KR20210118881A - 면역글로불린 a 항체 및 생산과 이용의 방법 - Google Patents

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트와일라 노엘 롬바나
줄리 에이. 조른
마리사 엘. 마츠모토
크리스토프 스피쓰
클라우디오 씨페리
알베르토 에스테베즈
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본원에서 개시된 요부는 항체, 예를 들면, IgA 항체 및 IgG-IgA 융합 분자, 그리고 이런 항체를 포함하는 조성물뿐만 아니라 이런 항체 및 조성물을 만들고 이용하는 방법을 제공한다.

Description

면역글로불린 A 항체 및 생산과 이용의 방법
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 1월 22일자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/795,367 및 2019년 4월 24일자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/838,071에 우선권을 주장하고, 이들의 내용은 전체적으로 참조로서 편입되고 우선권이 청구된다.
발명의 분야
본원 발명은 항체, 예를 들면, IgA 항체 및 IgG-IgA 융합 분자, 그리고 이런 항체를 포함하는 조성물뿐만 아니라 이런 항체와 조성물을 만들고 이용하는 방법에 관계한다.
배경
면역글로불린 A (IgA)는 대부분의 포유동물의 점막 분비물 내에 존재하는 항체의 주요 부류이고, 그리고 취약한 점막 표면에서 흡입되고 섭취된 병원체에 의한 침습에 대한 방어의 일선을 나타낸다. 인간에서, IgA2 분자에서 부재하는 IgA1 중쇄 (HC)의 힌지 영역 내에 13-잔기 연장에 의해 식별되는 2가지 IgA 아이소타입, IgA1 및 IgA2가 있다 (Leusen, Mol. Immunol. 68:35-9 (2015)). 양쪽 아이소타입은 IgA2가 우세한 장 및 IgA1 단량체가 거의 배타적으로 발견되는 혈청을 제외하고, 모든 장기와 조직에서 풍부하다 (Kerr, Biochem. J. 271:285-96 (1990)). IgA2의 3가지 알로타입이 있다: m1 (Tsuzukida et al., Proc Natl Acad Sci USA 76:1104-8 (1979)), m2 (Tora
Figure pct00001
o et al., Proc Natl Acad Sci USA 75:966-9 (1978)) 및 mn (Chintalacharuvu et al., J Immunol 152:5299-304 (1994)). m2와 mn 알로타입은 정준 경쇄 (LC)-HC 이황화물을 형성하고, 반면 IgA2m1 내에 HC의 위치 221에서 프롤린의 존재는 LC-LC 이황화 결합 형성을 유발한다 (Chintalacharuvu et al., J Immunol 157:3443-9 (1996)). IgA2m1 알로타입에서 프롤린 221의 아르기닌으로의 돌연변이 (P221R) (이것은 m2와 mn 알로타입에서 발견된다)는 정준 LC-HC 연쇄를 복원한다 (Lohse et al., Cancer Res 76:403-17 (2016) 및 Chintalacharuvu et al. (1996)). IgA1 및 IgA2 아이소타입 사이에 서열 동일성은 ~90%으로 상당히 높고 IgA2 알로타입 사이에서는 훨씬 높은데, m1 및 m2 사이에는 단지 6개의 잔기 차이 및 m1 또는 m2 중 어느 한 가지 및 mn 사이에는 단지 2개의 잔기 차이만 존재한다 (Chintalacharuvu et al. (1994)).
다른 인간 면역글로불린 부류에 반해서, IgA는 단량체성 및 중합성 가용성 종류 둘 모두로서 자연적으로 존재하는 고유한 능력을 갖지만, 단지 중합성 IgA (pIgA)만 차후 통과세포외배출을 위해 pIgR에 결합할 수 있다 (Yoo et al., Clin. Immunol. 116:3-10 (2005)). IgA의 소중합체화는 테일피스로 불리는 HC의 18개 잔기 C 말단 연장 및 137개 아미노산 연결 사슬 (JC)에 의해 가능해진다. 첫 번째 IgA 단량체의 IgA 테일피스의 끝에서 두 번째 잔기, Cys471은 JC의 Cys15와의 이황화 결합 형성을 매개하고, 반면 두 번째 IgA 단량체의 Cys471은 JC의 Cys69와의 이황화 결합 형성을 매개하여, 단일 JC에 의해 묶이는 공유 IgA 이합체를 형성한다 (Zikan et al., Mol Immunol 23:541-4 (1986) 및 Halpern et al., J Immunol 111:1653-60 (1973)). 각 IgA 단량체가 각각, 테일피스를 갖는 2개의 HC로 구성되기 때문에, IgA 이합체는 추가 IgA 단량체가 연결될 수 있었던 2개의 비대합된 Cys471 잔기를 갖는다. 고차 IgA 소중합체 예컨대 삼합체, 사합체 및 오합체가 보고되었다 (Suzuki et al., Proc Natl Acad Sci USA 112:7809-14 (2015)). 혈청 IgA는 지배적으로 단량체성이긴 하지만, 중합성 IgAs가 고유판 내에 혈장 세포에 의해 생산된다. 중합성 IgA 내에 JC의 존재는 상피의 기저측 측면 상에서 pIgR에 결합 및 점막 조직의 정점 측면으로의 능동 운반을 위해 필요하다 (Wu et al., Clin Dev Immunol 11:205-13 (2004)). 통과세포외배출 시에, pIgR의 세포외 도메인은 단백질분해적으로 개열되어, 분비 성분 (SC)으로서 알려져 있는 것을 창출하는데, 이것은 pIgR 내에 Cys467 및 한쪽 HC 내에 Cys311 사이에 이황화 결합을 통해 중합성 IgA 중쇄에 공유 부착된 상태로 남아있다 (Fallgreen-Gebauer et al., Biol Chem Hoppe-Seyler 374:1023-8 (1993) 및 Bastian et al., Adv Exp Med Biol 371A:581-3 (1995)). 이러한 복합체는 점막 면역성의 주된 결정인자인 분비성 IgA (sIgA)인 것으로 간주된다 (Mantis et al., Mucosal Immunol 4:603-11 (2011) 및 Johansen et al. Mucosal Immunol 4:598-602 (2011)).
