WO2016010161A1 - 多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体及びその利用 - Google Patents
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Abstract
多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体；多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する医薬；ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法；抗体を多量体ＩｇＡ型化する工程を含む、前記抗体の抗原結合活性又は中和活性を向上させる方法。
Description
本発明は、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体及びその利用に関する。本願は、２０１４年７月１８日に、日本に出願された特願２０１４－１４８３２８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
抗体の最大の特徴は、標的である抗原にだけ強く結合し、それ以外には結合しないという抗原結合活性と特異性の高さである。抗体は、この抗原結合活性と特異性の総和により中和活性等の機能活性を有しており、抗体医薬、診断薬、生物学研究ツール等としてバイオ産業全般で幅広く利用されている。
近年、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体の大量製造系が確立され、抗体医薬は主要な医薬品の１つとなっている。しかしながら、ほとんどのモノクローナル抗体はＩｇＧ型であり、特に抗体医薬に関してはＩｇＧ型のみしか実用化されていない。
一方、抗体には、ＩｇＧの他にＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の様々なアイソタイプが存在しており、それぞれ生体内での機能が異なっている。例えば、ＩｇＧは生体内血液中の主たる抗体であるが、粘膜上皮を覆う粘液や分泌液中の主たる抗体はＩｇＡであり、粘膜感染症における生体防御機構の最前線として機能していることが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
また、ＩｇＡやＩｇＭ等の一部の抗体は、同一の可変領域を有する抗体同士が二量体や五量体などの多量体を形成し、生体内で機能していることが知られている。例えば、初乳や唾液等の分泌液中、及び多発性骨髄腫の患者血清中には、多量体ＩｇＡが存在することが知られている。
そして、多発性骨髄腫の患者血清中には、単量体、二量体、三量体、四量体のＩｇＡが様々な割合で含まれていることが明らかにされている。また、分泌液中には、二量体と四量体が含まれることが報告されている。しかしながら、これらの多量体抗体の生理学的意義については、ほとんど分かっていない。
また、人為的に二量体ＩｇＡを作製する技術は既に報告されているが、その収率は悪く、ＩｇＧをＩｇＡ型に変換したことによる高機能化が達成された例はない。また、人為的に三量体以上の多量体ＩｇＡを作製する技術は知られていない。
Woof J.M. and Russell M.W., Structure and function relationships in IgA, Mucosal immunology, 4(6), 590-597, 2011
これまでに、任意の単量体抗体を人為的に多量体化する技術は知られていない。また、ＩｇＡ型抗体を工業的に生産し、産業応用した例は存在しない。そこで、本発明は、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を提供することを目的とする。また、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する医薬を提供することを目的とする。また、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法を提供することを目的とする。また、抗体の抗原結合活性を向上させる方法を提供することを目的とする。
本発明は以下の通りである。
（１）多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体。
（２）重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に由来するアミノ酸残基である、（１）に記載の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体。
（３）四量体の含有量が全ＩｇＡの２０モル％以上である、（１）又は（２）に記載の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体。
（４）（１）～（３）のいずれか一項に記載の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する医薬。
（５）感染症の治療又は予防用である、（４）に記載の医薬。
（６）ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法。
（７）前記ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質は、遺伝子組換えによりＩｇＧ型からＩｇＡ型に変換されたものである、（６）に記載の製造方法。
（８）前記工程において、更にｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を前記細胞内で共発現させる、（６）又は（７）に記載の製造方法。
（９）前記細胞がＣＨＯ ＹＡ７細胞株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０１５３５）である、（６）～（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）前記工程は、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を発現するための発現ベクターを前記細胞内に導入することにより行われ、前記発現ベクターは、プロモーターの下流で、かつ、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質又は分泌成分タンパク質をコードする核酸の開始コドンの上流に、ＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合又は相互作用するｃｉｓ－エレメントを有する、（６）～（９）のいずれかに記載の製造方法。
（１１）前記ｃｉｓ－エレメントが、配列モチーフＧＡＮ１－（Ｘ）ｎ－ＡＣＮ２（ｎは３～６の整数であり、Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立して、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかである。）からなる塩基配列を１～数個含む、（１０）に記載の製造方法。
（１２）前記ｃｉｓ－エレメントが、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、ＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列、又は、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列からなる、（１０）又は（１１）に記載の製造方法。
（１３）抗体を多量体ＩｇＡ型化する工程を含む、前記抗体の抗原結合活性又は中和活性を向上させる方法。
（１４）前記抗体は、ＩｇＧ型抗体である、（１３）に記載の方法。
（１５）前記工程が、前記抗体の重鎖可変領域を有するＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、前記抗体の軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、（１３）又は（１４）に記載の方法。
（１）多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体。
（２）重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に由来するアミノ酸残基である、（１）に記載の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体。
（３）四量体の含有量が全ＩｇＡの２０モル％以上である、（１）又は（２）に記載の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体。
（４）（１）～（３）のいずれか一項に記載の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する医薬。
（５）感染症の治療又は予防用である、（４）に記載の医薬。
（６）ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法。
（７）前記ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質は、遺伝子組換えによりＩｇＧ型からＩｇＡ型に変換されたものである、（６）に記載の製造方法。
（８）前記工程において、更にｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を前記細胞内で共発現させる、（６）又は（７）に記載の製造方法。
（９）前記細胞がＣＨＯ ＹＡ７細胞株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０１５３５）である、（６）～（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）前記工程は、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を発現するための発現ベクターを前記細胞内に導入することにより行われ、前記発現ベクターは、プロモーターの下流で、かつ、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質又は分泌成分タンパク質をコードする核酸の開始コドンの上流に、ＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合又は相互作用するｃｉｓ－エレメントを有する、（６）～（９）のいずれかに記載の製造方法。
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（１２）前記ｃｉｓ－エレメントが、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列、
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配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列からなる、（１０）又は（１１）に記載の製造方法。
（１３）抗体を多量体ＩｇＡ型化する工程を含む、前記抗体の抗原結合活性又は中和活性を向上させる方法。
（１４）前記抗体は、ＩｇＧ型抗体である、（１３）に記載の方法。
（１５）前記工程が、前記抗体の重鎖可変領域を有するＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、前記抗体の軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、（１３）又は（１４）に記載の方法。
本発明によれば、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を提供することができる。また、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する医薬を提供することができる。また、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法を提供することができる。また、抗体の抗原結合活性を向上させる方法を提供することができる。
［用語の説明］
ＩｇＡ型抗体に関連して、従来用いられている用語について以下に説明する。
ＩｇＡ型抗体に関連して、従来用いられている用語について以下に説明する。
（単量体ＩｇＡ（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ＩｇＡ、ｍＩｇＡ））
ＩｇＡは、血清中では、主に単量体ＩｇＡとして分子量１７万前後で存在しており、ＩｇＡ１が主要構成要素である。
ＩｇＡは、血清中では、主に単量体ＩｇＡとして分子量１７万前後で存在しており、ＩｇＡ１が主要構成要素である。
（二量体ＩｇＡ（Ｄｉｍｅｒｉｃ ＩｇＡ、ｄＩｇＡ））
二量体ＩｇＡとは、粘膜固有層に存在する形質細胞が産生する二量体ＩｇＡであって、重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の割合が４：４：１である分子を指す。ＩｇＡ２が約半分程度存在する。
二量体ＩｇＡとは、粘膜固有層に存在する形質細胞が産生する二量体ＩｇＡであって、重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の割合が４：４：１である分子を指す。ＩｇＡ２が約半分程度存在する。
（多量体ＩｇＡ（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ＩｇＡ、ｐＩｇＡ））
従来、ポリメリックＩｇ受容体により認識される二量体以上のＩｇＡを総称して、多量体ＩｇＡという場合が多い。すなわち、重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の構成比が４：４：１の複合体である二量体ＩｇＡが主成分で、抗体Ｊ鎖タンパク質（Ｊｏｉｎｉｎｇ ｃｈａｉｎ）によりＩｇＡ二分子が結合し、分泌成分タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＣタンパク質）を含む場合と含まない場合の両方について「多量体ＩｇＡ」という用語が使用されている。
従来、ポリメリックＩｇ受容体により認識される二量体以上のＩｇＡを総称して、多量体ＩｇＡという場合が多い。すなわち、重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の構成比が４：４：１の複合体である二量体ＩｇＡが主成分で、抗体Ｊ鎖タンパク質（Ｊｏｉｎｉｎｇ ｃｈａｉｎ）によりＩｇＡ二分子が結合し、分泌成分タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＣタンパク質）を含む場合と含まない場合の両方について「多量体ＩｇＡ」という用語が使用されている。
すなわち、形質細胞が分泌する多量体ＩｇＡ（重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の構成比が４：４：１の複合体）を指して「多量体ＩｇＡ」という場合と、粘膜上皮細胞より分泌されるＳ－ＩｇＡ（重鎖：軽鎖：Ｊ鎖：ＳＣの構成比が４：４：１：１の複合体）を指して「多量体ＩｇＡ」という場合、及びこれら両者を指す場合が散見され、厳密に区別されずに使用されている。電気泳動での移動度、ゲル濾過クロマトグラフィーでの挙動から二量体ＩｇＡより分子量が大きい成分も検出され、二量体以上であろうと予想されて多量体ＩｇＡと呼ばれている場合もあるが、凝集体との鑑別はなされていないため、分子構造の詳細は不明である。
（ポリメリックＩｇ受容体（ｐＩｇＲ、多量体免疫グロブリン受容体））
粘膜上皮細胞の基底膜側の細胞膜上に発現しているｐＩｇＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型の膜貫通型蛋白質で、細胞外ドメイン部分、膜貫通部、細胞質内領域からなる。ｐＩｇＲは粘膜固有層に存在する形質細胞が産生したＪ鎖を含む二量体／多量体型Ｉｇ分子を特異的に認識して結合し、上皮細胞中への取り込み後も結合したままアピカル側へ輸送される。上皮細胞内から粘膜面への放出には、ｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分と膜貫通部との間で切断が必要で、上皮細胞のタンパク質分解酵素による切断後に内腔側粘膜層へＳ－ＩｇＡとして分泌される。このｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分がＩｇＡ複合体の構成成分となる事実に由来して、分泌成分タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＣタンパク質）とも呼ばれている。ｐＩｇＲは五量体ＩｇＭの取り込みにも同様にして機能している。
粘膜上皮細胞の基底膜側の細胞膜上に発現しているｐＩｇＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型の膜貫通型蛋白質で、細胞外ドメイン部分、膜貫通部、細胞質内領域からなる。ｐＩｇＲは粘膜固有層に存在する形質細胞が産生したＪ鎖を含む二量体／多量体型Ｉｇ分子を特異的に認識して結合し、上皮細胞中への取り込み後も結合したままアピカル側へ輸送される。上皮細胞内から粘膜面への放出には、ｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分と膜貫通部との間で切断が必要で、上皮細胞のタンパク質分解酵素による切断後に内腔側粘膜層へＳ－ＩｇＡとして分泌される。このｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分がＩｇＡ複合体の構成成分となる事実に由来して、分泌成分タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＣタンパク質）とも呼ばれている。ｐＩｇＲは五量体ＩｇＭの取り込みにも同様にして機能している。
ＳＣタンパク質はｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分であり分子量約７０ｋＤａの高度に糖鎖修飾を受けたポリペプチドである。Ｎ末端から５つの免疫グロブリン様ドメインを持ち、それぞれＤ１からＤ５と名付けられており、このうちＤ１からＤ３までが二量体ＩｇＡとの結合に必要で、特にＤ１は免疫グロブリンの可変領域のｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ （ＣＤＲｓ）に類似した構造をもち二量体ＩｇＡとの結合に重要な役割を担う。この相互作用には、Ｄ１のＣＤＲ１中のＴｈｒ２７－Ｔｈｒ３３が関与する。またＤ１のＣＤＲ２ループ中のＧｌｕ５３－Ｇｌｙ５４も寄与するとの報告もある。Ｊ鎖は分子量１５ｋＤａのポリペプチド鎖であり、Ｎ結合型糖鎖を持ち免疫グロブリン構造をとるように折りたたまれている。哺乳類と鳥類のＪ鎖を比較した場合、一次構造や抗原認識の交差性において非常に高い相同性を持つため、それらの基本特性が生物間で保存されてきたと考えられている。Ｊ鎖は二量体ＩｇＡがｐＩｇＲと相互作用する上で必要不可欠である。Ｊ鎖を取り込んだ二量体ＩｇＡは、ｐＩｇＲのＤ１とＩｇＡのＦｃ領域又はｐＩｇＲとＪ鎖との間に相互作用を生じ、その後にＩｇＡＣα２ドメイン中の３１１番目のｃｙｓ残基とＳＣのＤ５の４６７番目のｃｙｓ残基間にＳ－Ｓ結合が形成されると考えられている。（Mucosal immunology, 4(6), 590-597, 2011、清野宏（２０１０）．臨床粘膜免疫学 株式会社シナジー）
（分泌型ＩｇＡ（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ＩｇＡ、Ｓ－ＩｇＡ））
粘膜上皮細胞より分泌され、ＳＣタンパク質を含んだ二量体以上のＩｇＡ複合体を指し、Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｄｉｍｅｒｉｃ ＩｇＡ（Ｓ－ｄＩｇＡ）の場合は重鎖：軽鎖：Ｊ鎖：ＳＣの構成比が４：４：１：１である。
粘膜上皮細胞より分泌され、ＳＣタンパク質を含んだ二量体以上のＩｇＡ複合体を指し、Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｄｉｍｅｒｉｃ ＩｇＡ（Ｓ－ｄＩｇＡ）の場合は重鎖：軽鎖：Ｊ鎖：ＳＣの構成比が４：４：１：１である。
（多量体ＩｇＡと分泌型多量体ＩｇＡの違い）
粘膜固有層に存在する形質細胞が産生する多量体ＩｇＡの分子量等の性状解析は技術的に困難なため、分泌型多量体ＩｇＡ形成の詳細な分子形成過程は不明である。すなわち、生体内で形質細胞が産生する主要な分泌型多量体ＩｇＡは、二量体、三量体、四量体等の多量体のうちどれが主であるか、多量体化は上皮細胞内で起こっているかどうか、粘膜部で生体防御に中心的役割を果たしているのがどの型かも不明である。生体内ＩｇＡ及び組換え体でも二量体（４４０ｋＤａ付近）より大きいＩｇＡも微量検出されているが、凝集体との鑑別はなされていない。
粘膜固有層に存在する形質細胞が産生する多量体ＩｇＡの分子量等の性状解析は技術的に困難なため、分泌型多量体ＩｇＡ形成の詳細な分子形成過程は不明である。すなわち、生体内で形質細胞が産生する主要な分泌型多量体ＩｇＡは、二量体、三量体、四量体等の多量体のうちどれが主であるか、多量体化は上皮細胞内で起こっているかどうか、粘膜部で生体防御に中心的役割を果たしているのがどの型かも不明である。生体内ＩｇＡ及び組換え体でも二量体（４４０ｋＤａ付近）より大きいＩｇＡも微量検出されているが、凝集体との鑑別はなされていない。
（本明細書での多量体ＩｇＡの定義）
本明細書においては、分泌成分タンパク質（ＳＣ）を分子内に有する多量体抗体を分泌型抗体という。また、次のように表記する場合がある。
・単量体抗体＝ｍＩｇＡ
・二量体抗体＝ｄＩｇＡ
・分泌型二量体抗体＝Ｓ－ｄＩｇＡ
・分泌型三量体抗体＝Ｓ－ｔＩｇＡ
・分泌型四量体抗体＝Ｓ－ｑＩｇＡ
・四量体以上の分泌型多量体抗体＝Ｓ－ｐＩｇＡ
・組換え単量体抗体＝ｒｍＩｇＡ
・組換え二量体抗体＝ｒｄＩｇＡ
・組換え分泌型二量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ－ｄＩｇＡ（ｒＳ－ｄＩｇＡ）
・組換え分泌型三量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ－ｔＩｇＡ（ｒＳ－ｔＩｇＡ）
・組換え分泌型四量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ－ｑＩｇＡ（ｒＳ－ｑＩｇＡ）
・四量体以上の組換え分泌型多量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ－ｐＩｇＡ（ｒＳ－ｐＩｇＡ）
ここでは、分泌成分タンパク質（ＳＣ）を分子内に有する場合に「Ｓ－」を分子名の頭に付記する。分子内にＳＣを有さない抗体は「Ｓ－」を付記しない。また、分子の会合状態を、ＩｇＡの前に略称を付記することにより表記する。単量体は「ｍ」、二量体は「ｄ」、三量体は「ｔ」、四量体は「ｑ」、四量体以上の多量体は「ｐ」を付記する。また、単量体抗体と組換え単量体抗体を特に区別なく「ｍｏｎｏｍｅｒ」と表記する場合がある。また、二量体抗体と分泌型二量体抗体、組換え二量体抗体、組換え分泌型二量体抗体を特に区別なく「ｄｉｍｅｒ」と表記する場合がある。また、分泌型三量体抗体と組換え分泌型三量体抗体を特に区別なく「ｔｒｉｍｅｒ」と表記する場合がある。また、分泌型四量体抗体と組換え分泌型四量体抗体を特に区別なく「ｔｅｔｒａｍｅｒ」と表記する場合がある。また、四量体以上の分泌型抗体と四量体以上の組換え分泌型多量体抗体を特に区別なく「ｐｏｌｙｍｅｒ」と表記する場合がある。
本明細書においては、分泌成分タンパク質（ＳＣ）を分子内に有する多量体抗体を分泌型抗体という。また、次のように表記する場合がある。
・単量体抗体＝ｍＩｇＡ
・二量体抗体＝ｄＩｇＡ
・分泌型二量体抗体＝Ｓ－ｄＩｇＡ
・分泌型三量体抗体＝Ｓ－ｔＩｇＡ
・分泌型四量体抗体＝Ｓ－ｑＩｇＡ
・四量体以上の分泌型多量体抗体＝Ｓ－ｐＩｇＡ
・組換え単量体抗体＝ｒｍＩｇＡ
・組換え二量体抗体＝ｒｄＩｇＡ
・組換え分泌型二量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ－ｄＩｇＡ（ｒＳ－ｄＩｇＡ）
・組換え分泌型三量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ－ｔＩｇＡ（ｒＳ－ｔＩｇＡ）
・組換え分泌型四量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ－ｑＩｇＡ（ｒＳ－ｑＩｇＡ）
・四量体以上の組換え分泌型多量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ－ｐＩｇＡ（ｒＳ－ｐＩｇＡ）
ここでは、分泌成分タンパク質（ＳＣ）を分子内に有する場合に「Ｓ－」を分子名の頭に付記する。分子内にＳＣを有さない抗体は「Ｓ－」を付記しない。また、分子の会合状態を、ＩｇＡの前に略称を付記することにより表記する。単量体は「ｍ」、二量体は「ｄ」、三量体は「ｔ」、四量体は「ｑ」、四量体以上の多量体は「ｐ」を付記する。また、単量体抗体と組換え単量体抗体を特に区別なく「ｍｏｎｏｍｅｒ」と表記する場合がある。また、二量体抗体と分泌型二量体抗体、組換え二量体抗体、組換え分泌型二量体抗体を特に区別なく「ｄｉｍｅｒ」と表記する場合がある。また、分泌型三量体抗体と組換え分泌型三量体抗体を特に区別なく「ｔｒｉｍｅｒ」と表記する場合がある。また、分泌型四量体抗体と組換え分泌型四量体抗体を特に区別なく「ｔｅｔｒａｍｅｒ」と表記する場合がある。また、四量体以上の分泌型抗体と四量体以上の組換え分泌型多量体抗体を特に区別なく「ｐｏｌｙｍｅｒ」と表記する場合がある。
