JP2022522985A - 免疫グロブリンａ抗体、並びに産生及び使用の方法 - Google Patents

Abstract

本開示の主題は、抗体、例えば、ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子、並びにそのような抗体を含む組成物と、そのような抗体及び組成物を作製及び使用する方法を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月２２日に出願された米国仮出願第６２／７９５，３６７号、及び２０１９年４月２４日に出願された米国仮出願第６２／８３８，０７１号の優先権を主張し、これらの内容全体が参照により組み込まれ、優先権が主張される。

本開示は、抗体、例えば、ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子、並びにそのような抗体を含む組成物と、そのような抗体及び組成物を作製及び使用する方法に関する。

免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、ほとんどの哺乳動物の粘膜分泌物に存在する主要なクラスの抗体であり、脆弱な粘膜表面での吸入及び摂取された病原体による侵入に対する防御の第一線となる。ヒトでは、ＩｇＡ２分子には存在しないＩｇＡ１重鎖（ＨＣ）のヒンジ領域の１３残基の伸長によって区別される２つのＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が存在する（Ｌｅｕｓｅｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６８：３５－９（２０１５））。両方のアイソタイプは、ＩｇＡ２が優勢である腸及びＩｇＡ１単量体がほぼ排他的に見出される血清を除いて、全ての器官及び組織に豊富である（Ｋｅｒｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７１：２８５－９６（１９９０））。ＩｇＡ２には、ｍ１（Ｔｓｕｚｕｋｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ７６：１１０４－８（１９７９））、ｍ２（Ｔｏｒａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ７５：９６６－９（１９７８））、及びｍｎ（Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１５２：５２９９－３０４（１９９４））の３つのアロタイプがある。ｍ２及びｍｎのアロタイプはカノニカル軽鎖（ＬＣ）－ＨＣジスルフィドを形成するが、ＩｇＡ２ｍ１中のＨＣの位置２２１にプロリンが存在するとＬＣ－ＬＣジスルフィド結合が形成される（Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：３４４３－９（１９９６））。ＩｇＡ２ｍ１アロタイプにおけるプロリン２２１のアルギニン（Ｐ２２１Ｒ）への変異は、ｍ２アロタイプ及びｍｎアロタイプにおいて見出され、標準的なＬＣ－ＨＣ結合を回復させる（Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ７６：４０３－１７（２０１６）及びＣｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６））。ＩｇＡ１アイソタイプとＩｇＡ２アイソタイプとの間の配列同一性は、約９０％と非常に高く、ＩｇＡ２アロタイプの間では更に高く、ｍ１とｍ２との間にわずか６残基の差があり、ｍｎとｍ１又はｍ２のいずれかとの間に２残基の差がある（Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４））。

他のヒト免疫グロブリンクラスとは対照的に、ＩｇＡは、単量体可溶性種及びポリマー可溶性種の両方として天然に存在する固有の能力を有するが、その後のトランスサイトーシスのためにポリマーＩｇＡ（ｐＩｇＡ）のみがｐＩｇＲに結合することができる（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：３－１０（２００５））。ＩｇＡのオリゴマー化は、テールピース及び１３７アミノ酸連結鎖（ＪＣ）と呼ばれるＨＣの１８残基のＣ末端伸長によって促進される。第１のＩｇＡ単量体のＩｇＡテールピースの最後から２番目の残基Ｃｙｓ４７１は、ＪＣのＣｙｓ１５とのジスルフィド結合形成を媒介し、第２のＩｇＡ単量体のＣｙｓ４７１は、ＪＣのＣｙｓ６９とのジスルフィド結合形成を媒介して、単一のＪＣによって一緒に保持される共有結合ＩｇＡ二量体を形成する（Ｚｉｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ２３：５４１－４（１９８６）及びＨａｌｐｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１１：１６５３－６０（１９７３））。各ＩｇＡ単量体は、各々がテールピースを有する２つのＨＣから構成されることから、ＩｇＡ二量体は、追加のＩｇＡ単量体を連結することができる２つの不対のＣｙｓ４７１残基を有する。三量体、四量体及び五量体等のより高次のＩｇＡオリゴマーが報告されている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１１２：７８０９－１４（２０１５））。血清ＩｇＡは主に単量体であるが、ポリマーＩｇＡは粘膜固有層内の形質細胞によって産生される。ポリマーＩｇＡ中のＪＣの存在は、上皮の基底外側でのｐＩｇＲの結合及び粘膜組織の頂端側への能動輸送に必要である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ１１：２０５－１３（２００４））。トランスサイトーシスの際に、ｐＩｇＲの細胞外ドメインはタンパク質分解的に切断されて分泌成分（ＳＣ）として知られるものを生成し、これはｐＩｇＲ中のＣｙｓ４６７と１つのＨＣ中のＣｙｓ３１１との間のジスルフィド結合を介してポリマーＩｇＡ重鎖に共有結合したままである（Ｆａｌｌｇｒｅｅｎ－Ｇｅｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ３７４：１０２３－８（１９９３）及びＢａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ３７１Ａ：５８１－３（１９９５））。この複合体は、粘膜免疫の主な決定因子である分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）と考えられている（Ｍａｎｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ４：６０３－１１（２０１１）及びＪｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ４：５９８－６０２（２０１１））。

免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）研究は、従来のＩｇＧベースの治療薬と比較して、単量体及びポリマー免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体の両方について、複数の潜在的な治療用途及び独特の作用機序を強調している（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）、Ｂａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ３：３５２－６１（２０１１）及びＬｅｕｓｅｎ（２０１５））。腫瘍学において、単量体及びポリマーの抗ＥＧＦＲ及び抗ＣＤ２０ ＩｇＡは、ＦｃαＲＩ媒介性細胞傷害又はより効果的な受容体結合及びダウンモジュレーションによって駆動され、ＩｇＧと比較して優れた腫瘍細胞殺傷を実証した（Ｐａｓｃａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ９７：１６８６－９４（２０１２）、Ｂｏｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１２１３－２６（２０１３）及びＬｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６））。ＩｇＡの細胞傷害活性は、ＩｇＧ／Ａ融合分子又はハイブリッド分子によるＦｃγＲ及びＦｃαＲＩの両方の二重結合を介して更に増加させることができた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１７）及びＫｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ２１：１６０３－９（２０１５））。感染症については、ＩｇＡ多価標的関与は、インフルエンザ感染モデルにおいて優れた抗原結合及び中和を可能にした（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５））。更に、ヒトＩｇＡ二量体（ｄＩｇＡ）は、多発性嚢胞腎疾患マウスモデルにおいて、ポリマー免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）への結合を介して腎管腔に効果的に送達することができたが、ＩｇＧ分子は送達することができなかった（Ｏｌｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９０：１５６７９－８６（２０１５））。ＩｇＡの特異的トランスサイトーシス活性を利用することにより、現在のＩｇＧ治療薬によって非効率的に標的化される粘膜組織の管腔側内の治療標的へのアクセスが潜在的に可能になり得る（Ｂａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）、Ｏｌｓａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）及びＢｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ３（２０１８））。

組換え単量体ＩｇＡの産生は、十分に確立されたＩｇＧ分子の産生よりも困難である。ＩｇＡ抗体は、典型的には発現不良及び不均一なグリコシル化を被る。ヒトＩｇＧ１は、典型的には、各Ｃ_Ｈ２ドメインに１つずつ、２つのＮ結合型グリコシル化部位のみを有するのに対して、ヒトＩｇＡは、グリカン不均一性に感受性であり得る複数のグリコシル化部位を含む（Ｌｅｕｓｅｎ（２０１５））。ＩｇＡ１は、ヒンジ領域に複数のＯ結合型グリコシル化部位を有し、ＨＣ定常ドメインにも２つのＮ結合型グリコシル化部位を有する。ＩｇＡ２分子はＯ結合型グリカンによって改変されていないが、４つ（ＩｇＡ２ｍ１）又は５つ（ＩｇＡ２ｍ２及びＩｇＡ２ｍｎ）のＮ結合型グリコシル化部位（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）及びＢａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１１））を含む。ＪＣはまた、１つのＮ結合型グリコシル化部位を含む。３つのポリペプチド鎖（ＬＣ、ＨＣ及びＪＣ）のアセンブリは、複数のオリゴマー状態をもたらし、組換えポリマーＩｇＡ（Ｒｏｕｗｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８：７４－８６（２０１６）及びＢｒｕｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ５：９３６－４５（２０１３））の全体的な複雑さに更に寄与する。ＩｇＡオリゴマーのサイズが増加すると、グリコシル化部位の数が増加するだけでなく、より多くのグリカン不均一性の可能性も生じる。

ＩｇＡは、複数の種において短い循環半減期（１日未満～約４日）を有することが以前に示されている（Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３６：３３１－８（１９７９）及びＬｅｕｓｅｎ（２０１５））。ＩｇＧとは異なり、ＩｇＡは新生児型受容体ＦｃＲｎに結合せず、したがってエンドソームリサイクルを受けず、リソソーム分解から逃れることができない（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ７：７１５－２５（２００７））。ＦｃＲｎ結合の欠如に加えて、未成熟Ｎ結合型グリカンはまた、それらを炭水化物特異的エンドサイトーシス受容体、例えばアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）（Ｂｏｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）及びＲｉｆａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１９１：２１７１－８２（２０００））並びにマンノース受容体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：１８９８－９０１（２００２）及びＨｅｙｓｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８：１０２－７（２００２））の感受性標的にすることによって、組換えＩｇＡのより短い血清半減期に寄与し得る。肝臓に高度に濃縮されているこれらのスカベンジング受容体は、不完全にシアリル化されたＮ結合型グリカンを有する糖タンパク質を認識し、それらを循環から除去する（Ｔｏｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ９４：７６２－７０（１９８８）及びＤａｎｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ９：２２９－３４（１９８９））。

したがって、当該技術分野では、より長い半減期を有するＩｇＡ抗体、並びに発現レベル及びポリマーＩｇＡ生成を改善するための産生方法が必要とされている。

本開示は、ＩｇＡ抗体及びそのような抗体を含む組成物、並びにそのような抗体及び組成物を作製及び使用する方法に関する。

ある特定の実施形態では、本開示は、単離されたＩｇＡ抗体に関する。例えば、限定するものではないが、本開示の単離されたＩｇＡ抗体又はその断片は、アミノ酸Ｖ４５８に置換を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｖ４５８は、イソロイシンで置換されている（すなわち、Ｖ４５８Ｉ）。ある特定の実施形態では、単離されたＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍｎ抗体、又はＩｇＡ２ｍ１抗体である。

ある特定の実施形態では、本開示の単離されたＩｇＡ抗体又はその断片は、アミノ酸Ｉ４５８に置換を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｉ４５８は、バリンで置換されている（すなわち、Ｉ４５８Ｖ）。ある特定の実施形態では、単離されたＩｇＡ抗体はＩｇＡ２ｍ２抗体である。

本開示は更に、アミノ酸Ｎ４５９及び／又はＳ４６１に置換を含む単離されたＩｇＡ抗体を提供する。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｎ４５９は、グルタミンで置換されている（すなわち、Ｎ４５９Ｑ）。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｓ４６１は、アラニンで置換されている（すなわち、Ｓ４６１Ａ）。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体である。

本開示は、Ｎ１６６、Ｔ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９、Ｓ４６１及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に１種以上の置換を含む単離されたＩｇＡ抗体を更に提供する。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体がアミノ酸Ｎ４５９に置換を有し、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１又はＩｇＡ２ｍ２抗体である。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体がアミノ酸Ｎ１６６に置換を有し、ＩｇＡ２ｍ１又はＩｇＡ２ｍ２抗体である。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体がアミノ酸Ｓ２１２に置換を有し、ＩｇＡ２ｍ２抗体である。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体がアミノ酸Ｎ２６３に置換を有し、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１又はＩｇＡ２ｍ２の抗体である。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体が、アミノ酸Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９に置換を有し、ＩｇＡ２ｍ１抗体又はＩｇＡ２ｍ２抗体である。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体は、アミノ酸Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９における置換、並びにＴ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ４５９、Ｓ４６１及びそれらの組合せにおける１種以上の置換を有する。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体はＩｇＡ２ｍ２抗体であり、アミノ酸Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９及びＮ４５９に置換を含む。例えば、限定するものではないが、アミノ酸Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９及びＮ４５９における置換は、Ｎ１６６Ａ、Ｓ２１２Ｐ、Ｎ２６３Ｑ、Ｎ３３７Ｔ、Ｉ３３８Ｌ、Ｔ３３９Ｓ及びＮ４５９Ｑであり得る。

本開示は、単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を更に提供する。ある特定の実施形態では、単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含むことができ、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＰ２２１又はＲ２２１を含む配列を含み、ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を更に含む。本発明の開示は、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含む単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子であって、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＣ２４２を含む配列を含む、単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を提供する。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体が、アミノ酸Ｋ４４７の欠失を含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体及びＩｇＧ４抗体からなる群より選択される。例えば、限定するものではないが、ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１抗体であり得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体及びＩｇＡ２ｍｎ抗体からなる群より選択される。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体はＩｇＡ２ｍ１抗体である。

本開示は更に、本明細書に開示されるＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子をコードする単離された核酸、及びそのような核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示は、ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子が産生されるように本明細書に開示される宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法を更に提供する。該方法は、宿主細胞からＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を回収することを更に含む。

本開示は、本明細書に開示されるＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、追加の治療剤を更に含み得る。

本開示は更に、疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の本明細書に開示されるＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を個体に投与する工程を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患は炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである。

本開示は、ＩｇＡ二量体の発現を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、該方法は、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）をコードするＤＮＡの量に対して、第１の細胞に導入される連結鎖（ＪＣ）をコードするＤＮＡの量を増加させることを含み、発現の増加は、等量のＪＣ、ＬＣ及びＨＣのＤＮＡが導入された第２の細胞で産生されるＩｇＡ二量体の量に対するものである。例えば、限定するものではないが、第１の細胞に導入される、ＨＣをコードするＤＮＡの量対ＬＣをコードするＤＮＡの量対ＪＣをコードするＤＮＡの量の比（ＨＣ：ＬＣ：ＪＣ）は約１：１：２～約１：１：５である。

ある特定の実施形態では、本開示は、ＩｇＡ二量体、三量体又は四量体の発現を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、該方法は、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）をコードするＤＮＡの量に対して、第１の細胞に導入される連結鎖（ＪＣ）をコードするＤＮＡの量を減少させることを含み、発現の増加は、ＪＣ ＤＮＡの量に対してより多くのＨＣ及びＬＣ ＤＮＡを導入した第２の細胞で産生されるＩｇＡの三量体又は四量体の量に対するものである。ある特定の実施形態では、第１の細胞に導入される、ＨＣをコードするＤＮＡの量対ＬＣをコードするＤＮＡの量対ＪＣをコードするＤＮＡの量の比（ＨＣ：ＬＣ：ＪＣ）は、約１：１：０．２５～約１：１：０．５である。

本開示は、ＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの産生を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、該方法は、第１の細胞において、アミノ酸Ｖ４５８に置換（例えば、Ｖ４５８Ｉ）を有するＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸Ｖ４５８に置換を有さないＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの量に対するものである。本開示は、アミノ酸Ｉ４５８に置換（例えば、Ｉ４５８Ｖ）を有するＩｇＡ２ｍ２抗体を第１の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸Ｉ４５８に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ２ｍ２二量体の量に対するものである、ＩｇＡ２ｍ２二量体の産生を増加させる方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの産生を増加させる方法は、アミノ酸Ｎ４５９及び／又はＳ４６１に置換（例えば、Ｎ４５９Ｑ及び／又はＳ４６１Ａ）を有するＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を第１の細胞において発現させることを含み、産生の増加は、アミノ酸Ｎ４５９又はＳ４６１に置換を有さないＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの量に対するものである。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ２ｍ２ポリマーの産生を減少させる方法は、第１の細胞において、アミノ酸Ｃ４７１に置換（例えば、Ｃ４７１Ｓ）を有するＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させることを含み、産生の減少は、アミノ酸Ｃ４７１に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ２ｍ２ポリマーの量に対するものである。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｃ４７１における置換（例えば、Ｃ４７１Ｓ）を含むＩｇＡ抗体は、Ｐ２２１における置換（例えば、Ｐ２２１Ｒ）を更に含むことができる。

本開示は、ＩｇＡ２ｍ２抗体の一過性発現を増加させる方法であって、第１の細胞において、Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を含むＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させることを含み、一過性発現の増加が、Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させる第２の細胞において産生される一過性発現の量に対するものである、方法を提供する。

本開示は更に、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含むＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を発現させることを含む、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体を発現させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＰ２２１又はＲ２２１を含む配列を含み、ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体、三量体、又は四量体を発現させる方法であって、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含むＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を発現させることを含み、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＣ２４２を含む配列を含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体が、アミノ酸Ｋ４４７の欠失を含む。

本開示は、本明細書に開示されるＩｇＡ及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を精製する方法、及び／又は本明細書に開示されるＩｇＡ及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の特定のオリゴマー状態、例えば二量体、三量体又は四量体を精製する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体と少なくとも１つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からＩｇＡ抗体を精製する方法は、プロテインＬを含むカラムに混合物を適用してＩｇＡ抗体を結合させること、ＰＢＳを含む洗浄緩衝液でプロテインＬカラムを洗浄すること、及びリン酸を含む溶出緩衝液によってプロテインＬカラムからＩｇＡ抗体を溶出すること、を含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子及び少なくとも１つの宿主細胞タンパク質を含む混合物からオリゴマー状態のＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を精製する方法は、プロテインＬ又はプロテインＡを含む親和性精製カラムに混合物を適用してＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を結合すること、洗浄緩衝液で親和性精製カラムを洗浄すること、溶出緩衝液によって親和性精製カラムからＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を溶出して第１の溶出液を形成すること、及び第１の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィカラムに適用して異なるＩｇＡオリゴマー状態を分離し、オリゴマー状態のＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を含むフロースルーを得ること、を含み得る。