면역글로불린 A (IgA) 연구는 전통적인 IgG-기초된 치료제와 비교하여 단량체성 및 중합성 면역글로불린 A (IgA) 항체 둘 모두에 대한 복수의 잠재적인 치료적 적용 및 고유한 작용 기전을 부각시켰다 (Yoo et al. (2005), Bakema et al., MAbs 3:352-61 (2011) 및 Leusen (2015)). 종양학에서, 단량체성 및 중합성 항-EGFR 및 항-CD20 IgAs는 IgG와 비교하여, FcαRI-매개된 세포독성에 의해 주동된 우수한 종양 세포 사멸, 또는 더 효과적인 수용체 결합 및 하향조정을 나타냈다 (Pascal et al., Haematologica 97:1686-94 (2012), Boross et al., EMBO Molecular Medicine 5:1213-26 (2013) 및 Lohse et al. (2016)). IgA의 세포독성 활성은 IgG/A 융합 또는 하이브리드 분자에 의한 FcγR 및 FcαRI 둘 모두의 이중 인게이지먼트를 통해 더욱 증가될 수 있었다 (Li et al., Oncotarget (2017) 및 Kelton et al., Chem Biol 21:1603-9 (2015)). 감염성 질환의 경우에, IgA 다가 표적 인게이지먼트가 인플루엔자 감염 모형에서 우수한 항원 결합과 중화를 가능하게 하였다 (Suzuki et al. (2015)). 추가적으로, 인간 IgA 이합체 (dIgA)는 중합성 면역글로불린 수용체 (pIgR)에 결합을 통해, 다낭 신장병 생쥐 모형에서 신장 내강으로 효과적으로 전달될 수 있었고, 반면 IgG 분자는 그럴 수 없었다 (Olsan et al., Journal of Biological Chemistry 290:15679-86 (2015)). IgA의 특이적 통과세포외배출 활성을 활용하는 것은 현재의 IgG 치료제에 의해 비효율적으로 표적화되는 점막 조직의 내강 측면 내에 치료 표적에 대한 접근을 잠재적으로 가능하게 할 수 있었다 (Bakema et al. (2011), Olsan et al. (2015) 및 Borrok et al., JCI Insight 3 (2018)).
재조합 단량체성 IgA의 생산은 충분히 확립된 IgG 분자의 것보다 더 어렵다. IgA 항체는 전형적으로, 불량한 발현 및 외생 글리코실화를 겪는다. 인간 IgG1은 전형적으로, 각 CH2 도메인에서 하나씩 2개의 N-연결된 글리코실화 부위만을 갖는 반면, 인간 IgA는 글리칸 이질성에 대해 감수성일 수 있는 복수의 글리코실화 부위를 내포한다 (Leusen (2015)). IgA1은 힌지 영역 내에 복수의 O-연결된 글리코실화 부위, 그리고 또한, HC 불변 도메인 내에 2개의 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는다. IgA2 분자는 O-연결된 글리칸에 의해 변형되지 않는 반면, 이들은 4개 (IgA2m1) 또는 5개 (IgA2m2 및 IgA2mn)의 N-연결된 글리코실화 부위를 내포한다 (Yoo et al. (2005) 및 Bakema et al. (2011)). JC 또한, 1개의 N-연결된 글리코실화 부위를 내포한다. 3개의 폴리펩티드 사슬 (LC, HC 및 JC)의 조립은 복수의 소중합체성 상태를 야기하고, 그리고 재조합 중합성 IgA의 전체 복잡성에 더욱 기여한다 (Rouwendal et al., MAbs 8:74-86 (2016) 및 Brunke et al., MAbs 5:936-45 (2013)). IgA 소중합체의 크기가 증가함에 따라서, 증가된 숫자의 글리코실화 부위뿐만 아니라 더 큰 글리칸 이질성에 대한 잠재력이 나타난다.