［多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体］
１実施形態において、本発明は、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を提供する。本実施形態の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体は、本来非ＩｇＡ型であった抗体を遺伝子組換えによりＩｇＡ型に変換し、更に多量体化したものであってもよい。非ＩｇＡ型抗体としては、特に制限されず、例えば、非ＩｇＡ型の、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物由来の抗体、げっ歯類由来の抗体、鳥類由来の抗体等が挙げられる。また、抗体のクラスも特に制限されず、例えば、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＹ型抗体等が挙げられる。
１実施形態において、本発明は、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を提供する。本実施形態の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体は、本来非ＩｇＡ型であった抗体を遺伝子組換えによりＩｇＡ型に変換し、更に多量体化したものであってもよい。非ＩｇＡ型抗体としては、特に制限されず、例えば、非ＩｇＡ型の、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物由来の抗体、げっ歯類由来の抗体、鳥類由来の抗体等が挙げられる。また、抗体のクラスも特に制限されず、例えば、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＹ型抗体等が挙げられる。
例えば、ＩｇＧ型抗体の可変領域をＩｇＡ型抗体のバックボーンフレームワークに移植することによりＩｇＡ型に変換することができる。あるいは、ＩｇＧ型抗体のＣＤＲ領域のみをＩｇＡ型抗体のＣＤＲ領域に移植することにより、ＩｇＡ型に変換することもできる。ＩｇＡのサブクラスは、ＩｇＡ１型であってもＩｇＡ２型であってもよい。
なお、免疫グロブリン分子において、同一種内の個体間に認められる遺伝的に異なった抗原性をもつアロタイプの存在が知られている。アロタイプは、多くの場合免疫グロブリン分子の定常部領域の１～数個のアミノ酸変異に起因することが多い。
ヒトのＩｇＡ２においては、一般的に２つのアロタイプ（ＩｇＡ２ｍ（１）及びＩｇＡ２ｍ（２））が認められ、ＩｇＡ２（ｎ）という３番目のアロタイプの存在も報告されている。本明細書において、ＩｇＡ２は、上記のいずれのアロタイプであってもよい。
本実施形態の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体は、分子内に分泌成分タンパク質（ＳＣ）を含むことが好ましい。また、二量体以上であることが好ましく、三量体以上であることがより好ましく、四量体以上であることが更に好ましい。
後述するように、発明者らは、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を効率的に作製することに初めて成功した。本実施形態の抗体により、ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を産業応用することが可能になる。
本実施形態の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体において、重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に由来するアミノ酸残基であることが好ましい。
実施例において後述するように、発明者らは、重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に由来するアミノ酸残基であると、三量体／四量体抗体の割合を大きく高めることができることを見出した。
上記の疎水性アミノ酸としては、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ）、グリシン（Ｇ）が挙げられる。中でも、三量体／四量体抗体の割合をより高める活性が高いことからイソロイシンであることが好ましい。
本実施形態の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体は、二量体、三量体、四量体抗体の混合物であってもよい。また、単量体が混入していてもよい。本実施形態の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体は、四量体の含有量が全ＩｇＡの２０モル％以上である。四量体の含有量は全ＩｇＡの３０モル％以上であることが好ましく、４０モル％以上であることがより好ましく、５０モル％以上であることが更に好ましく、６０モル％以上であることが特に好ましい。
多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体中の単量体、二量体、三量体／四量体抗体の割合は、例えば、実施例において後述するように、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定することができる。実施例において後述するように、サイズ排除クロマトグラフィーによる測定では、三量体及び四量体のピークが分離しない場合がある。このような場合において、本実施形態の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体は、三量体／四量体（三量体又は四量体）の含有量が全ＩｇＡの２０モル％以上であることが好ましく、３０モル％以上であることがより好ましく、４０モル％以上であることが更に好ましく、５０モル％以上であることが特に好ましく、６０モル％以上であることが最も好ましい。
実施例において後述するように、二量体ＩｇＡは３００～４００ｋＤａの分子量を有する。また、三量体ＩｇＡは５００～６００ｋＤａの分子量を有する。また、四量体ＩｇＡは７００～８００ｋＤａの分子量を有する。ＩｇＡの分子量は、実施例において後述するように、例えばイオンの取り込み部付近の真空度を下げることによって達成されるマイルドなイオン導入条件下における質量分析等によって測定することができる。
本実施形態の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体において、抗体はＩｇＡ型抗体と非ＩｇＡ型抗体とのキメラであってもよい。本明細書において、ＩｇＡ型抗体とは、少なくとも１部がＩｇＡ型抗体に由来するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。いい換えると、ＩｇＡ型抗体とは、一般的な抗ＩｇＡポリクローナル抗体が反応するタンパク質であるということもできる。
実施例において後述するように、発明者らは、多量体抗体は、抗原に対する抗原結合活性又は中和活性が、単量体抗体よりも高いことを見出した。
１実施形態において、本発明は、配列番号７０～９７に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを内部標準に用いて質量分析を行う工程を備える、多量体ＩｇＡ型抗体の構成成分の定量方法を提供する。また、Taga Y., et al., Stable isotope-labeled collagen: a novel and versatile tool for quantitative collagen analyses using mass spectrometry, J. Proteome Res. 13 (8), 3671-3678, 2014 に記載されるような方法で、ＩｇＡ抗体分泌細胞に安定同位体標識アミノ酸を添加して培養し安定同位体標識ＩｇＡ抗体を作製すれば、これを内部標準として用いることもできる。多量体ＩｇＡ型抗体はヒト型であることが好ましい。また、上記の構成成分とは、ＩｇＡ１抗体重鎖、ＩｇＡ２抗体重鎖、λ型抗体軽鎖、κ型抗体軽鎖、Ｊ鎖、ＳＣであってもよい。
１実施形態において、本発明は、配列番号７０～９７に記載のアミノ酸配列を有するペプチドセットを含む、多量体ＩｇＡ型抗体の構成成分定量用スタンダードを提供する。
［医薬］
１実施形態において、本発明は、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する医薬を提供する。本実施形態の医薬は、感染症の治療又は予防用であることが好ましい。感染症としては、寄生虫、細菌、真菌、ウイルス、異常プリオン等の病原体によるものが挙げられる。
１実施形態において、本発明は、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する医薬を提供する。本実施形態の医薬は、感染症の治療又は予防用であることが好ましい。感染症としては、寄生虫、細菌、真菌、ウイルス、異常プリオン等の病原体によるものが挙げられる。
粘膜上皮を覆う粘液や分泌液中の主たる抗体はＩｇＡであり、粘膜感染症における生体防御機構の最前線として機能しているにもかかわらず、ＩｇＡは抗体医薬として実用化されていないのが現状である。
発明者らは、次世代インフルエンザワクチンとしてインフルエンザウイルス不活化全粒子抗原を用いた安全で簡便な接種を特徴とする経鼻不活化全粒子インフルエンザワクチンの開発研究を行ってきた。これまでに、動物を用いた基礎研究に加え健康成人ボランティアを募った臨床研究においても良い成績を得ており、実用化を見据えた臨床開発の段階に入りつつある。
この過程で、発明者らは、経鼻不活化インフルエンザワクチンを接種したヒトの呼吸器粘膜上でウイルス感染防御に重要な役割を果たすＩｇＡ抗体の中に二量体よりも大きい多量体抗体が存在し、インフルエンザウイルス中和活性が単量体、二量体抗体よりも高いことを見出した。
また、後述するように、発明者らは、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を効率的に作製することに初めて成功し、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体が、単量体、二量体抗体よりも高いインフルエンザウイルス中和活性及びＨＡタンパク質結合活性を有することを明らかにした。
したがって、本実施形態の医薬は、インフルエンザウイルス感染症、ＲＳウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の粘膜感染症の治療又は予防剤として有用である。
また、後述するように、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体は、少量で、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス等に結合し、中和することができる。
したがって、本実施形態の医薬は、呼吸器投与型抗体医薬として、上記の感染症の予防又は治療薬、体外診断薬、研究用途の抗体等として応用することができる。
本実施形態の医薬は、上記の感染症の原因ウイルスによる感染リスクが高い対象に対して、予防を目的として投与してもよい。あるいは、上記の感染症に対する罹患が認められた患者に対して、治療及びウイルス拡散防止を目的として投与してもよい。
本実施形態の医薬は、粉剤、液剤等の剤型に製剤化して投与することができる。本実施形態の医薬には、例えば、噴霧した抗体の滞留性を高める目的で、既に市販されているアレルギー性鼻炎に対する点鼻薬に通常含まれるような増粘剤を添加してもよい。
本実施形態の医薬は、鼻腔粘膜上への噴霧による投与、ネブライザーを用いた下気道への吸入による投与等により投与することができる。
鼻腔粘膜上への噴霧による投与は、例えば、Ainai A, et al., Intranasal vaccination with an inactivated whole influenza virus vaccine induces strong antibody responses in serum and nasal mucus of healthy adults., Hum Vaccin Immunother. 9(9), 1962-1970, 2013. に記載された、経鼻全粒子不活化インフルエンザワクチンと同様にして行うことができる。
本実施形態の治療又は予防剤を、鼻腔粘膜上に噴霧により投与する場合、例えば、両側鼻孔に片鼻２５０μＬずつ噴霧するとよい。また、投与抗体量は、接種１回（５００μＬ）あたり、数百μｇ～数ｍｇであってもよい。噴霧には、例えば、経鼻不活化全粒子インフルエンザワクチンに使用される噴霧デバイスを使用すればよい。また、１日あたり２回（朝晩）～４回（６時間ごとに１回）噴霧すればよい。投与期間としては、例えば１週間が挙げられる。
また、本実施形態の医薬を、下気道への吸入により投与する場合、例えば、通常使用されるエアロゾルタイプの吸入器を使用するとよい。吸入抗体量は、例えば、１回の吸入あたり数ｍｇ～数十ｍｇであってもよい。また、１日あたり２回（朝晩）程度吸入すればよい。投与期間としては、例えば１週間が挙げられる。
本実施形態の医薬は、ヒトを対象とするものであってもよく、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の家畜；イヌ、ネコ等の愛玩動物；チンパンジー、ゴリラ、カニクイザル等の霊長類；マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類等を対象とするものであってもよい。
本実施形態の医薬において、ＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖、Ｊ鎖、分泌成分タンパク質（以下、「ＳＣ」という場合がある。）は、対象とする動物由来のアミノ酸配列を有している（対象とする動物型である）ことが好ましい。ここで、対象とする動物型であるとは、多量体抗体をコードするＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖の定常領域が対象とする動物のＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列を有していることを意味する。また、Ｊ鎖、分泌成分タンパク質が対象とする動物型であるとは、Ｊ鎖、分泌成分タンパク質が、対象とする動物のＪ鎖、分泌成分タンパク質のアミノ酸配列を有していることを意味する。ＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖、Ｊ鎖、分泌成分タンパク質のアミノ酸配列は、目的とする抗原結合活性を有している限り変異を含んでいてもよい。
［多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法］
１実施形態において、本発明は、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法を提供する。多量体ＩｇＡ型抗体は、遺伝子組換え抗体であってもよい。
１実施形態において、本発明は、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法を提供する。多量体ＩｇＡ型抗体は、遺伝子組換え抗体であってもよい。
上述したように、粘膜上皮細胞の基底膜側の細胞膜上に発現しているｐＩｇＲは、粘膜固有層に存在する形質細胞が産生した二量体／多量体型Ｉｇ分子中のＪ鎖タンパク質を特異的に認識して結合して細胞内に取り込み、上皮細胞中への取り込み後も結合したままアピカル側へ輸送された後、ｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分と膜貫通部との間で切断されて、上皮細胞内から粘膜面に放出される。
つまり、生体内においては、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質が１つの細胞内で共発現されることはない。
これに対し、発明者らは、分泌成分タンパク質を、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質と共に１つの細胞内で共発現させることにより、意外にも、多量体ＩｇＡ型抗体を作製することに初めて成功した。本実施形態の製造方法により、多量体ＩｇＡ型抗体を産業応用することが可能となる。
多量体ＩｇＡ型抗体が、医薬として対象に投与するものである場合、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質は、対象である動物種に由来するアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。また、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質は、複数の動物種に由来するアミノ酸配列を有するキメラであってもよい。
本実施形態におけるＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質は、本来非ＩｇＡ型であった抗体を遺伝子組換えによりＩｇＡ型に変換したものであってもよい。非ＩｇＡ型抗体としては、特に制限されず、例えば、非ＩｇＡ型の、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物由来の抗体、げっ歯類由来の抗体、鳥類由来の抗体等が挙げられる。また、抗体のクラスも特に制限されず、例えば、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＹ型抗体等が挙げられる。
例えば、ＩｇＧ型抗体の可変領域をＩｇＡ型抗体のバックボーンフレームワークに移植することによりＩｇＡ型に変換することができる。あるいは、ＩｇＧ型抗体のＣＤＲ領域のみをＩｇＡ型抗体のＣＤＲ領域に移植することにより、ＩｇＡ型に変換することもできる。ＩｇＡのサブクラスは、ＩｇＡ１型であってもＩｇＡ２型であってもよい。
宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。哺乳動物細胞としては、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ ＹＡ７細胞等が挙げられ、特にＣＨＯ ＹＡ７細胞が好ましい。昆虫細胞としては、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株等が挙げられる。
１実施形態において、本発明は、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質、分泌成分タンパク質、ｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法を提供する。多量体ＩｇＡ型抗体は、遺伝子組換え抗体であってもよい。ｐ１８０タンパク質のアミノ酸配列を配列番号９８に示し、ｐ１８０タンパク質をコードする塩基配列を配列番号９９に示す。また、ＳＦ３ｂ４タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１００に示し、ＳＦ３ｂ４タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１０１に示す。
ｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を細胞中で発現させることにより、当該細胞内の小胞体膜上において、ポリソーム形成を促進することができる。ここで、ポリソームとは、細胞内の小胞体膜上に存在する複数のリボソームに対して、１分子のｍＲＮＡが結合したものである。ポリソーム形成の促進の結果として、タンパク質の合成能を亢進し、目的タンパク質の生産効率を向上させることができる。好適な宿主細胞は、上述したものと同様である。またヒトｐ１８０タンパク質は、小胞体に存在するＩ型の膜貫通型蛋白質であり、短い細胞質内領域と膜貫通部、および細胞質ドメイン部分からなる。既に明らかになっているｃＤＮＡ配列の分析から、細胞質ドメインのＮ末端近傍に種間で高度に保存され非常に強い塩基性を持つドメイン（配列番号９８の第２７～１９７番目）とそれに続く塩基性の反復配列とを有することが知られており、この反復数が５４回、２６回、１４回の少なくとも３種類の分子種が存在することが分かっている（Ogawa-Goto K. et al., An endoplasmic reticulum protein, p180, is highly expressed in human cytomegalovirus-permissive cells and interacts with the tegument protein encoded by UL48, J. Virol., 76 (5), 2350-2362, 2002.）。本実施形態においては、いずれの反復数を有するｐ１８０タンパク質も用いることもできるが、５４回の反復数を有するｐ１８０タンパク質が好ましい。ｐ１８０タンパク質のＣ末端側はｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌドメインを形成し、このうち、配列番号９８の第９４５～１５４０番目の部分が、ＳＦ３ｂ４タンパク質との相互作用によるポリソーム形成促進に重要である（Ueno T. et al., Regulation of polysome assembly on the endoplasmic reticulum by a coiled-coil protein, p180, Nucleic Acids Res., 40 (7), 3006-3017, 2012.）。
したがって、本実施形態の製造方法により、多量体ＩｇＡ型抗体を効率よく製造することが可能となる。
細胞内のＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体は、スプライシングによりイントロン部分が除去され、成熟型ｍＲＮＡに変換される。この過程は、スプライソソームという核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）－タンパク質からなる巨大複合体が担う。スプライソソームには、５種類の低分子リポ核タンパク質複合体（ｓｎＲＮＰ）が存在し、ＳＦ３ｂ４タンパク質はこのうちのＵ２－ｓｎＲＮＰの構成成分であり、ＲＮＡ結合ドメインを有している。
発明者らは、ＳＦ３ｂ４タンパク質が細胞質内の小胞体を含む膜画分で優位に増加し、それとともにｍＲＮＡと結合したＳＦ３ｂ４タンパク質が、ｐ１８０タンパク質のｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌドメインと相互作用することにより、ｍＲＮＡの小胞体への局在化を促進させ、その結果として細胞によるタンパク質の合成能又は分泌能が亢進されることを明らかにした。
したがって、ｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質の発現が亢進された細胞において、目的タンパク質をコードする核酸を発現させると、当該核酸から転写されたｍＲＮＡがＳＦ３ｂ４タンパク質又はｐ１８０タンパク質と相互作用した結果、あるいは上記ｍＲＮＡがＳＦ３ｂ４タンパク質と相互作用し、次いでｐ１８０タンパク質のｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌドメインとＳＦ３ｂ４タンパク質とが相互作用した結果、ｍＲＮＡの小胞体への局在化を促進させ、この細胞内において目的タンパク質の合成能又は分泌能が亢進される。
本実施形態において、ｐ１８０タンパク質は、配列番号９８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、配列番号９８に示されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列からなり、細胞内の小胞体膜上でのポリソーム形成を促進する機能を有するタンパク質であってもよく、配列番号９８に示されるアミノ酸配列との配列類似性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列からなり、細胞内の小胞体膜上でのポリソーム形成を促進する機能を有するタンパク質であってもよく、配列番号９８に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内の小胞体膜上でのポリソーム形成を促進する機能を有するタンパク質であってもよく、配列番号９９に示される塩基配列との配列同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、細胞内の小胞体膜上でのポリソーム形成を促進する機能を有するタンパク質であってもよく、配列番号９９に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、細胞内の小胞体膜上でのポリソーム形成を促進する機能を有するタンパク質であってもよい。また、ｐ１８０タンパク質は、ヒト以外の哺乳動物由来のものであってもよい。