図１Ａ～図１Ｄ。ヒトＩｇＡ重鎖定常ドメイン及びＪ鎖のタンパク質配列。（Ａ）ヒト重鎖定常ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、ヒンジ（Ｂｒｅｚｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ４０：６２－９（２０１６））、並びにＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１及びＩｇＡ２ｍ２のテールピース（Ｔｏｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．７５：９６６－９（１９７８））のタンパク質配列のアラインメント。ＩｇＡ１配列に対するミスマッチを灰色で強調し、Ｎ結合型グリコシル化モチーフを囲み、アスタリスクは、テールピースにおけるＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ１とのＩｇＡ２ｍ２におけるアミノ酸の相違を示す。（Ｂ）Ｎ結合型グリコシル化モチーフを枠で囲ったヒトＪ鎖のタンパク質配列。（Ｃ）ＩｇＡ２ｍｎのヒト重定常鎖ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、ヒンジ及びテールピースのタンパク質配列。Ｎ結合型グリコシル化部位は四角で囲まれている。（Ｄ）軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）を有するＩｇＡオリゴマー状態の概略図。ＩｇＡポリマーは、三量体種、四量体種及び五量体種を表す。 図２Ａ～図２Ｆ。組換え生成されたオリゴマー状態のＩｇＡは、トランスフェクションに使用されるＪ鎖ＤＮＡの量及び重鎖テールピース配列によって影響を受ける。（Ａ～Ｃ）以下のアイソタイプ／アロタイプについて軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）ＤＮＡの様々な比で実施された小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ＩｇＡの正規化分析サイズ排除クロマトグラムのオーバーレイ：（Ａ）ＩｇＡ１、（Ｂ）ＩｇＡ２ｍ１又は（Ｃ）ＩｇＡ２ｍ２。単量体（Ｍ）、二量体（Ｄ）及びポリマー（Ｐ）のピークが示されている。各クロマトグラムの最高シグナルに基づいて値を正規化した。（Ｄ～Ｆ）分析ＳＥＣによって定量化された、ＩｇＡ変異体について産生された単量体種、二量体種、及び三量体種／四量体種の相対量。（Ｄ）三量体／四量体形成に対する位置４５８及び４６７でのＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１及びＩｇＡ２ｍ２のＩｇＡテールピースにおける変異の効果。三量体／四量体形成に対する（Ｅ）ＩｇＡ１又は（Ｆ）ＩｇＡ２ｍ２のＮ結合型グリコシル化部位を除去する変異の効果。 図３Ａ～図３Ｄ。組換えＩｇＡオリゴマーの生物物理学的及び構造的特性評価。（Ａ）精製されたＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ１ Ｐ２２１Ｒ及びＩｇＡ２ｍ２単量体、二量体及び四量体の分析サイズ排除クロマトグラムのオーバーレイ。（Ｂ）非還元（ＤＴＴ）及び還元（＋ＤＴＴ）ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ１ Ｐ２２１Ｒ及びＩｇＡ２ｍ２単量体（Ｍ）、二量体（Ｄ）及び四量体（Ｔ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）及び連結鎖（＊）は還元された試料で示され、ＩｇＡ２ｍ１のＬＣ－ＬＣ二量体は矢印で示される。（Ｃ～Ｄ、上パネル）（Ｃ）ＩｇＡ２ｍ２二量体又は（Ｄ）ＩｇＡ２ｍ２四量体に対する陰性染色電子顕微鏡法による参照フリー２Ｄクラス。（Ｃ～Ｄ、下パネル）割り当てられた２Ｄクラスと比較した生画像粒子を、Ｆｃドメイン及びＦａｂ断片が強調された２Ｄクラスに重ね合わせたＩｇＡのモデルの隣に提示する。 図４Ａ～図４Ｂ。組換え生成されたＩｇＡオリゴマーは、インビトロで安定かつ機能的である。（Ａ）ヒトｐＩｇＲをトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞における抗ｍＩＬ－１３ ｈＩｇＡ単量体、二量体及び四量体のインビトロトランスサイトーシス。ＩｇＡポリマーはトランスサイトーシスするが、単量体はトランスサイトーシスしない。（Ｂ）抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１ Ｆａｂ断片の熱安定性を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって測定する。全ての試料について１つの融解転移のみが観察された。 図５Ａ～図５Ｃ。組換えＩｇＡオリゴマーは、インビボで迅速な血清クリアランスを示す。（Ａ）マウスにおけるＩｇＡ又はＩｇＧの血清時間濃度プロファイル。５ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）の単回用量の投薬から５分後、１５分後、３０分後、１時間後、１日後、３日後、７日後及び１４日後のＩｇＡ又はＩｇＧ分子を投与されたＢａｌｂ／ｃマウスの全血清曝露。全てのマウスをイソフルラン下で後眼窩採血して、血清濃度プロファイルを評価した。ヒト血清ＩｇＡ単量体を１０ｍｇ／ｋｇで投与し、破線で示す。（Ｂ～Ｃ）注射１時間後のマウスにおけるＩｇＡ又はＩｇＧの組織分布。全てのグラフは、ｎ＝４の各群の平均±ＳＥＭである。（Ｂ）インタクトな抗体の濃度は、^１２５Ｉ（％ＩＤ／ｇ組織）として血液を除いて、組織ごとに正常化された減算血液（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｂｌｏｏｄ）であった。（Ｃ）^１１１Ｉｎ（％ＩＤ／ｇ組織）から^１２５Ｉ（％ＩＤ／ｇ組織）を差し引くことによって、異化抗体値の濃度を決定した。 図６Ａ～図６Ｃ。組換えＩｇＡ分子の不完全なグリコシル化。（Ａ）Ｎ結合型グリカンプロセシングの概略図。（Ｂ）組換えＩｇＡ及びヒト血清から精製されたＩｇＡの全体的なＮ結合型グリカン分析。抗体脱グリコシル化及びその後のグリカン濃縮後の質量分析によって、グリカン分析を行った。ヒト血清ＩｇＡは９０％超のシアリル化を示すが、全ての組換え発現ＩｇＡ分子は６０％未満のシアリル化を有する。（Ｃ）ＩｇＡ２ｍ１二量体の部位特異的Ｎ結合型グリカン分析は、ＩｇＡ２ｍ１重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）上の異なるＮ結合型グリコシル化部位間の不均一なグリカン組成を明らかにする。 図７Ａ～図７Ｅ。ＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合物及びアグリコシル化ＩｇＡ２ｍ２は、インビボで野生型ＩｇＡと比較して増加した血清曝露を示し、インビトロでトランスシトースする能力を実証する。（Ａ）軽鎖（ＬＣ、黒色）、重鎖（ＨＣ、白色）及び４１個のＮ結合型グリコシル化部位（菱形）を有する連結鎖（左）又はアグリコシル化鎖（右）を有するＩｇＡ２ｍ２四量体の概略図。（Ｂ）ＬＣ（黒色）、ＩｇＧ１ ＨＣ（点線）、ＩｇＡ２ｍ１ ＨＣ（白色）、ＪＣ及びＮ結合型グリコシル化（菱形）を有するＩｇＧ１、ＩｇＡ２ｍ１二量体又はＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ二量体フォーマットの概略図。（Ｃ）マウス血漿中での０時間（黒）、２４時間（オレンジ）又は９６時間（青）のインキュベーション後のヨウ素化ＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ二量体又は四量体の分析ＳＥＣ。初期のＩｇＧ１－Ｌ－Ｐ２２１Ｒ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ四量体及び二量体は、抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ１（トラスツズマブ）対照のピークと同様の分解を示すが、再操作されたＩｇＧ１ΔＫ－Ｐ２２１ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ又はＩｇＧ１ΔＫ－Ｃ２４２ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃの二量体は安定している。（Ｄ）マウスにおけるＩｇＡ又はＩｇＧの血清時間濃度プロファイル。単回の３０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ用量のＩｇＡ分子を投与したＢａｌｂ／ｃマウスの全体的な血清曝露。３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内（ＩＶ）注射として以前に投薬された典型的なヒトＩｇＧ１（抗ｇＤ）の社内濃度データを破線として示す。血清濃度プロファイルを評価するために、全てのマウスからイソフルラン下で後眼窩又は心臓穿刺によって採血した。（Ｅ）ヒトｐＩｇＲでトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞におけるｈＩｇＡのインビトロトランスサイトーシス。 図８Ａ～図８Ｂ。ＩｇＡ２ｍ２二量体及び四量体精製の生陰性染色ＥＭ画像。（Ａ）精製されたＩｇＡ２ｍ２二量体の陰性染色電子顕微鏡（ＥＭ）による生画像は、良好な単分散粒子を示す。（Ｂ）精製されたＩｇＡ２ｍ２四量体の陰性染色ＥＭによる生画像は、良好な単分散放射状粒子を示す。 図９。血漿濃度に対して正規化されたインタクトな抗体分布。注射１時間後のマウスにおけるＩｇＡ又はＩｇＧの組織分布。全ての値は、血漿の％ＩＤ／ｍＬに対して正規化された、血液補正後の組織の％ＩＤ／ｇを表す。全てのグラフは、ｎ＝４の各群についての平均±ＳＤである。 図１０。１日後のインタクト抗体の組織分布。インタクト抗体の組織濃度は、^１２５Ｉ（％ＩＤ／ｇ組織）として表される組織ごとに正規化された減算血液であり、注射１日後に計算された。全てのグラフは、ｎ＝４の各群の平均±ＳＥＭである。 図１１。１日後の分解抗体の組織分布。^１１１Ｉｎ（％ＩＤ／ｇ組織）から^１２５Ｉ（％ＩＤ／ｇ組織）を差し引くことによって、異化抗体値を決定し、注射１日後に計算した。全てのグラフは、ｎ＝４の各群の平均±ＳＥＭである。 図１２。ＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合オリゴマーの模式図。ＩｇＧ１－Ｌ－Ｐ２２１Ｒ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合物（Ｂｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ７：７４３－５１（２０１５）を二量体及び四量体として作製したが、マウス血漿中での安定性が低いことが示された（図７Ｃ）。潜在的なフリン切断部位を排除するために、ＩｇＧ１由来のＣ末端リジン（Ｋ）及び介在ロイシン残基（Ｌ）を欠失させた。更に、位置２２１のプロリンでＩｇＡ２ｍ１野生型（ＷＴ）配列を回復させ、ＩｇＧ１ΔＫ－Ｐ２２１ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合物を作製した。ＩｇＧ１ΔＫ－Ｃ２４２ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合物の設計は類似しているが、ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃは残基Ｃ２４２で開始し、それによってＩｇＡ２ｍ１ヒンジ（Δヒンジ）を欠失させる。 図１３。操作されたＩｇＡオリゴマーの全体的なグリカン分析。Ｐ２２１又はＣ２４２ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ及びアグリコシル化抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ２ｍ２四量体に融合した抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＧ１ΔＫのＣＨＯの組換え生成された二量体の全体的なＮ結合型グリカンの分析。Ｐ２２１又はＣ２４２ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃに融合した抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＧ１ΔＫの二量体は両方とも約２０％のシアリル化を有し、予想されるように、アグリコシル化抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ２ｍ２四量体についてグリコシル化は検出されない。 図１４。ヒト及び他の種由来のＩｇＡ重鎖定常ドメインのタンパク質配列。ヒト重鎖定常ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、ヒンジ（Ｂｒｅｚｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６））及びテールピース（Ｔｏｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９７８））のタンパク質配列のアラインメント。種間のタンパク質配列の保存は灰色で強調されているが、Ｎ結合型グリコシル化モチーフは四角で囲まれている。 図１５Ａ～図１５Ｃ。（Ａ）１：１：０．２５～１：１：２の間の様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＩＬ１３．ｈｕＩｇＡ１の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｂ）１：１：１～１：１：５の間の様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＩＬ１３．ｈｕＩｇＡ１の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｃ）ＩｇＡ抗体について産生された二量体及び四量体種の量。 図１６Ａ～図１６Ｂ。（Ａ）様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＩＬ１３．ＩｇＡ２ｍ１の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｂ）ＩｇＡ抗体について産生された二量体及び四量体種の量。 図１７Ａ～図１７Ｂ。（Ａ）様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＩＬ１３．ＩｇＡ２ｍ１．Ｐ２２１Ｒの分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｂ）ＩｇＡ抗体について産生された二量体及び四量体種の量。 図１８Ａ～図１８Ｅ。（Ａ）様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＩＬ１３．ｈｕＩｇＡ２ｍ２の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｂ）１：１：１～１：１：５の間の様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＩＬ１３．ｈｕＩｇＡ２ｍ２の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｃ）ＩｇＡ抗体について産生された二量体及び四量体種の量。（Ｂ）様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）、連結鎖（ＪＣ）、及び分泌成分（ＳＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＩＬ１３．ｈｕＩｇＡ２ｍ２の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｅ）質量分析によるｘｍｕＩＬ１３．ｈｕＩｇＡ２ｍ２の重鎖、軽鎖及びＪ鎖の確認。 図１９は、以下のアイソタイプ／アロタイプの以下の抗ＩＬ－１３抗体のＢｉａｃｏｒｅ分析を示す：ＩｇＡ１二量体、ＩｇＡ２ｍ１二量体、ＩｇＡ２ｍ２二量体及びＩｇＡ２ｍ２四量体。 図２０Ａ～図２０Ｂ。（Ａ）様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＧＰ１２０．３Ｅ５．ｈｕＩｇＡ１の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｂ）様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＧＰ１２０．３Ｅ５．ＩｇＡ２ｍ１．Ｐ２２１Ｒの分析サイズ排除クロマトグラム。 図２１は、様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＧＰ１２０．３Ｅ５．ｈｕＩｇＡ２ｍ２の分析サイズ排除クロマトグラムを示す。 図２２は、様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製ｘｍｕＧＰ１２０．３Ｅ５．ｈｕＩｇＡ２ｍ２の分析サイズ排除クロマトグラムを示す。 図２３は、様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）のＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製マウスｘｇＤ．５Ｂ６．ｈＩｇＡ２ｍ２の分析サイズ排除クロマトグラム。 図２４Ａ～図２４Ｃは、ＩｇＡ２ｍ２及びＪ鎖のグリコシル化部位の改変を示す。（Ａ）ＩｇＡ２ｍ２の重鎖及びＪ鎖に行われた改変並びに野生型と比較したインビトロでのそれらの発現の概要。（Ｂ）ＩｇＡ２ｍ２単一グリコシル化変異体の一過性発現の概要。（Ｃ）複数の変異を有するＩｇＡ２ｍ２グリコシル化変異体の一過性発現の概要。 図２５は、ヒト血清、野生型ＩｇＡ２ｍ２四量体及びＩｇＡ２ｍ２四量体（アグリコシル化）及びＪ鎖（グリコシル化）由来のＩｇＡ単量体の受容体結合特性の分析を示す図である。 図２６は、各ＩｇＡ分子のグリカン特性の分析を示す。 図２７。雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける単回１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ注射後のＩｇＡ分子の濃度時間プロファイル。 図２８Ａ～図２８Ｂ。（Ａ）分泌成分又はＪ鎖とのジスルフィド結合を防ぐためのシステイン変異の分析。（Ｂ）Ｃ３１１ではなくＣ４７１は、連結鎖を軽鎖及び重鎖に付加する場合、ＩｇＡ２ｍ２二量体及びより高次のオリゴマー形成に必要である。 図２９は、分泌成分、連結鎖、軽鎖及び重鎖の同時トランスフェクションの分析を示す。 図３０Ａ～図３０Ｅ。（Ａ）ｐＩｇＲ結合を無効にするために生成されたｘｍｕＩＬ１３．ＩｇＡ２ｍ２変異体の発現レベル。（Ｂ）Ｅｘｐｉ２９３細胞で行われた小規模一過性トランスフェクションからのｘｍｕＩＬ１３．ＩｇＡ２ｍ２変異体の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｃ）マウスｐＩｇＲに結合するｘｍｕＩＬ１３．ＩｇＡ２ｍ２変異体のＢｉａｃｏｒｅ分析。（Ｄ）ヒトｐＩｇＲに結合するｘｍｕＩＬ１３．ＩｇＡ２ｍ２変異体のＢｉａｃｏｒｅ分析。（Ｅ）ヒトＦｃαＲＩに結合するｘｍｕＩＬ１３．ＩｇＡ２ｍ２変異体のＢｉａｃｏｒｅ分析。 図３１Ａ～図３１Ｂは、抗Ｊａｇ１ ＩｇＡ２ｍ２のシアリル化を増加させるための細胞培養条件の分析を示す。（Ａ）ｘＪＡＧ１．２Ｂ３．ｈＩｇＡ２ｍ２安定細胞株の細胞培養条件のマトリクス。（Ｂ）細胞培養条件がｘＪＡＧ１．２Ｂ３．ｈＩｇＡ２ｍ２のグリコシル化に及ぼす効果の分析。 図３２は、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によるＩｇＡ変異体の安定性を示す図である。 図３３Ａ～図３３Ｄは、オリゴマー安定性を増加させるための完全長抗マウスＩＬ－１３ ＩｇＧ１．Ｌｅｕ－Ｐ２２１Ｒ．ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合分子の特性評価及び操作を示す。（Ａ）様々な比率の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）及び連結鎖（ＪＣ）ＤＮＡを有するＥｘｐｉ２９３細胞において行われた小規模一過性トランスフェクションからの親和性精製されたグリコシル化完全長抗マウスＩＬ－１３ ＩｇＧ１．Ｌｅｕ－Ｐ２２１Ｒ．ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合分子の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｂ）マウスｐＩｇＲに結合するＩｇＡオリゴマーのＢｉａｃｏｒｅ分析。（Ｃ）マウスｐＩｇＲ及びヒトｐＩｇＲへのＩｇＡオリゴマーの結合の概要。（Ｄ）ＤＳＦによるＩｇＡオリゴマーの安定性。 図３４Ａ～図３４Ｃ。（Ａ）フリン部位及び不安定性を排除するためのＩｇＧ１全長－ＩｇＡ Ｆｃコンストラクトの設計。（Ｂ）操作されたコンストラクトの完全長抗マウスＩＬ－１３ ＩｇＧ１－ＩｇＡ Ｆｃ一過性発現データ。（Ｃ）操作された抗マウスＩＬ－１３ ＩｇＡ分子のマウス血漿安定性データ。 図３５Ａ～図３５Ｂ。（Ａ）ヒトＦｃαＲＩに結合するＩｇＡオリゴマーのＷａｓａｔｃｈ分析。（Ｂ）Ｗａｓａｔｃｈ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定したＦｃαＲＩへのＩｇＡオリゴマーの結合の概要。 図３６Ａ～図３６Ｄ。（Ａ）ＣＨＯ細胞及びＥｘｐｉ２９３細胞における一過性発現によって産生されるＩｇＡ２ｍ２の二量体及び四量体のマウス及びヒトのｐＩｇＲへの結合のＷａｓａｔｃｈ分析。（Ｂ）マウスｐＩｇＲへのＩｇＡ２ｍ２グリコシル化変異体の結合のＷａｓａｔｃｈ分析。（Ｃ）ヒトｐＩｇＲへのＩｇＡ２ｍ２グリコシル化変異体の結合のＷａｓａｔｃｈ分析。（Ｄ）Ｗａｓａｔｃｈ ＳＰＲによって測定したマウス及びヒトのｐＩｇＲへのＩｇＡオリゴマーの結合の概要。 図３７Ａ～図３７Ｃ。（Ａ）ｈＩｇＧ１－ｈＩｇＡ１融合分子の発現プロファイル。（Ｂ）ｈＩｇＧ１－ｈＩｇＡ１融合分子の分析サイズ排除クロマトグラム。（Ｃ）マウス及びヒトのｐＩｇＲ並びにヒトＦｃαＲＩへのｈＩｇＧ１－ｈＩｇＡ１融合分子の結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。 図３８は、様々なＩｇＡ１抗体のＮ結合型グリコシル化の除去の分析を示す。 図３９。組換え発現ヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２をＣａｐｔｏ Ｌカラムで親和性精製した。次いで、Ｃａｐｔｏ Ｌ溶出液を、ＨＰＬＣで３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって分析した。多角度光散乱（ＭＡＬＳ）及び陰性染色電子顕微鏡によって決定されるように、高次ポリマー（ピーク１（三量体、四量体、五量体を含む））、二量体（ピーク２）、及び単量体（ピーク３）に対応する３つの主なピークが分析ＳＥＣ溶出プロファイルで観察された。 図４０。Ｃａｐｔｏ Ｌ親和性カラム溶出液に見られる組換えヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２オリゴマー種の混合物の分離を、ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ｐｇ）カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって試みた。分析ＳＥＣ及び陰性染色電子顕微鏡と組合せた多角度光散乱（ＭＡＬＳ）によって測定したところ、高分子量凝集体（ピーク１、カラムの空隙体積中で溶出）、高次ポリマー（ピーク２、おそらく三量体、四量体及び五量体を含む）、二量体（ピーク３）及び単量体（ピーク４）に対応するＳｕｐｅｒｏｓｅ ６溶出プロファイルに４つの主なピークが観察された。ピーク２及びピーク３から得られた画分から測定されたタンパク質のモル質量（ＭＷ）及び多分散指数（ＰＤＩ）を示す。 図４１。組換えヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２二量体の高次ポリマーからの分離は、ＨＰＬＣで３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍ水のＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ４５０ Åカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって達成された。分析ＳＥＣ及び陰性染色電子顕微鏡と組合せた多角度光散乱（ＭＡＬＳ）によって決定されるように、高次ポリマー（ピーク１（三量体、四量体、五量体を含む））、二量体（ピーク２）、及び単量体（ピーク３）に対応する３つの主なピークが分析ＳＥＣ溶出プロファイルで観察された。 図４２Ａ～図４２Ｄ。（Ａ）ヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２のＣａｐｔｏ Ｌ親和性カラム溶出を、ＨＰＬＣで３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって分析した。分析ＳＥＣ及び陰性染色電子顕微鏡と組合せた多角度光散乱（ＭＡＬＳ）によって決定されるように、高次ポリマー（ピーク１（三量体、四量体、五量体を含む））、二量体（ピーク２）、及び単量体（ピーク３）に対応する３つの主なピークが観察された。（Ｂ）パネル（Ａ）からのピーク１を、図４１のように３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ４５０ Åカラムでの精製によって単離した。ＭＡＬＳ検出器に連結された３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムでの精製後のピーク１の分析をここに示す。ＭＡＬＳによって決定されるモル質量（ＭＷ）及び多分散指数（ＰＤＩ）は、主に四量体ＩｇＡ２ｍ２の予想質量と一致する。（Ｃ）パネル（Ａ）からのピーク２を、図４１のように３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ４５０ Åカラムでの精製によって単離した。ＭＡＬＳ検出器に連結された３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムでの精製後のピーク２の分析をここに示す。ＭＡＬＳによって決定されたＭＷ及びＰＤＩは、主に二量体のＩｇＡ２ｍ２の予想質量と一致する。（Ｄ）パネル（Ｂ）及びパネル（Ｃ）によるピーク１及びピーク２からの精製タンパク質を、非還元（－ＤＴＴ）又は還元（＋ＤＴＴ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。還元された試料では、重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）及びＪ鎖（ＪＣ）について予想される質量で移動するバンドが観察される。 図４３Ａ～図４３Ｂ。（Ａ）図４２Ｂにおけるピーク１からのヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２粒子の陰性染色電子顕微鏡（ＥＭ）による代表的な生画像。（Ｂ）図４２Ｂのピーク１からの粒子の陰性染色ＥＭによる参照フリー２Ｄクラスであり、試料が主に四量体であることを示す。 図４４Ａ～図４４Ｂ。（Ａ）図４２Ｃにおけるピーク２からのヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２粒子の陰性染色電子顕微鏡（ＥＭ）による代表的な生画像。（Ｂ）図４２Ｃのピーク２からの粒子の陰性染色ＥＭによる参照フリー２Ｄクラスであり、試料が主に二量体であることを示す。 図４５。図４２Ｃのピーク２から精製したヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２二量体の質量分析。熱変性、ジチオスレイトールによる還元、及びＰＮＧａｓｅＦによる脱グリコシル化の後に行われた質量分析により、正しい連結鎖（ＪＣ）、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）の存在を認める。 図４６Ａ～図４６Ｃ。（Ａ）ヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ１のＣａｐｔｏ Ｌ親和性カラム溶出を、ＨＰＬＣで３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって分析した。オリゴマーの分離の前に、高次ポリマー（ピーク１（三量体、四量体、五量体を含む））、二量体（ピーク２）、及び単量体（ピーク３）に対応する３つの主なピークが観察された。（Ｂ）パネル（Ａ）からのピーク２を、図４１のように、ＨＰＬＣの３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ４５０ Åカラムでの精製によって単離した。多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器に連結された３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムでの精製後のピーク２の分析をここに示す。ＭＡＬＳによって決定されるモル質量（ＭＷ）及び多分散指数（ＰＤＩ）は、主に二量体ＩｇＡ１の予想質量と一致する。（Ｃ）パネル（Ｂ）によるピーク２からの精製タンパク質を、非還元（－ＤＴＴ）又は還元（＋ＤＴＴ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。還元された試料では、重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）及びＪ鎖（ＪＣ）について予想される質量で移動するバンドが観察される。 図４７Ａ～図４７Ｃ。（Ａ）ヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ１のＣａｐｔｏ Ｌ親和性カラム溶出を、ＨＰＬＣで３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって分析した。オリゴマーの分離の前に、高次ポリマー（ピーク１（三量体、四量体、五量体を含む））、二量体（ピーク２）、及び単量体（ピーク３）に対応する３つの主なピークが観察された。（Ｂ）パネル（Ａ）からのピーク２を、図４１のように、ＨＰＬＣの３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ４５０ Åカラムでの精製によって単離した。多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器に連結された３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムでの精製後のピーク２の分析をここに示す。ＭＡＬＳによって決定されるモル質量（ＭＷ）及び多分散指数（ＰＤＩ）は、主に二量体ＩｇＡ２ｍ１の予想質量と一致する。（Ｃ）パネル（Ｂ）によるピーク２からの精製タンパク質を、非還元（－ＤＴＴ）又は還元（＋ＤＴＴ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。還元された試料では、重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）及びＪ鎖（ＪＣ）について予想される質量で移動するバンドが観察される。 図４８Ａ～図４８Ｃ。（Ａ）重鎖にＰ２２１Ｒ変異を含むヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ１のＣａｐｔｏ Ｌ親和性カラム溶出を、ＨＰＬＣで３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって分析した。オリゴマーの分離の前に、高次ポリマー（ピーク１（三量体、四量体、五量体を含む））、二量体（ピーク２）、及び単量体（ピーク３）に対応する３つの主なピークが観察された。（Ｂ）パネル（Ａ）からのピーク２を、図４１のように、ＨＰＬＣの３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ４５０ Åカラムでの精製によって単離した。３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒ’ｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ Åカラムでの精製後のピーク２の分析を示す。（Ｃ）パネル（Ｂ）によるピーク２からの精製タンパク質を、非還元（－ＤＴＴ）又は還元（＋ＤＴＴ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。還元された試料では、重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）及びＪ鎖（ＪＣ）について予想される質量で移動するバンドが観察される。 図４９は、ＨＥＲ２＋乳がん細胞株ＫＰＬ－４、ＢＴ４７４－ｍ１及びＳＫＢＲ３の死をもたらす単量体及びポリマーの抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ抗体の能力を示す。 図５０は、単量体及びポリマーの抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ抗体が、異なるドナー由来の好中球の存在下でＳＫＢＲ３乳がん細胞の死をもたらす能力を示す。 図５１は、ＳＫＢＲ３乳がん細胞の死をもたらす、グリコシル化及びアグリコシル化されたＩｇＡのポリマー及び単量体の能力を示す図である。 図５２Ａ～図５２Ｂ。（Ａ）ヒトＦｃαＲＩに結合するＩｇＡオリゴマー及び四量体のＢｉａｃｏｒｅ分析。（Ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲによって測定したＦｃαＲＩへのＩｇＡオリゴマー及び四量体の結合の概要。

限定を行うものではなく、明確化のために、本明細書にて開示する主題の詳細の説明を、以下の小節に分ける：
Ｉ．定義；
ＩＩ．抗体：
ＩＩＩ．抗体の産生方法及び精製方法；
ＩＶ．処置方法；
Ｖ．医薬組成物；
ＶＩ．製造品；及び
ＶＩＩ．例示的な実施形態。

Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容できる誤差範囲を意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での１実施当たり３つ又は３つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、更により好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。

「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。「１つ（ａ）」（又は「ａｎ」）と並んで、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。更に、本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、他のものの有無にかかわらず、２つの指定された特徴又は構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／又はＢ」等の句で使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」等の語句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することが意図されている：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。

「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、抗体断片、及び抗体融合分子が挙げられるが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（ｅ．ｇ、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる源又は種に由来する抗体を指す。

抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５種類の主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。

「ＩｇＡ抗体」という用語は、抗体のＩｇＡクラスの抗体を指し、ＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２、並びにＩｇＡ２、ｍ１、ｍ２及びｍｎの３つのアロタイプを含む。

本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞機能を阻害若しくは防止し、及び／又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性薬としては、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、若しくは他の挿入剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素等の酵素及びそれらの断片；抗生物質；細菌、真菌、植物、又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素（それらの断片及び／若しくは変異体を含む）等の毒素；及びに下に記載される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤が挙げられるが、これらに限定されない。

「エフェクタ機能」は、抗体のアイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクタ機能の例としては、以下のものが挙げられる。Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；並びにＢ細胞活性化が挙げられる。

薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。例えであって、限定するものではなく、「有効量」とは、疾患及び／又は障害の症状を軽減し、最小限に抑え、かつ／又は予防し、生存を長引かせ、かつ／又は疾患及び／又は障害が再発するまでの期間を長引かせることができる本明細書に開示される抗体の量を指し得る。

「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書では定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）は存在してもよく、又は存在していなくてもよい。特定の実施形態では、ヒトＩｇＡ重鎖Ｆｃ領域は、Ｐｒｏ２２１（Ｐ２２１）、Ａｒｇ２２１（Ｒ２２１）、Ｖａｌ２２２（Ｖ２２２）、Ｐｒｏ２２３（Ｐ２２３）又はＣｙｓ２４２（Ｃ２４２）から重鎖のカルボキシル末端まで延在する（図１Ａ及び図１Ｃを参照）。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。Ｆｃ受容体には、ＦｃαＲＩ（ＩｇＡ抗体のＦｃ領域を認識する）及びＦｃγＲＩＩ（ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を認識する）が含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が挙げられ、これらは、主にそれらの細胞質ドメインの点で異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質側ドメイン内に免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（例えば、Ｄａｅｏｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）を参照）ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）に総説がある。今後特定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書において「ＦｃＲ」という用語により包含されている。

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語はまた、胎児（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））への母体ＩｇＧ抗体の移入及び免疫グロブリンの恒常性の調節を担う新生児受容体ＦｃＲｎを含む。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８（１２）：５９２－５９８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（７）：６３７－６４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６２１６（２００４）；国際公開第２００４／９２２１９号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）を参照）。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトヒト細胞株で、又は変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類でアッセイされ得る。国際公開第２０００／０４２０７２糖（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合が改善又は低減された抗体変異体について記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）も参照されたい。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）において次の配列で現れる：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（ＣＤＲ－Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（ＣＤＲ－Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（ＣＤＲ－Ｌ３）－ＦＲ４