IgA는 복수의 종류에서 짧은 순환 반감기 (<1 일 내지 ~4 일)를 갖는 것으로 이전에 밝혀졌다 (Challacombe et al., Immunology 36:331-8 (1979) 및 Leusen (2015)). IgG와 달리, IgA는 신생아 수용체, FcRn에 결합하지 않고, 그리고 이런 이유로, 엔도솜 재활용 및 리소좀 분해로부터 탈출을 겪을 수 없다 (Roopenian et al., Nat Rev Immunol 7:715-25 (2007)). FcRn 결합의 결여에 더하여, 미성숙 N-연결된 글리칸 또한, 재조합 IgA를 탄수화물-특이적, 식작용 수용체 예컨대 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) (Boross et al. (2013) 및 (Rifai et al., J Exp Med 191:2171-82 (2000)) 및 만노오스 수용체 (Lee et al., Science 295:1898-901 (2002) 및 Heystek et al., J Immunol 168:102-7 (2002))의 감수성 표적으로 만듦으로써, 이들의 더 짧은 혈청 반감기에 기여할 수 있다. 간에서 고도로 농축되는 이들 스캐빈징 수용체는 불완전하게 시알화된 N-연결된 글리칸을 보유하는 당단백질을 인식하고, 그리고 이들을 순환으로부터 제거한다 (Tomana et al., Gastroenterology 94:762-70 (1988) 및 Daniels et al., Hepatology 9:229-34 (1989)).
따라서, 더 긴 반감기를 갖는 IgA 항체, 그리고 발현 수준 및 중합성 IgA 산출을 향상시키기 위한 생산 방법이 당해 분야에서 요구된다.
요약
본원 발명은 IgA 항체 및 이런 항체를 포함하는 조성물뿐만 아니라 이런 항체 및 조성물을 만들고 이용하는 방법에 관계한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 단리된 IgA 항체에 관계한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 단리된 IgA 항체 또는 이의 단편은 아미노산 V458에서 치환을 포함한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 V458은 이소류신 (다시 말하면, V458I)으로 치환된다. 일정한 구체예에서, 단리된 IgA 항체는 IgA1, IgA2mn 또는 IgA2m1 항체이다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 단리된 IgA 항체 또는 이의 단편은 아미노산 I458에서 치환을 포함한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 I458은 발린 (다시 말하면, I458V)으로 치환된다. 일정한 구체예에서, 단리된 IgA 항체는 IgA2m2 항체이다.
본원 발명은 아미노산 N459 및/또는 S461에서 치환을 포함하는 단리된 IgA 항체를 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 N459는 글루타민 (다시 말하면, N459Q)으로 치환된다. 일정한 구체예에서, 아미노산 S461은 알라닌 (다시 말하면, S461A)으로 치환된다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 IgA1 또는 IgA2m1 항체이다.
본원 발명은 N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459, S461 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하는 단리된 IgA 항체를 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 N459에서 치환을 갖고, 그리고 IgA1, IgA2m1 또는 IgA2m2 항체이다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 N166에서 치환을 갖고, 그리고 IgA2m1 또는 IgA2m2 항체이다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 S212에서 치환을 갖고, 그리고 IgA2m2 항체이다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 N263에서 치환을 갖고, 그리고 IgA1, IgA2m1 또는 IgA2m2 항체이다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 N337, I338, T339에서 치환을 갖고, 그리고 IgA2m1 또는 IgA2m2 항체이다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 N337, I338, T339에서 치환을 갖고, 그리고 T168, N211, S212, S213, N263, T265, N459, S461 및 이들의 조합에서 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 IgA2m2 항체이고, 그리고 아미노산 N166, S212, N263, N337, I338, T339 및 N459에서 치환을 포함한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 아미노산 N166, S212, N263, N337, I338, T339 및 N459에서 치환은 N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S 및 N459Q일 수 있다.
본원 발명은 단리된 IgG-IgA 융합 분자를 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 단리된 IgG-IgA 융합 분자는 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함할 수 있고, 여기서 IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 P221 또는 R221을 포함하는 서열을 포함하고, 그리고 여기서 IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 더욱 포함한다. 본원 발명은, 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 단리된 IgG-IgA 융합 분자를 제공하고, 여기서 IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 C242를 포함하는 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 포함한다. 일정한 구체예에서, IgG 항체는 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 및 IgG4 항체로 구성된 군에서 선택된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgG 항체는 IgG1 항체일 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 IgA1 항체, IgA2m1 항체, IgA2m2 항체 및 IgA2mn 항체로 구성된 군에서 선택된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체는 IgA2m1 항체이다.