また、ＳＦ３ｂ４タンパク質は、配列番号１００に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、配列番号１００に示されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列からなり、配列番号１００に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の、細胞に発現された場合に目的物としてのタンパク質の合成能又は分泌能を亢進させる機能を有するタンパク質であってもよく、配列番号１００に示されるアミノ酸配列との配列類似性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列からなり、配列番号１００に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の、細胞に発現された場合に目的物としてのタンパク質の合成能又は分泌能を亢進させる機能を有するタンパク質であってもよく、配列番号１００に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１００に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の、細胞に発現された場合に目的物としてのタンパク質の合成能又は分泌能を亢進させる機能を有するタンパク質であってもよく、配列番号１０１に示される塩基配列との配列同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１００に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の、細胞に発現された場合に目的物としてのタンパク質の合成能又は分泌能を亢進させる機能を有するタンパク質であってもよく、配列番号１０１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、細胞内の小胞体膜上でのポリソーム形成を促進する機能を有するタンパク質であってもよい。
１実施形態において、本発明は、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を、ＣＨＯ ＹＡ７細胞株（寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）、寄託機関のあて名：日本国 〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、寄託日：２０１３年２月１３日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０１５３５）で発現させる工程を含む、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法を提供する。多量体ＩｇＡ型抗体は、遺伝子組換え抗体であってもよい。
ＣＨＯ ＹＡ７細胞株は、発明者らが樹立した細胞株であり、ｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を細胞内で構成的に発現している。したがって、本実施形態の製造方法により、多量体ＩｇＡ型抗体を効率よく製造することが可能となる。
１実施形態において、本発明は、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程が、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を発現するための発現ベクターを細胞内に導入することにより行われ、前記発現ベクターは、プロモーターの下流で、かつ、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質又は分泌成分タンパク質をコードする核酸の開始コドンの上流に、ＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合又は相互作用するｃｉｓ－エレメントを有する、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法を提供する。多量体ＩｇＡ型抗体は、遺伝子組換え抗体であってもよい。
前記ｃｉｓ－エレメントは、配列モチーフＧＡＮ１－（Ｘ）ｎ－ＡＣＮ２（ｎは３～６の整数であり、Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立して、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかである。）からなる塩基配列を１～数個含むことが好ましい。
発明者らは、成熟ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に上記のｃｉｓ－エレメントが存在すると、当該ｃｉｓ－エレメントを認識するＲＲＭタンパク質が当該ｃｉｓ－エレメントに結合し、分泌タンパク質の合成の場である小胞体の膜上へのｍＲＮＡの輸送／局在化を増強し、翻訳効率を上昇させる機能があることを見出している。
したがって、本実施形態の製造方法により、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を更に効率よく製造することが可能となる。好適な宿主細胞は、上述したものと同様である。
上記のｃｉｓ－エレメントは、配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列であってもよく、配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列であってもよく、配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である塩基配列からなり、かつ、ＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列であってもよく、配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列からなる核酸断片であってもよい。上記のｃｉｓ－エレメントは、非天然型の塩基配列からなる核酸断片であってもよい。核酸断片としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。
本明細書において、欠失、置換又は付加されてもよい塩基の数としては、例えば１～３０個、例えば１～１５個、例えば１～１０個、例えば１～５個が挙げられる。また、欠失、置換又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、例えば２～４０個、例えば２～３０個、例えば２～２０個、例えば２～１０個、例えば２～７個、例えば２～５個、例えば５個、例えば４個、例えば３個、例えば２個が挙げられる。
本明細書において、アミノ酸配列の同一性とは、対象とする２つのアミノ酸配列の同一性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成されたアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて一致するアミノ酸残基の割合（％）によって表される。アミノ酸配列の同一性は、視覚的検査及び数学的計算により決定することができ、当業者に周知のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）、配列整列プログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ）、遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標））等を用いて算出することができる。
本明細書におけるアミノ酸配列の同一性は、具体的には、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）のウェブサイトで公開されている系統解析プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を用い、初期設定の条件（Version 2.1、Alignment type: slow、Protein Weight Matrix: Gonnet、GAP OPEN: 10、GAP EXTENSION: 0.1）で求めることができる。
本明細書において、アミノ酸配列の類似性とは、対象とする２つのアミノ酸配列の類似性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成されたアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて一致するアミノ酸残基及び類似性を示すアミノ酸残基の割合（％）によって表される。アミノ酸配列の類似性は、物理化学的な性質が相互に類似するアミノ酸残基の関係により示され、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、ヒドロキシル基を含むアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）等のグループにおいて、同一のグループに属するアミノ酸同士は、相互に類似するアミノ酸残基であると理解される。このような類似性を示すアミノ酸残基は、タンパク質の表現型に影響を及ぼさないことが予測される。アミノ酸配列の類似性は、同一性と同様に視覚的検査及び数学的計算により決定することができ、当業者に周知のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ）、遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標））等を用いて算出することができる。
本明細書におけるアミノ酸配列の類似性は、具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）ネットワーク版ｖｅｒ．１１．１．３（株式会社ゼネティックス）を用い、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ を初期設定の条件（Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ を２に設定する）で求めることができる。
本明細書において、塩基配列の同一性とは、対象とする２つの塩基配列の同一性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成された塩基配列の最適なアラインメントにおいて一致する核酸残基の割合（％）によって表される。
塩基配列の同一性を算出する代表的なコンピュータ・プログラムとしては、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html により利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、又はＵＷ－ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム等が挙げられる。
本明細書において「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％ホルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、５５～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
上記のｃｉｓ－エレメントは、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質の発現ベクターのうち、いずれか１つ以上に含まれていれば多量体ＩｇＡ型抗体の発現量又は分泌量の向上の効果が得られる。
後述するように、本実施形態の方法により、従来の方法に比べ２６倍から３５倍以上に効率良く多量体抗体を作製することが可能である。さらに、この方法により作製したインフルエンザウイルスに対するモノクローナル四量体抗体（ｒＳ－ｑＩｇＡ）は、単量体抗体に比べ、抗原結合活性が上昇しており、最大で１００倍以上の中和活性を示した。
［抗体の抗原結合活性又は中和活性を向上させる方法］
１実施形態において、本発明は、抗体を多量体ＩｇＡ型化する工程を含む、前記抗体の抗原結合活性又は中和活性を向上させる方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、抗体を多量体ＩｇＡ型化する工程を含む、前記抗体の抗原結合活性又は中和活性を向上させる方法を提供する。
抗体を多量体ＩｇＡ型化する工程は、前記抗体の重鎖可変領域を有するＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、前記抗体の軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含むことが好ましい。
抗体の抗原結合活性とは、抗体が標的分子に結合する能力そのものであるが、特異性とは、標的分子以外には結合しないという能力であり、高い特異性を担保するためには標的分子にしか存在しない部位を認識部位（エピトープ）とする必要がある。これらの抗原結合活性と特異性は、抗体分子の可変領域配列の多様性によって生み出されるが、可変領域配列から標的分子への抗原結合活性と特異性を予測することは困難であり、抗原結合活性および特異性の高い抗体は、マウスなどの生体内やランダムに生み出された抗体産生細胞や抗体遺伝子、もしくは人為的に作製したランダムな可変領域ライブラリーから何らかの方法によりクローニングする必要がある。また、特異性と抗原結合活性の双方が独立して可変領域の配列に依存していることから、得られた抗体の特異性を変化させることなく、すなわち、認識するエピトープを変化させることなく、人為的に抗原結合活性を向上させることは非常に難しい。
これに対し、後述するように、発明者らは、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、前記抗体の軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させることにより、多量体ＩｇＡ型抗体を製造できることを見出した。好適な宿主細胞は、上述したものと同様である。
発明者らは、更に、単量体抗体を多量体化することにより、抗体の抗原結合活性又は中和活性を向上させることができることを見出した。例えば、後述するように単量体抗体を多量体化することにより、単量体抗体に比べ、抗体１モルあたりのウイルス中和活性を１００倍以上に向上させることも可能である。
抗原結合活性又は中和活性を向上させる対象となる抗体としては、特に制限されず、例えば、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物由来の抗体、げっ歯類由来の抗体、鳥類由来の抗体等が挙げられる。また、抗体のクラスも特に制限されず、例えば、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＥ型、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型、ＩｇＹ型抗体等が挙げられる。本実施形態の方法により、既存の抗体の特異性を変化させることなく抗原結合活性又は中和活性を向上させることができる。
遺伝子組換えにより、当該抗体の可変領域をＩｇＡ型抗体の定常領域に結合してＩｇＡ型に変換することにより、本実施形態の方法を適用することができる。例えば、ＩｇＧ型モノクローナル抗体の可変領域をＩｇＡ型抗体のバックボーンフレームワークに移植することによりＩｇＡ型モノクローナル抗体に変換することができる。あるいは、抗原結合活性を向上させる対象となる抗体のＣＤＲ領域のみをＩｇＡ型抗体のＣＤＲ領域に移植することにより、ＩｇＡ型に変換してもよい。ＩｇＡのサブクラスは、ＩｇＡ１型であってもＩｇＡ２型であってもよい。
本実施形態の方法は、同じエピトープを認識する可変領域を有するＩｇＧ型モノクローナル抗体を高結合型、高活性型に変換できる技術として非常に汎用性が高い。このため、医薬品用抗体、イムノクロマト法、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ法等に用いられる診断用抗体、その他の研究用途の抗体等モノクローナル抗体が使用されている製品に広く応用することができる。
ＩｇＡ１抗体の定常領域のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置を示す場合、本明細書では、Liu YS et al. Complete covalent structure of a human IgA1 immunoglobulin. Science. 1976;193: 1017-20. にしたがった番号を用いた。また、ＩｇＡ２抗体アロタイプ（ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、ＩｇＡ２（ｎ））の定常領域のアミノ酸残基の位置を示す場合、各ＩｇＡ２抗体アロタイプの定常領域とＩｇＡ１抗体の定常領域とのアラインメントを行い、対応するＩｇＡ１抗体のアミノ酸残基の番号を用いた。ＩｇＡ１抗体のアミノ酸配列２２４－２３６（ＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴ）は各ＩｇＡ２抗体アロタイプにおいては対応するアミノ酸が存在しないため欠番とした。
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１：経鼻不活化全粒子インフルエンザワクチンによりヒトに誘導される抗体可変領域遺伝子の単離及びそれを利用したモノクローナルＩｇＧ１抗体の作製］
（ワクチン接種と末梢血リンパ球の回収）
高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／Ｈ５Ｎ１の不活化全粒子ワクチンを健康成人へ３週間隔で２回経鼻接種（片鼻２５０μＬ、計５００μＬ）した。ワクチンとしては、４５μｇのヘマグルチニン（ＨＡ）を含有する不活化全粒子ワクチンを使用した。２回目のワクチン接種から７日後に末梢血を回収し、血球分離溶液Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＡＸＩＳ－ＳＨＩＥＬＤ社）を用いて末梢血リンパ球を回収した。
（ワクチン接種と末梢血リンパ球の回収）
高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／Ｈ５Ｎ１の不活化全粒子ワクチンを健康成人へ３週間隔で２回経鼻接種（片鼻２５０μＬ、計５００μＬ）した。ワクチンとしては、４５μｇのヘマグルチニン（ＨＡ）を含有する不活化全粒子ワクチンを使用した。２回目のワクチン接種から７日後に末梢血を回収し、血球分離溶液Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＡＸＩＳ－ＳＨＩＥＬＤ社）を用いて末梢血リンパ球を回収した。
（抗体産生形質細胞の単離及びｃＤＮＡ調製）
経鼻ワクチン接種により末梢血中に誘導された抗体産生形質細胞の単離は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて実施した。細胞表面マーカーＣＤ２－、ＣＤ３－、ＣＤ４－、ＣＤ１０－、ＣＤ２０－、ＩｇＤ－、ＣＤ１９ｌｏｗ、ＣＤ２７ｈｉｇｈかつＣＤ３８ｈｉｇｈの細胞集団を抗体産生形質細胞とし、単一細胞として分離・回収した。単一抗体産生形質細胞は、各ウェルに４５ｎｇのキャリアＲＮＡを含む滅菌水９μＬを分注した９６穴プレートに回収した。ｃＤＮＡ調製は、Ｔ． Ｔｉｌｌｅｒら（J Immunol Methods, 329, 112-24, 2008）の報告に則り実施した。具体的には、細胞を回収した各ウェルにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ（ライフテクノロジーズ社）、Ｒａｎｄａｍ Ｈｅｘａｍｅｒ（ライフテクノロジーズ社）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（ライフテクノロジーズ社）、ｄＮＴＰ ｍｉｘ（キアゲン社）を含む６μＬの混合液を添加し、５０℃５０分、８５℃５分の反応を行うことでｃＤＮＡを調製した。
経鼻ワクチン接種により末梢血中に誘導された抗体産生形質細胞の単離は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて実施した。細胞表面マーカーＣＤ２－、ＣＤ３－、ＣＤ４－、ＣＤ１０－、ＣＤ２０－、ＩｇＤ－、ＣＤ１９ｌｏｗ、ＣＤ２７ｈｉｇｈかつＣＤ３８ｈｉｇｈの細胞集団を抗体産生形質細胞とし、単一細胞として分離・回収した。単一抗体産生形質細胞は、各ウェルに４５ｎｇのキャリアＲＮＡを含む滅菌水９μＬを分注した９６穴プレートに回収した。ｃＤＮＡ調製は、Ｔ． Ｔｉｌｌｅｒら（J Immunol Methods, 329, 112-24, 2008）の報告に則り実施した。具体的には、細胞を回収した各ウェルにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ（ライフテクノロジーズ社）、Ｒａｎｄａｍ Ｈｅｘａｍｅｒ（ライフテクノロジーズ社）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（ライフテクノロジーズ社）、ｄＮＴＰ ｍｉｘ（キアゲン社）を含む６μＬの混合液を添加し、５０℃５０分、８５℃５分の反応を行うことでｃＤＮＡを調製した。
（抗体アイソタイプの決定）
調製したｃＤＮＡを２μＬ用いて、各ウェルに単離された抗体重鎖のアイソタイプをＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより決定した。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの各定常領域に対してＴａｑＭａｎプローブとプライマーを準備した。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対するＴａｑＭａｎプローブは、それぞれＦＡＭ、ＨＥＸおよびＣｙ５による標識とした。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ＮｏＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン社）を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（ロシュ社）を用いて解析を行った。
調製したｃＤＮＡを２μＬ用いて、各ウェルに単離された抗体重鎖のアイソタイプをＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより決定した。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの各定常領域に対してＴａｑＭａｎプローブとプライマーを準備した。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対するＴａｑＭａｎプローブは、それぞれＦＡＭ、ＨＥＸおよびＣｙ５による標識とした。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ＮｏＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン社）を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（ロシュ社）を用いて解析を行った。
（抗体可変領域遺伝子の増幅及びシークエンス）
抗体可変領域遺伝子の増幅は、Ｔ． Ｔｉｌｌｅｒら（J Immunol Methods, 329, 112-24, 2008）の報告に則り実施した。具体的には、調製したｃＤＮＡ１μＬに対して１１．５μＬのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（キアゲン社）、ｄＮＴＰ ｍｉｘ及び各抗体可変領域遺伝子を増幅するプライマーセットの混合液を添加し、１回目のＰＣＲ反応を行った。更にこのＰＣＲ産物１μＬに含まれる各遺伝子に対して更に内側に設計したプライマーセットを用いて２回目のＰＣＲ反応を行った。いずれのＰＣＲ反応においても、９５℃１５分、（９４℃３０秒、５８℃２０秒、７２℃６０秒）×４３サイクル、７２℃２分の条件で増幅を行った。また、ＰＣＲ産物の塩基配列解析（シークエンス）を常法により行った。
抗体可変領域遺伝子の増幅は、Ｔ． Ｔｉｌｌｅｒら（J Immunol Methods, 329, 112-24, 2008）の報告に則り実施した。具体的には、調製したｃＤＮＡ１μＬに対して１１．５μＬのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（キアゲン社）、ｄＮＴＰ ｍｉｘ及び各抗体可変領域遺伝子を増幅するプライマーセットの混合液を添加し、１回目のＰＣＲ反応を行った。更にこのＰＣＲ産物１μＬに含まれる各遺伝子に対して更に内側に設計したプライマーセットを用いて２回目のＰＣＲ反応を行った。いずれのＰＣＲ反応においても、９５℃１５分、（９４℃３０秒、５８℃２０秒、７２℃６０秒）×４３サイクル、７２℃２分の条件で増幅を行った。また、ＰＣＲ産物の塩基配列解析（シークエンス）を常法により行った。
（抗体可変領域遺伝子の発現ベクターへのクローニング）
抗体可変領域遺伝子のＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。鋳型として上述の１回目のＰＣＲ産物を使用し、プライマーとしては、上述の２回目のＰＣＲ産物のシークエンスの結果に基づいて、増幅する遺伝子座に適切なペアを選択した。ＰＣＲ条件は９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１０秒で２５サイクルとした。ＰＣＲ産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、３０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｃに溶出した。