「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では相互に交換可能に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は、本明細書で同義に使用され、かかる細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞には、初代形質転換細胞、及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する変異体の子孫は、本発明に含まれる。

「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生された抗体、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），Ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。ある特定の実施形態では、ＶＬの場合、サブグループは、Ｋａｂａｔら（上記参照）に見られるようなサブグループカッパＩである。ある特定の実施形態では、ＶＨの場合、サブグループは、Ｋａｂａｔら（上記参照）に見られるようなサブグループＩＩＩである。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様において、ヒト化抗体は、非ヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＣＤＲ、及びヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＦＲにおける、ほぼ全ての少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列が超可変であり（「相補性決定領域」又は「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ」）、かつ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／又は抗原接触残基（「抗原接触体」）を含有する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。別途示されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔら（上記参照）に従って本明細書ではナンバリングされる。一般的に、抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨに３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。

「免疫複合体」とは、細胞毒性薬を含むが、これに限定されない１つ以上の異種分子（複数可）にコンジュゲートされる抗体を指す。

本明細書で同義に使用される「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。

「単離」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリ電気泳動）、又はクロマトグラフ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超又は９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。

「単離された」核酸とは、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。

「抗体をコードする単離核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内の核酸分子（複数可）を含み、そのような核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ又は複数の場所に存在する。

「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。それぞれのヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。更に、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学改変された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例としては、改変されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子はまた、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び／又はインビボで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして好適なＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。このようなＤＮＡベクター（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡベクター（例えば、ｍＲＮＡ）は、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、インビボで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学改変されてもよい（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １２ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又は欧州特許第２１０１８２３号公報Ｂ１を参照）。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能な変異体抗体は除く。このような変異体は、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、改変詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本願で開示された主題に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができ、かかる方法及び他の例示のモノクローナル抗体の作製方法は、本明細書に記載されている。

「ネイキッド抗体」とは、異種性部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、医薬組成物中に存在していてもよい。

「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、これに定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに分けられてもよい。

本明細書で使用される「添付文書」という用語は、かかる治療剤製品の使用に関する指示、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、及び／又は警告についての情報を含む、治療剤製品の商用包装に通例含まれている取扱説明書を指す。

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性率（％）」は、アラインメントの目的で、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントさせるのに適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性率の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、かつ、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。

しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性パーセントの値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用するか、又はその後にＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），’’Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ’’，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）’’Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ’’ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６にって認定され、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ ｏｒ ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公的に利用可能である。これに代えて、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用いて、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバを使用して配列を比較し、ローカルではなくグローバルなアライメントを確実に実行することができる。アミノ酸同一性率は、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。

「医薬組成物」との用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、組成物が投与される被験体に対して受け入れられないほど毒性である追加の構成要素を含まないような形態での製剤を指す。

本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」とは、活性成分以外の対象に無毒である医薬組成物中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「処置」（及びその文法的な変形語、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体の本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体を使用して、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を減速させることができる。

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照。）抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインで十分な場合がある。更に、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と呼ばれる。

ＩＩ．抗体
ある特定の実施形態では、本開示は、改善された血清保持を示し、ポリマー抗体産生を増加させるために、抗体、例えばＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を操作する方法に部分的に基づく。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＦｃＲｎに対する結合を示す。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、増大したＩｇＲ媒介性トランスサイトーシスを示す。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＦｃαＲＩに対する結合が低下している、及び／又は、ＦｃαＲＩに対する結合を何ら示さない。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、投与後の炎症誘発性応答を最小限に抑えることによって、治療状況において優れた安全性を提供することができる。

ある特定の実施形態では、本開示は、改善された血清保持を示す抗体、例えばＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体、例えばＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合分子は、約１日まで、約２日まで、約３日まで、約４日まで又は約５日まで血漿中で安定である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体、例えばＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、血漿中で最大約４日間安定である。

ある特定の実施形態では、本開示は、グリコシル化が減少しているか又はグリコシル化がない抗体、例えばＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、未改変ＩｇＡ又は未改変ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子と比較して、グリコシル化の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％の減少を示す。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約５％未満グリコシル化、約１０％未満グリコシル化、約２０％未満のグリコシル化、約３０％未満グリコシル化又は約４０％未満グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、０％グリコシル化を有する、すなわち、アグリコシル化されている。

Ａ．例示的な抗体
１．ＩｇＡ抗体変異体
本開示は、抗体がグリコシル化される程度を減少させるように改変されたＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体及びＩｇＡ２ｍｎ抗体を提供する。抗体のグリコシル化部位の欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が除去されるように抗体のアミノ酸配列を変更することによって達成することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は６つ以上のグリコシル化部位、例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位及び／又はＯ結合型グリコシル化部位を除去するように改変され得る。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体を、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の１つ以上のＮ結合型グリコシル化モチーフを除去するように改変することができる。特定の実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化部位の除去は、グリコシル化部位のモチーフに存在する１つ以上のアミノ酸の改変、例えば変異を含み得る。例えば、限定するものではないが、Ｎ、Ｘ及び／又はＳ／Ｔアミノ酸は、グリコシル化部位のモチーフにおいて改変、例えば変異され得る。ある特定の実施形態では、モチーフの３つ全てのアミノ酸を変異させることができる。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体を、重鎖定常ドメインから１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上又は５つ以上のグリコシル化部位を除去するように改変することができる。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、重鎖定常ドメインのアミノ酸１６６、２１１、２６３及び／又は３３７における１つ以上、２つ以上、３つ以上又は４つ全てのＮ結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、重鎖のテールピースにおける１つ以上のグリコシル化部位を除去するように改変され得る（図１Ａを参照）。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、重鎖のテールピースのアミノ酸４５９のＮ結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ１抗体を、アミノ酸２６３及び／又は４４９の１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ２ｍ１抗体を、アミノ酸１６６、２６３、３３７及び／又は４４９の１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体を、アミノ酸１６６、２１１、２６３、３３７及び／又は４４９の１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常ドメイン及びテールピースを含む抗体の重鎖から全てのＮ結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体はアグリコシル化され得る。例えば、限定するものではないが、本開示のアグリコシル化抗体は、重鎖定常領域及びテールピースを含む抗体の重鎖にグリコシル化を有さない抗体である。ある特定の実施形態では、本開示のアグリコシル化抗体は、重鎖定常領域及びテールピースを含む重鎖上にグリコシル化を有さず、Ｊ鎖上にグリコシル化を有さない抗体である。

ある特定の実施形態では、本開示は、ＩｇＡ抗体のグリコシル化を減少させるためのアミノ酸１６６、１６８、２１１、２１２、２１３、２６３、２６５、３３７、３３８、３３９、４５９及び／又は４６１における１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、１１つ以上又は１２個の改変、例えば置換を有するＩｇＡ抗体を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示は、ＩｇＡ抗体のグリコシル化を減少させるためのアミノ酸Ｎ１６６、Ｔ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及び／又はＳ４６１における１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、１１つ以上又は１２個の改変、例えば置換を有するＩｇＡ抗体を提供する。

特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ１抗体は、アミノ酸２６３、２６５、４５９及び／又は４６１、例えばアミノ酸Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ４５９及び／又はＳ４６１に１つ以上、２つ以上、３つ以上又は４つの改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ２ｍ１抗体は、アミノ酸１６６、１６８、２６３、２６５、３３７、３３８、３３９、４５９及び／又は４６１において、例えば、アミノ酸Ｎ１６６、Ｔ１６８、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及び／又はＳ４６１において、１つ以上の改変、２つ以上の改変、３つ以上の改変、４つ以上の改変、５つ以上の改変、６つ以上の改変、７つ以上の改変又は８つの改変を有する。ある特定の実施形態において、本開示のＩｇＡ２ｍ２又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸１６６、１６８、２１１、２１２、２１３、２６３、２６５、３３７、３３８、３３９、４５９及び／又は４６１において、例えば、アミノ酸Ｎ１６６、Ｔ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及び／又はＳ４６１において、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上又は１２個の改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、３つ全てのアミノ酸３３７、３３８及び３３９において、例えば、アミノ酸Ｎ３３７、Ｉ３３８及びＴ３３９において改変される。

ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸Ｎ１６６に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸Ｎ１６８に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸Ｓ２１１に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸Ｓ２１２に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸Ｓ２１３に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸Ｎ２６３に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸Ｎ２６５に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、３つのアミノ酸Ｎ３３７、Ｉ３３８及びＴ３３９に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸Ｎ４５９に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、アミノ酸Ｓ４６１に改変を有する。

ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｎを、Ａ、Ｇ又はＱアミノ酸に変異させることができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸ＳをＡアミノ酸に変異させることができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸ＴをＡアミノ酸に変異させることができる。特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えば本開示のＩｇＡ２ｍ２又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、以下の変異Ｎ１６６Ａ、Ｓ２１２Ｐ、Ｎ２６３Ｑ、Ｎ３３７Ｔ、Ｉ３３８Ｌ、Ｔ３３９Ｓ及びＮ４５９Ｑのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上又は７つ全てを含むように改変することができる。例えば、限定するものではないが、本開示のＩｇＡ１抗体は、以下の変異Ｎ２６３Ｑ及びＮ４５９Ｑの１つ以上又は２つ全てを含むように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ２ｍ１抗体は、以下の変異、Ｎ１６６Ａ、Ｎ２６３Ｑ、Ｎ３３７Ｔ、Ｉ３３８Ｌ、Ｔ３３９Ｓ及びＮ４５９Ｑのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上又は６つ全てを含むように改変することができる。特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ２ｍ２又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、以下の変異Ｎ１６６Ａ、Ｓ２１２Ｐ、Ｎ２６３Ｑ、Ｎ３３７Ｔ、Ｉ３３８Ｌ、Ｔ３３９Ｓ及びＮ４５９Ｑのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上又は７つ全てを含むように改変することができる。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体のＪ鎖は、１つ以上のグリコシル化部位を除去するように改変され得る。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、例えば、アミノ酸４９、５０及び５１を包含するグリコシル化部位モチーフの１つ以上のアミノ酸を改変することによって、Ｊ鎖のアミノ酸４９におけるＮ結合型グリコシル化部位を除去するように改変され得る。例えば、限定するものではないが、Ｊ鎖のアミノ酸Ｎ４９及び／又はアミノ酸Ｓ５１を改変することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸ＮをＡ、Ｇ又はＱアミノ酸に変異させることができ、及び／又はアミノ酸ＳをＡアミノ酸に変異させることができる。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体のＪ鎖は、Ｎ４９Ａ／Ｇ／Ｑ変異及び／又はＳ５１Ａ変異を含み得る。ある特定の実施形態では、本開示の抗体のＪ鎖は、Ｎ４９Ｑ変異を含み得る。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体を、重鎖から１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上又は５つ以上のグリコシル化部位を除去するように改変し、Ｊ鎖から１つのグリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、重鎖のアミノ酸Ｎ１６６、Ｔ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及び／又はＳ４６１における１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上又は１２個の改変、例えば、置換、並びにＪ鎖のアミノ酸Ｎ４９及び／又はＳ５１における１つ又は２つの改変、例えば、置換を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、重鎖のアミノ酸Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９及び／又はＮ４５９における１つ以上の改変、２つ以上の改変、３つ以上の改変、４つ以上の改変、５つ以上の改変、６つ以上の改変又は７つ全ての改変、例えば置換、並びにＪ鎖のアミノ酸Ｎ４９及び／又はＳ５１における１つ又は２つの改変、例えば置換を有する。

ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体は、ＩｇＡ抗体のグリコシル化を減少させるためにアミノ酸Ｎ４５９又はＳ４６１に１つ以上の改変を有することができる。特定の実施形態では、アミノ酸Ｎ４５９及び／又はＳ４６１の改変は、ポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び五量体を生成する能力が増加した抗体をもたらす。

特定の実施形態では、本開示の抗体、例えばＩｇＡ抗体は、アミノ酸４５８に改変、例えば置換を有することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、アミノ酸Ｖ４５８に置換を有するＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、及びＩｇＡ２ｍｎ抗体を提供する。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｖ４５８をイソロイシン（すなわち、Ｖ４５８Ｉ）に変異させることができる。ある特定の実施形態では、本開示は、アミノ酸Ｉ４５８に置換を有するＩｇＡ２ｍ２抗体を提供する。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｉ４５８をバリン（すなわち、Ｉ４５８Ｖ）に変異させることができる。ある特定の実施形態では、１つ以上のこれらの改変は、本明細書中に記載されるように、グリコシル化が低減された又はグリコシル化されていない抗体中に存在し得る。

特定の実施形態では、本開示の抗体、例えばＩｇＡ抗体は、アミノ酸Ｃ４７１及び／又はＣ３１１に改変、例えば置換を有することができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体は、アミノ酸Ｃ４７１、例えばＣ４７１Ｓに変異を有し得る。特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体は、アミノ酸Ｃ３１１、例えばＣ３１１Ｓに変異を有することができる。

ある特定の実施形態では、ある特定の特性が改善された抗体変異体を作製するために、本開示の抗体の改変が行われ得る。例えば、限定するものではないが、グリコシル化が低下した本開示の抗体は、改善された血清保持を示すことができる。ある特定の実施形態では、グリコシル化が減少した本開示の抗体は、ポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び五量体を生成する能力が増加し得る。ある特定の実施形態では、グリコシル化が減少した本開示の抗体は、ＩｇＡ特異的ｈＦｃ受容体ＦｃαＲＩへの結合の減少、例えばＦｃαＲＩへの結合を示さないことができる。特定の実施形態では、アミノ酸４５８、４５９及び／又はＳ４６１に改変を有する本開示の抗体は、改変の一方を有さない抗体と比較して、ポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び五量体を生成する能力が増加している。特定の実施形態では、アミノ酸Ｃ４７１での改変を有する本明細書に開示される抗体は、ポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び五量体を生成する能力が低下している。

２．ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子
本開示は更に、本明細書においてＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子と呼ばれる、ＩｇＧ抗体の少なくとも一部及びＩｇＡ抗体の少なくとも一部を含む抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、プロテアーゼ、例えばフリンに対する抵抗性の増加、活性及び／又は血清半減期の増加を有する（表９を参照）。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子はＦｃＲｎに結合する。

ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子のＩｇＧ抗体は、全長ＩｇＧ抗体であり得る。特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体は、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する任意のＩｇＧ抗体であり得る。例えば、限定するものではないが、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１抗体である。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体はＩｇＧ２抗体である。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体はＩｇＧ３抗体である。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体はＩｇＧ４抗体である。

特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、ＩｇＡ抗体の断片に融合したＩｇＧ抗体を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍｎ抗体又はＩｇＡ２ｍ２抗体であり得る。特定の実施形態では、ＩｇＡ断片は、約３００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、約１００アミノ酸長、約８０アミノ酸長、約６０アミノ酸長、約４０アミノ酸長又は約２０アミノ酸長であり得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ断片は約２５０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ断片は約２０アミノ酸、例えば約１８アミノ酸長である。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ断片はＩｇＡ抗体のＦｃ領域を含むことができる。特定の実施形態では、ＩｇＡ断片は、ＩｇＡ抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むことができる。特定の実施形態では、ＩｇＡ断片は、ＩｇＡ抗体のヒンジ領域を更に含むことができる。特定の実施形態では、ＩｇＡ断片は、ＩｇＡ抗体のテールピースを更に含むことができる。

特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、ＩｇＧ抗体及びＩｇＡ抗体のＦｃ領域を含むことができる。特定の実施形態では、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、本明細書に開示されるＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合したＩｇＧ抗体を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、ＩｇＡ重鎖のＦｃ領域にＣ末端で融合した完全長ＩｇＧ重鎖配列を含むことができる（図７Ｂ、図１２及び図３４Ａを参照）。

特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＰ２２１の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体のアミノ酸Ｐ２２１～Ｙ４７２を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＰ２２１の配列を含み得る。一定の実施形態では、Ｐ２２１アミノ酸をアルギニン（Ｒ）、すなわちＰ２２１Ｒに変異させることができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＲ２２１の配列を含むことができ、例えば、ＩｇＡ抗体のアミノ酸Ｒ２２１～Ｙ４７２を含むことができる。あるいは、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、ＩｇＡ抗体のヒンジ領域を欠失させる重鎖のＣ末端を介してＣ２４２の配列を含み得る。例えば、限定するものではないが、融合分子のＩｇＡ部分は、ＩｇＡ抗体のアミノ酸Ｃ２４２～Ｙ４７２を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＶ２２２の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍｎ抗体、又はＩｇＡ２ｍ２抗体のアミノ酸Ｖ２２２～Ｙ４７２を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＰ２２３の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍｎ抗体、又はＩｇＡ２ｍ２抗体のアミノ酸Ｐ２２３～Ｙ４７２を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＣ２４１の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体、又はＩｇＡ２ｍｎ抗体のアミノ酸Ｃ２４１～Ｙ４７２を含むことができる。

特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＰ２３７の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍｎ抗体、又はＩｇＡ２ｍ２抗体のアミノ酸Ｐ２３７～Ｙ４７２を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＰ２３８の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体、又はＩｇＡ２ｍｎ抗体のアミノ酸Ｐ２３８～Ｙ４７２を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＳ２３８の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体のアミノ酸Ｓ２３８～Ｙ４７２を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＰ２３９の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体のアミノ酸Ｐ２３９～Ｙ４７２を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＰ２４０の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体、又はＩｇＡ２ｍｎ抗体のアミノ酸Ｐ２４０～Ｙ４７２を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分、例えばＩｇＡ抗体のＦｃ領域は、重鎖のＣ末端を介してＳ２４０の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体部分は、ＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体のアミノ酸Ｓ２４０を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のＩｇＡ部分は、ＩｇＡ抗体のテールピース、例えばアミノ酸４５４～４７２を含まない。

ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、１つのＩｇＡアイソタイプ由来のＦｃ領域及び第２のアイソタイプ由来のヒンジ領域を含み得る。例えば、限定するものではないが、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、ＩｇＡ２、例えばＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２又はＩｇＡ２ｍｎ抗体由来のヒンジ領域を含むことができ、ＩｇＡ１抗体由来のＦｃ領域を含むことができる。

特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖は、Ｃ末端リジンアミノ酸、例えばＩｇＧ抗体のアミノ酸Ｋ４４７（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）を除去するように改変されている。例えば、限定するものではないが、本開示は、アミノ酸Ｋ４４７を欠くＩｇＧ抗体と、ＩｇＡ抗体のアミノ酸Ｐ２２１～Ｙ４７２又はＲ２２１～Ｙ４７２を含むＩｇＡ部分とを含むＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を提供する。

ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体とＩｇＡ抗体のＦｃ領域との間の接合部は、アミノ酸配列ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＰＶＰＰＰＰＰＣＣ（配列番号１）若しくはその断片、又はその保存的置換を含み得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体とＩｇＡ抗体のＦｃ領域との間の接合部は、アミノ酸配列ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＣ（配列番号２）若しくはその断片、又はその保存的置換を含み得る。保存的置換の非限定的な例を表１に示す。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体とＩｇＡ抗体のＦｃ領域との間の接合部は、図３４Ａに開示されるアミノ酸配列を含むことができる。

ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合物は、約１日まで、約２日まで、約３日まで、約４日まで、又は約５日まで血漿中で安定である。例えば、限定するものではないが、本開示のＩｇＧ１－ＩｇＡ Ｆｃ融合物は、血漿中で最大約４日間安定である。

特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、グリコシル化を減少させるために、上記の１つ以上のアミノ酸置換を更に含むことができる。例えば、限定するものではないが、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、ＩｇＡ抗体の重鎖及び／又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子のＪ鎖のグリコシル化を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子のＩｇＡ抗体がアグリコシル化される。ある特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、ＦｃＲｎに結合するが、ＦｃαＲＩには結合しない。

特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、１つ以上のＦｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９における置換を更に含むことができる。例えば、限定するものではないが、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、アミノ酸２９７、例えばＮ２９７Ｇにおける置換を更に含むことができる。

特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、アミノ酸Ｃ４７１及び／又はＣ３１１に置換を更に含むことができる。特定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子は、アミノ酸Ｃ４７１、例えばＣ４７１Ｓに変異を有することができる。一定の実施形態では、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合分子が、アミノ酸Ｃ３１１、例えばＣ３１１Ｓに変異を有し得る。

Ｂ．キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。ある特定の実施形態では、本開示のキメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）、及びヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体であり得る。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

ある特定の実施形態では、本開示のキメラ抗体は、ヒト化抗体であり得る。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減する一方で、親非ヒト抗体の特異性及び親和性は保持するようにヒト化される。通常、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来する１つ以上の可変ドメインを含み、ＦＲ（又はその一部）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を復元又は改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。

ヒト化抗体及びこれを製造する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ、「Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．」、第１３巻：第１６１９～１６３３頁（２００８年）に記載され、更に、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３３２巻：第３２３～３２９頁（１９８８年）；Ｑｕｅｅｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８６巻：第１００２９～１００３３頁（１９８９年）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第３６巻：第２５～３４頁（２００５年）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフト接合を記載する）；Ｐａｄｌａｎ、「Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第２８巻：第４８９～４９８頁（１９９１年）（「リサーフェシング」を記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第３６巻：第４３～６０頁（２００５年）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；並びに、Ｏｓｂｏｕｒｎら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第３６巻：第６１～６８頁（２００５年）、及びＫｌｉｍｋａら、「Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」、第８３巻：第２５２～２６０頁（２０００年）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド付き選択」手法を記載する）に更に記載される。

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）、及びＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）。

Ｃ．ヒト抗体
ある特定の実施形態では、本開示の抗体はヒト抗体であり得る。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して作製され得る。ヒト抗体は、全体的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。

ヒト抗体は、抗原投与に応答してヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、又は染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３：１１１７～１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ^{（登録商標）}技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ^{（登録商標）}技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；及び、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ^{（登録商標）}技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。かかる動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組合せることによって更に改変され得る。

ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）にも記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号明細書（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の作製を記載する）、及びＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５～２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載している）を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。

ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても作製され得る。その後、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組合せられ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択する技術は以下に記載される。

Ｄ．抗体変異体
本願で開示された主題は更に、開示された抗体のアミノ酸配列変異体を提供する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に組み込むことで、又はペプチド合成により調製することができる。かかる改変としては、本抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はその置換が挙げられるが、これらに限定されない。最終コンストラクトに到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組合せることができるが、但し、その最終抗体改変、すなわち改変された抗体が、所望の特性、例えば抗原結合を保有することを条件とする。

１．置換、挿入及び欠失変異体
ある特定の実施形態では、抗体変異体は、１つ以上のアミノ酸置換を有することができる。置換による変異誘発に関して目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換の非限定的な例は、表１において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化の非限定的な例を表１で「例示的置換」の見出しの下に示し、またアミノ酸側鎖クラスに関して下に更に記載する。アミノ酸置換は、目的の抗体中に導入され得、その産物は、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善された補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）若しくは抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）についてスクリーニングされ得る。

表１

アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けされてもよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

ある特定の実施形態では、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバを別のクラスと交換することを伴うことになる。

ある特定の実施形態では、一種の置換変異体は、親抗体、例えばヒト化抗体又はヒト抗体の超可変領域残基の１つ以上の置換を伴う。一般に、更なる試験のために選択される結果として生じる変異体（複数可）は、親抗体と比較した、親和性の増加、免疫原性の低減等のこれらに限定されないある特定の生物学的特性の修正、例えば、改善を有し、かつ／又は実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有する。置換型変異体の非限定的な例は、例えば、本明細書に記載の技法等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

ある特定の実施形態では、改変（例えば、置換）がＨＶＲに行われて、例えば、抗体親和性を改善することができる。そのような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）、及び／又は抗原と接触する残基内で行われ得、結果として得られる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のある特定の実施形態では、多様性が、様々な方法（例えば、エラー－プローンＰＣＲ、鎖シャフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のうちのいずれかによって、成熟させるために選択された可変遺伝子に導入され得る。その後、二次ライブラリが作製される。その後、このライブラリがスクリーニングされて、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に特定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。

ある特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような改変が、抗体が抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）が、ＨＶＲ中で行われてもよい。そのような変化は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外側であり得る。上に提供される変異体ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、変化していないか、又は１つ、２つ若しくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。