본원 발명은 본원에서 개시된 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자를 인코딩하는 단리된 핵산, 그리고 이런 핵산을 포함하는 숙주 세포를 더욱 제공한다. 본원 발명은 항체를 생산하기 위한 방법을 더욱 제공하고, 이들 방법은 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자가 생산되도록 본원에서 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 숙주 세포로부터 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자를 회수하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본원 발명은 본원에서 개시된 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자 및 제약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 추가 치료제를 더욱 포함할 수 있다.
본원 발명은 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법을 더욱 제공하고, 여기서 상기 방법은 본원에서 개시된 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 질환은 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암이다.
본원 발명은 IgA 이합체의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 인코딩하는 DNA의 양에 비하여 첫 번째 세포 내로 도입되는 연결 사슬 (JC)을 인코딩하는 DNA의 양을 증가시키되, 증가된 발현이 동등한 양의 JC, LC 및 HC DNA가 도입되는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA 이합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 첫 번째 세포 내로 도입되는 HC를 인코딩하는 DNA의 양 대 LC를 인코딩하는 DNA의 양 대 JC를 인코딩하는 DNA의 양의 비율 (HC:LC:JC)은 약 1:1:2 내지 약 1:1:5이다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 IgA 이합체, 삼합체 또는 사합체의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 인코딩하는 DNA의 양에 비하여 첫 번째 세포 내로 도입되는 연결 사슬 (JC)을 인코딩하는 DNA의 양을 감소시키되, 증가된 발현이 JC DNA의 양에 비하여 더 많은 양의 HC 및 LC DNA가 도입되는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA 삼합체 또는 사합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 세포 내로 도입되는 HC를 인코딩하는 DNA의 양 대 LC를 인코딩하는 DNA의 양 대 JC를 인코딩하는 DNA의 양의 비율 (HC:LC:JC)은 약 1:1:0.25 내지 약 1:1:0.5이다.
본원 발명은 IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 아미노산 V458에서 치환, 예를 들면, V458I를 갖는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 첫 번째 세포에서 발현하되, 증가된 생산이 아미노산 V458에서 치환을 갖지 않는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다. 본원 발명은 아미노산 I458에서 치환, 예를 들면, I458V를 갖는 IgA2m2 항체를 첫 번째 세포에서 발현하는 단계를 포함하는, IgA2m2 이합체의 생산을 증가시키는 방법을 더욱 제공하고, 여기서 증가된 생산은 아미노산 I458에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA2m2 이합체의 양에 상대적이다. 일정한 구체예에서, IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 생산을 증가시키기 위한 방법은 아미노산 N459 및/또는 S461에서 치환, 예를 들면, N459Q 및/또는 S461A를 갖는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 첫 번째 세포에서 발현하되, 증가된 생산이 아미노산 N459 또는 S461에서 치환을 갖지 않는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, IgA2m2 중합체의 생산을 감소시키는 방법은 아미노산 C471에서 치환, 예를 들면, C471S를 갖는 IgA2m2 항체를 첫 번째 세포에서 발현하되, 감소된 생산이 아미노산 C471에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA2m2 중합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 C471에서 치환, 예를 들면, C471S를 포함하는 IgA 항체는 P221에서 치환, 예를 들면, P221R을 더욱 포함할 수 있다.
본원 발명은 N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에서 치환을 포함하는 IgA2m2 항체를 첫 번째 세포에서 발현하는 단계를 포함하는, IgA2m2 항체의 일시적인 발현을 증가시키는 방법을 제공하고, 여기서 증가된 일시적인 발현은 N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 일시적인 발현의 양에 상대적이다.
본원 발명은 IgG-IgA 융합 분자의 이합체를 발현하는 방법을 더욱 제공하고, 이들 방법은, 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 IgG-IgA 융합 분자를 발현하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 P221 또는 R221을 포함하는 서열을 포함하고, 여기서 IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 IgG-IgA 융합 분자의 이합체, 삼합체 또는 사합체를 발현하는 방법을 제공하고, 이들 방법은, 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 IgG-IgA 융합 분자를 발현하되, IgA 항체의 Fc 영역이 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 C242를 포함하는 서열을 포함하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 포함한다.