抗体可変領域遺伝子のＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。鋳型として上述の１回目のＰＣＲ産物を使用し、プライマーとしては、上述の２回目のＰＣＲ産物のシークエンスの結果に基づいて、増幅する遺伝子座に適切なペアを選択した。ＰＣＲ条件は９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１０秒で２５サイクルとした。ＰＣＲ産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、３０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｃに溶出した。
精製されたＰＣＲ産物は全量３０μＬでＡｇｅＩ－ＨＦ（全ての鎖）及びＳａｌＩ－ＨＦ（重鎖）、ＢｓｉＷＩ（κ鎖）又はＸｈｏＩ（λ鎖）（以上、ＮＥＢ社）を用いて、適切な条件で制限酵素処理した。各鎖に応じた発現ベクターγ１ ＨＣ（重鎖）、κ ＬＣ（κ鎖）、λ ＬＣ（λ鎖）も同様の酵素の組み合わせで制限酵素処理した。制限酵素産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、２０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｃに溶出した。
制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって全量１０μＬで実施した。ライゲーション産物は、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）へ４２℃の加温により１０μＬ形質転換した。プラスミド抽出は、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。
続いて、１遺伝子につき４クローンをシークエンスした。抽出したプラスミドのシークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。反応産物はＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって精製し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ社）でシークエンスした。読まれた配列と２回目のＰＣＲ産物の配列のアラインメント解析を実施し、最も共通配列を保持するサンプルを選択した。
（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＧ１抗体の発現）
遺伝子組換え抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。
遺伝子組換え抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。
継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地にプラスミドＤＮＡ３０μｇ（ＩｇＧ重鎖及び軽鎖各１５μｇ）を添加した。別に用意した１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地に８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。５分間、室温で静置した後、ＤＮＡ溶液をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液へ全量加え、室温で２０～３０分静置した。細胞へトランスフェクションミックスを添加した後、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクションの１６～１８時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。細胞は３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクション後６日で上清を回収した。
（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＧ１抗体の精製）
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ （ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎ Ｆｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ （ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎ Ｆｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＧ１抗体の確認）
精製した抗体の確認はＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を実施した。図１はＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。抗体クローンＧ２、Ｈ１０、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５及びＣ１が、ＩｇＧ１型化されたことが確認された。抗体クローンＧ２、Ｈ１０、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５及びＣ１が、ＩｇＧ１型化されたことが確認された。クローンによって発現量にばらつきが見られた。４０ｍＬ培養系において、クローンＢ１２は約４０ｍｇ、クローンＤ１１は約４ｍｇ、クローンＦ９は約１．５ｍｇ、クローンＦ１１は約２．１ｍｇ、クローンＨ５は約１ｍｇの抗体を作製することができた。
精製した抗体の確認はＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を実施した。図１はＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。抗体クローンＧ２、Ｈ１０、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５及びＣ１が、ＩｇＧ１型化されたことが確認された。抗体クローンＧ２、Ｈ１０、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５及びＣ１が、ＩｇＧ１型化されたことが確認された。クローンによって発現量にばらつきが見られた。４０ｍＬ培養系において、クローンＢ１２は約４０ｍｇ、クローンＤ１１は約４ｍｇ、クローンＦ９は約１．５ｍｇ、クローンＦ１１は約２．１ｍｇ、クローンＨ５は約１ｍｇの抗体を作製することができた。
［実験例２：性状解析されたモノクローナルＩｇＧ抗体と同一の可変領域を保持するモノクローナルＩｇＡ抗体の作製］
ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を以下の方法により作製した。実験例１で作製したＩｇＧ１抗体に限らず、配列が既知の抗体は全て以下の方法でＩｇＡ型化することができる。
ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を以下の方法により作製した。実験例１で作製したＩｇＧ１抗体に限らず、配列が既知の抗体は全て以下の方法でＩｇＡ型化することができる。
（α１ ＨＣ発現ベクターの作製）
ＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子を含む発現ベクターα１ ＨＣを作製した。ＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子のＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。
ＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子を含む発現ベクターα１ ＨＣを作製した。ＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子のＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。
具体的には、鋳型としてｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＡ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を用い、ＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒で３０サイクルとした。ＰＣＲ産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、３０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｃに溶出した。精製したＰＣＲ産物及びγ１ ＨＣプラスミドを、全量３０μＬでＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ（以上、ＮＥＢ社）を用いて３７℃で制限酵素処理した。制限酵素処理産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、２０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｃに溶出した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって全量１０μＬで実施した。ライゲーション産物は、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５αへ４２℃の加温により１０μＬ形質転換した。
プラスミド抽出は、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。抽出したプラスミドのシークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。反応産物はＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって精製され、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ社）でシークエンスした。
（抗体可変領域遺伝子のα１ ＨＣ発現ベクターへのＰＣＲクローニング）
抗体可変領域遺伝子のＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。γ１ ＨＣ発現ベクターへクローニングした抗体遺伝子を鋳型として、リバースプライマーをα１ ＨＣ発現ベクター用のものに変更し、ＰＣＲ条件は９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃５秒で２５サイクルとした。
抗体可変領域遺伝子のＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。γ１ ＨＣ発現ベクターへクローニングした抗体遺伝子を鋳型として、リバースプライマーをα１ ＨＣ発現ベクター用のものに変更し、ＰＣＲ条件は９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃５秒で２５サイクルとした。
ＰＣＲ産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、３０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｃに溶出した。精製されたＰＣＲ産物及びα１ ＨＣ発現ベクターは全量３０μＬでＡｇｅＩ－ＨＦ及びＮｈｅＩ－ＨＦ（以上、ＮＥＢ社）を用いて、適切な条件で制限酵素処理した。制限酵素産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、２０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｃに溶出した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって全量１０μＬで実施した。ライゲーション産物は、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）へ４２℃の加温により１０μＬ形質転換した。
プラスミド抽出は、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。抽出したプラスミドのシークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。反応産物はＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって精製し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ社）でシークエンスした。シークエンスの結果、γ１ ＨＣ発現ベクターへクローニングした抗体遺伝子と同一であることが確かめられた。
（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＡ１抗体の発現）
遺伝子組換え抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。
遺伝子組換え抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。
継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地にプラスミドＤＮＡ３０μｇ（ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖各１５μｇ）を添加した。別に用意した１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地に８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。５分間、室温で静置した後、ＤＮＡ溶液をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液へ全量加え、室温で２０～３０分静置した。細胞へトランスフェクションミックスを添加した後、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクションの１６～１８時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。細胞は３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクション後６日で上清を回収した。
（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＡ１抗体の精製）
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ （ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎ ＩｇＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ （ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎ ＩｇＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＡ１抗体の確認）
精製した抗体の確認はＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を実施した。図２はＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。抗体クローンＢ１２、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１及びＨ５が、ＩｇＡ１型化されたことが確認された。
精製した抗体の確認はＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を実施した。図２はＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。抗体クローンＢ１２、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１及びＨ５が、ＩｇＡ１型化されたことが確認された。
［実験例３：モノクローナルＩｇＡ抗体の二量体作製］
実験例２において作製したＩｇＡ１抗体発現コンストラクトを用いて、二量体ＩｇＡ１型抗体を作製した。
実験例２において作製したＩｇＡ１抗体発現コンストラクトを用いて、二量体ＩｇＡ１型抗体を作製した。
（抗体Ｊ鎖のクローニング）
抗体Ｊ鎖は人工遺伝子合成サービス（オペロン バイオテクノロジー）を利用して、Ｊ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１４４６４６）のコード領域（ＣＤＳ）の５’側にＸｈｏＩ切断サイト及びＫｏｚａｋ配列を付加し、３’側にＮｏｔＩ切断サイトを付加した人工遺伝子（配列番号２４）を合成した。Ｊ鎖遺伝子をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ－ＨＦ（以上、ＮＥＢ社）を用いて、適切な条件で制限酵素処理した。同一の制限酵素で処理したｐＣＸＳＮベクター（ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ ｐｏｌｙＡから構成される哺乳類細胞発現用ベクター）にクロ－ニングし、抗体Ｊ鎖の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ－ｈＪＣを得た。
抗体Ｊ鎖は人工遺伝子合成サービス（オペロン バイオテクノロジー）を利用して、Ｊ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１４４６４６）のコード領域（ＣＤＳ）の５’側にＸｈｏＩ切断サイト及びＫｏｚａｋ配列を付加し、３’側にＮｏｔＩ切断サイトを付加した人工遺伝子（配列番号２４）を合成した。Ｊ鎖遺伝子をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ－ＨＦ（以上、ＮＥＢ社）を用いて、適切な条件で制限酵素処理した。同一の制限酵素で処理したｐＣＸＳＮベクター（ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ ｐｏｌｙＡから構成される哺乳類細胞発現用ベクター）にクロ－ニングし、抗体Ｊ鎖の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ－ｈＪＣを得た。
（二量体ＩｇＡ１型抗体の発現）
二量体ＩｇＡ１型抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。
二量体ＩｇＡ１型抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。
継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地にプラスミドＤＮＡ（Ｊ鎖発現群：ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖各１２μｇ、Ｊ鎖６μｇ；Ｊ鎖非発現群：ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖各１５μｇ）を添加した。
別に用意した１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地に８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。５分間、室温で静置した後、ＤＮＡ溶液をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液へ全量加え、室温で２０～３０分静置した。細胞へトランスフェクションミックスを添加した後、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクションの１６～１８時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。細胞は３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクション後６日で上清を回収した。
（発現させたＩｇＡ１抗体の精製）
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ （ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎ ＩｇＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ （ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎ ＩｇＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
（発現させたＩｇＡ１抗体の確認）
精製した抗体の確認は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＢＮ－ＰＡＧＥ、３－１３％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により行った。図３はＢＮ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。Ｊ鎖非発現群（－Ｊ）では、単量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体のバンドが確認されたのに対し、Ｊ鎖発現群（＋Ｊ）では、単量体のバンドに加えて、二量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体のバンドが確認された。
精製した抗体の確認は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＢＮ－ＰＡＧＥ、３－１３％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により行った。図３はＢＮ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。Ｊ鎖非発現群（－Ｊ）では、単量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体のバンドが確認されたのに対し、Ｊ鎖発現群（＋Ｊ）では、単量体のバンドに加えて、二量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体のバンドが確認された。
［実験例４：モノクローナルＩｇＡ抗体の多量体作製］
実験例２において作製したＩｇＡ１抗体発現コンストラクトを用いて、多量体ＩｇＡ１型抗体を作製した。
実験例２において作製したＩｇＡ１抗体発現コンストラクトを用いて、多量体ＩｇＡ１型抗体を作製した。
（分泌成分（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＣ）のクローニング）
ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社）を利用して、ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＮＭ＿００２６４４）の１８５～２００５残基の５’側にＸｈｏＩ切断サイト及びＫｏｚａｋ配列を付加し、３’側にＨｉｎｄＩＩＩ切断サイト、ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断サイト、ヒスチジンタグ及びＮｏｔＩ切断サイトを付加した人工ＤＮＡフラグメントを、中央付近で重複するように５’側フラグメントと３’側フラグメントの２本合成した。合成した２本のＤＮＡフラグメントを鋳型に用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用したｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを行い、分泌成分（ＳＣ）をコードする遺伝子断片を増幅し（配列番号２５）、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで制限酵素処理し、ｐＣＸＳＮベクターにクローニングし、分泌成分の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ－ｈＳＣ－ＨｉｓＴａｇを得た。また、ｐＣＸＳＮ－ｈＳＣ－ＨｉｓＴａｇを鋳型としてインバースＰＣＲを行い、３’側に付与したＨｉｎｄＩＩＩ切断サイト、ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断サイト、ヒスチジンタグを除去した分泌成分のみを発現するｐＣＸＳＮ－ｈＳＣを作製した。分泌成分としてどちらのプラスミドを用いても多量体抗体を作製することができた。
ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社）を利用して、ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＮＭ＿００２６４４）の１８５～２００５残基の５’側にＸｈｏＩ切断サイト及びＫｏｚａｋ配列を付加し、３’側にＨｉｎｄＩＩＩ切断サイト、ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断サイト、ヒスチジンタグ及びＮｏｔＩ切断サイトを付加した人工ＤＮＡフラグメントを、中央付近で重複するように５’側フラグメントと３’側フラグメントの２本合成した。合成した２本のＤＮＡフラグメントを鋳型に用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用したｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを行い、分泌成分（ＳＣ）をコードする遺伝子断片を増幅し（配列番号２５）、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで制限酵素処理し、ｐＣＸＳＮベクターにクローニングし、分泌成分の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ－ｈＳＣ－ＨｉｓＴａｇを得た。また、ｐＣＸＳＮ－ｈＳＣ－ＨｉｓＴａｇを鋳型としてインバースＰＣＲを行い、３’側に付与したＨｉｎｄＩＩＩ切断サイト、ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断サイト、ヒスチジンタグを除去した分泌成分のみを発現するｐＣＸＳＮ－ｈＳＣを作製した。分泌成分としてどちらのプラスミドを用いても多量体抗体を作製することができた。
（多量体ＩｇＡ１型抗体の発現）
多量体ＩｇＡ１型抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。
多量体ＩｇＡ１型抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。
継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地にプラスミドＤＮＡ（ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖各１２μｇ、Ｊ鎖及び分泌成分各６μｇ）を添加した。
別に用意した１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地に８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。５分間、室温で静置した後、ＤＮＡ溶液をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液へ全量加え、室温で２０～３０分静置した。細胞へトランスフェクションミックスを添加した後、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクションの１６～１８時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。細胞は３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクション後６日で上清を回収した。
（発現させたＩｇＡ１抗体の精製）
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ （ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎ ＩｇＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ （ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎ ＩｇＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
（多量体ＩｇＡ１型抗体のサイズ分画）
濃縮した多量体ＩｇＡ１型抗体を、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。カラムには、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ １０／３００ ＧＬ （ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を以下のプロトコールで流した。流速０．５ｍＬ／分、カラム平衡化１．５カラム容量、溶出０．５ｍＬ（計１．５カラム容量）。
濃縮した多量体ＩｇＡ１型抗体を、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。カラムには、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ １０／３００ ＧＬ （ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を以下のプロトコールで流した。流速０．５ｍＬ／分、カラム平衡化１．５カラム容量、溶出０．５ｍＬ（計１．５カラム容量）。
溶出したサンプルをフラクションごとに回収し、ＩｇＡを含むフラクションをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて濃縮した。Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
続いて、各フラクションに含まれる抗体を、非還元条件下のＢｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（ＢＮ－ＰＡＧＥ）により確認した。図４は、ゲル濾過クロマトグラフィーのチャート及びフラクション１９～３２に含まれる抗体のＢＮ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。発現させたＩｇＡ１型抗体には、四量体、二量体、単量体が含まれることが示された。この結果は、四量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を作製した初めての結果である。
［実験例５：インフルエンザウイルス中和活性の検討］
実験例１において、インフルエンザウイルスに対するヒトＩｇＧ１抗体を作製し、実験例２において、当該ＩｇＧ１抗体と同一の可変領域を有するＩｇＡ１抗体を作製した。また、実験例３及び４において多量体ＩｇＡ１型抗体を作製した。これらの抗体を用いて、インフルエンザウイルス中和活性を検討した。
実験例１において、インフルエンザウイルスに対するヒトＩｇＧ１抗体を作製し、実験例２において、当該ＩｇＧ１抗体と同一の可変領域を有するＩｇＡ１抗体を作製した。また、実験例３及び４において多量体ＩｇＡ１型抗体を作製した。これらの抗体を用いて、インフルエンザウイルス中和活性を検討した。
調製した各抗体の中和活性は、マイクロ中和試験による最小中和濃度測定により定量した。サンプルの２倍段階希釈系列を準備し、１００ ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量の１００倍量）のウイルス液と混合後、３０分間３７℃にてインキュベーションした。その後、この混合液をＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来株化細胞）に添加して４日間培養を行い、顕微鏡下でインフルエンザウイルスによる細胞変性効果が確認できないサンプル最大希釈倍率でサンプルの濃度を割った値を最少中和濃度とした。最少中和濃度が低いほどウイルス中和活性が高いことを示す。
（単量体遺伝子組換え抗体のインフルエンザウイルス中和活性）
抗体クローンＧ２、Ｈ１０、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５、Ｂ１２及びＣ１の単量体ＩｇＧ１型抗体及び単量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、インフルエンザウイルス中和活性を測定した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ ２．１）及びＡ／Ｈ１Ｎ１株を使用した。
抗体クローンＧ２、Ｈ１０、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５、Ｂ１２及びＣ１の単量体ＩｇＧ１型抗体及び単量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、インフルエンザウイルス中和活性を測定した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ ２．１）及びＡ／Ｈ１Ｎ１株を使用した。
表１に結果を示す。最少中和濃度が低いほどウイルス中和活性が高いことを示す。クローンＦ１１及びＨ５の抗体は、Ｈ５Ｎ１株及びＨ１Ｎ１株の双方に対して良好な中和活性を示すことが明らかとなった。
（二量体ＩｇＡ１型遺伝子組換え抗体のインフルエンザウイルス中和活性）
抗体クローンＤ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５及びＢ１２の単量体ＩｇＡ１型抗体及び二量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、上記と同様にしてインフルエンザウイルス中和活性を測定した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ ２．１）及びＡ／Ｈ１Ｎ１株を使用した。
抗体クローンＤ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５及びＢ１２の単量体ＩｇＡ１型抗体及び二量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、上記と同様にしてインフルエンザウイルス中和活性を測定した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ ２．１）及びＡ／Ｈ１Ｎ１株を使用した。
表２に結果を示す。最少中和濃度が低いほどウイルス中和活性が高いことを示す。抗体の可変領域の構造は同じであるにもかかわらず、単量体抗体よりも二量体抗体の方が、ウイルス中和活性が高い傾向が示された。
（四量体ＩｇＡ１型遺伝子組換え抗体のインフルエンザウイルス中和活性）
抗体クローンＦ９、Ｆ１１及びＨ５の単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、上記と同様にしてインフルエンザウイルス中和活性を測定した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ ２．１）を使用した。表３に結果を示す。最少中和濃度が低いほどウイルス中和活性が高いことを示す。
抗体クローンＦ９、Ｆ１１及びＨ５の単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、上記と同様にしてインフルエンザウイルス中和活性を測定した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ ２．１）を使用した。表３に結果を示す。最少中和濃度が低いほどウイルス中和活性が高いことを示す。
抗体の可変領域の構造は同じであるにもかかわらず、単量体抗体よりも二量体抗体の方がウイルス中和活性が高く、二量体抗体よりも四量体抗体の方がウイルス中和活性が高い傾向が示された。
（多量体化によるインフルエンザウイルス中和活性の増加）
抗体クローンＦ１１及びＨ５について、単量体ＩｇＧ１型抗体、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の中和能の活性比較のため、図５Ａ及び図５Ｂに単量体ＩｇＧ１型抗体のウイルス中和活性を１とした場合における、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の中和活性比を示した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ ２．１）を使用した。
抗体クローンＦ１１及びＨ５について、単量体ＩｇＧ１型抗体、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の中和能の活性比較のため、図５Ａ及び図５Ｂに単量体ＩｇＧ１型抗体のウイルス中和活性を１とした場合における、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の中和活性比を示した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ ２．１）を使用した。
図５Ａは、単量体ＩｇＧ１型抗体のウイルス中和活性を１とした場合における、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の単位タンパク質量当たりの中和活性比を示すグラフである。
図５Ｂは、単量体ＩｇＧ１型抗体のウイルス中和活性を１とした場合における、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の単位分子数当たりの中和活性比を示すグラフである。
クローンＦ１１及びＨ５共に、ＩｇＧ１型からＩｇＡ１型に変換することによりウイルス中和活性の増加が認められ、更に、二量体化、四量体化することにより更なる中和活性の増加が認められた。また、抗体１モルあたりのウイルス中和活性は、四量体化することにより、単量体の１００倍以上の上昇が認められた。
［実験例６：抗体の塩基配列及びアミノ酸配列の解析］
抗体クローンＦ１１及びＨ５について、重鎖及び軽鎖の塩基配列及びアミノ酸配列をＩＧＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）にて解析した。また、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）をＡｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ博士らの方法（http://www.bioinf.org.uk/abs/）により決定した。配列表の配列番号と、各塩基配列及びアミノ酸配列との対応を表４に示す。クローンＦ１１の軽鎖はκ鎖であった。また、クローンＨ５の軽鎖はλ鎖であった。
抗体クローンＦ１１及びＨ５について、重鎖及び軽鎖の塩基配列及びアミノ酸配列をＩＧＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）にて解析した。また、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）をＡｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ博士らの方法（http://www.bioinf.org.uk/abs/）により決定した。配列表の配列番号と、各塩基配列及びアミノ酸配列との対応を表４に示す。クローンＦ１１の軽鎖はκ鎖であった。また、クローンＨ５の軽鎖はλ鎖であった。
［実験例７：抗原結合活性の検討］
遺伝子組換えウイルス糖タンパク質発現ベクターの作製、遺伝子組換えウイルス糖タンパク質の発現と精製は後述する実験例９と同様の方法により行った。抗体クローンＢ１２及びＦ１１について、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に対する抗原結合活性を検討した。
遺伝子組換えウイルス糖タンパク質発現ベクターの作製、遺伝子組換えウイルス糖タンパク質の発現と精製は後述する実験例９と同様の方法により行った。抗体クローンＢ１２及びＦ１１について、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に対する抗原結合活性を検討した。
９６ウェルハーフプレートに５０μＬの遺伝子組換えＨＡタンパク質（Ａ／Ｈ５Ｎ１株由来、１μｇ／ｍＬ）を添加し、４℃で一晩放置した後、ブロッキングを行った。
続いて、各抗体サンプルの２倍段階希釈系列を４℃で一晩反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＡ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社）を２５００倍希釈したものを、室温で１時間反応させた。続いて、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社）を用いて発色反応を行い、６９０ｎｍを基準波長として４０５ｎｍの波長における吸光度を測定した。測定された吸光度に基づいて、各抗体のＨＡタンパク質に対する最少結合濃度を求めた。
結果を表５及び表６に示す。抗体クローンＦ１１では、ワクチンと同クレード（ｃｌａｄｅ ２．１）のウイルス（Ａ／Ｈ５Ｎ１（ｃｌａｄｅ ２．１）由来ＨＡに対しては、二量体及び四量体で、単量体よりも結合活性の上昇が見られた。また、ワクチンと別クレードのウイルス（Ａ／Ｈ５Ｎ１（ｃｌａｄｅ １）由来のＨＡに対しては、四量体で最も強い抗原結合活性が見られた。また、単量体の抗体で抗原結合活性を有するクローンは、多量体化することにより、抗原結合活性が向上することが示された。
［実験例８：ＣＨＯ ＹＡ７細胞とｃｉｓ－エレメント使用による多量体抗体の発現増強効果］
上述した抗体Ｊ鎖タンパク質の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ－ｈＪＣのプロモーターの下流かつＪ鎖タンパク質の開始コドンの上流に、配列番号２２に示すｃｉｓ－エレメント＃１を導入し、ｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃１－ｈＪＣを得た。遺伝子配列解析によりｃｉｓ－エレメントの向きが正しい挿入方向であることを確認した。
上述した抗体Ｊ鎖タンパク質の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ－ｈＪＣのプロモーターの下流かつＪ鎖タンパク質の開始コドンの上流に、配列番号２２に示すｃｉｓ－エレメント＃１を導入し、ｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃１－ｈＪＣを得た。遺伝子配列解析によりｃｉｓ－エレメントの向きが正しい挿入方向であることを確認した。
また、上述した分泌成分の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ－ｈＳＣのプロモーターの下流かつ分泌成分タンパク質の開始コドンの上流に、配列番号２３に示すｃｉｓ－エレメント＃２を導入し、ｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃２－ｈＳＣを得た。遺伝子配列解析によりｃｉｓ－エレメントの向きが正しい挿入方向であることを確認した。
ｐ１８０タンパク質とＳＦ３ｂ４タンパク質を共発現する細胞株である、ＣＨＯ ＹＡ７細胞及び対照のＣＨＯ細胞それぞれ１×１０５個に対して、実験例２で構築したＩｇＡ１抗体重鎖発現プラスミド、軽鎖全長の発現プラスミド、ｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃１－ｈＪＣ及びｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃２－ｈＳＣの４種類の発現プラスミド各０．５μｇずつを、リポフェクション法にてトランスフェクションした。
５％ウシ胎児血清０．５ｍＬを含むＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した後、培養上清各１０μＬを実験例３と同様にしてＢＮ－ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写後にぺルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社）を使用して検出し、多量体ＩｇＡ型抗体産生能を評価した。
図６は、ＢＮ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。レーン１及び２は、ＣＨＯ細胞で多量体ＩｇＡ型抗体を発現させた結果であり、レーン３及び４は、ＣＨＯ ＹＡ７細胞で多量体ＩｇＡ型抗体を発現させた結果である。また、レーン１及び３は、対照として、ｃｉｓ－エレメントを有しない抗体Ｊ鎖タンパク質の発現プラスミド及びｃｉｓ－エレメントを有しない分泌成分の発現プラスミドを使用した結果であり、レーン２及び４は、ｃｉｓ－エレメントを有する抗体Ｊ鎖タンパク質の発現プラスミド及びｃｉｓ－エレメントを有する分泌成分の発現プラスミドを使用した結果である。矢印は四量体ＩｇＡ型抗体のバンドを示す。
その結果、ｃｉｓ－エレメントを有しない発現プラスミドを用いた場合において、ＣＨＯ ＹＡ７細胞の多量体ＩｇＡ型抗体の分泌量がＣＨＯ細胞の約２倍に増加したことが示された。更に、ｃｉｓ－エレメントを有する発現プラスミドの使用により、ＣＨＯ ＹＡ７細胞の多量体ＩｇＡ型抗体の分泌量がＣＨＯ細胞の３．２倍に増加したことが示された。
以上の結果は、ｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を共発現することや、ｃｉｓ－エレメントを有する発現プラスミドを使用することにより、多量体ＩｇＡ型抗体の高効率な発現及び分泌が可能であることを示す。
［実験例９：抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体の結合活性に対する多量体化の影響の検討］
（抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体の作製）
公共データベースであるＲＣＳＢ ＰＤＢに登録されている抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体のアミノ酸配列（ＰＤＢ ＩＤ：２ＨＷＺ）の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をヒト用にコドン最適化したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ人工合成した。合成した重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を上述したα１ ＨＣに、軽鎖 可変領域をコードするＤＮＡ断片を上述したκ ＬＣにクローニングした。続いて、実験例４と同様にして抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体の多量体の発現及び精製を行った。
（抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体の作製）
公共データベースであるＲＣＳＢ ＰＤＢに登録されている抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体のアミノ酸配列（ＰＤＢ ＩＤ：２ＨＷＺ）の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をヒト用にコドン最適化したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ人工合成した。合成した重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を上述したα１ ＨＣに、軽鎖 可変領域をコードするＤＮＡ断片を上述したκ ＬＣにクローニングした。続いて、実験例４と同様にして抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体の多量体の発現及び精製を行った。
（ウイルス糖タンパク質発現ベクターの作製）
インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質及びＲＳウイルスのＦタンパク質ΔＦＰ（アミノ酸配列１３７－１４６番の欠失変異体、McLellan J. S., et al., Structure of respiratory syncytial virus fusion glycoprotein in the postfusion conformation reveals preservation of neutralizing epitopes., J. Virol. 85(15), 7788-7796, 2011 を参照）の細胞外領域をコードするアミノ酸配列のＣ末端側に三量体形成配列及び精製用タグのコード配列（バクテリオファージＴ４フィブリチン三量体形成フォールドン配列、トロンビン切断部位（ＲＳＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ、配列番号２６）、タンパク質精製用のＳｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩ配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号２７）及び６×Ｈｉｓ ｔａｇ配列（Stevens J. et al., Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus., Science 303, 1866-1870, 2004 を参照））を融合したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を合成し、哺乳類細胞発現用のベクターｐＣＸＳＮにクローニングした。
インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質及びＲＳウイルスのＦタンパク質ΔＦＰ（アミノ酸配列１３７－１４６番の欠失変異体、McLellan J. S., et al., Structure of respiratory syncytial virus fusion glycoprotein in the postfusion conformation reveals preservation of neutralizing epitopes., J. Virol. 85(15), 7788-7796, 2011 を参照）の細胞外領域をコードするアミノ酸配列のＣ末端側に三量体形成配列及び精製用タグのコード配列（バクテリオファージＴ４フィブリチン三量体形成フォールドン配列、トロンビン切断部位（ＲＳＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ、配列番号２６）、タンパク質精製用のＳｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩ配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号２７）及び６×Ｈｉｓ ｔａｇ配列（Stevens J. et al., Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus., Science 303, 1866-1870, 2004 を参照））を融合したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を合成し、哺乳類細胞発現用のベクターｐＣＸＳＮにクローニングした。
（ウイルス糖タンパク質の発現）
遺伝子組換えウイルス糖タンパク質の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬ系を以下に例示する。
遺伝子組換えウイルス糖タンパク質の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬ系を以下に例示する。
継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地にプラスミドＤＮＡ３０μｇを添加した。別に用意した１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地に８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。５分間、室温で静置した後、ＤＮＡ溶液をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液へ全量加え、室温で２０～３０分静置した。細胞へトランスフェクションミックスを添加した後、３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクションの１６～１８時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。細胞は３７℃、８％ＣＯ２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクション後４～６日で上清を回収した。
（ウイルス糖タンパク質の精製）
まず、回収した上清中の細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた。続いて、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ミリポア社）を使用して上清をろ過した。続いて、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０（ＧＥヘルスケア社）を用いたアフィニティー精製によりウイルス糖タンパク質を精製した。カラムにはＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥヘルスケア社）を用いた。より具体的には、平衡化溶液として２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用した。また、洗浄液として２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を使用した。また、溶出液として、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を使用した。精製条件は、流速１ｍＬ／分、カラム平衡化１０ＣＶ、カラム洗浄４０ＣＶ、溶出１ｍＬ／フラクション（計５０ＣＶ）、カラム再平衡化５ＣＶとした。６ｘＨｉｓ ｔａｇによる精製サンプルを、更に精製する場合にはＳｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）／Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）システムを使用した。Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）（ｉｂａ社）を用いて、説明書にしたがって精製した。より具体的には、まず、試薬として、Ｂｕｆｆｅｒ Ｗ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、Ｂｕｆｆｅｒ Ｅ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ、ｐＨ８．０）、Ｂｕｆｆｅｒ Ｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＨＡＢＡ、ｐＨ８．０）を準備した。続いて、カラムを２ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｗで平衡化し、サンプルをロードし、１ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｗで５回洗浄し、３ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｅでウイルス糖タンパクを溶出した。そして、カラムを５ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｒで３回再生洗浄し、４ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｗで２回平衡化した。タンパク質を濃縮する場合には、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓを用いて、説明書にしたがって濃縮した。精製されたタンパク質の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いた吸光測定により測定した。
まず、回収した上清中の細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた。続いて、Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ミリポア社）を使用して上清をろ過した。続いて、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０（ＧＥヘルスケア社）を用いたアフィニティー精製によりウイルス糖タンパク質を精製した。カラムにはＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥヘルスケア社）を用いた。より具体的には、平衡化溶液として２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用した。また、洗浄液として２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を使用した。また、溶出液として、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を使用した。精製条件は、流速１ｍＬ／分、カラム平衡化１０ＣＶ、カラム洗浄４０ＣＶ、溶出１ｍＬ／フラクション（計５０ＣＶ）、カラム再平衡化５ＣＶとした。６ｘＨｉｓ ｔａｇによる精製サンプルを、更に精製する場合にはＳｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）／Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）システムを使用した。Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）（ｉｂａ社）を用いて、説明書にしたがって精製した。より具体的には、まず、試薬として、Ｂｕｆｆｅｒ Ｗ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、Ｂｕｆｆｅｒ Ｅ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ、ｐＨ８．０）、Ｂｕｆｆｅｒ Ｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＨＡＢＡ、ｐＨ８．０）を準備した。続いて、カラムを２ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｗで平衡化し、サンプルをロードし、１ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｗで５回洗浄し、３ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｅでウイルス糖タンパクを溶出した。そして、カラムを５ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｒで３回再生洗浄し、４ＣＶのＢｕｆｆｅｒ Ｗで２回平衡化した。タンパク質を濃縮する場合には、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓを用いて、説明書にしたがって濃縮した。精製されたタンパク質の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いた吸光測定により測定した。
（ＲＳウイルスＦタンパク質に対するＥＬＩＳＡ）
抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体の多量体のＲＳウイルスＦタンパク質に対する反応性をＥＬＩＳＡにより検討した。まず、９６ウェルハーフプレートに５０μＬの遺伝子組換えＦタンパク質（１μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩固相化した後、ブロッキングを行った。続いて、抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体サンプルの２倍段階希釈系列を室温で２時間反応させた。続いて、ＰＢＳＴを用いた洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体（３００００倍）（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社）を室温で１時間反応させた。続いて、１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて発色反応を行い、１Ｍ硫酸を加えて反応停止後、吸光度を測定した。抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体サンプル濃度１μｇ／ｍＬにおけるＯＤ ４５０ｎｍの値（平均値±標準偏差）を図７に示した。その結果、抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体の抗原結合活性は、抗体が、二量体、四量体化すると有意に上昇することが確認された。
抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体の多量体のＲＳウイルスＦタンパク質に対する反応性をＥＬＩＳＡにより検討した。まず、９６ウェルハーフプレートに５０μＬの遺伝子組換えＦタンパク質（１μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩固相化した後、ブロッキングを行った。続いて、抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体サンプルの２倍段階希釈系列を室温で２時間反応させた。続いて、ＰＢＳＴを用いた洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体（３００００倍）（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社）を室温で１時間反応させた。続いて、１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて発色反応を行い、１Ｍ硫酸を加えて反応停止後、吸光度を測定した。抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体サンプル濃度１μｇ／ｍＬにおけるＯＤ ４５０ｎｍの値（平均値±標準偏差）を図７に示した。その結果、抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体の抗原結合活性は、抗体が、二量体、四量体化すると有意に上昇することが確認された。
［実験例１０：ＩｇＡ１及び各ＩｇＡ２アロタイプの多量体化の検討］
（α２ｍ１ ＨＣ、α２ｍ２ ＨＣ、α２（ｎ） ＨＣ発現ベクターの作製）
ＩｇＡ２のアロタイプの重鎖定常領域の遺伝子をクローニングした。具体的には、ＩｇＡ２ｍ１の重鎖定常領域をコードする遺伝子（α２ｍ１ ＨＣ、アクセッション番号：Ｊ００２２１）、ＩｇＡ２ｍ２の重鎖定常領域をコードする遺伝子（α２ｍ２ ＨＣ、アクセッション番号：Ｍ６０１９２及びＡＪ０１２２６４）、ＩｇＡ２（ｎ）の重鎖定常領域をコードする遺伝子（α２（ｎ） ＨＣ、アクセッション番号：Ｓ７１０４３）の各塩基配列を、公共データベースであるＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ－ＤＢに登録されている配列に基づいて入手し、ヒト用にコドン最適化を行い、人工遺伝子合成した。可変領域の最後のアミノ酸アラニンと定常領域の最初のアミノ酸セリンのコドンを改変してＮｈｅＩ切断サイトを作製した。ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理した合成配列を、上述のα１ ＨＣをＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したベクターにクローニングした。
（α２ｍ１ ＨＣ、α２ｍ２ ＨＣ、α２（ｎ） ＨＣ発現ベクターの作製）
ＩｇＡ２のアロタイプの重鎖定常領域の遺伝子をクローニングした。具体的には、ＩｇＡ２ｍ１の重鎖定常領域をコードする遺伝子（α２ｍ１ ＨＣ、アクセッション番号：Ｊ００２２１）、ＩｇＡ２ｍ２の重鎖定常領域をコードする遺伝子（α２ｍ２ ＨＣ、アクセッション番号：Ｍ６０１９２及びＡＪ０１２２６４）、ＩｇＡ２（ｎ）の重鎖定常領域をコードする遺伝子（α２（ｎ） ＨＣ、アクセッション番号：Ｓ７１０４３）の各塩基配列を、公共データベースであるＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ－ＤＢに登録されている配列に基づいて入手し、ヒト用にコドン最適化を行い、人工遺伝子合成した。可変領域の最後のアミノ酸アラニンと定常領域の最初のアミノ酸セリンのコドンを改変してＮｈｅＩ切断サイトを作製した。ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理した合成配列を、上述のα１ ＨＣをＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したベクターにクローニングした。
（抗体可変領域遺伝子の各ＩｇＡ２発現ベクターへのクローニング）
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、上述した抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２の抗体可変領域遺伝子のＰＣＲを行った。γ１ ＨＣ発現ベクターにクローニングした抗体遺伝子を鋳型とする場合には、α１ ＨＣ発現ベクターへの抗体遺伝子のクローニングと同様の方法を用いた。α１ ＨＣ発現ベクターにクローニングした抗体遺伝子を利用する場合には、ＡｇｅＩ及びＮｈｅＩを用いた通常の制限酵素を用いたサブクローニング法を用いた。
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、上述した抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２の抗体可変領域遺伝子のＰＣＲを行った。γ１ ＨＣ発現ベクターにクローニングした抗体遺伝子を鋳型とする場合には、α１ ＨＣ発現ベクターへの抗体遺伝子のクローニングと同様の方法を用いた。α１ ＨＣ発現ベクターにクローニングした抗体遺伝子を利用する場合には、ＡｇｅＩ及びＮｈｅＩを用いた通常の制限酵素を用いたサブクローニング法を用いた。
続いて、実験例４と同様にして、ＩｇＡ１型及び各ＩｇＡ２アロタイプ型の抗インフルエンザ抗体クローンＢ１２の多量体の発現及び精製を行った。
（サイズ排除クロマトグラフィーによる多量体の解析）
コスモスピンフィルターＨ（ナカライテスク社）を用いてサンプルを前処理し、サイズ排除クロマトグラフィーにより分子サイズに基づいて分離し、抗体の構造を解析した。ＨＰＬＣシステムとして、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。また、カラムにはＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＥＣ－５ ５００Å （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。溶離液にはＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、流速は１ｍＬ／分の条件で行った。１回の解析あたり抗体サンプルを１μｇ以上使用した。クロマトグラムはＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて解析し、三量体／四量体、二量体、単量体各々に相当するピーク面積を算出し、面積比として比較した。図８Ａに、サイズ排除クロマトグラフィーにより得られるクロマトグラムのＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、ＩｇＡ２（ｎ）型抗体の代表的な結果を示す。図８Ｂは、図８Ａに基づいて、三量体／四量体、二量体、単量体抗体各々のピーク面積比を算出した結果を示すグラフである。図８Ａのクロマトグラムのピーク間の谷又はピークの分離が不明瞭な場合はピークの変曲点を推測し、ベースラインへ垂直の線を引き、各々のフラクションに区分けを行い、クロマトグラムとベースラインに囲まれる面積を算出した。
コスモスピンフィルターＨ（ナカライテスク社）を用いてサンプルを前処理し、サイズ排除クロマトグラフィーにより分子サイズに基づいて分離し、抗体の構造を解析した。ＨＰＬＣシステムとして、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。また、カラムにはＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＥＣ－５ ５００Å （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。溶離液にはＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、流速は１ｍＬ／分の条件で行った。１回の解析あたり抗体サンプルを１μｇ以上使用した。クロマトグラムはＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて解析し、三量体／四量体、二量体、単量体各々に相当するピーク面積を算出し、面積比として比較した。図８Ａに、サイズ排除クロマトグラフィーにより得られるクロマトグラムのＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、ＩｇＡ２（ｎ）型抗体の代表的な結果を示す。図８Ｂは、図８Ａに基づいて、三量体／四量体、二量体、単量体抗体各々のピーク面積比を算出した結果を示すグラフである。図８Ａのクロマトグラムのピーク間の谷又はピークの分離が不明瞭な場合はピークの変曲点を推測し、ベースラインへ垂直の線を引き、各々のフラクションに区分けを行い、クロマトグラムとベースラインに囲まれる面積を算出した。
その結果、現在報告されているＩｇＡアイソタイプ、アロタイプ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、ＩｇＡ２（ｎ））は全て多量体を形成可能であることが明らかになった。また、ＩｇＡ１及び各ＩｇＡ２アロタイプの多量体化の傾向は異なることが明らかになった。特に、ＩｇＡ２ｍ２型抗体は、多量体形成能が高いことが示された。
［実験例１１：ＩｇＡ１型抗体及びＩｇＡ２ｍ２型抗体のキメラ抗体の多量体化の検討］
ＩｇＡ２ｍ２型抗体の多量体化促進活性について解析するため、以下の解析を行った。
ＩｇＡ２ｍ２型抗体の多量体化促進活性について解析するため、以下の解析を行った。
（α１α２ｍ２ ＨＣキメラ発現ベクターの作製）
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、上述したα１ ＨＣ発現ベクターを鋳型として、ＩｇＡ１ ＨＣのＣＨ１からＣＨ２までの配列（α１セグメント：定常領域のＮ末端からＧ３４２まで）をＰＣＲ増幅した。また、α２ｍ２ ＨＣ発現ベクターを鋳型として、ＩｇＡ２ｍ２ ＨＣのＣＨ３以降Ｃ末までの配列（α２ｍ２セグメント：Ｎ３４３から定常領域のＣ末端まで）をＰＣＲ増幅した。
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、上述したα１ ＨＣ発現ベクターを鋳型として、ＩｇＡ１ ＨＣのＣＨ１からＣＨ２までの配列（α１セグメント：定常領域のＮ末端からＧ３４２まで）をＰＣＲ増幅した。また、α２ｍ２ ＨＣ発現ベクターを鋳型として、ＩｇＡ２ｍ２ ＨＣのＣＨ３以降Ｃ末までの配列（α２ｍ２セグメント：Ｎ３４３から定常領域のＣ末端まで）をＰＣＲ増幅した。
続いて、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して、上記のα１セグメントとα２ｍ２セグメントを鋳型に用いたＯｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを行った。続いて、得られたＤＮＡ断片を、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いたサブクローニング法により、α１ ＨＣの定常領域の配列と交換し、ＩｇＡ１Ａ２ｍ２キメラ発現ベクターを得た。
続いて、実験例１０と同様にしてＩｇＡ１Ａ２ｍ２キメラ発現ベクターに抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２の抗体可変領域をクローニングした。また、実験例４と同様にして、多量体抗体の発現及び精製を行った。また、実験例１０と同様にして、サイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体、二量体、三量体／四量体の各構造の抗体の存在比を解析した。
図９は結果を示すグラフである。その結果、ＩｇＡ１抗体重鎖のＣＨ３以降Ｃ末端までの配列をＩｇＡ２ｍ２由来配列に置換すると、多量体形成が促進されることが明らかになった。
［実施例１２：ＩｇＡ２ｍ２の多量体化促進活性に関わる領域の解析］
ＩｇＡ２ｍ２の多量体化促進活性について解析するため、各種発現ベクターを以下の通りに構築した。
ＩｇＡ２ｍ２の多量体化促進活性について解析するため、各種発現ベクターを以下の通りに構築した。
（ＩｇＡ重鎖定常領域を改変した発現ベクターの構築）
ＩｇＡ重鎖定常領域の変異体発現ベクターを構築するため、定常領域にアミノ酸置換を伴わないよう制限酵素部位を付加した定常領域フラグメントＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ（配列番号２８）、ＩｇＡ２ｍ２－ＮＲＥ（配列番号２９）を人工遺伝子合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）により合成した。続いて、ＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ、ＩｇＡ２ｍ２－ＮＲＥを制限酵素ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ライゲーション用フラグメントを調製した。
ＩｇＡ重鎖定常領域の変異体発現ベクターを構築するため、定常領域にアミノ酸置換を伴わないよう制限酵素部位を付加した定常領域フラグメントＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ（配列番号２８）、ＩｇＡ２ｍ２－ＮＲＥ（配列番号２９）を人工遺伝子合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）により合成した。続いて、ＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ、ＩｇＡ２ｍ２－ＮＲＥを制限酵素ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ライゲーション用フラグメントを調製した。