変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、残基又は標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性又は負荷電アミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられて、抗体と抗原との相互作用に影響が及ぼされたかを決定する。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。あるいは、又は加えて、抗体と抗原との間の接点を特定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。変異体は、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。

アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入型変異体としては、抗体の血清半減期を増加させる、酵素（例えば、抗体指向性酵素プロドラッグ療法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ：ＡＤＥＰＴ）のため）又はポリペプチドへの抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が挙げられる。

２．Ｆｃ領域変異体
ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸改変が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域変異体が生成され得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＡ Ｆｃ領域、又はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。

ある特定の実施形態では、本開示は、全てではないが一部のエフェクタ機能を有し、それによりインビボでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクタ機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ等）が不要又は有害である用途にとって望ましい候補となる、抗体変異体を提供する。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＩｇＡ特異的ｈＦｃ受容体、すなわち、ＦｃαＲＩ結合を欠くが、ＦｃＲｎ結合能を保持することを確実にすることができる。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁、表３に要約されている。例えば、ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための初代細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州マウンテンビュー）のためのＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ；及びＣＹＴＯＴＯＸ ９６^{（登録商標）}非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクタ細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照，）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定もまた、当該技術分野で既知の方法を使用して行われ得る（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６））を参照）。ある特定の実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、変化した（すなわち、改善されたか又は減少したかのいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす改変が、Ｆｃ領域において行われる。

エフェクタ機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９において１つ以上の置換を含むものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。

ＦｃＲに対する結合が改善又は減少したある特定の抗体変異体が記載される。例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１～６６０４（２００１）を参照されたい。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥＵナンバリング）での置換を有するＦｃ領域を含む。

ある特定の実施形態では、抗体のＦｃ領域で起こる改変、例えば本明細書に開示される二重特異性抗体は、増加した半減期及び新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する、変異体抗体を作成することができ、これは母体ＩｇＧの胎児への移入の原因であり（Ｇｕｙｅｒら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第１１７巻：第５８７頁（１９７６年）及びＫｉｍら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第２４巻：第２４９頁（１９９４年））、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載される。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域をそこに含む。かかるＦｃ変異体は、１つ以上のＦｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４における置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を伴うものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。

Ｆｃ領域変異体のその他の例に関係するＤｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号もまた参照されたい。

３．システイン操作抗体変異体
ある特定の実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作された抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、それを使用して、薬物部分又はリンカー－薬物部分等の他の部分に抗体を複合体化して、本明細書に更に記載されるように、免疫複合体を作製することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基のうちの任意の１つ以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。

４．抗体誘導体
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するように、更に改変され得る。抗体の誘導体化に好適な部分としては、限定するものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。このポリマーは、任意の分子量を有していてもよい、分岐していてもよい、又は分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は変化し得て、１つを超えるポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善される抗体の具体的な特性又は機能、抗体の誘導体が規定の状態下である療法で使用されるか等を含むが、これらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。

ある特定の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００－１１６０５（２００５））。ある特定の実施形態では、放射線は、いずれの波長のものであってもよく、これには、限定するものではないが、通常の細胞を傷つけないが、抗体－非タンパク質性部分に近接する細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長が挙げられる。

５．免疫複合体
本開示の主題はまた、化学療法剤若しくは薬物、増殖阻害剤、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体等の１つ以上の細胞毒性物質にコンジュゲートされた、本明細書に記載される、抗体を含む免疫複合体を提供する。例えば、開示された主題の抗体は、別の抗体、抗体断片、ペプチド、又は結合模倣物等の１つ以上の他の結合分子に機能的に結合され得る（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合、又は他の方法による）。

ある特定の実施形態では、免疫複合体は抗体薬剤複合体（ＡＤＣ）であり、本開示の抗体が、これらに限定されるわけではないが、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４、及び欧州特許第０ ４２５ ２３５号を参照）；モノメチルオーリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）等のオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号、及び同第５，７８０，５８８号、及び同第７，４９８，２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）；ａｎｄ Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照）；ダウノマイシン又はドキソルビシン等のアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル等のタキサン；トリコテセン；並びにＣＣ１０６５を含む１つ以上の薬剤に複合化されている。

ある特定の実施形態では、免疫複合体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、並びにトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含むがこれらに限定されない酵素活性毒素又はその断片に複合された本明細書に記載される抗体を含む。

ある特定の実施形態では、免疫複合体は、放射性原子に複合体化されて放射性複合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。放射性複合体の産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。非限定的な例としては、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性複合体が検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィ研究のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍ若しくはＩ^１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ｍｒｉ）のためのスピン標識、例えば、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄を含むことができる。

抗体断片及び細胞傷害性剤の抱合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）等の多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合化するための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内での細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。リンカーの非限定的な例を上に開示する。

本明細書に開示される免疫複合体は、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製、米国イリノイ州ロックフォード）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（サクシニミジル－（４－ビニルスルホン）安息香酸塩）を含むが、これらに限定されない架橋剤試薬で調製されるかかる複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。

ＩＩＩ．抗体産生及び精製の方法
Ａ．抗体産生の方法
本明細書に開示される抗体は、当技術分野で利用可能な技術又は既知の技術を用いて作製することができる。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を用いて産生することができる。本開示の抗体、例えばＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を作製するための詳細な手順を以下の実施例に記載する。

本願で開示された主題は、本明細書に開示される抗体をコードする単離された核酸を更に提供する。例えば、単離された核酸は、本開示のアグリコシル化抗体をコードするアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、本開示の単離された核酸は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上又は６つ以上のグリコシル化部位、例えばＮ結合型グリコシル化部位及び／又はＯ結合型グリコシル化部位を除去するように改変されたＩｇＡ抗体をコードするアミノ酸配列をコードすることができる。特定の実施形態では、本開示の単離された核酸は、アミノ酸Ｎ１６６、Ｔ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及び／又はＳ４６１に１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上又は１２個の改変、例えば置換を有するＩｇＡ抗体をコードするアミノ酸配列をコードすることができる。特定の実施形態では、本開示の単離された核酸は、本明細書に開示されるＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子、例えばＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合分子をコードするアミノ酸配列をコードすることができる。

ある特定の実施形態では、核酸は、１つ以上のベクター、例えば発現ベクター中に存在し得る。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１種は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクター、発現ベクターは、それらが作動可能に連結する遺伝子の発現を誘導することができる。一般に、組換えＤＮＡ技法において利用される発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態である場合が多い。しかしながら、開示された主題は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクター等を含むことを意図している。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体をコードする核酸、及び／又は核酸を含む１つ以上のベクターを、宿主細胞に導入することができる。ある特定の実施形態では、細胞への核酸の導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスベクター又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、微小細胞媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば（１）抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列、抗体の重鎖を含むアミノ酸配列、及び抗体のＪ鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター；（２）（ａ）抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列及び抗体の重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、並びに（ｂ）抗体のＪ鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター；又は（３）（ａ）抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、（ｂ）抗体の重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター、及び（ｃ）抗体のＪ鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第３のベクターで形質転換されたものを含み得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば、（ａ）抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、（ｂ）抗体の重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター、（ｃ）抗体のＪ鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第３のベクター、及び（ｄ）抗体の分泌成分を含むアミノ酸をコードする核酸を含む第４のベクターで形質転換されたものを含み得る。

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、２９３細胞、例えば、Ｅｘｐｉ２９３細胞である。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体を作製する方法は、抗体をコードする１つ以上の核酸が導入された宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、及び必要に応じて、宿主細胞及び／又は宿主細胞培養培地から抗体を回収することを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、クロマトグラフィ技術によって宿主細胞から回収される。

本開示の抗体の組換え産生のために、例えば上記のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入され得る。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核生物細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクタ機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（大腸菌における抗原断片の発現を記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。

原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、抗体をコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組合せて使用してもよい。

グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組合せて使用してもよい。

ある特定の実施形態では、植物細胞培養物を宿主細胞として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^（商標）技術を記載している）を参照されたい。

ある特定の実施形態では、脊椎動物細胞を宿主として使用することもできる。例えば、限定するものではなく、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の非限定的な例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児性腎株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ：ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファロラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；並びにＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ^－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。

ある特定の実施形態では、動物系を用いて、本開示の抗体を産生することができる。ハイブリドーマを調製するための１つの動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立された手法である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコル及び技術は、当技術分野において公知である。融合パートナ（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順もまた公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。

１．ポリマーＩｇＡの産生方法
本開示は、ポリマーＩｇＡを産生する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の方法を使用して、２種以上のＩｇＡ単量体、例えば約２～約５種のＩｇＡ単量体を含有するＩｇＡポリマーを産生することができる。例えば、限定するものではないが、本開示の方法を使用して、ＩｇＡ二量体、三量体、四量体及び／又は五量体を産生することができる。特定の実施形態では、そのような方法は、細胞に導入される、例えばトランスフェクトされる軽鎖（ＬＣ）及び／又は重鎖（ＨＣ）をコードするＤＮＡの量に対するＪ鎖をコードするＤＮＡの量の比を変更することを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、細胞に導入される、例えばトランスフェクトされるＬＣ、ＨＣ及び分泌成分（ＳＣ）をコードするＤＮＡの量に対するＪ鎖をコードするＤＮＡの量の比を変更することを含む。

本開示は、ＩｇＡ二量体の産生を増加させる方法を提供する。特定の実施形態では、ＩｇＡ二量体の産生を増加させる方法は、軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡの量と比較して、細胞に導入される、例えばトランスフェクトされるＪ鎖をコードするＤＮＡの量を増加させることを含む。ある特定の実施形態では、発現の増加は、等量のＪ鎖、重鎖及び軽鎖ＤＮＡが導入された、例えばトランスフェクトされた細胞で産生されたＩｇＡ二量体の量に対するものである。例えば、限定するものではないが、方法は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ１．Ｐ２２１Ｒ二量体、ＩｇＡ２ｍ２及びＩｇＡ２ｍｎ二量体を産生するために使用することができる。特定の実施形態では、本方法は、ＩｇＡ二量体の産生を増加させるために、約１：１：２、約１：１：３、約１：１：４又は約１：１：５である、Ｊ鎖をコードするＤＮＡの量に対する重鎖をコードするＤＮＡの量と軽鎖をコードするＤＮＡの量との比（ＨＣ：ＬＣ：ＪＣ）、例えば約１：１：２～約１：１：５の比で宿主細胞に導入する、例えばトランスフェクトすることを含み得る。ある特定の実施形態では、この方法は、軽鎖をコードするＤＮＡの量及び／又は重鎖をコードするＤＮＡの量よりも約２倍多い、約３倍多い、約４倍多い、又は約５倍多い量のＪ鎖をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトすることを含み得る。

本開示は、ＩｇＡポリマーの産生を増加させる方法を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示は、ＩｇＡ二量体、三量体、四量体及び／又は五量体の産生を増加させる方法を提供する。特定の実施形態では、ＩｇＡポリマー、例えば、二量体、三量体、四量体及び／又は五量体の産生を増加させる方法は、軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡの量と比較して、細胞に導入されるＪ鎖をコードするＤＮＡの量を減少させることを含む。特定の実施形態では、産生の増加は、Ｊ鎖ＤＮＡの量に対して等量の重鎖及び軽鎖ＤＮＡを導入、例えばトランスフェクトした細胞で産生されるＩｇＡポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び／又は五量体の量に対してである。例えば、限定するものではないが、方法は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ１Ｐ２２１Ｒ、ＩｇＡ２ｍ２又はＩｇＡ２ｍｎポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び／又は五量体を産生するために使用することができる。ある特定の実施形態では、該方法は、約１：１：０．２５又は約１：１：０．５、例えば、約１：１：０．２５～約１：１：０．５の比である、重鎖をコードするＤＮＡの量対軽鎖をコードするＤＮＡの量対Ｊ鎖をコードするＤＮＡの量の比（ＨＣ：ＬＣ：ＪＣ）で宿主細胞をトランスフェクトして、ＩｇＡ三量体、四量体及び／又は五量体の産生を増加させることを含み得る。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖をコードするＤＮＡの量は、軽鎖をコードするＤＮＡの量及び／又は重鎖をコードするＤＮＡの量よりも約３倍未満、約２倍未満又は約１倍未満大きくすることができる。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖をコードするＤＮＡの量は、軽鎖をコードするＤＮＡの量及び／又は重鎖をコードするＤＮＡの量の約０．５倍未満又は約０．２５倍未満であり得る。

ある特定の実施形態では、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１及び／又はＩｇＡ２ｍｎ三量体、四量体及び五量体の産生を増加させる方法が、細胞内で、アミノ酸Ｖ４５８に置換を有するＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体及び／又はＩｇＡ２ｍｎ抗体を発現させることを含み得る。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｖ４５８をイソロイシン（すなわち、Ｖ４５８Ｉ）に変異させることができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１及び／又はＩｇＡ２ｍｎ三量体、四量体及び五量体の産生の増加は、アミノ酸Ｖ４５８に置換を有さない細胞における、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体及び／又はＩｇＡ２ｍｎ抗体の発現から生じるＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１及び／又はＩｇＡ２ｍｎ三量体、四量体及び五量体の産生に対するものである。

ある特定の実施形態では、ＩｇＡ２ｍ２二量体の産生を増加させる方法は、アミノ酸Ｉ４５８に置換を有するＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させることを含み得る。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｉ４５８をバリン（すなわち、Ｉ４５８Ｖ）に変異させることができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ２ｍ２二量体の産生の増加は、アミノ酸Ｉ４５８に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体の発現から生じるＩｇＡ２ｍ２二量体の産生に対するものである。

特定の実施形態では、ＩｇＡポリマーの産生を増加させる方法は、例えば、グリコシル化部位を除去するように改変されていないＩｇＡ抗体によるＩｇＡポリマーの産生に対して、例えばアミノ酸置換（上記のように）によって、ＩｇＡ抗体から１つ以上のグリコシル化部位を除去することを含み得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＡポリマーの産生を増加させる方法が、アミノ酸Ｎ４５９及び／又はＳ４６１において１つ以上の置換を含み得る。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ抗体はアミノ酸Ｎ４５９に置換を有することができる。一定の実施形態では、ＩｇＡ抗体はアミノ酸Ｓ４６１に置換を有し得る。特定の実施形態では、ＩｇＡ抗体は、アミノ酸Ｎ４５９及び／又はＳ４６１に置換を有することができる。そのような置換の非限定的な例としては、Ｎ４５９のＡ、Ｇ又はＱへの変異が挙げられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｓ４６１をＡに変異させることができる。一定の実施形態では、ＩｇＡ１ポリマーの産生を増加させる方法が、アミノ酸Ｎ４５９及び／又はＳ４６１での置換、例えばアミノ酸Ｎ４５９及びＳ４６１での置換を有するＩｇＡ１抗体を発現させることを含み、例えば、発現の増加は、アミノ酸Ｎ４５９及び／又はＳ４６１での置換を有しないＩｇＡ１抗体の発現によって産生されるＩｇＡ１ポリマーの量に対するものである。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ２ポリマー、例えばＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２及びＩｇＡ２ｍｎポリマーの産生を増加させる方法が、アミノ酸Ｎ４５９及び／又はＳ４６１における置換、例えばアミノ酸Ｎ４５９及びＳ４６１における置換を有するＩｇＡ２抗体を発現させることを含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ２ポリマーの産生の増加は、アミノ酸Ｎ４５９及び／又はＳ４６１に置換を有さないＩｇＡ２抗体の発現から生じるＩｇＡ２ポリマーの産生に対するものである。

ある特定の実施形態では、ＩｇＡポリマー（例えば、ＩｇＡ単量体の産生の増加）の産生を減少させる方法が、アミノ酸Ｃ４７１、例えばＣ４７１Ｓ変異での置換を有するＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体又はＩｇＡ２ｍｎ抗体を発現させることを含む。例えば、限定するものではないが、ＩｇＡ２ｍ２ポリマーの産生を減少させる方法は、アミノ酸Ｃ４７１における置換、例えばＣ４７１Ｓ変異を有するＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させることを含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＡポリマー、例えばＩｇＡ２ｍ２ポリマーの産生の減少は、アミノ酸Ｃ４７１に置換を有さないＩｇＡ抗体、例えばＩｇＡ２ｍ２抗体の発現から生じるＩｇＡポリマー、例えばＩｇＡ２ｍ２ポリマーの産生に対するものである。

２．ポリマーＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の産生方法
本開示は更に、本開示のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を産生する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体を生成する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子のポリマー、例えば二量体、三量体及び／又は四量体を産生する方法を提供する。

特定の実施形態では、該方法は、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体の産生に関する。例えば、限定するものではないが、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体を発現させる方法は、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含むＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を発現させることを含み得、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＰ２２１又はＲ２２１を含む配列を含み、ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を含む。

特定の実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子のポリマーの産生に関する。例えば、限定するものではないが、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体、三量体、又は四量体を発現させる方法は、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含むＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を発現させることを含み、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＣ２４２を含む配列を含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体が、アミノ酸Ｋ４４７の欠失を含む。ある特定の実施形態では、上記方法によって産生されるＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子のポリマーは、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体、三量体及び／又は四量体を含む。

Ｂ．抗体産生の方法
本開示は更に、本明細書中に開示される抗体を精製する方法を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示は、本明細書中に開示される抗体のオリゴマー状態を分離するための方法、例えば、抗体の四量体状態から二量体状態を分離するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体を精製するための方法は、タンパク質親和性カラムを使用して抗体を精製することを含み得る。ある特定の実施形態では、本方法は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を行うことを更に含み得る。例えば、限定するものではないが、ＳＥＣは、本明細書に開示される抗体、例えばＩｇＡ抗体及び／又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の特定のオリゴマー状態を精製及び／又は単離するために実施することができる。ある特定の実施形態では、ＳＥＣを実施して、本明細書に開示される抗体の１つのオリゴマー状態、例えば二量体状態、三量体状態、四量体状態及び／又は五量体状態を精製及び／又は単離することができる。

特定の実施形態では、タンパク質親和性カラムは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムであり得る。ある特定の実施形態では、本開示の抗体、例えば主に１つのオリゴマー状態を含むＩｇＡ試料を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＳＥＣを用いて親和性精製することができる。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体、例えば本明細書に開示されるＩｇＡ抗体を、プロテインＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＳＥＣで精製することができる。ある特定の実施形態では、プロテインＬカラムは、トリス緩衝液（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＮａＮ_３）を含む第１洗浄緩衝液で洗浄することができる。ある特定の実施形態では、プロテインＬカラムを、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、２ｍＭ ＮａＮ_３）を含む第２の洗浄緩衝液で更に洗浄して、エンドトキシンを除去することができる。ある特定の実施形態では、プロテインＬカラムを、Ｔｒｉｓ緩衝液を含む第３の洗浄緩衝液で洗浄し、ＫＰ緩衝液（０．４Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＮａＮ３）を含む第４の洗浄緩衝液で洗浄し、及び／又はＴｒｉｓ緩衝液を含む第５の洗浄緩衝液で洗浄することができる。代替的又は追加的に、プロテインＬカラムは、ＰＢＳを含む洗浄緩衝液で１回以上洗浄することができる。

特定の実施形態では、抗体は、１Ｍアルギニン、０．４Ｍコハク酸塩、ｐＨ２．７で中和することができる１５０ｍＭ酢酸、ｐＨ９．０を含む緩衝液を使用してプロテインＬカラムから溶出することができる。代替的又は追加的に、抗体は、ｐＨ３．０の５０ｍＭリン酸を含む緩衝液を使用してプロテインＬカラムから溶出することができる。ある特定の実施形態では、溶出した抗体をｐＨ１１の２０×ＰＢＳで中和することができる。

ある特定の実施形態では、複合オリゴマーを含むＩｇＡ試料では、例えば、抗体の特定のオリゴマー状態（例えば、二量体、三量体及び／又は四量体の状態）を単離するために、３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ４５０ Å ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してプロテインＬ溶出液を更に精製することができる。ある特定の実施形態では、１００μＬ以下の注入体積中の１ｍｇ未満の総タンパク質を、移動相として０．２Ｍアルギニン、０．１３７Ｍコハク酸塩、ｐＨ５．０を用いたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣを使用して１ｍＬ／分でカラムに流し、２００μＬの画分を収集した。特定の実施形態では、ＳＥＣカラムからの画分を選択的にプールして、主に１つのオリゴマー状態を単離することができる。１回以上の実行を行うことができ、各実行からの所与のオリゴマーの画分を一緒にプールすることができる。

処置方法
本開示の主題は、開示された抗体、例えばＩｇＡ及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を使用する方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、本開示の抗体の治療的使用に関する。

ある特定の実施形態では、本開示の主題の１つ以上の抗体は、対象における疾患及び／又は障害を処置するために使用され得る。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、炎症性疾患、自己免疫疾患及びがんを処置するために使用され得る。ある特定の実施形態において、本開示の抗体は、がんを処置するために使用され得る。ある特定の実施形態では、ＦｃαＲＩへの結合を欠き、ＦｃαＲＩを活性化することができない本開示の抗体を、炎症性疾患、自己免疫疾患及びがんを処置するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、治療効果のために抗体のトランスサイトーシスを必要とする疾患及び／又は障害を処置するために、及び／又は治療標的にアクセスするために使用され得る。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、粘膜を横切る抗体のトランスサイトーシスを必要とする疾患及び／又は障害を処置するために使用され得る。

ある特定の実施形態では、本開示は、特定の疾患及び／又は障害を有する個体を処置する方法に使用するための抗体であって、有効量の抗体又はそれを含む組成物を個体に投与することを含む抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。ある特定の実施形態では、本開示は、特定の分子経路及び／又は機構を阻害するのに使用するための抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、個体における特定の分子経路及び／又は機構を阻害する方法であって、特定の分子経路及び／又は機構を阻害するのに有効な抗体を個体に投与することを含む方法に使用される抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、特定の分子経路及び／又は機構を不活性化するのに使用される抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、個体における特定の分子経路及び／又は機構を阻害する方法であって、特定の分子経路及び／又は機構を不活性化するのに有効な抗体を個体に投与することを含む方法に使用される抗体を提供する。

本明細書で同義に使用される「個体」、「患者」、又は「対象」は、哺乳動物を指す。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。

本開示は更に、対象の疾患及び／又は障害を処置するための医薬品の製造又は調製における抗体の使用を提供する。ある特定の実施形態では、医薬は、特定の疾患及び／又は障害の処置用である。ある特定の実施形態では、医薬は、疾患を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、特定の疾患及び／又は障害を処置する方法に使用するためのものである。ある特定の実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。ある特定の実施形態では、医薬は、特定の分子経路及び／又は機構を阻害又は活性化するためのものである。ある特定の実施形態では、医薬は、個体における特定の分子経路及び／又は機構を阻害又は活性化する方法であって、特定の分子経路及び／又は機構を阻害するのに有効な量の医薬を個体に投与することを含む方法において使用するためのものである。

ある特定の実施形態では、開示される治療方法で使用するための抗体は、本明細書に記載される医薬組成物中に存在することができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の薬学的に許容可能な担体を含むことができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の本開示の抗体を含むことができる。

追加的又は代替的に、医薬組成物は、第２の治療剤を含むことができる。開示される抗体の１種以上が別の治療剤と共に投与される場合、１種以上の抗体及び他の治療剤は、いずれかの順序で又は同時に投与され得る。上述のかかる併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる）及び個別投与を包含し、個別投与の場合、本開示の抗体の投与が、追加の治療剤（複数可）の投与前に、投与と同時に、及び／又は投与後に起こる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約１ヶ月以内、又は約１週間、２週間若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。

本開示の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含み、局所処置に所望される場合、病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短時間であるか、又は慢性的であるかに部分的に応じて、例えば、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射によるものであり得る。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。

本開示の抗体は、グッドメディカルプラクティス（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）と一致した様式で製剤化、投薬、及び投与され得る。本文脈で考慮すべき因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の因子が挙げられる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。有効量のそのような他の作用物質は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類、及び上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載される投薬量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

疾患の予防又は治療について、本開示の抗体の適切な投薬量（単独で又は１つ以上の他の追加の治療剤と組合せて使用される場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的のために投与されるか、以前の療法、患者の病歴、及び抗体への応答、並びに主治医の判断に依存する。ある特定の実施形態では、本開示の抗体を必要に応じて投与することができる。特定の実施形態では、抗体は、１回又は一連の治療にわたって患者に投与することができる。例えば、限定するものではないが、本明細書中に開示される抗体及び／又は医薬組成物は、対象に、１日に２回、１日に１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回又は１年に１回投与され得る。