본원 발명은 본원에서 개시된 IgA 및 IgG-IgA 융합 분자를 정제하기 위한 및/또는 본원에서 개시된 IgA 및 IgG-IgA 융합 분자의 특정한 소중합체성 상태, 예를 들면, 이합체, 삼합체 또는 사합체를 정제하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, IgA 항체 및 적어도 하나의 숙주 세포 단백질을 포함하는 혼합물로부터 IgA 항체를 정제하기 위한 방법은 상기 혼합물을 IgA 항체에 결합하는 단백질 L을 포함하는 칼럼에 적용하고, 단백질 L 칼럼을 PBS를 포함하는 세척 완충액으로 세척하고, 그리고 IgA 항체를 인산을 포함하는 용리 완충액에 의해 단백질 L 칼럼으로부터 용리하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자 및 적어도 하나의 숙주 세포 단백질을 포함하는 혼합물로부터 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자의 소중합체성 상태를 정제하기 위한 방법은 상기 혼합물을 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자에 결합하는 단백질 L 또는 단백질 A를 포함하는 친화성 정제 칼럼에 적용하고, 친화성 정제 칼럼을 세척 완충액으로 세척하고, IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자를 용리 완충액에 의해 친화성 정제 칼럼으로부터 용리하여 첫 번째 용출물을 형성하고, 그리고 첫 번째 용출물을 크기 배제 크로마토그래피 칼럼에 적용하여 상이한 IgA 소중합체성 상태를 분리하고 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자의 소중합체성 상태를 포함하는 통과액을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1a-1d. 인간 IgA 중쇄 불변 도메인 및 J 사슬의 단백질 서열. (a) IgA1, IgA2m1 및 IgA2m2의 인간 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2, CH3, 힌지 (Brezski et al. Curr Opin Immunol 40:62-9 (2016)) 및 테일피스 (Tora
Figure pct00002
o et al. 75:966-9 (1978))에 대한 단백질 서열의 정렬. IgA1 서열에 비하여 부정합은 회색으로 강조되고, N-연결된 글리코실화 모티프는 상자모양으로 표시되고, 그리고 별표는 테일피스 내에 IgA1 및 IgA2m1로부터 IgA2m2에서 아미노산 차이를 표시한다. (b) N-연결된 글리코실화 모티프가 상자모양으로 표시된, 인간 J 사슬의 단백질 서열. (c) IgA2mn의 인간 중쇄 불변 사슬 도메인 CH1, CH2, CH3, 힌지 및 테일피스의 단백질 서열. N-연결된 글리코실화 부위는 상자모양으로 표시된다. (d) 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC)을 갖는 IgA 소중합체성 상태의 계통도. IgA 중합체는 삼합체, 사합체 및 오합체 종류를 나타낸다.
도 2a-2f. 재조합적으로 생산된 IgA의 소중합체성 상태는 형질감염에서 이용된 J 사슬 DNA의 양 및 중쇄 테일피스 서열에 의해 영향을 받는다. (a-c) 하기의 아이소타입/알로타입에 대해 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA로 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 IgA의 정규화된 분석적 크기 배제 크로마토그램의 오버레이: (a) IgA1, (b) IgA2m1 또는 (c) IgA2m2. 단량체 (M), 이합체 (D) 및 중합체 (P) 피크가 표시된다. 값은 각 크로마토그램의 최대 신호에 기초하여 정규화되었다. (d-f) 분석적 SEC에 의해 정량된, IgA 변이체에 대해 생산된 단량체, 이합체 및 삼합체/사합체 종류의 상대적 양. (d) 삼합체/사합체 형성에 대한, 위치 458 및 467에서 IgA1, IgA2m1 및 IgA2m2의 IgA 테일피스에서 돌연변이의 효과. 삼합체/사합체 형성에 대한, (e) IgA1 또는 (f) IgA2m2에서 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이의 효과.
도 3a-3d. 재조합 IgA 소중합체의 생물물리학적 및 구조적 특징화. (a) 정제된 IgA1, IgA2m1, IgA2m1 P221R, 그리고 IgA2m2 단량체, 이합체 및 사합체의 분석적 크기 배제 크로마토그램의 오버레이. (b) 비-환원된 (DTT) 및 환원된 (+DTT) IgA1, IgA2m1, IgA2m1 P221R, 그리고 IgA2m2 단량체 (M), 이합체 (D) 및 사합체 (T)의 SDS-PAGE 분석. 중쇄 (HC), 경쇄 (LC) 및 연결 사슬 (*)은 환원된 표본에서 표시되고, 그리고 IgA2m1의 LC-LC 이합체는 화살촉으로 표시된다. (c-d, 위쪽 패널) (c) IgA2m2 이합체 또는 (d) IgA2m2 사합체에 대한 음성 염색 전자 현미경검사로부터 무참조 2D 클래스. (c-d, 아래쪽 패널) 배정된 2D 클래스와 비교하여 미가공 이미지 입자가 2D 클래스 상에서 중첩된 IgA의 모형의 바로 옆에 제시되며, Fc 도메인 및 Fab 단편이 강조된다.
도 4a-4b. 재조합적으로 생산된 IgA 소중합체는 시험관내에서 안정되고 기능적이다. (a) 인간 pIgR로 형질감염된 MDCK 세포에서 항-mIL-13 hIgA 단량체, 이합체 및 사합체의 시험관내 통과세포외배출. IgA 중합체는 통과세포외배출하고, 반면 단량체는 그렇지 않다. (b) 항-mIL-13 IgAs, IgG1 및 IgG1 Fab 단편의 열안정성은 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 계측된다. 모든 표본에 대해 단지 하나의 용융 전이만 관찰되었다.