続いて、上述した抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２のＩｇＡ１型重鎖の発現プラスミド（ｐＩｇＡ１Ｈ）、及び抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２のＩｇＡ２ｍ２型重鎖の発現プラスミド（ｐＩｇＡ２ｍ２Ｈ）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、同様にライゲーション用フラグメントを調製した。各フラグメントを連結し、プラスミドｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ、ｐＩｇＡ２ｍ２Ｈ－ＮＲＥを作製した。
（ＩｇＡ１／ＩｇＡ２ｍ２キメラ重鎖発現ベクターの構築）
ＩｇＡ１／ＩｇＡ２ｍ２キメラ重鎖発現ベクターの構築を以下の通りに行った。すなわち、ｐＩｇＡ２ｍ２Ｈ－ＮＲＥをＭｆｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し得られたフラグメントとＭｆｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理したｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥとを連結し、ＩｇＡ１重鎖のアミノ酸３４２～４７２番目の領域をＩｇＡ２ｍ２型に置換した変異体ｐＩｇＡ１Ｈ／ｐＩｇＡ２ｍ２－ｃｈｉｍｅｒａを構築した。図１０Ａは各変異体の構造を示す模式図である。
ＩｇＡ１／ＩｇＡ２ｍ２キメラ重鎖発現ベクターの構築を以下の通りに行った。すなわち、ｐＩｇＡ２ｍ２Ｈ－ＮＲＥをＭｆｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し得られたフラグメントとＭｆｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理したｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥとを連結し、ＩｇＡ１重鎖のアミノ酸３４２～４７２番目の領域をＩｇＡ２ｍ２型に置換した変異体ｐＩｇＡ１Ｈ／ｐＩｇＡ２ｍ２－ｃｈｉｍｅｒａを構築した。図１０Ａは各変異体の構造を示す模式図である。
（Ｊ／ＳＣ安定発現株の構築とＩｇＡ多量体産生能の検証）
Ｊ鎖、ＳＣの共発現ベクター構築のため、実施例５のｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃１－ｈＪＣ及びｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃２－ｈＳＣより、ｃｉｓ＃１－ｈＪＣ ＯＲＦ、ｃｉｓ＃２－ｈＳＣ ＯＲＦを切り出した。ｃｉｓ＃１－ｈＪＣ ＯＲＦ、ｃｉｓ＃２－ｈＳＣ ＯＲＦをそれぞれヒトＥＦ１プロモーターとＢＧＨ ｐｏｌｙＡから構成される発現ユニット内のプロモーターとｐｏｌｙＡの間に連結し、発現ベクターｐＥＦ－ｃｉｓ－ｈＪＣ／Ｚｅｏ及びｐＥＦ／ｃｉｓ－ｈＳＣ／Ｚｅｏをそれぞれ構築した。
Ｊ鎖、ＳＣの共発現ベクター構築のため、実施例５のｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃１－ｈＪＣ及びｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃２－ｈＳＣより、ｃｉｓ＃１－ｈＪＣ ＯＲＦ、ｃｉｓ＃２－ｈＳＣ ＯＲＦを切り出した。ｃｉｓ＃１－ｈＪＣ ＯＲＦ、ｃｉｓ＃２－ｈＳＣ ＯＲＦをそれぞれヒトＥＦ１プロモーターとＢＧＨ ｐｏｌｙＡから構成される発現ユニット内のプロモーターとｐｏｌｙＡの間に連結し、発現ベクターｐＥＦ－ｃｉｓ－ｈＪＣ／Ｚｅｏ及びｐＥＦ／ｃｉｓ－ｈＳＣ／Ｚｅｏをそれぞれ構築した。
また、Ｊ鎖、ＳＣ各タンパク質について、Ｎ結合型糖鎖が結合するアスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）に置換した変異体（以下、それぞれ「ＪＮＱ」及び「ＳＣＮＱ」という。）を発現するベクターを構築するため、ＪＮＱ及びＳＣＮＱをコードするフラグメントを人工遺伝子合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）により作製した（配列番号３０、３１）。Ｊ鎖はＮ５９をＱに置換した。また、ＳＣはＮ８３、Ｎ９０、Ｎ１３５、Ｎ１８６、Ｎ４２１、Ｎ４６９及びＮ４９９を全てＱに置換した。続いて、各合成フラグメントをＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで処理後、同じくＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで処理したｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃１－ｈＪＣ又はｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃２－ｈＳＣとそれぞれ連結し、ｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃１－ｈＪＣＮＱ及びｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃２－ｈＳＣＮＱを構築した。
また、国際公開第２０１４／１５７４２９号に記載の方法にしたがって、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にｐ１８０及びＳＦ３ｂ４の発現ベクターを導入後、ハイグロマイシンによる薬剤選択を行いｐ１８０とＳＦ３ｂ４を安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株１Ｅ２６を作製した。なお、本明細書において、発現増強２因子（ｐ１８０及びＳＦ３ｂ４）の発現ベクターを細胞に導入することにより、遺伝子の発現を増強する技術を「ｓｐＥＲｔ技術」という。
ＣＨＯ－Ｋ１（１Ｅ２６）細胞に、上述したｐＥＦ－ｃｉｓ－ｈＪＣ／Ｚｅｏ及びｐＥＦ／ｃｉｓ－ｈＳＣ／Ｚｅｏを導入し、Ｚｅｏｃｉｎ（４００μｇ／ｍＬ）で薬剤選択を行い、ｈＪＣ及びｈＳＣを安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１株Ｃ２３を樹立した。同様に、ＣＨＯ－Ｋ１（１Ｅ２６）細胞に、ｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃１－ｈＪＣＮＱ及びｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃２－ｈＳＣＮＱを導入し、Ｚｅｏｃｉｎ（４００μｇ／ｍＬ）で薬剤選択を行い、ｈＪＣＮＱ及びｈＳＣＮＱを安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１株Ｃ４５２を樹立した。
続いて、Ｃ２３細胞に、上述した抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２の軽鎖発現ベクター（ｐＩｇＡ－ＬＣ）と、抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２のＩｇＡ重鎖発現ベクターをリポフェクション法にてトランスフェクションした。ＩｇＡ重鎖発現ベクターとしては、上述した３種の発現ベクター（ｐＩｇＡ１Ｈ、ｐＩｇＡ２ｍ２、ｐＩｇＡ１Ｈ／ｐＩｇＡ２ｍ２－ｃｈｉｍｅｒａ）を使用した。
続いて、各細胞を５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で７２時間培養した後、培養上清各１０μＬを、実験例３と同様の方法により未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＢＮ－ＰＡＧＥ、３－１２％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写後にペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社）を使用して検出した。
その結果、図１０Ｂに示すように、Ｃ２３細胞の培養上清中にＩｇＡ１多量体、ＩｇＡ２ｍ２多量体がそれぞれ検出され（図１０Ｂ、レーン２及び３）、Ｃ２３細胞にＩｇＡ抗体重鎖及び軽鎖の遺伝子導入を行うことにより、効率良くＩｇＡ多量体抗体を作製できることが確認された。
また、図１６Ｃのレーン１１及び１２に示すように、上述した抗インフルエンザウイルス抗体クローンＦ１１及びＣ４５２細胞を用いて行った同様の実験においても、培養上清中にＩｇＡ１多量体及びＩｇＡ２ｍ２多量体がそれぞれ検出された。
図１０Ｂのレーン２及び３の比較から、ＩｇＡ２ｍ２はＩｇＡ１よりも多量体化が促進されることが明らかとなった。また、ｐＩｇＡ１Ｈ／ｐＩｇＡ２ｍ２キメラ体はＩｇＡ１野生型よりも高分子側にシフトしたバンドが増え（図１０Ｂ、矢印）、ＩｇＡ２ｍ２野生型に近い多量体化がみられた（図１０Ｂ、レーン１）。したがって、ＩｇＡ１重鎖の多量体形成には３４２残基以降のＣ末側ドメインが重要であり、この部分をＩｇＡ２ｍ２由来配列に置換すると、ＣＨＯ細胞において多量体形成が促進されることが明らかとなった。
［実験例１３：ＩｇＡ２ｍ２抗体のシングルアミノ酸置換変異体の多量体化の検討］
ＩｇＡ１重鎖のＣＨ３以降Ｃ末端までのアミノ酸配列と、これに対応するＩｇＡ２ｍ２重鎖のアミノ酸配列とで異なるアミノ酸残基は、第４１１残基、第４２８残基、第４５１残基、第４５８残基、第４６７残基の５残基であるため、以下の解析を行った。
ＩｇＡ１重鎖のＣＨ３以降Ｃ末端までのアミノ酸配列と、これに対応するＩｇＡ２ｍ２重鎖のアミノ酸配列とで異なるアミノ酸残基は、第４１１残基、第４２８残基、第４５１残基、第４５８残基、第４６７残基の５残基であるため、以下の解析を行った。
（Ｆｃ領域のアミノ酸置換変異体の作製）
重鎖定常領域（Ｆｃ領域）のアミノ酸置換変異体を作製した。より具体的には、α２ｍ２ ＨＣ発現ベクターを鋳型として、５種のアミノ酸置換（Ｙ４１１Ｆ、Ｅ４２８Ｄ、Ｍ４５１Ｌ、Ｉ４５８Ｖ、Ａ４６７Ｖ）が起こるように配列を改編したプライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、インバースＰＣＲを行った。
重鎖定常領域（Ｆｃ領域）のアミノ酸置換変異体を作製した。より具体的には、α２ｍ２ ＨＣ発現ベクターを鋳型として、５種のアミノ酸置換（Ｙ４１１Ｆ、Ｅ４２８Ｄ、Ｍ４５１Ｌ、Ｉ４５８Ｖ、Ａ４６７Ｖ）が起こるように配列を改編したプライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、インバースＰＣＲを行った。
続いて、増幅したＰＣＲ産物の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより環状に連結させた。反応産物で大腸菌を形質転換し、プラスミドを抽出し、シークエンスによりアミノ酸置換を起こす変異が導入されたことを確認した。
以下、作製した変異体を「ＩｇＡ２ｍ２ Ｙ４１１Ｆ」のように表記する。この場合、ＩｇＡ２ｍ２の定常領域の第４１１残基に相当するアミノ酸チロシン（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置換されている。他の変異体についても同様である。
続いて、実験例１１と同様にして、各変異体の多量体化への影響を解析した。図１１は検討結果を示すグラフである。その結果、ＩｇＡ２ｍ２抗体の４５８番目のＩをＶに置換すると、多量体が減少し単量体の比率が増加することが明らかとなった。
［実験例１４：ＩｇＡ１抗体のシングルアミノ酸置換変異体の多量体化の検討］
実験例１３と同様にして、Ｆｃ領域のアミノ酸置換変異体の作製及び解析を行った。以下、作製した変異体を「ＩｇＡ１ Ｆ４１１Ｙ」のように表記する。この場合、ＩｇＡ１の定常領域の第４１１残基に相当するアミノ酸フェニルアラニン（Ｆ）がチロシン（Ｙ）に置換されている。他の変異体についても同様である。
実験例１３と同様にして、Ｆｃ領域のアミノ酸置換変異体の作製及び解析を行った。以下、作製した変異体を「ＩｇＡ１ Ｆ４１１Ｙ」のように表記する。この場合、ＩｇＡ１の定常領域の第４１１残基に相当するアミノ酸フェニルアラニン（Ｆ）がチロシン（Ｙ）に置換されている。他の変異体についても同様である。
続いて、実験例１１と同様にして、各変異体の多量体化への影響を解析した。図１２は検討結果を示すグラフである。その結果、ＩｇＡ１抗体の４５８番目のＶをＩに置換すると、多量体化が顕著に促進されることが明らかとなった。
［実施例１５：ＩｇＡ多量体化促進活性に対するＩｇＡ１重鎖内Ｖ４５８の解析］
ＩｇＡの多量体化促進活性におけるＩｇＡ１重鎖内Ｖ４５８の役割について解析するため、Ｖ４５８の変異体発現ベクターを以下の通りに構築した。
ＩｇＡの多量体化促進活性におけるＩｇＡ１重鎖内Ｖ４５８の役割について解析するため、Ｖ４５８の変異体発現ベクターを以下の通りに構築した。
（Ｖ４５８変異体ベクターの構築）
ＩｇＡ１重鎖４５８番目のＶをアミノ酸各種に置換した変異体を構築するため、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥを制限酵素ＭｆｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理しライゲーション用フラグメントを調製した。また、インサートリンカーを調製するため、Ｖ４５８Ｉ（配列番号３２及び３３）、Ｖ４５８Ａ（配列番号３４及び３５）、Ｖ４５８Ｗ（配列番号３６及び３７）、Ｖ４５８Ｃ（配列番号３８及び３９）、Ｖ４５８Ｄ（配列番号４０及び４１）、Ｖ４５８Ｅ（配列番号４２及び４３）、Ｖ４５８Ｆ（配列番号４４及び４５）、Ｖ４５８Ｇ（配列番号４６及び４７）、Ｖ４５８Ｈ（配列番号４８及び４９）、Ｖ４５８Ｋ（配列番号５０及び５１）、Ｖ４５８Ｌ（配列番号５２及び５３）、Ｖ４５８Ｍ（配列番号５４及び５５）、Ｖ４５８Ｎ（配列番号５６及び５７）、Ｖ４５８Ｐ（配列番号５８及び５９）、Ｖ４５８Ｑ（配列番号６０及び６１）、Ｖ４５８Ｒ（配列番号６２及び６３）、Ｖ４５８Ｓ（配列番号６４及び６５）、Ｖ４５８Ｔ（配列番号６６及び６７）、Ｖ４５８Ｙ（配列番号６８及び６９）の組み合わせで各ＤＮＡ断片を９５℃で１０分熱処理後に段階的に２５℃まで下げてアニーリングさせた。
ＩｇＡ１重鎖４５８番目のＶをアミノ酸各種に置換した変異体を構築するため、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥを制限酵素ＭｆｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理しライゲーション用フラグメントを調製した。また、インサートリンカーを調製するため、Ｖ４５８Ｉ（配列番号３２及び３３）、Ｖ４５８Ａ（配列番号３４及び３５）、Ｖ４５８Ｗ（配列番号３６及び３７）、Ｖ４５８Ｃ（配列番号３８及び３９）、Ｖ４５８Ｄ（配列番号４０及び４１）、Ｖ４５８Ｅ（配列番号４２及び４３）、Ｖ４５８Ｆ（配列番号４４及び４５）、Ｖ４５８Ｇ（配列番号４６及び４７）、Ｖ４５８Ｈ（配列番号４８及び４９）、Ｖ４５８Ｋ（配列番号５０及び５１）、Ｖ４５８Ｌ（配列番号５２及び５３）、Ｖ４５８Ｍ（配列番号５４及び５５）、Ｖ４５８Ｎ（配列番号５６及び５７）、Ｖ４５８Ｐ（配列番号５８及び５９）、Ｖ４５８Ｑ（配列番号６０及び６１）、Ｖ４５８Ｒ（配列番号６２及び６３）、Ｖ４５８Ｓ（配列番号６４及び６５）、Ｖ４５８Ｔ（配列番号６６及び６７）、Ｖ４５８Ｙ（配列番号６８及び６９）の組み合わせで各ＤＮＡ断片を９５℃で１０分熱処理後に段階的に２５℃まで下げてアニーリングさせた。
続いて、各リンカーとベクターとを連結し、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｉ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ａ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｗ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｃ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｄ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｅ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｆ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｇ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｈ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｋ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｌ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｍ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｎ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｐ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｑ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｒ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｓ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｔ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｙを構築した。
（各種変異体発現ベクターの遺伝子導入と発現解析）
続いて、リポフェクション法により、作製したＶ４５８の各種変異体発現ベクターと上述した抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２の軽鎖発現ベクター（ｐＩｇＡ－ＬＣ）とをＣ２３細胞にそれぞれトランスフェクションした。
続いて、リポフェクション法により、作製したＶ４５８の各種変異体発現ベクターと上述した抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２の軽鎖発現ベクター（ｐＩｇＡ－ＬＣ）とをＣ２３細胞にそれぞれトランスフェクションした。
続いて、５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で７２時間培養した後、多量体抗体産生能の評価のため培養上清各１０μＬを実験例３と同様にして、ＢＮ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング解析に供した。
図１３は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、第４５８残基をＩ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、Ｇ、Ｙに置換した場合に多量体が検出され、特にＩに置換した場合に、より高分子側へシフトしていた。上記以外のアミノ酸に置換した場合には、ほとんど多量体の形成は認められなかった。この結果から、多量体形成には第４５８残基のアミノ酸が重要な役割を担い、第４５８残基が疎水性アミノ酸である場合に有意に抗体の多量体化が促進されることが明らかとなった。また、特に第４５８残基がイソロイシンである場合に、強い多量体形成促進活性が認められた。
［実験例１６：Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるＩｇＡ１抗体の第４５８残基のアミノ酸置換変異体の多量体化の検討］
（Ｆｃ領域のアミノ酸置換変異体の作製）
Ｃ２３細胞の代わりにＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を用いて実験例１５と同様の検討を行った。具体的には、実験例１５で作製した、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｉ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ａ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｗ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｅ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｇ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｋ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｌの発現プラスミドを使用し、実験例１３と同様の実験を行った。
（Ｆｃ領域のアミノ酸置換変異体の作製）
Ｃ２３細胞の代わりにＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を用いて実験例１５と同様の検討を行った。具体的には、実験例１５で作製した、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｉ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ａ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｗ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｅ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｇ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｋ、ｐＩｇＡ１Ｈ－ＮＲＥ－Ｖ４５８Ｌの発現プラスミドを使用し、実験例１３と同様の実験を行った。
図１４は、検討結果を示すグラフである。その結果、ＩｇＡ１抗体の４５８番目のＶをＩに置換すると多量体化が顕著に促進されることが明らかとなった。
［実験例１７：ＩｇＡ１及び各ＩｇＡ２アロタイプの多量体化におけるＶ４５８の役割の検討］
（Ｆｃ領域のアミノ酸置換変異体の作製）
ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、ＩｇＡ２（ｎ）について、第４５８残基の変異体を作製し、多量体化における役割を検討した。α２ｍ１ ＨＣのアミノ酸置換変異体を作製する場合、α２ｍ１ ＨＣ発現ベクターを鋳型として、目的のアミノ酸置換（Ｖ４５８Ｉ）が起こるように配列を改編したプライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用したインバースＰＣＲを行った。続いて、増幅したＰＣＲ産物の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより環状に連結させた。続いて、反応産物で大腸菌を形質転換し、プラスミドを抽出し、シークエンスにより目的のアミノ酸置換を起こす変異が導入されたことを確認した。α２（ｎ） ＨＣについても同様にして第４５８残基のアミノ酸変異を有する変異体を作製した。α１ ＨＣについては実験例１４、α２ｍ２ ＨＣは実験例１３で作製した変異体を用いた。
（Ｆｃ領域のアミノ酸置換変異体の作製）
ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、ＩｇＡ２（ｎ）について、第４５８残基の変異体を作製し、多量体化における役割を検討した。α２ｍ１ ＨＣのアミノ酸置換変異体を作製する場合、α２ｍ１ ＨＣ発現ベクターを鋳型として、目的のアミノ酸置換（Ｖ４５８Ｉ）が起こるように配列を改編したプライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用したインバースＰＣＲを行った。続いて、増幅したＰＣＲ産物の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより環状に連結させた。続いて、反応産物で大腸菌を形質転換し、プラスミドを抽出し、シークエンスにより目的のアミノ酸置換を起こす変異が導入されたことを確認した。α２（ｎ） ＨＣについても同様にして第４５８残基のアミノ酸変異を有する変異体を作製した。α１ ＨＣについては実験例１４、α２ｍ２ ＨＣは実験例１３で作製した変異体を用いた。
続いて、実験例１３と同様にして、作製した各変異体の多量体化への影響を解析した。図１５は検討結果を示すグラフである。その結果、第４５８番目のアミノ酸残基がＩの場合に、ＩｇＡ１及び全てのＩｇＡ２アロタイプで顕著な多量体形成促進活性が確認された。
［実験例１８：ＩｇＡ四量体安定発現株の樹立及びプロダクトの機能解析］
上述したｓｐＥＲｔ技術を用いて四量体ＩｇＡ抗体を製造し、以下の方法で解析した。
上述したｓｐＥＲｔ技術を用いて四量体ＩｇＡ抗体を製造し、以下の方法で解析した。
（ｓｐＥＲｔ技術を用いたＩｇＡ四量体安定発現株の樹立）
Ｊ／ＳＣ安定発現ＣＨＯ株Ｃ２３に抗インフルエンザウイルス抗体クローンＦ１１の軽鎖発現ベクターｐＩｇＡ－ＬＣと、ＩｇＡ１重鎖発現ベクターｐＩｇＡ１－ＨＣ又はＩｇＡ２ｍ２重鎖発現ベクターｐＩｇＡ２ｍ２－ＨＣとをリポフェクション法にてトランスフェクションした。ピューロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）による薬剤選択を経て、ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖を安定に発現するＣＨＯ株Ｃ７８、並びにＩｇＡ２ｍ２重鎖及び軽鎖を安定に発現するＣＨＯ株Ｃ１７９を樹立した。