ある特定の実施形態では、疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回又は複数回の別個の投与によるものであれ、連続注入によるものであれ、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、１日投与量は、約１００ｍｇ／ｋｇを超える場合がある。ある特定の実施形態では、投与量は、１～１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では２５～３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整され得る。

数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、治療は、概して、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられ得る。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。ある特定の実施形態では、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）の１回又は複数回の用量を患者に投与してもよい。あるいは、抗体は、持続放出製剤として投与することができ、その場合、必要とされる投与頻度は少ない。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に基づいて変動し得る。ある特定の実施形態では、そのような用量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間毎（ｅ．ｇ、患者が約２～約２０回、又はｅ．ｇ約６回の用量の抗体を受けるように）投与されてもよい。初期の多めの用量、それに続く１回又は複数回の量の少ない用量を投与してよい。

ある特定の実施形態では、方法は、対象を監視し、処置の有効性を決定することを更に含むことができる。例えば、この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視され得る。

Ｖ．医薬組成物
本開示の主題は、本開示の抗体の１つ以上、例えばＩｇＡ及びＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合タンパク質を薬学的に許容可能な担体と共に含有する医薬組成物を更に提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本開示の主題の複数の（例えば、２つ以上）抗体及び／又はその抗原結合部分の組合せを含むことができる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を１つ以上の任意の薬学的に許容可能な担体と凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混和することによって調製され得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。例えば、限定するものではないが、凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。ある特定の実施形態では、水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、純度が約８０％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、約９９．１％超、約９９．２％超、約９９．３％超、約９９．４％超、約９９．５％超、約９９．６％超、約９９．７％超、約９９．８％超又は約９９．９％超であり得る。

薬学的に許容可能な担体は一般的に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール等）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容可能な担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ^{（登録商標）}、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書及び同第２００６／０１０４９６８号明細書に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１種以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組合せる。

担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は点滴によって）に適し得る。投与経路に応じて、抗体は、化合物を不活性化し得る酸及び他の自然条件の作用から化合物を保護するために材料でコーティングすることができる。

本開示の医薬組成物は、併用療法で、すなわち他の薬剤と組合せて投与することもできる。ある特定の実施形態では、本明細書における医薬組成物は、処置される特定の適応症に必要な２種以上の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する有効成分も含み得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、第１の治療薬によって治療される同じ疾患を処置するための第２の有効成分を含むことができる。そのような有効成分は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組合せて存在する。例えば、限定するものではないが、本開示の製剤は、治療されている特定の適応症に対して必要に応じて１つを超える活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する活性成分も含有し得る。例えば、同じ疾患の処置に有用な第２の治療薬を更に提供することが望ましい場合がある。そのような有効成分は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組合せて存在する。

本開示の組成物は、当該技術分野で知られている種々の方法によって投与することができる。投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化する。活性化合物を、化合物を急速放出から保護する担体、例えばインプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤をいて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法は、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８によって記載されている。特定の実施形態では、医薬組成物は、米国食品医薬品局の医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造される。

開示される抗体を含有する徐放性調製物を調製することもできる。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、これらのマトリクスは、成形物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。ある特定の実施形態では、活性成分はまた、例えばコアセルベーション技法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタチレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、又はマクロ乳濁液中に取り込まれても良い。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

特定の投与経路によって本開示の抗体を投与するために、化合物をその不活性化を防止するための材料で被覆するか、又は化合物をその不活性化を防止するための材料と同時投与することが必要な場合がある。例えば、化合物は、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤中で対象に投与され得る。薬学的に許容可能な希釈剤としては、生理食塩水、及び緩衝液水溶液が挙げられる。リポソームには、水中油中水型ＣＧＦエマルジョン並びに従来のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７（１９８４））が含まれる。

薬学的に許容可能な担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。いずれかの従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本開示の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性のある化合物はまた、該組成物中に組み込むことができる。

治療用組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で滅菌され、実質的に等張であり、安定でなければならない。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール等の多価アルコール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。

滅菌注射用溶液は、１つ以上の開示された抗体を、必要に応じて、上に列挙した成分の１つ又は組合せを含む適切な溶媒中に必要な量で組み込み、続いて、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって滅菌精密濾過を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又はエマルションを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる、減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。

治療用組成物を、当技術分野で公知の医療機器により投与することもできる。例えば、本開示の治療用組成物は、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号又は第４，５９６，５５６号に開示されている装置等の無針皮下注射装置を用いて投与することができる。本開示において有用なインプラント及びモジュールの例には、以下が含まれる：制御された速度で薬剤を分配するための植え込み型微小注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を開示している米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための可変流量植込み型注入装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示している米国特許第４，４３９，１９６号；浸透圧薬物送達システムを開示している米国特許第４，４７５，１９６号。他の多くのそのようなインプラント、送達システム、及びモジュールが知られている。

治療用組成物の場合、本開示の製剤には、経口、経鼻、局所（頬側及び舌下を含む）、直腸、膣及び／又は非経口の投与に適したものが含まれる。製剤は、都合良く、単位剤形で提示されてもよく、薬学分野において公知のいずれかの方法によって調製され得る。単一剤形を製造するために担体材料と組合わせることができる抗体の量は、処置される対象及び特定の投与様式に応じて変化する。単一剤形を生成するために担体材料と組合せることができる抗体の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、有効成分の約０．０１パーセント～約９９パーセント、約０．１パーセント～約７０パーセント、又は約１パーセント～約３０パーセントの範囲である。

本開示の組成物の局所投与又は経皮投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。活性化合物は、滅菌条件下で薬学的に許容可能な担体と、及び必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤又は噴射剤と混合され得る。

「非経口投与」及び「非経口で投与される」という句は、経腸投与及び局所投与以外の投与態様を意味し（通常は注射による）、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入が挙げられる。

これらの医薬組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤等のアジュバントを含有することができる。上記の滅菌化手順によって、及び種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含むことの両方によって、微生物の存在の予防が確保され得る。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物に含めることも望ましい場合がある。更に、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射用医薬形態の長期吸収をもたらすことができる。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体が医薬としてヒト及び動物に投与されるとき、それらは、単独で、又は、例えば、約０．０１％～約９９．５％（又は約０．１～約９０％）の本明細書中に記載される抗体を薬学的に許容可能な担体と組合せて含有する医薬組成物として与えられ得る。

ＶＩ．製造品
本開示の主題は更に、上記の疾患及び／又は障害の治療及び／又は予防に有用な、例えば１つ以上の本開示の抗体を含有する製造品材料に関する。

ある特定の実施形態では、製造品は、容器、及び容器についての又は容器に関連するラベル又は添付文書を含んでもよい。適切な容器の非限定的な例としては、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、又は別の組成物との組合せで、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効である組成物を保持し得、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静注溶液袋又は皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。

特定の実施形態では、組成物中の少なくとも１つの活性物質は、本開示の主題の抗体である。ラベル又はパッケージ添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す場合がある。

ある特定の実施形態では、製造品は、（ａ）本開示の抗体を含む組成物を内部に収容した第１の容器と、（ｂ）更なる細胞傷害性薬剤、又はさもなければ治療剤を含む組成物を内部に収容した第２の容器とを含無ことができる。特定の実施形態では、製造品は、組成物を使用して特定の状態を治療することができることを示す添付文書を更に含むことができる。

代替的に、又は追加的に、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２の又は第３の容器を更に含無ことができる。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料を含み得る。

ＶＩＩ．例示的な実施形態
Ａ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、単離されたＩｇＡ抗体又はその断片であって、ＩｇＡ抗体がアミノ酸Ｖ４５８、Ｎ４５９及び／又はＳ４６１に置換を含む、単離されたＩｇＡ抗体又はその断片を提供する。

Ａ１．アミノ酸Ｖ４５８がイソロイシンで置換されている（Ｖ４５８Ｉ）、アミノ酸Ｎ４５９がグルタミン（Ｎ４５９Ｑ）、グリシン（Ｎ４５９Ｇ）若しくはアラニン（Ｎ４５９Ａ）で置換されている、及び／又はアミノ酸Ｓ４６１がアラニンで置換されている（Ｓ４６１Ａ）、上述のＡに記載の単離されたＩｇＡ抗体。

Ｂ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、単離されたＩｇＡ抗体又はその断片であって、ＩｇＡ抗体がアミノ酸Ｉ４５８に置換を含む、単離されたＩｇＡ抗体又はその断片を提供する。

Ｂ１．アミノ酸Ｉ４５８がバリンで置換されている（Ｉ４５８Ｖ）、上述のＢに記載の単離されたＩｇＡ抗体。

Ｃ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ抗体が、Ｎ１６６、Ｔ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９、Ｓ４６１及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸において１つ以上の置換を含む、単離されたＩｇＡ抗体又はその断片を提供する。

Ｃ１．アミノ酸Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９及びＮ４５９における置換が、Ｎ１６６Ａ、Ｓ２１２Ｐ、Ｎ２６３Ｑ、Ｎ３３７Ｔ、Ｉ３３８Ｌ、Ｔ３３９Ｓ及びＮ４５９Ｑである、上述のＣに記載の単離されたＩｇＡ抗体。

Ｃ２．ＩｇＡ抗体がＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２又はＩｇＡ２ｍｎ抗体である、上述のＡ～Ｃ１のいずれか１つに記載の単離されたＩｇＡ抗体。

Ｃ３．ＩｇＡ抗体が、アミノ酸Ｎ３３７、Ｉ３３８及びＴ３３９における置換、並びにＴ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ４５９、Ｓ４６１及びそれらの組合せにおいて１つ以上の置換を含む、上述のＣ及びＣ１のいずれか１つに記載の単離されたＩｇＡ抗体。

Ｃ４．ＩｇＡ抗体が、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、又はＩｇＡ２ｍｎ抗体である、上述のＣ３に記載の単離されたＩｇＡ抗体。

Ｃ５．ＩｇＡ抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はヒト抗体である、上述のＡ～Ｃ４のいずれか１つに記載の単離されたＩｇＡ抗体。

Ｄ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含む単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子であって、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＰ２２１又はＲ２２１を含む配列を含み、ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を更に含む、単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を提供する。

Ｅ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含む単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子であって、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＣ２４２を含む配列を含む、単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を提供する。

Ｅ１．ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を更に含む、上述のＥに記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。

Ｅ２．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体及びＩｇＧ４抗体からなる群より選択される、上述のＤ～Ｅ１のいずれか１つに記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。

Ｅ３．ＩｇＧ抗体がＩｇＧ１抗体である、上述のＤ～Ｅ２のいずれか１つに記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子

Ｅ４．ＩｇＡ抗体が、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体及びＩｇＡ２ｍｎ抗体からなる群より選択される、上述のＤ～Ｅ３のいずれか１つに記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。

Ｅ５．ＩｇＡ抗体がＩｇＡ２ｍ１抗体である、上述のＤ～Ｅ４のいずれか１つに記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子

Ｆ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、Ａ～Ｃ４のいずれか１つのＩｇＡ抗体、又はＤ～Ｅ５のいずれか１つのＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子をコードする単離された核酸を提供する。

Ｇ．ある特定の非限定的な実施形態では、本願で開示された主題は、Ｆに記載の核酸を含む宿主細胞を提供する。

Ｈ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡを産生する方法であって、Ｇに記載の宿主細胞を、前記ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子が産生されるように培養することを含む、方法を提供する。

Ｈ１．宿主細胞から前記ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を回収することを更に含む、上述のＨに記載の方法。

Ｈ２．Ｈから産生された、又はＨ１から回収された上述のＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。

Ｉ．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、Ａ～Ｃ４及びＨ２のいずれか１つに記載の１種以上のＩｇＡ抗体、又はＤ～Ｅ５及びＨ２のいずれか１つに記載の１種以上のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。

Ｉ１．追加の治療剤を更に含む、上述のＩに記載の医薬組成物。

Ｊ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量のＡ～Ｃ４及びＨ２のいずれか１つに記載の１種以上のＩｇＡ抗体、又はＤ～Ｅ５及びＨ２のいずれか１つに記載の１種以上のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を前記個体に投与することを含む、方法を提供する。

Ｊ１．疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、前述のＪに記載の方法。

Ｋ．医薬として使用するための前述のＡ～Ｃ４及びＨ２のいずれか１つに記載のＩｇＡ抗体又はＤ～Ｅ５及びＨ２のいずれか１つに記載のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。

Ｌ．疾患の処置に使用するための、前述のＡ～Ｃ４及びＨ２のいずれか１つに記載のＩｇＡ抗体又はＤ～Ｅ５及びＨ２のいずれか１つに記載のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。

Ｍ．疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、前述のＬに記載のＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。

Ｎ．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、疾患を治療するための医薬品の製造における、Ａ～Ｃ４及びＨ２のいずれか１つに記載のＩｇＡ抗体又はＤ～Ｅ５及びＨ２のいずれか１つに記載のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の使用を提供する。

Ｎ１．疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、前述のＮに記載の使用。

Ｏ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ二量体の発現を増加させる方法であって、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）をコードするＤＮＡの量に対して、第１の細胞に導入される連結鎖（ＪＣ）をコードするＤＮＡの量を増加させることを含み、発現の増加が、等量のＪＣ、ＬＣ及びＨＣのＤＮＡが導入された第２の細胞で産生されるＩｇＡ二量体の量に対するものである、方法を提供する。

Ｏ１．第１の細胞に導入される、ＨＣをコードするＤＮＡの量対ＬＣをコードするＤＮＡの量対ＪＣをコードするＤＮＡの量の比（ＨＣ：ＬＣ：ＪＣ）が約１：１：２～約１：１：５である、上述のＯに記載の方法。

Ｐ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ二量体、三量体又は四量体の発現を増加させる方法であって、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）をコードするＤＮＡの量に対して、第１の細胞に導入される連結鎖（ＪＣ）をコードするＤＮＡの量を減少させることを含み、発現の増加が、ＪＣ ＤＮＡの量に対してより多くのＨＣ及びＬＣ ＤＮＡを導入した第２の細胞で産生されるＩｇＡの三量体又は四量体の量に対するものである、方法を提供する。

Ｐ１．第１の細胞に導入される、ＨＣをコードするＤＮＡの量対ＬＣをコードするＤＮＡの量対ＪＣをコードするＤＮＡの量の比（ＨＣ：ＬＣ：ＪＣ）が約１：１：０．２５～約１：１：０．５である、上述のＰに記載の方法。

Ｑ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの産生を増加させる方法であって、第１の細胞において、アミノ酸Ｖ４５８に置換を有するＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸Ｖ４５８に置換を有さないＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの量に対するものである、方法を提供する。

Ｑ１．アミノ酸がイソロイシンで置換されている（Ｖ４５８Ｉ）、上述のＱに記載の方法。

Ｒ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ２ｍ２二量体の産生を増加させる方法であって、アミノ酸Ｉ４５８に置換を有するＩｇＡ２ｍ２抗体を第１の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸Ｉ４５８に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ２ｍ２二量体の量に対するものである、方法を提供する。

Ｒ１．アミノ酸がバリンで置換されている（Ｉ４５８Ｖ）、上述のＲに記載の方法。

Ｓ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの産生を増加させる方法であって、アミノ酸Ｎ４５９又はＳ４６１に置換を有するＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を第１の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸Ｎ４５９又はＳ４６１に置換を有さないＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの量に対するものである、方法を提供する。

Ｓ１．アミノ酸Ｎ４５９がＮ４５９Ｑ、Ｎ４５９Ｇ若しくはＮ４５９Ａ変異で置換されており、及び／又はアミノ酸Ｓ４６１がＳ４６１Ａ変異で置換されている、上述のＳに記載の方法。

Ｔ．ＩｇＡ２ｍ２ポリマーの産生を減少させる方法であって、第１の細胞において、アミノ酸Ｃ４７１に置換を有するＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させることを含み、産生の減少が、アミノ酸Ｃ４７１に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ２ｍ２ポリマーの量に対するものである、方法。

Ｔ１．アミノ酸Ｃ４７１がＣ４７１Ｓ変異で置換されている、Ｔに記載の方法。

Ｕ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ２ｍ２抗体の一過性発現を増加させる方法であって、第１の細胞において、Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を含むＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させることを含み、前記一過性発現の増加が、Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させる第２の細胞において産生される一過性発現の量に対するものである、方法を提供する。

Ｖ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体を発現する方法であって、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含む単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を発現することを含み、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＰ２２１又はＲ２２１を含む配列を含み、ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を含む、方法を提供する。

Ｗ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体、三量体、又は四量体を発現させる方法であって、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含むＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を発現させることを含み、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＣ２４２を含む配列を含む、方法を提供する。

Ｗ１．ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を含む、上述のＷに記載の方法。

Ｘ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ抗体と少なくとも１つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からＩｇＡ抗体を精製する方法であって、
（ａ）プロテインＬを含むカラムに混合物を適用してＩｇＡ抗体を結合させること；
（ｂ）ＰＢＳを含む洗浄緩衝液でプロテインＬカラムを洗浄すること；及び
（ｃ）リン酸を含む溶出緩衝液によってプロテインＬカラムからＩｇＡ抗体を溶出させること、を含む、方法を提供する。

Ｙ．非限定的な実施形態では、本開示の主題は、ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子と少なくとも１つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からオリゴマー状態のＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を精製する方法であって、
（ａ）プロテインＬ又はプロテインＡを含む親和性精製カラムに混合物を適用して、ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を結合させること；
（ｂ）親和性精製カラムを洗浄緩衝液で洗浄すること；
（ｃ）溶出緩衝液によって親和性精製カラムからＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を溶出して、第１の溶出液を形成すること；及び
（ｄ）サイズ排除クロマトグラフィカラムに前記第１の溶出液を適用して、異なるオリゴマー状態のＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を分離し、オリゴマー状態のＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を含むフロースルーを得ること、を含む、方法を提供する。

以下の実施例は、本開示の主題の単なる例示であり、いかなる意味においても制限とみなすべきではない。

実施例１：マウスにおけるポリマーＩｇＡの薬物動態パラメータに対するグリコシル化及びＦｃＲｎ結合の役割の評価
ＩｇＡ抗体は、伝統的なＩｇＧベースの薬物と比較して、それらの優れた受容体媒介性細胞傷害活性、病原体の強力な中和、及びポリマー免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）媒介性輸送を介した粘膜バリアを越えるトランスサイトーシス能に基づいて、新規な治療プラットフォームとして幅広い可能性を有する。しかしながら、ＩｇＡの臨床開発への移行は、複雑な発現及び特性評価、並びに組換え生成された不完全なシアリル化Ｎ結合型グリカンを持つＩｇＡ単量体のグリカン受容体捕捉によって媒介されると考えられる迅速な血清クリアランスによる課題があった。本実施例では、組換え生成された単量体、二量体及びポリマーのヒトＩｇＡの包括的な生化学的、生物物理学的及び構造的な特性評価が提供される。更に、ポリマーＩｇＡの急速な血清クリアランスを克服するための２つの戦略が特定されている：（１）アグリコシル化又は部分的にアグリコシル化されたポリマーＩｇＡを生成するＮ結合型グリコシル化部位の除去、及び（２）ポリマーＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合物の生成によるＦｃＲｎ結合の操作。

方法：
プラスミドクローニング及び配列アラインメント。使用される抗体可変ドメイン配列には、ヒト化抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４２８５－９（１９９２））及びマウス抗マウスＩＬ－１３抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。ヒトＩｇＡ定常重鎖ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１及びＩｇＡ２ｍ２、他のＩｇＡ種及びヒトＪ鎖のタンパク質配列を、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）から得た。得られた他の種には、以前に報告されたように軽鎖－重鎖ジスルフィドを安定化するＩｇＡ２ｍ１、すなわちＰ２２１Ｒの変異が含まれる（Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：３４４３－９（１９９６）））。ヒト軽鎖定常ドメイン及びヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１及びＩｇＡ２ｍ２重鎖定常ドメインへの抗体可変ドメインの融合をコードする遺伝子を合成し、哺乳動物ｐＲＫベクター（Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：８３４３－７（１９８６））にクローニングした。部位特異的突然変異誘発を使用して、点突然変異を導入した。全てのプラスミドを配列検証した。配列アラインメントは、ＧＳｅｑＷｅｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して行った。

小規模抗体発現及び精製。Ｅｘｐｉ２９３Ｔ（商標）細胞を、ＩｇＡ単量体についてはＬＣ及びＨＣの両方の１５μｇのＤＮＡ、又はＩｇＡオリゴマーについてはＬＣ、ＨＣ及びＪＣの様々な比の合計３０μｇのＤＮＡで３０ｍＬの規模で一過性にトランスフェクトした（Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８０：１０－６（２０１４）及びＢｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １１２：１８３２－４２（２０１５））。全ての抗体がカッパ軽鎖を含有していたため、ＩｇＡをプロテインＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてバッチで親和性精製した。プロテインＬ溶出液を分析ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ）によって特性評価した。一定体積をカラムにロード、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して各曲線下面積を定量した。

大規模な抗体発現及び精製。ＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合物を、以前に記載されたようにＣＨＯ ＤＰ１２細胞において一過性に発現させた（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０６：７５１－６３（２０１０））。低発現クローンについては、ＴＩ安定細胞株を作製した。ＩｇＧ及びＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃの融合物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて親和性精製した。Ｃａｐｔｏ Ｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＳＥＣを用いてＩｇＡを親和性精製した。ＤＮＡ比が主に一方のオリゴマー状態への発現の偏りに成功したＩｇＡ試料については、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＳＥＣに使用した。オリゴマーの複雑な混合物を含有するＩｇＡ試料については、３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＸｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ４５０ Å ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を二量体及び四量体のピークのより良好な分離のために使用した。

ＳＥＣ－ＭＡＬＳ。ポリマーＩｇＡを３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ２００ Å ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に流し、モル質量決定及び多分散性測定のためにＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ／Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ ＩＩ（Ｗｙａｔｔ）多角度光散乱検出器に直接注入した。

示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）。ＤＳＦを以前に記載されたように行った（Ｌｏｍｂａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１７４８８（２０１５））。

インビトロトランスサイトーシスアッセイメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫＩＩ）細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国ソールズベリー）を、ヒトｐＩｇＲ遺伝子をコードするｃＤＮＡを含むレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏ－Ｘ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ；ＯｒｉＧｅｎｅ、メリーランド州ロックビル）で形質導入した。ｐＩｇＲ遺伝子の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びウェスタンブロッティングにより確認した。ｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州カールスバッド）及び２μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を補充したＤＭＥＭ中で維持した。トランスサイトーシスアッセイのために、細胞を０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ２４ウェル細胞培養インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州バーリントン）に播種し、４日間培養した。実験当日、細胞をＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で２回洗浄し、６μｇのＩｇＡ分子を基底外側区画に添加した。２４時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡによる分析のために、頂端側区画及び基底外側区画の両方から培地を収集した。

電子顕微鏡法。精製した抗ＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２二量体及び四量体試料を、０．０１５％グルタルアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）中、室温で１０分間インキュベートすることによって最初に架橋した。固定したら、試料をＴＢＳ緩衝液を用いて希釈して、１０ｎｇ／μＬの濃度を達成した。次いで、４μｌの各試料を、２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニル陰性染色剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理する前に、連続炭素の薄層で覆われた新たにグロー放電した４００メッシュの銅グリッド上で４０秒間インキュベートした。次いで、ＩｇＡの二量体及び四量体を、１２０ｋｅＶで操作するＴｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ Ｔ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて２５，０００×（２．２Å／ピクセル）の倍率で撮像した。低線量条件下でＧａｔａｎ ４０９６×４０９６ピクセルＣＣＤカメラを使用して画像を記録した。次いで、ＩｇＡの二量体及び四量体の両方について約５０００個の粒子を選択し、１２８ピクセルの粒子ボックスサイズを使用して、ＥＭＡＮ２パッケージ（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １５７：３８－４６（２００７））内のｅ２ｂｏｘｅｒ．ｐｙソフトウェアを使用して抽出した。ＲＥＬＩＯＮ画像ソフトウェアパッケージ（Ｓｃｈｅｒｅｓ Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １８０：５１９－３０（２０１２））内の参照フリー２Ｄクラスを使用して、両方の試料の平均画像を生成した。