도 5a-5c. 재조합 IgA 소중합체는 생체내에서 급속한 혈청 소실을 나타낸다. (a) 생쥐에서 IgA 또는 IgG의 혈청-시간 농도 프로필. 투약후 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 1 일, 3일, 7 일 및 14 일에 단일 5 mg/kg 정맥내 (IV) 용량의 IgA 또는 IgG 분자가 투여된 Balb/c 생쥐의 전체 혈청 노출. 모든 생쥐는 혈청 농도 프로필을 평가하기 위해 이소플루란 하에 안와후로 채혈되었다. 인간 혈청 IgA 단량체가 10 mg/kg으로 투여되었고 파선으로서 도시된다. (b-c) 주사후 1 시간에 생쥐에서 IgA 또는 IgG의 조직 분포. 모든 그래프는 n=4에서 각 군에 대한 평균 ± SEM이다. (b) 무손상 항체의 농도는 혈액을 제외한 조직마다, 125I (%ID/g 조직)로서 정규화된 감법 혈액이었다. (c) 이화된 항체 값의 농도는 111In (%ID/g 조직)으로부터 125I (%ID/g 조직)를 차감함으로써 결정되었다.
도 6a-6c. 재조합 IgA 분자의 불완전 글리코실화. (a) N-연결된 글리칸 처리의 계통도. (b) 재조합 IgA 및 인간 혈청으로부터 정제된 IgA의 전역 N-연결된 글리칸 분석. 글리칸 분석은 항체 데글리코실화 및 후속 글리칸 농축 후 질량 분광 분석에 의해 행위되었다. 인간 혈청 IgA가 90% 이상의 시알화를 보여주긴 하지만, 모든 재조합적으로 발현된 IgA 분자는 60% 이하의 시알화를 갖는다. (c) IgA2m1 이합체의 부위 특이적 N-연결된 글리칸 분석은 IgA2m1 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) 상에서 상이한 N-연결된 글리코실화 부위 사이에 외생 글리칸 조성을 드러낸다.
도 7a-7e. IgG1-IgA2m1 Fc 융합 및 비글리코실화된 IgA2m2는 생체내에서 야생형 IgA와 비교하여 증가된 혈청 노출을 보여주고, 그리고 시험관내에서 통과세포외배출 능력을 나타낸다. (a) 41개의 N-연결된 글리코실화 부위 (다이아몬드) (왼쪽)를 갖거나 또는 비글리코실화된 (오른쪽), 경쇄 (LC, 검은색), 중쇄 (HC, 흰색) 및 연결 사슬을 포함하는 IgA2m2 사합체의 계통도. (b) LC (검은색), IgG1 HC (부점), IgA2m1 HC (흰색), JC 및 N-연결된 글리코실화 (다이아몬드)를 포함하는 IgG1, IgA2m1 이합체 또는 IgG1-IgA2m1 Fc 이합체 형식의 계통도. (c) 생쥐 혈장에서 0 시간 (검은색), 24 시간 (오렌지색) 또는 96 시간 (청색) 배양 후 요오드화된 IgG1-IgA2m1 Fc 이합체 또는 사합체의 분석적 SEC. 초기 IgG1-L-P221R IgA2m1 Fc 사합체 및 이합체는 항-HER2 IgG1 (트라스투주맙) 대조의 피크와 유사한 분해를 보여주고, 반면 재가공된 IgG1△K-P221 IgA2m1 Fc 또는 IgG1△K-C242 IgA2m1 Fc 이합체는 안정된다. (d) 생쥐에서 IgA 또는 IgG의 혈청-시간 농도 프로필. 단일 30 mg/kg IV 용량의 IgA 분자가 투여된 Balb/c 생쥐의 전체 혈청 노출. 30 mg/kg에서 단일 정맥내 (IV) 주사로서 이전에 투약된 전형적인 인간 IgG1 (항-gD)의 인하우스 농도 데이터는 파선으로서 도시된다. 모든 생쥐는 혈청 농도 프로필을 평가하기 위해, 이소플루란 하에 안와후로 또는 심장 천자를 통해 채혈되었다. (e) 인간 pIgR로 형질감염된 MDCK 세포에서 hIgA의 시험관내 통과세포외배출.
도 8a-8b. IgA2m2 이합체 및 사합체 정제의 미가공 음성 염색 EM 이미지. (a) 정제된 IgA2m2 이합체의 음성 염색 전자 현미경검사 (EM)에 의한 미가공 이미지는 우수한 단분산 입자를 보여준다. (b) 정제된 IgA2m2 사합체의 음성 염색 EM에 의한 미가공 이미지는 우수한 단분산 방사상 입자를 보여준다.
도 9. 혈장 농도에 대해 정규화된 무손상 항체 분포. 주사후 1 시간에 생쥐에서 IgA 또는 IgG의 조직 분포. 모든 값은 %ID/mL의 혈장에 대해 정규화된, 혈액 보정 후 %ID/g의 조직을 나타낸다. 모든 그래프는 n=4에서 각 군에 대한 평균 ± SD이다.
