2023087491A1 (zh) * | 2021-11-19 | 2023-05-25 | 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 | 基于dna折纸的肿瘤新抗原递送系统及其制备方法和应用 |
| CN114668683B (zh) * | 2022-03-15 | 2023-09-08 | 杭州优玛达生物科技有限公司 | 一种纳米金掺杂自组装多肽活性物及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6756039B1 (en) | 1999-05-10 | 2004-06-29 | The Regents Of The University Of California | Self assembling proteins |
| GB9922013D0 (en) * | 1999-09-17 | 1999-11-17 | Univ Sussex | Peptides |
| AU2004315485A1 (en) * | 2003-10-24 | 2005-08-18 | The Regents Of The University Of California | Self-assembling split-fluorescent protein systems |
| RU2540871C2 (ru) * | 2008-02-01 | 2015-02-10 | Альфа-О Пептидес Аг | Самоорганизующиеся пептидные наночастицы, полезные в качестве вакцин |
| WO2011046521A1 (en) | 2009-10-15 | 2011-04-21 | Kemijski inštitut | Self-assembled structures composed of single polypeptide comprising at least three coiled-coil forming elements |
-
2011
- 2011-10-07 SI SI201100402A patent/SI23902A/sl not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-07-29 US US14/350,254 patent/US20160311859A1/en not_active Abandoned
- 2012-08-29 WO PCT/SI2012/000052 patent/WO2013052015A1/en active Application Filing
- 2012-08-29 EP EP12791872.0A patent/EP2764018B1/en not_active Not-in-force
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20160311859A1 (en) | 2016-10-27 |
| EP2764018A1 (en) | 2014-08-13 |
| EP2764018B1 (en) | 2017-10-11 |
| WO2013052015A1 (en) | 2013-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SI23902A (sl) | Samosestavljivi polipeptidni poliedri | |
| JP5291279B2 (ja) | 反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体 | |
| CN105960412B (zh) | 作为疫苗平台的含鞭毛蛋白的蛋白纳米颗粒 | |
| KR100905526B1 (ko) | 나노흑연 구조체-금속 나노입자 복합체 | |
| JP2005520519A (ja) | ハイブリッドおよび単鎖メガヌクレアーゼならびにその使用 | |
| Choi et al. | The incorporation of GALA peptide into a protein cage for an acid-inducible molecular switch | |
| JP7096239B2 (ja) | タンパク質の発現および送達のための組成物および方法 | |
| CN108864292B (zh) | 一种干扰素重组融合蛋白及其应用 | |
| CN113121704B (zh) | 基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗 | |
| PL194141B1 (pl) | Plazmidowy wektor ekspresyjny, plazmidy pPTAI, pHIS, pLMT8.5 sposób ekstrahowania zrekombinowanego białka, sposoby wytwarzania zrekombinowanej ludzkiej insuliny lub peptydu-C proinsuliny lub proinsuliny | |
| CN109475638B (zh) | 使用碳硅烷树状高分子的靶组织特异性递送型药物递送系统用胶囊 | |
| JP4088584B2 (ja) | 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。 | |
| EP2488546B1 (en) | Self-assembled structures composed of single polypeptide comprising at least three coiled-coil forming elements | |
| KR100368073B1 (ko) | 융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| SI23183A (sl) | Samosestavljive strukture sestavljene iz ene polipeptidne verige iz najmanj treh segmentov, ki lahko tvorijo ovite vijačnice | |
| Rongrong et al. | Effect of deletion mutation on the recombination activity of Cre recombinase. | |
| JP6957039B2 (ja) | 融合タンパク質、構造体、捕集剤、捕集する方法、ｄｎａ、及びベクター | |
| AT511130A2 (de) | Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften | |
| JP7193552B2 (ja) | 二硫化結合異性化酵素信号ペプチドを含む組み換えベクターおよびその用途 | |
| US20240050559A1 (en) | Method of making virus-like particle | |
| BR0017015A2 (pt) | toxina estafilocócica modificada, gene codificante, vetor de expressão, célula e métodos de produção de polipeptìdeo, de separação e purificação da toxina e de produção de vacina | |
| KR100535265B1 (ko) | 융합 단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 방법 | |
| WO2011069280A1 (zh) | 抗微生物的pexiganan类似物及其制备方法 | |
| JP2024507379A (ja) | 人工ｔｒａｐケージ、その使用、およびその調製の方法 | |
| WO2003045415A2 (en) | Self-assembling p53 peptides as gene delivery vehicles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OO00 | Grant of patent |
Effective date: 20130517 |
|
| KO00 | Lapse of patent |
Effective date: 20201030 |