Ｊ／ＳＣ安定発現ＣＨＯ株Ｃ２３に抗インフルエンザウイルス抗体クローンＦ１１の軽鎖発現ベクターｐＩｇＡ－ＬＣと、ＩｇＡ１重鎖発現ベクターｐＩｇＡ１－ＨＣ又はＩｇＡ２ｍ２重鎖発現ベクターｐＩｇＡ２ｍ２－ＨＣとをリポフェクション法にてトランスフェクションした。ピューロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）による薬剤選択を経て、ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖を安定に発現するＣＨＯ株Ｃ７８、並びにＩｇＡ２ｍ２重鎖及び軽鎖を安定に発現するＣＨＯ株Ｃ１７９を樹立した。
ＣＨＯ－Ｋ１（１Ｅ２６）細胞に上述したｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃１－ｈＪＣＮＱ及びｐＣＸＳＮ－ｃｉｓ＃２－ｈＳＣＮＱ並びに抗インフルエンザウイルス抗体クローンＦ１１の軽鎖発現ベクターｐＩｇＡ－ＬＣと、ＩｇＡ１重鎖発現ベクターｐＩｇＡ１－ＨＣ又はＩｇＡ２ｍ２重鎖発現ベクターｐＩｇＡ２ｍ２－ＨＣとをリポフェクション法にて導入しＺｅｏｃｉｎ（４００μｇ／ｍＬ）及びピューロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）で薬剤選択を行い、ＩｇＡ１重鎖、軽鎖、ｈＪＣＮＱ、ｈＳＣＮＱを安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１株Ｃ１０４、及び、ＩｇＡ２ｍ２重鎖、軽鎖、ｈＪＣＮＱ、ｈＳＣＮＱを安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１株Ｃ１１７を樹立した。各細胞の培養上清をＢＮ－ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングにより解析した。図１６Ａは結果を示す写真である。これらの細胞株は全てＩｇＡ多量体を効率的に分泌することが確認された。
（ＩｇＡ多量体抗体のウイルス中和活性解析）
上述した細胞株Ｃ７８、Ｃ１７９、Ｃ１０４及びＣ１１７を、それぞれ５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭにて７日間培養し、培養液を低速遠心とポアサイズ０．４５μｍのフィルターを用いたろ過により清澄化後、ＩｇＡ抗体をＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｈｕｍａｎ Ｆｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて実験例１～４と同様にして精製した。
上述した細胞株Ｃ７８、Ｃ１７９、Ｃ１０４及びＣ１１７を、それぞれ５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭにて７日間培養し、培養液を低速遠心とポアサイズ０．４５μｍのフィルターを用いたろ過により清澄化後、ＩｇＡ抗体をＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｈｕｍａｎ Ｆｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて実験例１～４と同様にして精製した。
得られたＩｇＡ粗精製画分に対しＶｉｖａｓｐｉｎ２０（ＧＥ社製）を用いてＰＢＳ（－）に溶媒置換し、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ２多量体抗体溶液を調製した。
抗体の収量は、細胞懸濁液８０ｍＬあたり、Ｃ７８は約０．４０４ｍｇ、Ｃ１７９は０．７１２ｍｇ、Ｃ１０４は約０．２９８ｍｇ、Ｃ１１７は約０．１７９ｍｇであった。なお、抗体の収量は、各細胞を無血清馴化後に浮遊培養を行うことや、培養条件、培地を検討すること等により、１～２桁上昇させることが可能である。
調製した各抗体の中和活性は、マイクロ中和試験による最小中和濃度測定により定量した。抗体サンプルの２倍段階希釈系列を準備し、１００ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量の１００倍量）のウイルス液と混合後、３０分間３７℃にてインキュベーションした。その後、この混合液をＭＤＣＫ細胞に添加し５日間培養を行い、顕微鏡下でインフルエンザウイルスによる細胞変性効果が確認できないサンプル最大希釈倍率でサンプルの濃度を割った値を最少中和濃度とした。
ウイルスとしては、ワクチン製造株Ａ／Ｘ－１７９Ａ（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）（以下、「Ｘ－１７９Ａ」という場合がある。）及び実験室株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（以下、「ＰＲ８」という場合がある。）を用いた。
結果を表７に示す。その結果、ＣＨＯ細胞から調製したＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ２抗体のＸ－１７９Ａに対する最少中和濃度は、それぞれ０．４４、０．２２、０．６３、０．２２μｇ／ｍＬであり、Ｅｘｐｉ２９３細胞で調製したＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ２抗体の最少中和濃度とほぼ同程度であった。またＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に対するＩｇＡ１抗体の最少中和濃度はそれぞれ４．４２μｇ／ｍｌであり、Ｅｘｐｉ２９３細胞で調製したＩｇＡ１抗体の最少中和濃度とほぼ同程度であった。
以上のことから、ｓｐＥＲｔ技術を用いて作製したＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ２抗体は、実験例７で測定した結果と同等の中和活性を有することが示された。
［実験例１９：ｓｐＥＲｔ技術によるＩｇＡ抗体の作製］
ｓｐＥＲｔ技術によるＩｇＡ抗体の生産性増強効果について検討した。
ｓｐＥＲｔ技術によるＩｇＡ抗体の生産性増強効果について検討した。
（単量体ＩｇＡ抗体の生産性増強効果）
実験例１２に記載の方法と同様にして、ｐ１８０及びＳＦ３ｂ４を安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株１Ｃ１７を樹立した。
実験例１２に記載の方法と同様にして、ｐ１８０及びＳＦ３ｂ４を安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株１Ｃ１７を樹立した。
細胞株Ｃ２３、ＣＨＯ－Ｋ１及び１Ｃ１７を無血清浮遊の培養条件に段階的に馴化し、細胞株Ｃ２３Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１Ｓ、１Ｃ１７Ｓを樹立した。また、国際公開第２０１４／１５７４２９号に記載のｃｉｓ＃２を抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２及びクローンＦ１１のｐＩｇＡ１－ＨＣ又はｐＩｇＡ２ｍ２－ＨＣに挿入した発現ベクターｐＩｇＡ１－ｃｉｓ－ＨＣ、ｐＩｇＡ２ｍ２－ｃｉｓ－ＨＣと、ｃｉｓ＃１を抗インフルエンザウイルス抗体クローンＢ１２及びクローンＦ１１のｐＩｇＡ－ＬＣに挿入した発現ベクターｐＩｇＡ－ｃｉｓ－ＬＣを構築した。
ＣＨＯ－Ｋ１Ｓ細胞に、ｐＩｇＡ－ＬＣと、ｐＩｇＡ１－ＨＣ又はｐＩｇＡ２ｍ２－ＨＣとをトランスフェクションした。また、１Ｃ１７Ｓ細胞に、ｐＩｇＡ－ｃｉｓ－ＬＣと、ｐＩｇＡ１－ｃｉｓ－ＨＣ又はｐＩｇＡ２ｍ２－ｃｉｓ－ＨＣをトランスフェクションした。４８時間後の培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより解析した。図１６Ｂは結果を示す写真である。図１６Ｂ中、「２９３ｐｏｓｉ」は実施例４と同様に２９３ｅｘｐｉ細胞で作製した多量体ＩｇＡ分画の陽性コントロールを表し、「ＩｇＡｐｏｓｉ」はＩｇＡのスタンダードを表す。
その結果、１Ｃ１７Ｓ細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１Ｓ細胞と比較して、ＩｇＡの発現が飛躍的に増加したことが確認された。
（多量体ＩｇＡ抗体の生産性増強効果）
各クローンの多量体を作製するため、ＣＨＯ－Ｋ１Ｓ細胞に、上述したｐＩｇＡ－ＬＣと、ｐＥＦ－ｃｉｓ－ｈＪＣ／Ｚｅｏと、ｐＥＦ／ｃｉｓ－ｈＳＣ／Ｚｅｏと、ｐＩｇＡ１－ＨＣ又はｐＩｇＡ２ｍ２－ＨＣとをリポフェクション法によりトランスフェクションした。
各クローンの多量体を作製するため、ＣＨＯ－Ｋ１Ｓ細胞に、上述したｐＩｇＡ－ＬＣと、ｐＥＦ－ｃｉｓ－ｈＪＣ／Ｚｅｏと、ｐＥＦ／ｃｉｓ－ｈＳＣ／Ｚｅｏと、ｐＩｇＡ１－ＨＣ又はｐＩｇＡ２ｍ２－ＨＣとをリポフェクション法によりトランスフェクションした。
同様に、１Ｃ１７Ｓ細胞に、上述したｐＩｇＡ－ｃｉｓ－ＬＣと、ｐＥＦ－ｃｉｓ－ｈＪＣ／Ｚｅｏと、ｐＥＦ／ｃｉｓ－ｈＳＣ／Ｚｅｏと、ｐＩｇＡ１－ｃｉｓ－ＨＣ又はｐＩｇＡ２ｍ２－ｃｉｓ－ＨＣとをトランスフェクションした。
また、Ｃ２３細胞に、ｐＩｇＡ－ｃｉｓ－ＬＣと、ｐＩｇＡ１－ｃｉｓ－ＨＣ又はｐＩｇＡ２ｍ２－ｃｉｓ－ＨＣとをトランスフェクションした。
続いて、４８時間後の培養上清を、実験例１５と同様にしてＢＮ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより解析した。結果を図１６Ｃに示す。その結果、１Ｃ１７Ｓ細胞、Ｃ２３細胞におけるクローンＢ１２およびＦ１１ともに７２０ｋＤａ以上の領域にヒトアルファ鎖に対する抗体の陽性バンドが強く検出され、多量体ＩｇＡ１抗体産生量が２６倍から３５倍以上に増加した（図１６Ｃ、レーン１～３、７～９）。
また、多量体ＩｇＡ２ｍ２産生量も１Ｃ１７Ｓ細胞、Ｃ２３細胞において顕著に増加していた。しかしながら、これらの細胞の親株であるＣＨＯ－Ｋ１Ｓ細胞では多量体ＩｇＡ２ｍ２の発現がではほとんど検出できなかった（図１６Ｃ、レーン４～６）。
また、図１６Ｄに示すように、抗ＳＣ抗体、抗Ｊ鎖抗体によるウエスタンブロッティングを行った結果、これらの多量体バンドは、ＳＣおよびＪ鎖陽性であることが明らかとなった。
以上の結果より、ｓｐＥＲｔ技術によりＩｇＡ多量体抗体の生産性を著しく向上させることができることが示され、ＩｇＡ多量体製造におけるｓｐＥＲｔ技術の高い有用性が確認された。
［実験例２０：ＩｇＡ多量体の質量分析］
実験例４と同様に調製したＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ２の多量体（四量体）分画成分の分子量を、質量分析計を用いて測定した。ここで、ＩｇＡ１にはｐＣＸＳＮ－ｈＳＣを用いてタグの無いＳＣを作製した。また、ＩｇＡ２ｍ２にはｐＣＸＳＮ－ｈＳＣ－ＨｉｓＴａｇを用いてタグ付きＳＣを発現させて各多量体を作製した。
実験例４と同様に調製したＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ２の多量体（四量体）分画成分の分子量を、質量分析計を用いて測定した。ここで、ＩｇＡ１にはｐＣＸＳＮ－ｈＳＣを用いてタグの無いＳＣを作製した。また、ＩｇＡ２ｍ２にはｐＣＸＳＮ－ｈＳＣ－ＨｉｓＴａｇを用いてタグ付きＳＣを発現させて各多量体を作製した。
まずＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ２多量体画分の溶媒を、脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、「Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ」、７Ｋ ＭＷＣＯ、０．５ｍＬ）を用いて１２．５ｍＭ酢酸アンモニウムに置換した。この試料を５０ｍＭ又は１００ｍＭ酢酸アンモニウムで５倍または１０倍に希釈し、ナノイオン源（Ａｄｖｉｏｎ 社製「ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ」）を用いて四重極－飛行時間型質量分析装置ｍａＸｉｓ ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）に導入して、以下の条件で測定を行った。イオン化：ＥＳＩポジティブ（Ｈｉｇｈ Ｍａｓｓオプション）、イオンスプレー電圧：１．４～１．８ｋＶ、イオンソース温度：８０℃。
図１７Ａ～図１７Ｄに、Ｈｉｇｈ Ｍａｓｓオプションを使用したマイルドなイオン導入条件下で測定された四量体、及び通常に近いイオン導入条件下で測定された単量体相当のイオンピークの例を示す。
図１７Ａに示すように、マイルドなイオン導入により、ＩｇＡ１の多量体画分では、四量体に相当する平均質量７４５．６３ｋＤａのピーク等が検出された。
図１７Ｃに示すように、マイルドなイオン導入により、ＩｇＡ２ｍ２の多量体画分では、四量体に相当する７４５．１８ｋＤａのピーク等が検出された。
これらの試料に、通常に近い条件下でイオン導入することにより、複合体を解離させると、図１７Ｂに示すように、ＩｇＡ１の単量体に相当する１６２．１８ｋＤａのピーク等が検出された。
また、図１７Ｄに示すように、通常に近い条件下でイオン導入することにより、ＩｇＡ２ｍ２の単量体に相当する１５４．８７ｋＤａのピーク等が検出された。
その他、ＩｇＡ１多量体画分の分析から４９．００ｋＤａ、４９．２１ｋＤａのイオンピークが検出された。また、ＩｇＡ２ｍ２多量体画分では５７．２８ｋＤａ、２３．０３ｋＤａ、３５４．４９ｋＤａのイオンピークが検出された。表８に各試料から得られた平均質量を示す。
続いて、実験例４と同様にして調製したＩｇＡ２ｍ２の多量体（四量体）画分について、ＨＭ３ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ（ＣｏｖａｌＸ社製）を装着したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ型質量分析計ＴＯＦ／ＴＯＦ ５８００システム（ＡＢＳｃｉｅｘ社製）で高分子領域の分子量測定を行った。まず、試料をそのまま分析したところ、図１８Ａに示すように、単量体に相当する１６２．６３ｋＤａのピークと四量体に相当する７３４．９３ｋＤａのピークが検出された。更に、図１８Ｂに示すように、５７６．８２ｋＤａのピークも検出された。５７６．８２ｋＤａのピークは、四量体に相当する７３４．９３ｋＤａのピークとの差が約１５８ｋＤａであることから、三量体型であると考えられた。
また、図１８Ｃに示すように、クロスリンク剤（Bich C., et al., Reactivity and applications of new amine reactive cross-linkers for mass spectrometric detection of protein-protein complexes., Anal. Chem. 82, 172-179, 2010 を参照。）により複合体を安定化させると、四量体の増加とそれに伴う単量体の減少が確認された。
［実施例２１：質量分析による新規定量方法］
多量体画分中の各サブユニットの構成比を高精度に定量するため、安定同位体標識ペプチドを内部標準とした質量分析による新規定量方法を確立した。
多量体画分中の各サブユニットの構成比を高精度に定量するため、安定同位体標識ペプチドを内部標準とした質量分析による新規定量方法を確立した。
ヒトＩｇＡの各重鎖（α１、α２ｍ１、α２ｍ２、α２ｎ）及び軽鎖（λ型、κ型）の定常領域部分のアミノ酸配列よりトリプシンによる生成される予想ペプチドを比較し、ＩｇＡ１重鎖（α１）特異的配列、ＩｇＡ２重鎖（α２ｍ１、α２ｍ２、α２ｎ）特異的配列、ＩｇＡ１／ＩｇＡ２共通配列、軽鎖のλ型とκ型の各特異配列の候補を選定した。
ここで、軽鎖については、個体間で異なる定常領域遺伝子及びアレルによる配列の違いで生じる影響を除外するため、公共データベースであるＩＭＧＴに登録されているアミノ酸配列情報から、ほとんどのサブタイプを網羅する共通配列部分を選択した。
続いて、実験例２と同様にして調製したＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ２の単量体を以下の手順でトリプシン消化後、高速液体クロマトグラフ－質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）に供して、上記候補配列の中からイオン強度が良好な配列を選定し、各ペプチドのＣ末端に位置するリジンまたはアルギニンを安定同位体（１３Ｃ６
１５Ｎ４－Ｌｙｓまたは１３Ｃ６
１５Ｎ４－Ａｒｇ）で標識した安定同位体標識ペプチドを外注により合成した（Ａｎｙｇｅｎ社）。選定した各アミノ酸配列を表９に示す。
Ｊ鎖及びＳＣに関しても同様にして候補を選び、実験例４と同様にして調製したＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ２の多量体画分のトリプシン消化物の分析結果から、イオン強度が良好な配列を選定し、安定同位体標識ペプチドを外注により合成した（Ａｎｙｇｅｎ社）。選定した各アミノ酸配列を表９に示す。
ヒト鼻腔粘膜由来ＩｇＡ二量体画分及び組換えＩｇＡ１多量体画分について、ＬＣ－ＭＳによる解析を行った。ヒト鼻腔粘膜由来ＩｇＡ二量体画分は、Suzuki T., et al., Relationship of the quaternary structure of human secretory IgA to neutralization of influenza virus, PNAS 112 (25), 7809-7817, 2015 に記載された方法と同様にして調製した。また、組換えＩｇＡ１多量体画分は、実験例４と同様にして調製した。これらのサンプルについて、ＩｇＡ多量体画分のサブユニット比を、トリプシン消化後、ＬＣ－ＭＳを用いて以下のように評価した。
まず、ＩｇＡサンプル１０μｇに１００ｍＭとなるようにＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を、１ｍＭとなるようにＣａＣｌ２を、そして各サブユニットの安定同位体標識ペプチドを内部標準として０．０５ｎｍｏｌ添加した。この溶液に５ｍＭとなるようにＤＴＴ（Ｗａｋｏ社製）を添加してから、５６℃で３０分間加熱して還元処理を行った。その後、２５ｍＭとなるようにヨードアセトアミド（Ｗａｋｏ社製）を添加し、遮光しながら室温で３０分間、遊離ＳＨ基のアルキル化反応を行った。続いて、０．２μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｆｒｏｚｅｎ」）を加え、３７℃、１６時間分解反応を行った。得られた分解液にギ酸を１％となるように添加し、これを測定試料とした。
ＬＣ－ＭＳ（ＬＣ部：島津製作所社製Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、ＭＳ部：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製ｍａＸｉｓ ＩＩ）により、作製したペプチド溶液の分析を行った。Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８カラム（Ｓｕｐｌｅｃｏ社製、粒子径５μｍ、直径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用い、カラム温度２５℃、流速０．５ｍＬ／分で以下のグラジエント条件により分離を行った。
０～２分：Ａ液（０．１％ギ酸）９８％、Ｂ液（１００％アセトニトリル）２％；
２．１～６分：Ａ液９８～５０％、Ｂ液２～５０％；
６．１～８分：Ａ液１０％、Ｂ液９０％；
８．１～１０分：Ａ液９８％、Ｂ液２％。
０～２分：Ａ液（０．１％ギ酸）９８％、Ｂ液（１００％アセトニトリル）２％；
２．１～６分：Ａ液９８～５０％、Ｂ液２～５０％；
６．１～８分：Ａ液１０％、Ｂ液９０％；
８．１～１０分：Ａ液９８％、Ｂ液２％。
分離したペプチド成分を、次の条件により質量分析部で検出した。イオン化：ＥＳＩポジティブ、イオンスプレー電圧：４．５ｋＶ、イオンソース温度：２００℃。
表９に示す各サブユニット由来のペプチドのピーク面積及びそれに対応する安定同位体標識ペプチドのピーク面積を定量し、そのピーク面積比の２ペプチドの平均から、重鎖（共通）を１として各サブユニットの比率を算出した。
図１９Ａにヒト由来ＩｇＡ二量体画分の結果を示す。その結果、重鎖のＩｇＡ１とＩｇＡ２ｍ２の比は約５対１であり、軽鎖のλ型とκ型の比は約１対２であり、混在が認められた。また、全体としての重鎖と軽鎖の比は約１対１と算出された。一方、Ｊ鎖及びＳＣ鎖の存在量は明らかに低く、重鎖及び軽鎖に対する比は、どちらも約１対４と算出された。
図１９Ｂに、組換えＩｇＡ１多量体画分の結果を示す。その結果、軽鎖λ型がＩｇＡ１重鎖に対し１：１に近い比で検出された。一方、Ｊ鎖及びＳＣは、ＩｇＡ１重鎖に対する比がそれぞれ約１対７及び約１対８であった。
本発明によれば、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を提供することができる。また、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する医薬を提供することができる。また、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法を提供することができる。また、抗体の抗原結合活性を向上させる方法を提供することができる。
ＮＩＴＥ ＢＰ－０１５３５
Claims (15)
- 多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体。
- 重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に由来するアミノ酸残基である、請求項１に記載の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体。
- 四量体の含有量が全ＩｇＡの２０モル％以上である、請求項１又は２に記載の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する医薬。
- 感染症の治療又は予防用である、請求項４に記載の医薬。
- ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、多量体ＩｇＡ型抗体の製造方法。
- 前記ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質は、遺伝子組換えによりＩｇＧ型からＩｇＡ型に変換されたものである、請求項６に記載の製造方法。
- 前記工程において、更にｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を前記細胞内で共発現させる、請求項６又は７に記載の製造方法。
- 前記細胞がＣＨＯ ＹＡ７細胞株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０１５３５）である、請求項６～８のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程は、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を発現するための発現ベクターを前記細胞内に導入することにより行われ、
前記発現ベクターは、プロモーターの下流で、かつ、ＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、抗体軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質又は分泌成分タンパク質をコードする核酸の開始コドンの上流に、ＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合又は相互作用するｃｉｓ－エレメントを有する、請求項６～９のいずれか一項に記載の製造方法。 - 前記ｃｉｓ－エレメントが、配列モチーフＧＡＮ１－（Ｘ）ｎ－ＡＣＮ２（ｎは３～６の整数であり、Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立して、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかである。）からなる塩基配列を１～数個含む、請求項１０に記載の製造方法。
- 前記ｃｉｓ－エレメントが、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、ＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列、又は、
配列番号２１～２３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＲＮＡ結合タンパク質が認識、結合若しくは相互作用する塩基配列からなる、請求項１０又は１１に記載の製造方法。 - 抗体を多量体ＩｇＡ型化する工程を含む、前記抗体の抗原結合活性又は中和活性を向上させる方法。
- 前記抗体は、ＩｇＧ型抗体である、請求項１３に記載の方法。
- 前記工程が、前記抗体の重鎖可変領域を有するＩｇＡ型抗体重鎖タンパク質、前記抗体の軽鎖タンパク質、抗体Ｊ鎖タンパク質及び分泌成分タンパク質を１つの細胞内で共発現させる工程を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
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