全体的なＮ結合型グリカン組成分析（ＬＣ－ＭＳ分析）。１０μｇの各ＩｇＡ試料を８ＭグアニジンＨＣｌで１：１の体積比で変性させ、１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で９５℃で１０分間還元した。試料を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で最終濃度の２ＭグアニジンＨＣｌに希釈し、続いて２μｌのＰ０７０５Ｓ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて３７℃で一晩Ｎ結合脱グリコシル化した。脱グリコシル化後、各試料１５０ｎｇをＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムに注入し、２％～３２％溶媒Ｂ（溶媒Ａ：０．１％ギ酸及び０．０２％トリフルオロ酢酸を含む９９．８８％水；溶媒Ｂ：９．８８％水＋０．１％ギ酸及び０．０２％トリフルオロ酢酸を含有する９０％アセトニトリル）の定組成勾配によって溶出した。ＨＰＬＣシステムを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ４２４０Ａ Ｃｕｂｅ ＭＳシステムを介してＧ６５２０Ｂ Ｑ－ＴＯＦ質量分析計に連結した。試料をグリカン濃縮し、Ｃｈｉｐ Ｃｕｂｅ ＭＳシステムのＧ４２４０－６４０２５ ｍＡｂ－Ｇｌｙｃｏチップ内に構築した多孔質グラファイト化炭素カラムを使用して分離した。データ取得：１．９ｋＶスプレー電圧；３２５℃ガス温度；５ｌ／分の乾燥ガス流；１６０Ｖフラグメンター電圧；６５Ｖスキマー電圧；７５０Ｖ ｏｃｔ １ ＲＦ Ｖｐｐ電圧；４００～３０００ｍ／ｚの走査範囲；正極性；拡張ダイナミックレンジ（２ＧＨｚ）機器モードを使用したＭＳ１重心データ取得；３スペクトル／秒；３３３．３ｍｓ／スペクトル；３２４３過渡／スペクトル；及びＣＥ設定０。取得したマススペクトルデータを、１０ｐｐｍの質量許容差を有する正確な質量とグリカン同定のための予想される保持時間との組合せを利用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアのグリカンライブラリに対して検索した。各グリカンの抽出された化合物クロマトグラムにおけるＡＵＣに基づいて、各試料内の全ての同定されたＮ結合型グリカンと比較して、Ｎ結合型グリカンを標識なしで定量した。

Ｎ結合型糖ペプチド部位マッピング分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析）。１０μｇのＩｇＡを３７℃で１時間、１０ｍＭのＤＴＴで還元し、室温で２０分間、１０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化し、０．２μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び０．２μｇのキモトリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で別々に３７℃で一晩消化し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でクエンチし、Ｃ１８（３Ｍ Ｅｍｐｏｒｅ Ｃ１８抽出ディスク）ステージ－チップ（５０％アセトニトリル、４９．９％水、０．１％ＴＦＡ）でクリーンアップに供した。２００ｆｍｏｌの試料をオートサンプラーを介してＷａｔｅｒｓ ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムに注入し、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（０．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．７μｍ樹脂）で４５℃で分離した。２％～４０％の溶媒Ｂの勾配を溶出に使用した（溶媒Ａ：９９．９％水、０．１％ギ酸；溶媒Ｂ ９９．９％アセトニトリル、０．１％ギ酸）。

分離したペプチドを、データ取得のために以下のパラメータを使用してＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にナノスプレーイオン化によってオンラインで分析した：６００００解像度；３７５～１６００ｍ／ｚ走査範囲；正極性；重心モード；０．２５活性化Ｑ及び１０ｍｓの活性化時間を有する１ｍ／ｚの分離幅；ＣＩＤ活性化；並びにＣＥ設定３５。データをデータ依存モードで収集し、前駆体イオンをＦＴＭＳで分析し、上位１５個の最も豊富なイオンをＩＴＭＳでのフラグメンテーション及び分析のために選択した。取得した質量スペクトルデータを、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｂｙｏｎｉｃソフトウェアを使用してタンパク質配列に対して検索し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｂｙｏｌｏｇｉｃソフトウェアで分析した。各グリコシル化部位のペプチド同定は、ＭＳ２断片化スペクトル、抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）、及び保持時間の組合せに基づいて手動で検証した。Ｎ結合型糖ペプチドを、その非改変ペプチドと比較して、ＸＩＣのＡＵＣインテグレーションによって標識なしで定量した。

マウス研究。雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６～８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって得た。到着したら、全てのマウスを、食物及び水を自由に摂取できるようにして、標準的な１２時間の明／１２時間の暗サイクルの下、２１℃の室温で病原体を含まない動物施設で維持した。全てのマウスは、それぞれの抗体（ＩｇＧ又はＩｇＡ）の単回静脈内（ＩＶ）注射を受けた。血液試料（１５０～２００μＬ）を、注射後の様々な時点でイソフルラン麻酔下で後眼－窩洞又は心臓穿刺のいずれかを介して収集した。試料を血清分離管に収集した。血液を周囲温度で少なくとも２０分間凝固させた。凝固した試料を、収集時間の１時間以内に開始して遠心分離するまで室温で維持した。各試料を１５００～２０００×ｇの相対遠心力で２～８℃で５分間遠心分離した。遠心分離後２０分以内に血清を血液試料から分離し、標識された２．０－ｍＬポリプロピレン、コニカル－ボトム微量遠心管に移した。

健康であるように見え、明らかな異常がない動物のみを試験に使用した。実施された全ての動物実験は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって検討及び承認された。

トランスサイトーシス及び薬物動態研究のためのＩｇＡ ＥＬＩＳＡ。ＩｇＡ抗体レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。３８４マイクロタイタープレートのウェルを、２５μｌのコーティング緩衝液（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトκ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０６０－０１）で４℃で一晩コーティングし、続いて５０μｌのＰＢＳ中０．５％ＢＳＡで３７℃で２時間ブロッキングした。次いで、試料緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ、０．３５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２５％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈した試料（２５μｌ）をブロックしたプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、２５μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＡ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０５３－０５）を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを２５μｌのＴＭＢ（Ｍｏｓｓ、カタログ番号ＴＭＢＥ－１０００）と共に１５分間インキュベートし、２５μｌの１Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４で反応を停止させた。プレートリーダーを使用して６３０ｎｍで還元しながら４５０ｎｍで吸光度を測定した。工程の間に、プレートを２００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）で６回洗浄した。定量のための基準として、各ＩｇＡ分子について連続希釈ストック材料（２０ｎｇ／ｍｌ～０．１５ｎｇ／ｍｌ）を使用して標準曲線を確立した。ＩｇＡ ＥＬＩＳＡは、最大１０％のマウス血清及び１０％の組織溶解物の生物学的マトリックスに耐える。

放射化学。ヨウ素－１２５［^１２５Ｉ］を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製の０．１Ｎ水酸化ナトリウム中のヨウ化ナトリウムとして得た（マサチューセッツ州ボストン）。１ ｍＣｉの^１２５Ｉ（約３μＬ）を使用して、間接ヨードゲン法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード）を使用して、約１０μＣｉ／μｇの比活性でチロシン残基を介して^１２５Ｉでランダムに標識した。^１１１Ｉｎ標識抗体（約８μＣｉ／μｇ）の放射合成を、^１１１Ｉｎ及び１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）結合体化（リジンを介してランダムに）ｍＡｂを０．３Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７中、３７℃で１時間インキュベートすることによって達成した。全ての放射性免疫抱合体の精製は、ＰＢＳ中で平衡化したＮＡＰ５カラムを使用して達成し、サイズ排除クロマトグラフィによって確認した。

抗体を、間接的なヨードゲン添加法（Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；１４７：１５４８－５６（１９９１））を使用して放射性ヨウ素化した。放射性標識タンパク質を、ＰＢＳ中で予め平衡化したＮＡＰ５（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ１７－０８５３－０１）を使用して精製した。放射性ヨウ素化後、標識抗体をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって特性評価し、非標識抗体と比較した。試料をＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクララ）及び直列に接続したＹａｒｒａ ＳＥＣ－３０００、３μＭ ３００ｍｍ×７．８ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カリフォルニア州トーランス、カタログ００Ｈ－４５１３－Ｋ０）サイズ排除カラムに注入し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ ｐＨ７．０）を用いて０．８ｍＬ／分の流速で２０分間溶出した。溶出を、２８０ｎｍでの吸収によって、及びインラインＧａｂｉガンマカウンター（Ｅｌｙｓｉａ－Ｒａｙｔｅｓｔ、ドイツ）で溶出画分の放射能を測定することによって監視した。

組織分布研究の設計及び分析。プロトコル、飼育及び麻酔は、ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの規制に準拠し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓによって承認された。

体重２０～３０ｇの範囲及び６～７週齢の範囲の雌ＢＡＬＢ－ｃマウスをＪａｃｋｓｏｎ／Ｗｅｓｔ（ＣＡ）から入手した。それぞれ１２匹のマウス、６群をこの試験に使用した。^１２５Ｉの甲状腺分離を防止するために、１００μＬの３０ｍｇ／ｍＬのヨウ化ナトリウムを、投与の１時間前及び２４時間前に腹腔内投与した。全てのマウスに、^１２５Ｉ標識抗体及び^１１１Ｉｎ標識抗体（それぞれ５μＣｉ）＋それぞれの未改変抗体の混合物からなる単回ＩＶ注射を総用量５ｍｇ／ｋｇで行った。４匹のマウスのコホートを、注射の５分後、１５分後、３０分後、１時間後、４時間後、１２時間後、１日後、２日後及び３日後にイソフルラン（効果を得るための吸入）下で後眼窩出血させた。１時間、１日、３日目；開胸によるケタミン（７５～８０ｍｇ／ｋｇ）／キシレン（７．５～１５ｍｇ／ｋｇ）の麻酔下で４匹の動物を安楽死させた。以下の組織を収集し、冷ＰＢＳですすぎ、ブロット乾燥し、秤量し、凍結した：脳、肝臓、肺、腎臓、脾臓、心臓、胃、小腸、筋肉、皮膚、脂肪、大腸。試料放射能を、自動バックグラウンド及び減衰補正を用いて^１１１Ｉｎ（２４５ｋｅＶ；減衰ｔ_１／２＝２．８日）及び^１２５Ｉ（３５ｋｅＶ；減衰ｔ_１／２＝５９．４日）のエネルギーウインドウにおいて１４８０ ＷＩＺＡＲＤ（商標）ガンマカウンターを使用して放射能についてカウントした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ用のバージョン７．００、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国カリフォルニア州サンディエゴ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を使用してデータを分析し、グラフ化した。

マウス血漿安定性。マウス血漿（抗凝固剤リチウムヘパリンを含む）をＢｉｏＩＶＴ（ニューヨーク州ウエストベリー）から入手し、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；ミズーリ州セントルイス、カタログＡ２０５８）をＰＢＳ（ＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡ）と混合することによって緩衝液対照を作製した。放射性標識抗体をマウス血漿又は緩衝液対照に５μＣｉの放射性標識トレーサで混合し、次いで、５％ＣＯ_２を含む３７^ｏＣに設定したインキュベータ内でインキュベートした。インキュベーションの０、２４、及び９６時間の設定時点で、試料をインキュベータから取り出し、分析まで－８０^ｏＣの冷凍庫で保存した。

試料は、ＰＢＳ中の１：１試料希釈を用いて、上記のＳＥＣ－ＨＰＬＣ法によって分析した。時間０における親ピークからの変化をモニターするために、結果クロマトグラムを時間点間で比較した。

Ｗａｓａｔｃｈによる抗体動態９６×９６アレイベースのＳＰＲイメージングシステム（Ｃａｒｔｅｒｒａ ＵＳＡ）を使用して、精製ＩｇＡ、ＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合物又はＩｇＧの２５℃での動態を分析した。抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５で１０μｇ／ｍｌに希釈し、アミンカップリングを使用して、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒを使用してＳＰＲセンサープリズムＣＭＤ ２００Ｍチップ（ＸａｎＴｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ、ドイツ）に直接固定した。ランニングバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈した抗原を様々な濃度で３分間注入し、１０分間解離させ、１０ｍＭグリシンｐＨ２．５を使用してサイクル間で再生した。抗原は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｍＩＬ－１３、４１３－ＭＬ－０２５／ＣＦ；ｍｐＩｇＲ、２８００－ＰＧ－０５０；ｈｐＩｇＲ、２７１７－ＰＧ－０５０；ｈＦｃαＲＩ、３９３９－ＦＡ－０５０）、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ｈＨＥＲ２、１０００４－Ｈ０８Ｈ）、又はＧｅｎｅｎｔｅｃｈからのものであり、種特異的β－２ミクログロブリン（ｍ／ｈＦｃＲｎ）と共発現させた。データをＷａｓａｔｃｈ動的ソフトウェアツールで処理した。

Ｂｉａｃｏｒｅによる抗体動態。抗ＩＬ－１３又は抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ２ｍ２抗体の結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴を用いて測定した。全ての動態実験は、３０μＬ／分の流速で、２５℃で、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び１ｍＭ ＥＤＴＡのランニングバッファーを用いて行った。Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からのＦａｂ Ｂｉｎｄｅｒを、アミンベースのカップリングを介してＣＭ５センサーチップに固定化した。５０～１００ｕｇ／ｍＬの濃度のＩｇＡ抗体を５ｕＬ／分で２１０秒間捕捉した。抗体に結合する組換えヒトＦｃαＲＩ抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３９３９－ＦＡ－０５０）を、１０００ｎＭ、３３３ｎＭ及び１１１ｎＭの濃度を使用して測定した。結合のためのセンサーグラムを、９０秒の注入時間、続いて１２０秒の解離時間、及びグリシンｐＨ２．１の２回の６０秒の注入によるサイクル間の表面の再生を用いて記録した。１：１ラングミュア結合モデルを使用して、反応速度及び結合定数を計算した。

結果：
ＩｇＡオリゴマー形成に影響を及ぼす因子。単量体ＩｇＡの組換え産生はよく理解されており、ＩｇＧの産生と同様に、軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）の共発現によって達成することができる。対照的に、ポリマーＩｇＡのアセンブリは、ＬＣ、ＨＣ及び連結鎖（ＪＣ）の共発現を必要とし、得られるＩｇＡオリゴマー状態はあまり特性評価されていない。ＩｇＡオリゴマーの集合プロセスのより良い理解を得るために、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ１．Ｐ２２１Ｒ（ジスルフィド安定化ＬＣ－ＨＣペアリング）及びＩｇＡ２ｍ２（図１Ａ）を含む様々なヒトＩｇＡアイソタイプ及びアロタイプの発現を特性評価した。抗マウスインターロイキン－１３（ｍＩＬ－１３）抗体のマウス可変ドメインを、ヒトカッパＬＣ定常ドメイン及びＩｇＡ ＨＣ定常ドメインとのキメラとしてクローニングした。次いで、キメラＬＣ及びＨＣをヒトＪＣの存在下及び非存在下で共発現させた（図１Ｂ）。プロテインＬによる親和性精製後、同時トランスフェクトＪＣの非存在下で産生されたＩｇＡは、３０ｍＬのＥｘｐｉ２９３Ｔ一過性発現から比較的純粋な単量体を生じた。これらの実験では、細胞に等しい質量量のＬＣ及びＨＣ ＤＮＡをトランスフェクトした。対照的に、等しい質量量のＬＣ、ＨＣ及びＪＣ ＤＮＡのトランスフェクションは、ＩｇＡ単量体、二量体、及び３～５個のＩｇＡ単量体を含有するポリマーに対応する様々なオリゴマー種を産生した（図１Ｄ及び図２Ａ～図２Ｃ）。ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１及びＩｇＡ２ｍ１．Ｐ２２１Ｒは主に二量体ＩｇＡを産生することが判明したが（図２Ａ～Ｂ）、ＩｇＡ２ｍ２はほぼ等量の二量体及びポリマーを産生した（図２Ｃ）。オリゴマーの同様の分布が、リットルスケールにスケールアップしたときにＣＨＯ一過性発現において観察された。

二次精製によるポリマーからのＩｇＡ二量体の分離は、大規模では困難であることが判明した。二量体形成に向かってアセンブリを偏らせようと試みて、ＬＣ及びＨＣ ＤＮＡ量の両方に対するＪＣ ＤＮＡの量を増加させて、ＪＣ発現レベルの増加を促進した。これにより、二量体種の相対的割合が増加し、ポリマー種の相対的割合が減少した（図２Ａ～図２Ｃ；図１５～図１７及び図２０も参照されたい。）。逆に、ＬＣ及びＨＣ ＤＮＡ量の両方と比較してＪＣ ＤＮＡの量を減少させると、高次ポリマー（三量体／四量体／五量体）の割合が増加した（図１８及び図２１～図２３）。ＪＣ ＤＮＡ量に基づいてオリゴマー種に影響を及ぼす能力は、ＩｇＡ２ｍ２種について最も顕著であった。更に、分泌成分、連結鎖、軽鎖及び重鎖の同時トランスフェクションは、分泌成分を含まない連結鎖、軽鎖及び重鎖の同時トランスフェクションと比較して、より高次のオリゴマーを生じた（図２９）。

ＩｇＡ２ｍ２がＩｇＡ１又はＩｇＡ２ｍ１よりも大きなオリゴマーを形成する傾向が高い理由を理解するために、異なるアイソタイプ／アロタイプに対するＨＣテールピースのアミノ酸配列を比較した。ＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ１テールピースの配列は同一であるが、ＩｇＡ２ｍ２は２つの残基が異なる。残基４５８及び４６７は両方ともＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ１中のバリンであるが、ＩｇＡ２ｍ２はそれぞれこれらの位置にイソロイシン及びアラニンを有する（図１Ａ、アスタリスク）。したがって、これらの２つのアミノ酸の相違が、より大きなオリゴマーを形成する組換えＩｇＡ２ｍ２の独特の素因を説明し得るかどうかを調べた。実際、イソロイシンがＩｇＡ１又はＩｇＡ２ｍ１の位置４５８でバリンに置換された場合、より多くのポリマーが生成され、これは残基４６７でアラニン又はバリンとは無関係であった（図２Ｄ）。逆に、ＩｇＡ２ｍ２の位置４５８をイソロイシンからバリンに変更すると、ポリマー種の含有量は減少し、二量体含有量が増加した。

分泌成分又は連結鎖とのジスルフィド結合を防ぐために、ＩｇＡ２ｍ２抗体の重鎖中の特定のシステイン残基の変異を生成し、オリゴマー形成に対するそのような変異の効果を決定するために分析した。Ｃｙｓ３１１のセリンへの変異は分泌成分とのジスルフィド結合を妨げ、Ｃｙｓ４７１のセリンへの変異は連結鎖とのジスルフィド結合を妨げる。図２８Ｂに示すように、連結鎖を軽鎖及び重鎖に付加する場合、ＩｇＡ２ｍ２二量体及び高次オリゴマー形成にはＣ３１１ではなくＣ４７１の変異が必要であった。

グリコシル化は、ＩｇＡオリゴマー化において役割を果たすことが知られている（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：７２４－３２（１９９７））。したがって、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ２の各Ｎ結合型グリコシル化部位を除去するように変異を作製した。ＩｇＡ１又はＩｇＡ２ｍ２のテールピース内のＮ結合型グリコシル化部位を除去した４つの別々の変異（Ｎ４５９Ａ／Ｇ／Ｑ又はＳ４６１Ａ）も、生成されたポリマーの量を増加させたが、テールピースの外側のグリコシル化部位を除去する変異はオリゴマー形成を変化させなかった（それぞれ図２Ｅ及び図２Ｆ；図３８も参照）。したがって、トランスフェクションにおけるＤＮＡ比の調節に加えて、テールピースアミノ残基４５８にイソロイシンを有するか、又はＩｇＡテールピースのＮ結合型グリコシル化を防止することによって、ＩｇＡポリマー形成を増加させることができる。

ＩｇＡ単量体及びオリゴマーの大規模精製及び生物物理学的特性評価。小規模発現によって得られたＩｇＡオリゴマー形成への洞察を使用して、単量体、二量体及び四量体ＩｇＡをＣＨＯ一過性発現を使用してスケールアップした。ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ１．Ｐ２２１Ｒ及びＩｇＡ２ｍ２の単量体及び二量体種、並びにＩｇＡ２ｍ２の四量体種を単離した（図３Ａ）。これらの試料の非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＩｇＡ単量体、二量体及び四量体についてそれぞれ約１５０ｋＤａ、約３１０ｋＤａ及び約６１０ｋＤａの予想質量と一致する分子量の主なバンドを示した（図３Ｂ）。これらの予想質量は、グリコシル化を伴わないアミノ酸配列に基づいており、オリゴマー当たり１つのＪＣの組み込みを仮定した。精製オリゴマー種のモル質量もＳＥＣ－ＭＡＬＳによって測定し、二量体及び四量体ＩｇＡの予想質量と一致することが分かった（表２）。精製ＩｇＡ試料の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、それぞれ約２５ｋＤａ及び約５５ｋＤａの単量体のＬＣ及びＨＣバンドの存在が確認されるが、オリゴマー試料では、２５ｋＤａ直下のＪＣのバンドも検出することができる（図３Ｂ）。ＬＣ、ＨＣ及びＪＣの同一性を、還元及び酵素的脱グリコシル化後に質量分析によって更に確認した（図１８Ｅ）。単離された種のオリゴマー状態を更に検証するために、陰性染色電子顕微鏡法（ＥＭ）も使用した。ＩｇＡ２ｍ２二量体（図３Ｃ）及び四量体（図３Ｄ）の陰性染色画像は、それぞれ２つ又は主に４つのＩｇＡ分子の存在を確認する。二量体では、２つのＩｇＡ分子がそれらのＦｃドメインによって尾部から尾部に連結されて細長い粒子になるが、四量体では、４つのＦｃドメイン間の相互作用により、４つのＩｇＡ分子のコンパクトな複合体が生じる。両方の試料の生画像は、良好に挙動した単分散粒子の存在を示した（図８）。

タンパク質を、モル質量及び多分散性測定のためにＷｙａｔｔ ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ／Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器に連結されたＷａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ２００ Å分析サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムに注入した。ＩｇＡ分子の予測分子量（ＭＷ）は、アミノ酸組成のみに基づいており、二量体又は四量体あたり１つのＪＣの取り込みを想定しており、潜在的なＮ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンを考慮していない。

抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ単量体、二量体及び四量体は、抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＧ１と同様の親和性でマウスＩＬ－１３に結合し（表３及び図１９）、Ｆａｂ領域が組換えＩｇＡにおいて適切に折り畳まれ、機能的であることを示している。予想されたように、マウス及びヒトｐＩｇＲ結合はＩｇＡオリゴマーについてのみ見られたが、単量体及びオリゴマーの両方の抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡはヒトＦｃαＲＩに対して同様の親和性で結合した（表３）。更に、ＣＨＯ細胞又はＥｘｐｉ２９３細胞における一過性発現から精製されたＩｇＡ２ｍ２は、マウス及びヒトｐＩｇＲに対して同様の結合を示した（図３６Ａ）。ｐＩｇＲ結合能のために、全てのＩｇＡオリゴマーは、ヒトｐＩｇＲを異所性に発現するＭＤＣＫ細胞株を使用してインビトロでトランスサイトーシスすることができたが、単量体はできなかった（図４Ａ及び図７Ｅ）。更に、ＩｇＡ単量体及びオリゴマーは全て、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって測定した場合、抗ｍＩＬ－１３ヒトＩｇＧ１と比較して安定性の増加、及びＩｇＧ１ Ｆａｂ断片と比較して安定性の類似又は増加を示した（図４Ｂ）。