도 10. 1 일 후 무손상 항체의 조직 분포. 무손상 항체의 조직 농도는 125I (%ID/g 조직)로서 표현되고 주사후 1 일에 계산된, 조직마다 정규화된 감법 혈액이었다. 모든 그래프는 n=4에서 각 군에 대한 평균 ± SEM이다.
도 11. 1 일 후 분해된 항체의 조직 분포. 이화된 항체 값은 111In (%ID/g 조직)으로부터 125I (%ID/g 조직)를 차감함으로써 결정되고 주사후 1 일에 계산되었다. 모든 그래프는 n=4에서 각 군에 대한 평균 ± SEM이다.
도 12. IgG1-IgA2m1 Fc 융합 소중합체 계통도. IgG1-L-P221R IgA2m1 Fc 융합 (Borrok et al. MAbs 7:743-51 (2015))이 이합체 및 사합체로서 만들어졌지만, 생쥐 혈장에서 불량한 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 7c). 잠재적인 퓨린 개열 부위를 제거하기 위해, IgG1로부터 C 말단 리신 (K) 및 개재성 류신 잔기 (L)가 결실되었다. 추가적으로, IgG1△K-P221 IgA2m1 Fc 융합을 만들기 위해, IgA2m1 야생형 (WT) 서열이 위치 221에서 프롤린으로 복원되었다. IgG1△K-C242 IgA2m1 Fc 융합 설계는 유사하지만, IgA2m1 Fc는 잔기 C242에서 시작하고, 그것에 의하여 IgA2m1 힌지가 결실된다 (△힌지).
도 13. 가공된 IgA 소중합체의 전역 글리칸 분석. P221 또는 C242 IgA2m1 Fc에 융합된 항-mIL-13 IgG1△K의 CHO 재조합적으로 생산된 이합체 및 비글리코실화된 항-HER2 IgA2m2 사합체의 전역 N-연결된 글리칸 분석. P221 또는 C242 IgA2m1 Fc에 융합된 항-mIL-13 IgG1△K의 이합체는 둘 모두 ~20% 시알화를 갖고, 그리고 예상한 대로, 비글리코실화된 항-HER2 IgA2m2 사합체의 경우에는 어떤 글리코실화도 검출되지 않는다.
도 14. 인간 및 다른 종으로부터 유래된 IgA 중쇄 불변 도메인의 단백질 서열. 인간 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2, CH3, 힌지 (Brezski et al. (2016)) 및 테일피스 (Tora
Figure pct00003
o et al. (1978))에 대한 단백질 서열의 정렬. 종 사이에 단백질 서열의 보존은 회색으로 강조되고, 반면 N-연결된 글리코실화 모티프는 상자모양으로 표시된다.
도 15a-15c. (a) 1:1:0.25 내지 1:1:2 사이에서 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuIL13.huIgA1의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (b) 1:1:1 내지 1:1:5 사이에서 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuIL13.huIgA1의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (c) IgA 항체에 대해 생산된 이합체 및 사합체 종류의 양.
도 16a-16b. (a) 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuIL13.IgA2m1의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (b) IgA 항체에 대해 생산된 이합체 및 사합체 종류의 양.
도 17a-17b. (a) 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuIL13.IgA2m1.P221R의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (b) IgA 항체에 대해 생산된 이합체 및 사합체 종류의 양.
도 18a-18e. (a) 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuIL13.huIgA2m2의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (b) 1:1:1 내지 1:1:5 사이에서 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuIL13.huIgA2m2의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (c) IgA 항체에 대해 생산된 이합체 및 사합체 종류의 양. (d) 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC), 연결 사슬 (JC) 및 분비 성분 (SC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuIL13.huIgA2m2의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (e) 질량 분광분석에 의한 xmuIL13.huIgA2m2의 중쇄, 경쇄 및 J 사슬의 확증.
도 19는 하기의 아이소타입/알로타입의 하기의 항-IL-13 항체의 Biacore 분석을 묘사한다: IgA1 이합체, IgA2m1 이합체, IgA2m2 이합체 및 IgA2m2 사합체.
도 20a-20b. (a) 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuGP120.3E5.huIgA1의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (b) 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuGP120.3E5.IgA2m1.P221R의 분석적 크기 배제 크로마토그램.
도 21은 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuGP120.3E5.huIgA2m2의 분석적 크기 배제 크로마토그램을 묘사한다.
도 22는 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 xmuGP120.3E5.huIgA2m2의 분석적 크기 배제 크로마토그램을 묘사한다.
도 23은 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 생쥐 xgD.5B6.hIgA2m2의 분석적 크기 배제 크로마토그램을 묘사한다.
도 24a-24c는 IgA2m2 및 J 사슬의 글리코실화 부위의 변형을 묘사한다. (a) IgA2m2의 중쇄 및 J 사슬에 만들어진 변형 및 야생형과 비교하여 시험관내에서 이들의 발현의 요약. (b) IgA2m2 단일 글리코실화 변이체의 일시적인 발현의 요약. (c) 복수의 돌연변이를 갖는 IgA2m2 글리코실화 변이체의 일시적인 발현의 요약.