組換えＩｇＡの薬物動態プロファイル及び体内分布。開示された組換えＩｇＡオリゴマーの血清濃度時間プロファイルを分析し、それらが組換え単量体を使用して以前に報告されたデータ（図５Ａ及び表４）に匹敵すると判断した（Ｂｏｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｒｏｕｗｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６）及びＬｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １１２：４１７０（２０１７））。組換えＩｇＡオリゴマーの単回投与後に非常に急速な血清クリアランス（＞２００ｍＬ／日／ｋｇ）が観察された。血清精製ヒトＩｇＡ単量体は、全体的なクリアランスがより遅く、血清ＰＫプロフィールは、高度にシアリル化されたＩｇＡ単量体について以前に報告されたものと概ね一致していた（Ｒｏｕｗｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６））。血清濃度時間プロファイルを特徴付けることに加えて、Ｉ－１２５及びＩｎ－１１１の二重標識抗体を用いたマウスにおける放射性標識体内分布研究も行った。二重トレーサ手法は、以前に記載されたように（図５Ｂ～図５Ｃ）、リソソーム分解前のインタクト抗体（Ｉ－１２５）と内在化／異化抗体（Ｉｎ－１１１マイナスＩ－１２５）とを区別する能力を提供した（Ｂｏｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２１：２１５３－６３（２０１０），Ｍａｎｄｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １７：７７６－８５（２０１８）及びＲａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ９：１３７９－８８（２０１７））。簡潔には、ヨウ素は細胞から急速に拡散し、ヨウ素化抗体がリソソーム分解を受けた後に除去されるが、Ｉｎ－１１１標識抗体は、リソソーム分解後にＩｎ－１１１付加物の細胞間蓄積を示す。ＩｇＡ抗体はＩｇＧ１と比較して非常に迅速に除去されたため、生の組織値は間質濃度と血管濃度の両方を表すので、組織分布データの直接比較は困難である。したがって、インタクトな抗体分布データを、組織中の間質濃度のみを表すように以前に記載されたように血液補正した（Ｂｏｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １１：１５９１－８（２０１４））。ＩｇＧ１と比較してインタクトＩｇＡオリゴマーのわずかな濃縮が、低いレベルであるが（図５Ｂ）、肝臓、胃、小腸、大腸及び皮膚において１時間後に観察された（Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６０：２６７－７２（２００４）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８３：２３５－４３（２０１６））。高レベルのＩｇＡ分解もまた、肝臓及び小腸における１時間の投与後に研究されたフォーマットにわたって見られた（図５Ｃ）。フォーマット間で観察された総血中濃度の差を説明するために、血漿濃度に対する個々の組織の比も記載した（図９）。１日後、インタクトＩｇＡ抗体はほとんど組織に残らず（図１０）、肝臓における最大の異化作用が検出された（図１１）が、小腸における異化作用は、Ｉｎ－１１１が後の時点で腸細胞にあまり蓄積しないので、検出されなかった可能性がある（Ｂｏｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １６８：４４５－５７（２０１３））。特定の理論に束縛されるものではないが、ＩｇＡの分解及び最終的なクリアランス機構を減少させると、ＩｇＧと比較して粘膜組織へのＩｇＡ分子の取り込みを更に改善できると仮定された。

単量体型ＩｇＡ分子のＮ結合型グリカン上のシアリル化含量は、特異的グリカン受容体を介した抗体クリアランスと負に相関することが報告されている（Ｒｏｕｗｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６））。したがって、開示されたＩｇＡ分子を分析して、それらの全体的なシアリル化含有量を決定した。グリカンを、複合体及びシアリル化がＩｇＡ分子にとって最も望ましいプロセシングのレベルに基づいてカテゴリーに分類した（図６Ａ）。ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ１．Ｐ２２１Ｒ、ＩｇＡ２ｍ２、並びにＩｇＡ２ｍ２単量体及び四量体の組換え生成された二量体は、約２０～５０％シアリル化されていた（図６Ｂ、図２５、図２６、及び表５）。これは、ＩｇＡ分子が、グリカン受容体によって認識され得る不完全にプロセシングされたグリカンを含有することを示している。更に、ＩｇＡ２ｍ１二量体上の各部位におけるシアリル化含有量を調べたところ、ＪＣ上の部位を含む全ての部位が、不完全にプロセシングされたグリカンを含有していることが見出され、不完全なグリカンプロセシングがただ１つの特定の部位で起こっていることを示唆した（図６Ｃ及び表６）。開示された組換えＩｇＡ分子とは対照的に、ヒト血清から精製されたＩｇＡは、シアリル化含有量が９５％であり（図６Ｂ及び表５）、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによって測定すると単量体であった。血清ＩｇＡは主に単量体であることが知られているため（Ｋｅｒｒ（１９９０））、シアリル化含有量は抗体の全身曝露と正に相関するので、高度にシアリル化された分子が濃縮され得る。特定の理論に束縛されるものではないが、ヒト精製ＩｇＡ単量体のこの増加したシアリル化レベルは、組換えＩｇＡ単量体と比較してマウスにおける分子の血清クリアランスの減少と相関すると考えられる。実際、これは真であることが実証され、肝臓における特異的グリカン受容体への結合がＩｇＡ単量体の重要なクリアランス機構であり得ることを示唆している（図５Ａ、図２５及び図２７）。

濃度－時間曲線下のＡＵＣ_ｌａｓｔ＝面積、最後の測定可能な濃度；ＣＬ＝クリアランス；Ｃ_ｍａｘ＝観察された最大濃度；ＩＶ＝静脈内；^＃Ｂａｌｂ／ｃマウスに１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶボーラスを投与した。注：全てのマウスＰＫデータについてまばらなＰＫ分析を行ったので、１群あたりの個々のマウスからのデータをプールし、ＳＤは報告しなかった。

ｐＩｇＲ結合が低下したＩｇＡ変異体の生成。ｐＩｇＲ結合に対する変異の効果を決定するために、ＩｇＡ２ｍ２の変異体を作製した。アミノ酸Ｙ４１１、Ｖ４１３及びＴ４１４のアラニンへの変異（本明細書では「４１１－４１４ＡＡＡ」と呼ぶ）、Ｐ４４０Ｒ変異、Ｃ３１１Ｓ変異又はそれらの組合せを有するＩｇＡ２ｍ２変異体を作製した。そのような変異体の発現レベルを図３０Ａに示す。図３０Ｂは、小規模精製抗ＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２変異体のＳＥＣ特性評価を提供する。図３０Ｃ～図３０Ｄに示されるように、アミノ酸Ｙ４１１、Ｖ４１３及びＴ４１４の変異を有するＩｇＡ２ｍ２変異体はマウスｐＩｇＲ又はヒトｐＩｇＲに結合しないが、Ｐ４４０Ｒ変異体はマウスｐＩｇＲに対する親和性の１０倍の低下及びヒトｐＩｇＲに対する結合能の顕著な喪失をもたらした。更に、アミノ酸４１１、４１３及び４１４の変異を有するＩｇＡ２ｍ２変異体もＦｃαＲＩに結合しない（図３０Ｅ）。

ＩｇＡ抗体のシアリル化含有量を増加させるための細胞培養条件の変更。ＩｇＡ抗体を発現する細胞の培養条件を改変して、抗体のシアリル化含有量を増加させた。試験した細胞培養条件を図３１Ａに提供する。図３１Ｂに示すように、ＩｇＡ２ｍ２抗体のシアリル化は、ガラクトース及びＮ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮａｃ）の存在下でシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）及びガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）を添加すると増加し、７日間の採取を行った。

グリコシル化部位及びＦｃＲｎ操作による組換えＩｇＡの薬物動態プロファイルの改善。マウスにおける組換えポリマーＩｇＡのクリアランスを減少させるために、２つの並行アプローチを行った。最初に、ＩｇＡ２ｍ２中の５つ全てのＮ結合型グリコシル化モチーフ及びＪＣ中の単一部位を突然変異誘発によって除去して、グリカンを含まない分子（アグリコシル化）を生成した（図７Ａ及び図２５）。アグリコシル化ＩｇＡポリマーは、グリカン受容体によって認識されず、グリカン受容体媒介クリアランス機構とは無関係の薬物動態の研究を可能にする。図３６Ｂ～図３６Ｄに示されるように、個々のＩｇＡ２ｍ２グリコシル化変異体は、マウスｐＩｇＲ及びヒトｐＩｇＲに対して同様の結合を有する。ＩｇＡ２ｍ２中のＮ結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔを除去するために、ＮをＡ／Ｇ／Ｑに変異させるか、Ｓ／ＴをＡに変異させるか、モチーフをアグリコシル化ＩｇＡ１配列に戻した３つの場合、これが起こる（図１Ａ）。ＪＣ残基Ｎ４９をＡ／Ｇ／Ｑに変異させるか、又はＳ５１をＡに変異させた。個々のＩｇＡ２ｍ２の変異Ｎ１６６Ａ、Ｓ２１２Ｐ、Ｎ２６３Ｑ、Ｎ３３７Ｔ．Ｉ３３８Ｌ．Ｔ３３９Ｓ及びＮ４５９Ｑ、並びにＮ４９Ｑ ＪＣの変異は、最高レベルの一過性発現を与えるが、ＩｇＡ２ｍ２の５つ全てのグリコシル化部位を除去する変異の組合せは、不十分な発現をもたらし、Ｊ鎖Ｎ４９Ｑ変異の更なる付加は、それを完全に無効にしたことが見出された。図２４Ａ～図２４Ｃも参照されたい。キメラ免疫グロブリンは、単一の種に由来するものと比較して、哺乳動物細胞においてより低い発現レベルを示すことが多い。したがって、マウス抗ｍＩＬ１３可変ドメインをヒト化抗ＨＥＲ２に切り替えてヒト化ＩｇＡを生成したが、これは一過性発現レベルを改善しなかった。したがって、オリゴマー種の混合物として精製されたアグリコシル化ヒト抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ２ｍ２ポリマーの発現レベルを増加させるために、ＣＨＯ標的化インテグレーション（ＴＩ）安定細胞株を作製した。

第２に、リソソーム分解を減少させる方法としてＦｃＲｎ結合を利用するために、２つのＩｇＧ１－ＩｇＡ Ｆｃ融合物を操作した（図７Ｂ）。以前の研究は、このアプローチがＩｇＡ単量体血清クリアランスをＩｇＧ１に匹敵するレベルまでレスキューすることを示唆した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ａｎｄ Ｂｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５））。最初に、以前に報告されたＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｐ２２１Ｒ Ｆｃ融合の二量体及び四量体バージョン（Ｂｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５））を作製したが、これらは４日目にマウス血漿中で不安定性を示すことが観察された（図７Ｃ）。一次切断産物は、完全長抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ１（トラスツズマブ）と同様の時間に分析ＳＥＣに溶出し、この不安定性は、ＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｐ２２１Ｒ Ｆｃ接合部で切断するエンドプロテアーゼによって引き起こされたことを示唆した。接合部のアミノ酸配列を検査し、フリン様切断部位に似た正電荷を帯びた残基のストレッチを同定した（図１２）。タンパク質分解的切断を軽減するために、接合部におけるこれらの正に荷電した残基を、ＩｇＧ１重鎖のＣ末端Ｋ４４７の除去によって除去し、ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃを、Ｐ２２１、天然のＩｇＡ２ｍ１残基（Ｐ２２１Ｒ変異の代わり）、又はＩｇＡ２ｍ１ヒンジを欠失させるＣ２４２のいずれかで開始させた（図１２及び図３４Ａ）。Ｃ２４２ Ｆｃ開始もまた、それがＩｇＡ１ Ｆｃ結晶構造コンストラクトの最初の残基であるので含まれており、そのため、安定な切断型タンパク質であると推定された（Ｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３：６１４－２０（２００３））。再操作されたＩｇＧ１ΔＫ－Ｐ２２１ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ及びＩｇＧ１ΔＫ－Ｃ２４２ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合物が二量体として産生された場合、両方ともマウス血漿中で最大４日間安定であることが見出された（図７Ｃ）。図３４Ｂは、完全長抗ＩＬ－１３ ＩｇＧ１－ＩｇＡ Ｆｃ融合物の一過性発現データを提供する。操作された融合分子のいくつかは、ＩｇＧ１及び元のコンストラクトと比較して改善された発現を示す（図３４Ｂ及び図３７Ａ）。更に、図３３Ａに示すように、ＬＣ及びＨＣ ＤＮＡの量と比較してＪＣ ＤＮＡの量を増加させると、高次オリゴマー種よりも多くの二量体種が生成された。

下部ヒンジ残基Ｅ２３３又はＬ２３４のＩｇＧ１をＣ２４１又はＣ２４２のＩｇＡ１のＦｃに融合することによって、ＩｇＧ１－ＩｇＡ１融合物も生成した。図３７Ｂに示すように、ＩｇＧ１－ＩｇＡ１融合物は、ＩｇＡ１と同様に、主に二量体として発現した。更に、ＩｇＧ１－ＩｇＡ１融合物は、ＩｇＡ１と同様の様式でヒト及びマウスｐＩｇＲ及びヒトＦｃαＲＩに結合した（図３７Ｃ）。

操作されたＩｇＡ抗体及びＩｇＧ１－ＩｇＡ融合分子を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって安定性について分析し、ＩｇＡ１二量体と比較して安定性の損失がないことを確認した（図３２）。

操作されたＩｇＡ抗体及びＩｇＧ１－ＩｇＡ融合分子を、全体的なグリカン含有量、抗原結合及び受容体結合について更に特性評価した。アグリコシル化抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ２ｍ２ポリマーは実際にグリコシル化を有していなかったが、抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＧ１ΔＫ－Ｐ２２１ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ及びＩｇＧ１ΔＫ－Ｃ２４２ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合物は、約２０％の複合体シアリル化グリカンしか含まなかった（図１３及び表８）。アグリコシル化抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ２ｍ２ポリマーは、ヒト（ｈ）ＨＥＲ２、マウス（ｍ）ｐＩｇＲ及びｈｐＩｇＲに対して、グリコシル化ＩｇＡ２ｍ２四量体と同様の結合親和性を有するが、Ｗａｓａｔｃｈ ＳＰＲアッセイによって測定したところ、ＩｇＡ特異的ｈＦｃ受容体ｈＦｃαＲＩには結合しなかった（表７；図３３Ｂ～図３３Ｃも参参照）。興味深いことに、ＩｇＡ２ｍ２ ＨＣ上にグリコシル化を欠くが、Ｊ鎖上にグリコシル化を保持するＩｇＡ２ｍ２四量体も、Ｗａｓａｔｃｈ ＳＰＲアッセイによって決定されるようにｈＦｃαＲＩに結合することができず（図３５Ａ～図３５Ｂ）、ＩｇＡＨＣのグリコシル化が受容体結合に必要であることを示唆した。しかしながら、製薬業界で一般的に使用されているＳＰＲシステムであるＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲシステムを使用して示されているように、ＩｇＡポリマーのグリコシル化状態はｈＦｃαＲＩへの結合に影響を及ぼさなかった（図５２Ａ～図５２Ｂ）。図５２Ａ～図５２Ｂに示されるように、アグリコシル化抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ２ｍ２ポリマー（「ｘＨＥＲ２ ４Ｄ５．ＩｇＡ２ｍ２四量体Ｎ１６８Ａ．Ｓ２１４Ｐ．Ｎ２５２Ｑ．Ｎ３２６Ｔ．Ｉ３２７Ｌ．Ｔ３２８Ｓ．Ｎ４６１Ｑ，Ｊ－Ｎ７１Ｑ」と称する）及び部分的に脱グリコシル化された抗ＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２オリゴマーは、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲアッセイによって測定されるようにｈＦｃαＲＩ結合を保持した。特定の理論に束縛されるものではないが、２つのＳＰＲシステム、すなわちＷａｓａｔｃｈ及びＢｉａｃｏｒｅシステムから得られた結果の違いは、一部には、方法に開示されているように、ＳＰＲシステムで使用されるチップに抗体を固定するために使用される異なる戦略に起因し得る。

更に、抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＧ１ΔＫ－Ｐ２２１ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ二量体及びＩｇＧ１Ｋ－Ｃ２４２ ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ二量体の両方は、抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＧ１と同様のｍＩＬ－１３、ｍＦｃＲｎ及びｈＦｃＲｎに対する結合親和性を有し（表７）、またＷａｓａｔｃｈ ＳＰＲアッセイによって測定した場合、ＩｇＡ２ｍ１二量体と同様のｍｐＩｇＲ、ｈｐＩｇＲ及びｈＦｃαＲＩに対する結合親和性を有していた（表３及び表７）。したがって、ＩｇＧ１－Ｉｇ２ｍ１Ａ Ｆｃ融合物は、ＩｇＧ及びポリマーＩｇＡの両方の所望の属性を保持する。

インビトロｐＩｇＲ媒介トランスサイトーシス及び血清濃度時間プロファイルを、これらの新たに生成されたフォーマットの両方のマウスにおいて測定した。ＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合物は、マウスにおける全体的なＩｇＡ血清曝露において最も顕著な改善を示した（図７Ｄ、図３４Ｃ及び表９）が、最も高いレベルのインビトロトランスサイトーシスを示したアグリコシル化ＩｇＡ２ｍ２ポリマーと比較して、最も低いレベルのインビトロトランスサイトーシスを示した（図７Ｅ）。

濃度－時間曲線下のＡＵＣ_ｌａｓｔ＝面積、最後の測定可能な濃度；ＣＬ＝クリアランス；Ｃ_ｍａｘ＝観察された最大濃度；ＩＶ＝静脈内。注：全てのマウスＰＫデータについてまばらなＰＫ分析を行ったので、１群あたりの個々のマウスからのデータをプールし、ＳＤは報告しなかった。

考察
ＩｇＡは、ＩｇＧによって提供される現在の機能性を超えてモノクローナル抗体の治療範囲を拡大する可能性を有する。部分的には、これは、ＩｇＡの汎用性によって単量体種とポリマー種の両方を形成することが可能である。過去数年にわたって、単量体型ＩｇＡ（Ｌｅｕｓｅｎ（２０１５），Ｄｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（２０１６），Ｖａｓｉｌｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ（２０１５）及びＶｉｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ（２０１５））の組換え産生に著しい進歩がみられ、Ｎ結合型グリカンのシアリル化含量が増加し、血清クリアランスの改善をもたらした十分に特性評価された材料を単離するための堅固な経路が提供されている（Ｒｏｕｗｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６））。単量体ＩｇＡの強力な細胞傷害特性は腫瘍学的適応症にとって魅力的な特徴であるが、ポリマーＩｇＡは、ｐＩｇＲ媒介性トランスサイトーシスを介して上皮障壁を超えて標的に到達する必要がある。本明細書中に記載される研究の前に、組換え作製された単量体及びオリゴマーの混合物のみを、トランスサイトーシスを研究するインビボ実験のために使用した（Ｏｌｓａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）及びＲｉｆａｉ ｅｔ ａｌ．（２０００））。この実施例に記載される実験は、二量体及び四量体ＩｇＡの濃縮を可能にする堅牢な発現及び精製経路を確立する。特に、トランスフェクションに使用されるＪＣ ＤＮＡの量又はＩｇＡ尾部領域のグリコシル化状態を調節することにより、オリゴマー種の分布に影響を及ぼすことができた。興味深いことに、ＩｇＡ尾部上のＮ結合型グリコシル化部位は、種間で極めて保存されている唯一の部位であり（図１４）、インビボで高次ＩｇＡオリゴマー形成を制御する方法を提供する。組換えＩｇＡの精製には、プロテインＬ親和性クロマトグラフィを使用した後、ＨＰＬＣ－ＳＥＣを使用し、四量体から二量体を容易に分離することができた。

組換え発現されたＩｇＡ単量体上のシアリル化レベルを増加させると、グリカン受容体媒介異化を克服することによって血清クリアランスが減少することが以前に実証されている（Ｒｏｕｗｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６））。代替戦略として、オリゴマーＩｇＡの血清クリアランスに対するグリカンの寄与が排除され、完全にアグリコシル化ＩｇＡ２ｍ２ポリマーが産生された。Ｎ結合型グリカンの欠如は、表面プラズモン共鳴によって評価されるように、ｐＩｇＲへの結合に影響を及ぼさなかった。驚くべきことに、インビトロＭＤＣＫトランスサイトーシスアッセイでは、アグリコシル化種は、グリコシル化四量体又は二量体と比較してトランスサイトーシスを有意に改善したことが観察された。この改善は、抗体Ｆｃ領域からＮ結合型グリカンを除去したが、それでもなおマウスＪ鎖上に炭水化物が存在するヒトＩｇＡ１二量体を用いた以前の研究では観察されなかった（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９７））。特定の理論に束縛されるものではないが、１つの説明は、グリカンの欠如がグリカン受容体への結合を排除し、したがってｐＩｇＲ結合を介して非摂動的でより効率的なトランスサイトーシスを提供することである。興味深いことに、ＦｃαＲＩへの四量体ＩｇＡ２ｍ２の結合は、グリコシル化に依存しており、これは、少ない数のグリコシル化部位を含むように操作された単量体ＩｇＡ２ｍ１について観察された結合に対する効果の欠如とは対照的であった。ポリマーＩｇＡの細胞傷害効果は分析されなかったが、ＦｃαＲＩを活性化することなくトランスサイトーシスすることができるＩｇＡ治療薬は、好中球移動からの炎症誘発性応答を防ぐので、炎症性疾患に望ましい（Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２６８：１２３－３８（２０１５））。

本明細書に開示される実験で組換え生産されたグリコシル化ＩｇＡオリゴマー及び単量体は、単量体及びポリマーＩｇＡについて以前に観察されたものと同様に血清から迅速に除去された（Ｒｏｕｗｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６）及びＣｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９７））。速いクリアランスは、グリカン受容体への潜在的な結合及びその後のリソソームにおける分解に起因していた。グリコシル化ＩｇＡを用いた体内分布研究はこの結論を支持し、肝臓及び小腸で最も異化作用があることを示した。グリカンを有することの寄与をよりよく理解するために、グリカンを含まないＩｇＡポリマー（アグリコシル化）を生成し、そのインビボＰＫプロフィールをグリコシル化バージョンと直接比較した。アグリコシル化ＩｇＡ２ｍ２ポリマーは、グリコシル化ポリマーと比較して、全体的なマウス血清曝露に顕著な差を示さなかった（２倍未満）。これは、Ｎ結合型グリカンを有することが、マウスにおけるＩｇＡポリマーのクリアランスへの寄与において最小限の役割を果たすことを示唆している。アグリコシル化ＩｇＡオリゴマーが血清クリアランスを改善しない理由を理解するために更なる研究が必要であるが、ｐＩｇＲ媒介性トランスサイトーシス及び／又はクリアランスは、マウスにおける全体的な血清濃度及びポリマーＩｇＡの運命を決定するのに重要な役割を果たし得ると考えられる。実際、ｐＩｇＲに対する四量体ＩｇＡの平衡結合親和性は、少なくともピコモル濃度範囲であり、豊富なｐＩｇＲ受容体への効率的な結合とそれに続くトランスサイトーシスを可能にする。しかしながら、分子の血清濃度時間プロファイル及びアグリコシル化ポリマーＩｇＡの配置をよりよく解釈するためには、組織分布プロファイルを調べる詳細な体内分布研究が必要であろう。げっ歯類におけるポリマーＩｇＡ分子の薬物動態特性及び生体内分布を研究するための１つの重要な注意点は、ｐＩｇＲの発現パターンがげっ歯類とヒトとで異なり、最終的な臨床翻訳を混乱させる可能性があることである。特に、げっ歯類及びウサギの肝細胞におけるｐＩｇＲの高発現は、ヒトでは起こらないと考えられているポリマーＩｇＡ （Ｄａｎｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９））の胆汁クリアランス機構に関連しており、ｐＩｇＲ発現は胆管の細胞で代わりに見られる（Ｔｏｍａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９８８））。したがって、ｐＩｇＲがマウスにおけるポリマーＩｇＡ分子の生体内分布及びクリアランスにおいて果たす正確な役割を別々に評価する必要がある。

加速された血清クリアランスを回避し、曝露を改善するためにとられた代替戦略は、ＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合物の操作によるものであった。ＦｃＲｎに結合する能力は、エンドソームにおけるリサイクルを可能にし、したがってリソソーム分解のための選別を回避する。単量体ＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合物を用いた以前の報告は、ＩｇＧに匹敵する血清クリアランスを報告した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１７）ａｎｄ Ｂｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５））。更に、アルブミン結合ペプチドに融合した単量体ＩｇＡについても薬物動態の改善が観察された（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８：８７－９８（２０１６））。ＩｇＡポリマーからグリカンを除去することによる大きな寄与は観察されなかったため、グリコシル化融合タンパク質が産生された。二量体ＩｇＧ１－ＩｇＡ２ Ｆｃ融合物は全体的な血清曝露の改善を示したが、単量体ＩｇＧ－ＩｇＡ Ｆｃ融合物について観察されたＩｇＧに匹敵するものではなかった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１７）ａｎｄ Ｂｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５））。表面プラズモン共鳴により、二量体ＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ融合物は、ＭＤＣＫモデルにおいてインビトロでのトランスサイトーシスが減少しているにもかかわらず、ＦｃＲｎ及びｐＩｇＲに結合することができることが実証された。ＦｃＲｎへの結合は最終半減期を延長したが、ｐＩｇＲとのＩｇＧ１－ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ二量体相互作用は、特に初期段階でクリアランス機構を提供し、ｐＩｇＲ媒介性トランスサイトーシス及び／又はクリアランスをもたらし、ＩｇＧと比較して血清濃度の低下に寄与した。

血清中のＩｇＡは、主に骨髄細胞から分泌されるＩｇＡ１単量体で構成され、一方、ポリマーＩｇＡ２は、トランスサイトーシスの位置で粘膜固有層の形質細胞から分泌される（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．１１６：３－１０（２００５））。ポリマーＩｇＡとｐＩｇＲとの間の高い親和性は、循環からのポリマーＩｇＡの迅速な捕捉を自然にもたらし、ＩｇＡ抗原複合体（Ｓｈｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：３９０４－１３（１９９５））としての循環からの有害抗原の効果的なクリアランスを提供し、治療状況では、薬物活性を所定の組織及び短期間に制限するために活用することができ、これはサイトカイン受容体をアゴナイズする場合に特に有益であり得る。マウスの血清からのｐＩｇＲを介したポリマーＩｇＡの迅速なクリアランスは、ｐＩｇＲ欠損ＮＯＤマウスの血清中のＩｇＡ濃度の約２０倍の増加によって更に裏付けられる（Ｓｉｍｐｆｅｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ０１２１９７９（２０１５））。

実施例２：組換えＩｇＡ抗体の精製
カッパ軽鎖を含有する組換えＩｇＡを、Ｃａｐｔｏ Ｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを使用して細胞培養上清から捕捉された分泌タンパク質及び親和性としてＣＨＯ細胞において発現させた。捕捉後、カラムを５カラム容量（ＣＶ）のＴｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＮａＮ３）、エンドトキシンを除去するための２０ ＣＶのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、２ｍＭ ＮａＮ３）、５ ＣＶのＴｒｉｓ緩衝液、５ ＣＶのＫＰ緩衝液（０．４Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＮａＮ３）及び１０ ＣＶのＴｒｉｓ緩衝液で洗浄した。ＩｇＡを１５０ｍＭ酢酸、ｐＨ２．７で溶出し、直ちに１／５体積の１Ｍアルギニン、０．４Ｍコハク酸塩、ｐＨ９．０で中和した。

親和性精製後、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して組換えＩｇＡを精製した。主に１つのオリゴマー状態（単一タイプのオリゴマーの＞９０％）が存在する組換えＩｇＡ試料については、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＳＥＣに使用し、続いて望ましくないオリゴマー状態の汚染物質を回避するためにピークシェービングを行った。ほぼ等量のオリゴマーの複合混合物（例えば、約４０％の二量体及び約６０％の高次ポリマー）を含むＩｇＡ試料について、いくつかの精製アプローチを試験した。図３９に示されるようなオリゴマーのヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２混合物を使用して、以下に記載される種々のタイプの精製を試験した。

ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １６／６００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＥＣでは、図４０に示すように、高次オリゴマーからＩｇＡ二量体を分離するための高分子量範囲の分解能が不十分であった。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６溶出プロファイルでは、ピーク１が約３５～３９ｍＬ付近で溶出し、これはカラムの空隙容積に対応し、したがって凝集したタンパク質である可能性が高い。ピーク２及びピーク３は、ピーク３がピーク２の後縁上の肩部として現れるように顕著に重なり合う。上記のＳＥＣ－ＭＡＬＳによるピーク２の前縁及びピーク３の後縁付近の画分の分析により、それぞれ７３５，０００ｇ／ｍｏｌ及び３７５，３００ｇ／ｍｏｌのモル質量が得られた。ヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２単量体の予想分子量は約１４８ｋＤａ、二量体約３１２ｋＤａ、三量体約４６０ｋＤａ、四量体約６０８ｋＤａ及び五量体約７５６ｋＤａである。これは、ピーク２及びピーク３が五量体、四量体、三量体及び二量体の混合物を含む可能性が高いことを示唆している。後に約６０ｍＬ付近で溶出するピーク４は、単量体ＩｇＡに対応している可能性が高い。

ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＨｉＬｏａｄ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ４００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかを使用するＳＥＣも、高次オリゴマーからのＩｇＡ二量体の分解能が不十分であった。ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するカチオン交換クロマトグラフィ、Ｑ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するアニオン交換クロマトグラフィ、及び５μｍ、７．８×７５ｍｍ ＰｒｏＰａｃ ＨＩＣ－１０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によってオリゴマーを分離する試みも成功しなかった。

対照的に、３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ４５０ Å ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して小規模精製を行うと、ヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２について図４１に示すように、ＩｇＡ二量体が高次オリゴマーから最も良好に分離された。分解能を最大にするために、１００μＬ以下の注入体積中の１ｍｇ未満の総タンパク質を、移動相として０．２Ｍアルギニン、０．１３７Ｍコハク酸塩、ｐＨ５．０を用いたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣを使用して１ｍＬ／分でカラムに流し、２００μＬの画分を収集した。次いで、画分を選択的にプールして、主に１つのオリゴマー状態を単離した。複数回の実行を行い、各実行からの所与のオリゴマーのプール画分を合わせた。

プールした画分に見られるＩｇＡ同一性、純度及びオリゴマー状態を、以下に記載される３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ２００ Å ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用するＳＥＣ－ＭＡＬＳ（図４２）、以下に記載されるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図４２）、以下に記載される陰性染色電子顕微鏡法（図４３及び図４４）及び以下に記載される質量分析（図４５）によって特性評価した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳは、３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ２００ Åサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムに、移動相として０．２Ｍアルギニン、０．１３７Ｍコハク酸塩、ｐＨ５．０を用いるＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣを使用して、１ｍＬ／分で組換えＩｇＡを注入することによって行った。Ｃａｐｔｏ Ｌ親和性精製からの組換え抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２の例示的な分析ＳＥＣプロファイルを図３９に示す。分析ＳＥＣカラムから溶出したタンパク質をＷｙａｔｔ ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ／Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器に直接注入して、所与の試料中に存在する様々なＩｇＡオリゴマー状態のモル質量及び多分散性を測定した。

抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２抗体については、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ２００ Å ＳＥＣカラムを用いた分析ＳＥＣで３つの主要なピークが同定された（図４２Ａ）。ヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２単量体の予想分子量は約１４８ｋＤａ、二量体約３１２ｋＤａ、三量体約４６０ｋＤａ、四量体約６０８ｋＤａ及び五量体約７５６ｋＤａである。全ての予想される分子量はアミノ酸配列組成に基づいており、糖組成はしばしば不均一で可変であるため、潜在的なＮ結合型又はＯ結合型グリカンを考慮していない。Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ４５０ Å ＳＥＣカラムで分離した後、ピーク１のモル質量は、ＭＡＬＳにより、６５８，０００ｇ／ｍｏｌ＋／－０．５１０％と決定された（図４２Ｂ）。これは、ピーク１が主に四量体ＩｇＡ２ｍ２であることを示唆している。ピーク２のモル質量は、３４３，７００ｇ／ｍｏｌ＋／－０．６４６％としてＭＡＬＳによって決定された（図４２Ｃ）。これは、ピーク２が主に二量体ＩｇＡ２ｍ２であることを示唆している。二量体よりも遅く溶出するピーク３は、おそらく単量体ＩｇＡである（図４２Ａ）。

図４２Ｂ及び図４２Ｃからの還元されていない精製ピーク１及び２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、それぞれＩｇＡ四量体及び二量体の予想分子量付近に移動する優勢なバンドを示した（図４２Ｄ）。これは、ＭＡＬＳによって特定されるモル質量と一致する（図４２Ｂ及び図４２Ｃ）。ＤＴＴで還元すると、ゲル上に３つのバンドが観察される（図４２Ｄ）。重鎖（ＨＣ）の予想分子量は５０．２ｋＤａであり、軽鎖（ＬＣ）は２３．８ｋＤａであり、連結鎖（ＪＣ）は１５．６ｋＤａである。全ての予想される分子量はアミノ酸配列組成に基づいており、糖組成はしばしば不均一で可変であるため、潜在的なＮ結合型又はＯ結合型グリカンを考慮していない。３つのバンドは、ほぼ３つ全ての鎖の予測された分子量で走り、ＨＣ及びＪＣはわずかに大きい。ＨＣには５つの予測Ｎ結合型グリコシル化部位があり、ＪＣには１つの予測Ｎ結合型グリコシル化部位があり、これが占有されると分子量が増加し、ゲル上の移動が減少する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、組換えＩｇＡタンパク質を、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む又は含まないＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、７０℃で１０分間加熱することによって行った。次いで、試料をＭＥＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の４％～１２％Ｂｏｌｔ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で泳動し、ＣｌｅａｒＰＡＧＥ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色した。

図４２Ｂ及び図４２Ｃからそれぞれ精製されたヒト抗ｍＩＬ－１３ ＩｇＡ２ｍ２のピーク１及び２を、陰性染色電子顕微鏡法（ＥＭ）によって分析した。精製したＩｇＡ２ｍ２試料を、０．０１５％グルタルアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）中、室温で１０分間インキュベートすることによって最初に架橋した。固定したら、試料をＴＢＳ緩衝液を用いて希釈して、１０ｎｇ／μＬの濃度を達成した。次いで、４μＬの各試料を、２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニル陰性染色剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理する前に、連続炭素の薄層で覆われた新たにグロー放電した４００メッシュの銅グリッド上で４０秒間インキュベートした。次いで、ＩｇＡを、１２０ｋｅＶで操作するＴｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ Ｔ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて２５，０００×（２．２Å／ピクセル）の倍率で撮像した。低線量条件下でＧａｔａｎ ４０９６×４０９６ピクセルＣＣＤカメラを使用して画像を記録した。次いで、各ＩｇＡ試料について約５０００個の粒子を選択し、１２８ピクセルの粒子ボックスサイズを使用してＥＭＡＮ２パッケージ内のｅ２ｂｏｘｅｒ．ｐｙソフトウェアを使用して抽出した。ＲＥＬＩＯＮ画像ソフトウェアパッケージ内の参照フリー２Ｄクラスを使用して、両方の試料の平均画像を生成した。精製されたピーク１及びピーク２からのＩｇＡについて、参照フリー２Ｄクラスと共に生画像ファイルを示す（図４３及び図４４）。ピーク１は主に四量体ＩｇＡ２ｍ２であり、幾つかの五量体、三量体及び二量体も存在する（図４３）。ピーク２は二量体ＩｇＡ２ｍ２である（図４４）。

質量分析により、ＪＣ、ＬＣ及びＨＣが予想分子量の５Ｄａ未満以内に存在し、ＪＣ及びＨＣのアミノ末端残基がピログルタミン酸を形成していることが確認された。質量分析は、５ｍＭのＤＴＴの存在下、ＩｇＡを０．５ｍｇ／ｍＬ、９７℃で３０分間加熱してタンパク質を還元及び変性させることによって行った。次いで、試料を氷上で冷却し、続いて１，０００単位のＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ）で３７℃で一晩脱グリコシル化した。次いで、還元され、変性し、脱グリコシル化されたＩｇＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＨＰＬＣを使用して１ｍＬ／分で３μｍ、４．６×５０ｍｍ逆相クロマトグラフィＰＬＲＰ－Ｓカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）に注入した。水中０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（緩衝液Ａ）及びアセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ（緩衝液Ｂ）を用いて、６分間にわたる５％～６０％緩衝液Ｂ勾配を行った。逆相カラムから溶出したタンパク質を、インタクト質量測定のためにＡｇｉｌｅｎｔ ６２３０エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計（ＥＳＩ－ＴＯＦ）に直接注入した。

図４１～図４５のＩｇＡ２ｍ２について記載された成功に加えて、この分離技術は、ＩｇＡ１（図４６）、ＩｇＡ２ｍ１野生型（図４７）及び軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合を回復させるためのＰ２２１Ｒ変異を含有するＩｇＡ２ｍ１（図４８）を含む、試験した全ての他のアイソタイプ及びアロタイプにも適用可能であった。

実施例３：組換えＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子のインビトロ分析
がん細胞死を引き起こすためのＩｇＡ抗体及びＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の能力を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイを用いてＨＥＲ２＋乳がん細胞株ＫＰＬ－４、ＢＴ４７４－ｍ１及びＳＫＢＲ３においてインビトロで分析した。アッセイを以下のように行った。抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用して、健常ドナーから末梢血を採取した。製造者の指示に従い、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、末梢血からエフェクタ細胞としてヒト好中球を単離した。好中球及びＨＥＲ２増幅標的細胞（ＳＫ－ＢＲ３；ウェルあたり１０，０００細胞の密度で）を、黒色透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、試験試薬の存在下で２０：１の比で４８時間インキュベートした。標的細胞生存率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏｗ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を使用して発光相対光単位（ＲＬＵ）によって測定した。標的細胞死滅活性を以下のように計算した：（（処置していないＲＬＵ－処置したＲＬＵ）／処置していないＲＬＵ）×１００％。

図４９に示すように、ＳＫＢＲ３及びＢＴ４７４－ｍ１細胞株は、抗ＨＥＲ ＩｇＡ２ｍ１単量体（図４９で「４Ｄ５．ＩｇＡ２ｍ１．Ｐ２２１Ｒ．Ｃ４７１Ｓ単量体」と呼ばれる）に対して感受性であった。特に、抗ＨＥＲ ＩｇＡ２ｍ１単量体は、ＢＴ４７４－ｍ１細胞の生存率に対するその効果と比較して、ＳＫＢＲ３細胞の有意な死滅をもたらした。しかしながら、ＫＰＬ－４細胞株は抗ＩｇＡ抗体に感受性ではなかった。がん細胞の死をもたらすＩｇＡ抗体の能力が好中球のドナーに特異的であるかどうかを更に分析するために、２人の別々のドナーからの好中球を細胞生存率アッセイに使用した。図５０に示すように、２人の異なるドナー由来の好中球は、単量体抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の存在下でＳＫＢＲ３細胞の死を媒介することができ、抗体及び融合分子の有効性がドナー特異的ではないことを示している。ポリマー型抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ抗体は、単量体型抗ＨＥＲ２ ＩｇＡ抗体と比較して細胞死が少なかった（図５０）。

抗体のグリコシル化状態が、がん細胞死をもたらすその能力に影響するかどうかを決定するために、更なる実験を行った。グリコシル化単量体及び四量体抗ＨＥＲ ＩｇＡ抗体は、ＳＫＢＲ３細胞の有意な死滅をもたらした（図５１）。しかしながら、アグリコシル化四量体抗ＨＥＲ ＩｇＡ抗体は、標的ＳＫＢＲ３細胞の死をもたらさなかった。特定の理論に束縛されるものではないが、これらの結果は、グリコシル化がＩｇＡ抗体の有効性に影響を及ぼし得ることを示唆している。

描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組合せられても良い。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例証及び説明目的のために提示されている。包括的であるようにも本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。

本開示の主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物及び方法に様々な修正及び変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の修正及び変形を含むよう意図されている。

様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (49)

1. 単離されたＩｇＡ抗体又はその断片であって、ＩｇＡ抗体は、アミノ酸Ｖ４５８、Ｎ４５９及び／又はＳ４６１に置換を含む、単離されたＩｇＡ抗体又はその断片。
2. アミノ酸Ｖ４５８がイソロイシンで置換されている（Ｖ４５８Ｉ）、アミノ酸Ｎ４５９がグルタミン（Ｎ４５９Ｑ）、グリシン（Ｎ４５９Ｇ）、若しくはアラニン（Ｎ４５９Ａ）で置換されている、及び／又はアミノ酸Ｓ４６１がアラニンで置換されている（Ｓ４６１Ａ）、請求項１に記載の単離されたＩｇＡ抗体。
3. 単離されたＩｇＡ抗体又はその断片であって、ＩｇＡ抗体は、アミノ酸Ｉ４５８に置換を含む、単離されたＩｇＡ抗体又はその断片。
4. アミノ酸Ｉ４５８がバリンで置換されている（Ｉ４５８Ｖ）、請求項３に記載の単離されたＩｇＡ抗体。
5. 単離されたＩｇＡ抗体又はその断片であって、ＩｇＡ抗体は、Ｎ１６６、Ｔ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９、Ｓ４６１及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸において１つ以上の置換を含む、単離されたＩｇＡ抗体又はその断片。
6. ＩｇＡ抗体は、前記アミノ酸Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９及びＮ４５９における置換が、Ｎ１６６Ａ、Ｓ２１２Ｐ、Ｎ２６３Ｑ、Ｎ３３７Ｔ、Ｉ３３８Ｌ、Ｔ３３９Ｓ及びＮ４５９Ｑである、請求項５に記載の単離されたＩｇＡ抗体。
7. 前記ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２又はＩｇＡ２ｍｎ抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたＩｇＡ抗体。
8. 前記ＩｇＡ抗体が、アミノ酸Ｎ３３７、Ｉ３３８及びＴ３３９における置換、並びにＴ１６８、Ｎ２１１、Ｓ２１２、Ｓ２１３、Ｎ２６３、Ｔ２６５、Ｎ４５９、Ｓ４６１及びそれらの組合せにおいて１つ以上の置換を含む、請求項５又は６に記載の単離されたＩｇＡ抗体。
9. 前記ＩｇＡ抗体が、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、又はＩｇＡ２ｍｎ抗体である、請求項８に記載の単離されたＩｇＡ抗体。
10. 前記ＩｇＡ抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はヒト抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離されたＩｇＡ抗体。
11. ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含む単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子であって、前記ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、前記ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＰ２２１又はＲ２２１を含む配列を含み、前記ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を更に含む、単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
12. ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含む単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子であって、前記ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、前記ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＣ２４２を含む配列を含む、単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
13. 前記ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を更に含む、請求項１２に記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
14. 前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体及びＩｇＧ４抗体からなる群より選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
15. 前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
16. 前記ＩｇＡ抗体が、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２ｍ１抗体、ＩｇＡ２ｍ２抗体及びＩｇＡ２ｍｎ抗体からなる群より選択される、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
17. 前記ＩｇＡ抗体がＩｇＡ２ｍ１抗体である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の単離されたＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
18. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１１～１７のいずれか一項に記載のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子をコードする単離された核酸。
19. 請求項１８に記載の核酸を含む、宿主細胞。
20. ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡを産生する方法であって、請求項１９に記載の宿主細胞を、前記ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子が産生されるように培養することを含む、方法。
21. 前記宿主細胞から前記ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を回収することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
22. 請求項２０から産生された、又は請求項２１から回収された、ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
23. 請求項１～１０若しくは２２のいずれか一項に記載の１つ以上のＩｇＡ抗体、又は請求項１１～１７若しくは２２のいずれか一項に記載の１つ以上のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
24. 追加の治療剤を更に含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
25. 疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の請求項１～１０若しくは２２のいずれか一項に記載の１以上のＩｇＡ抗体、又は請求項１１～１７若しくは２２のいずれか一項に記載の１以上のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を前記個体に投与することを含む、方法。
26. 前記疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、請求項２５に記載の方法。
27. 医薬として使用するための、請求項１～１０若しくは２２のいずれか一項に記載のＩｇＡ抗体、又は請求項１１～１７若しくは２２のいずれか一項に記載のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
28. 疾患の処置に使用するための、請求項１～１０若しくは２２のいずれか一項に記載のＩｇＡ抗体、又は請求項１１～１７若しくは２２のいずれか一項に記載のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
29. 前記疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、請求項２８に記載のＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子。
30. 疾患を処置するための医薬の製造における、請求項１～１０若しくは２２のいずれか一項に記載のＩｇＡ抗体、又は請求項１１～１７若しくは２２のいずれか一項に記載のＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の使用。
31. 前記疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、請求項３０に記載の使用。
32. ＩｇＡ二量体の発現を増加させる方法であって、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）をコードするＤＮＡの量に対して、第１の細胞に導入される連結鎖（ＪＣ）をコードするＤＮＡの量を増加させることを含み、発現の増加が、等量のＪＣ、ＬＣ及びＨＣのＤＮＡが導入された第２の細胞で産生されるＩｇＡ二量体の量に対するものである、方法。
33. 前記第１の細胞に導入される、前記ＨＣをコードするＤＮＡの量対前記ＬＣをコードするＤＮＡの量対前記ＪＣをコードするＤＮＡの量の比（ＨＣ：ＬＣ：ＪＣ）が約１：１：２～約１：１：５である、請求項３２に記載の方法。
34. ＩｇＡ二量体、三量体又は四量体の発現を増加させる方法であって、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）をコードするＤＮＡの量に対して、第１の細胞に導入される連結鎖（ＪＣ）をコードするＤＮＡの量を減少させることを含み、発現の増加が、ＪＣ ＤＮＡの量に対してより多くのＨＣ及びＬＣ ＤＮＡを導入した第２の細胞で産生されるＩｇＡの三量体又は四量体の量に対するものである、方法。
35. 前記第１の細胞に導入される、前記ＨＣをコードするＤＮＡの量対前記ＬＣをコードするＤＮＡの量対前記ＪＣをコードするＤＮＡの量の比（ＨＣ：ＬＣ：ＪＣ）が約１：１：０．２５～約１：１：０．５である、請求項３４に記載の方法。
36. ＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの産生を増加させる方法であって、第１の細胞において、アミノ酸Ｖ４５８に置換を有するＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸Ｖ４５８に置換を有さないＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの量に対するものである、方法。
37. アミノ酸がイソロイシンで置換されている（Ｖ４５８Ｉ）、請求項３６に記載の方法。
38. ＩｇＡ２ｍ２二量体の産生を増加させる方法であって、アミノ酸Ｉ４５８に置換を有するＩｇＡ２ｍ２抗体を第１の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸Ｉ４５８に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ２ｍ２二量体の量に対するものである、方法。
39. アミノ酸がバリンで置換されている（Ｉ４５８Ｖ）、請求項３８に記載の方法。
40. ＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの産生を増加させる方法であって、アミノ酸Ｎ４５９又はＳ４６１に置換を有するＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を第１の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸Ｎ４５９又はＳ４６１に置換を有さないＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２ｍ１抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ１ポリマー又はＩｇＡ２ｍ１ポリマーの量に対するものである、方法。
41. アミノ酸Ｎ４５９がＮ４５９Ｑ、Ｎ４５９Ｇ若しくはＮ４５９Ａ変異で置換されており、及び／又はアミノ酸Ｓ４６１がＳ４６１Ａ変異で置換されている、請求項４０に記載の方法。
42. ＩｇＡ２ｍ２ポリマーの産生を減少させる方法であって、第１の細胞において、アミノ酸Ｃ４７１に置換を有するＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させることを含み、産生の減少が、アミノ酸Ｃ４７１に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体を発現する第２の細胞において産生されるＩｇＡ２ｍ２ポリマーの量に対するものである、方法。
43. アミノ酸Ｃ４７１がＣ４７１Ｓ変異で置換されている、請求項４２に記載の方法。
44. ＩｇＡ２ｍ２抗体の一過性発現を増加させる方法であって、第１の細胞において、Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を含むＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させることを含み、前記一過性発現の増加が、Ｎ１６６、Ｓ２１２、Ｎ２６３、Ｎ３３７、Ｉ３３８、Ｔ３３９、Ｎ４５９及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を有さないＩｇＡ２ｍ２抗体を発現させる第２の細胞において産生される一過性発現の量に対するものである、方法。
45. ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体を発現させる方法であって、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含むＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を発現させることを含み、前記ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、前記ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＰ２２１又はＲ２２１を含む配列を含み、前記ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を含む、方法。
46. ＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子の二量体、三量体、又は四量体を発現させる方法であって、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域にそのＣ末端で融合した全長ＩｇＧ抗体を含むＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を発現させることを含み、前記ＩｇＡ抗体のＦｃ領域が、前記ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ末端を介してＣ２４２を含む配列を含む、方法。
47. 前記ＩｇＧ抗体がアミノ酸Ｋ４４７の欠失を含む、請求項４６に記載の方法。
48. ＩｇＡ抗体と少なくとも１つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からＩｇＡ抗体を精製するための方法であって、
    （ａ）プロテインＬを含むカラムに前記混合物を適用して前記ＩｇＡ抗体を結合させること；
    （ｂ）ＰＢＳを含む洗浄緩衝液で前記プロテインＬカラムを洗浄すること；及び
    （ｃ）リン酸を含む溶出緩衝液によって前記プロテインＬカラムから前記ＩｇＡ抗体を溶出させること、を含む、方法。
49. ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子と少なくとも１つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からオリゴマー状態のＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を精製する方法であって、
    （ａ）プロテインＬ又はプロテインＡを含む親和性精製カラムに前記混合物を適用して、前記ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を結合させること；
    （ｂ）前記親和性精製カラムを洗浄緩衝液で洗浄すること；
    （ｃ）溶出緩衝液によって前記親和性精製カラムから前記ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を溶出して、第１の溶出液を形成すること；及び
    （ｄ）サイズ排除クロマトグラフィカラムに前記第１の溶出液を適用して、異なるオリゴマー状態の前記ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を分離し、オリゴマー状態の前記ＩｇＡ抗体又はＩｇＧ－ＩｇＡ融合分子を含むフロースルーを得ることを含む、方法。

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