도 25는 인간 혈청으로부터 IgA 단량체, 야생형 IgA2m2 사합체 및 IgA2m2 사합체 (비글리코실화됨), 그리고 J-사슬 (글리코실화됨)의 수용체 결합 특성의 분석을 묘사한다.
도 26은 각 IgA 분자의 글리칸 특성의 분석을 묘사한다.
도 27. 암컷 Balb/C 생쥐에서 단일 10 mg/kg IV 주사 후 IgA 분자의 농도 시간 프로필.
도 28a-28b. (a) 분비 성분 또는 J 사슬과의 이황화 결합을 예방하기 위한 시스테인 돌연변이의 분석. (b) 연결 사슬을 경쇄와 중쇄에 부가할 때, IgA2m2 이합체 및 고차 소중합체 형성을 위해 C471은 필요하지만 C311은 그렇지 않다.
도 29는 분비 성분, 연결 사슬, 경쇄 및 중쇄의 동시형질감염의 분석을 묘사한다.
도 30a-30e. (a) pIgR 결합을 전폐하도록 산출된 xmuIL13.IgA2m2 변이체의 발현 수준. (b) Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 xmuIL13.IgA2m2 변이체의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (c) 생쥐 pIgR에 결합하는 xmuIL13.IgA2m2 변이체의 Biacore 분석. (d) 인간 pIgR에 결합하는 xmuIL13.IgA2m2 변이체의 Biacore 분석. (e) 인간 FcαRI에 결합하는 xmuIL13.IgA2m2 변이체의 Biacore 분석.
도 31a-31b는 항-Jag1 IgA2m2의 시알화를 증가시키기 위한 세포 배양 조건의 분석을 묘사한다. (a) xJAG1.2B3.hIgA2m2 안정된 세포주에 대한 세포 배양 조건의 매트릭스. (b) 세포 배양 조건이 xJAG1.2B3.hIgA2m2의 글리코실화에 대해 갖는 효과의 분석.
도 32는 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의한 IgA 변이체의 안정성을 묘사한다.
도 33a-33d는 소중합체 안정성을 증가시키기 위한 전장 항뮤린 IL-13 IgG1.Leu-P221R.IgA2m1 Fc 융합 분자의 특징화와 가공을 묘사한다. (a) 변하는 비율의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 연결 사슬 (JC) DNA를 이용하여, Expi293 세포에서 수행된 소규모 일시적인 형질감염으로부터 친화성 정제된 글리코실화된 전장 항뮤린 IL-13 IgG1.Leu-P221R.IgA2m1 Fc 융합 분자의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (b) 생쥐 pIgR에 결합하는 IgA 소중합체의 Biacore 분석. (c) 생쥐 pIgR 및 인간 pIgR에 대한 IgA 소중합체의 결합의 요약. (d) DSF에 의한 IgA 소중합체의 안정성.
도 34a-34c. (a) 퓨린 부위 및 불안정성을 제거하기 위한 IgG1 전장-IgA Fc 작제물 설계. (b) 가공된 작제물의 전장 항뮤린 IL-13 IgG1-IgA Fc 일시적인 발현 데이터. (c) 가공된 항뮤린 IL-13 IgA 분자에 대한 생쥐 혈장 안정성 데이터.
도 35a-35b. (a) 인간 FcαRI에 대한 IgA 소중합체 결합의 Wasatch 분석. (b) Wasatch 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정된 바와 같은, FcαRI에 대한 IgA 소중합체의 결합의 요약.
도 36a-36d. (a) 생쥐 및 인간 pIgR에 대한, CHO 세포 및 Expi293 세포에서 일시적인 발현에 의해 생산된 IgA2m2 이합체 및 사합체의 결합의 Wasatch 분석. (b) 생쥐 pIgR에 대한, IgA2m2 글리코실화 변이체의 결합의 Wasatch 분석. (c) 인간 pIgR에 대한, IgA2m2 글리코실화 변이체의 결합의 Wasatch 분석. (d) Wasatch SPR에 의해 결정된 바와 같은, 생쥐 및 인간 pIgR에 대한 IgA 소중합체의 결합의 요약.
도 37a-37c. (a) hIgG1-hIgA1 융합 분자의 발현 프로필. (b) hIgG1-hIgA1 융합 분자의 분석적 크기 배제 크로마토그램. (c) 생쥐 및 인간 pIgR 및 인간 FcαRI에 대한 hIgG1-hIgA1 융합 분자의 결합의 Biacore 분석.
도 38은 다양한 IgA1 항체의 N-연결된 글리코실화의 제거의 분석을 묘사한다.
도 39. 재조합적으로 발현된 인간 항-mIL-13 IgA2m2는 Capto L 칼럼 위에서 친화성 정제되었다. Capto L 용출물은 이후, HPLC 상에서 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석되었다. 다각도 광 산란 (MALS) 및 음성 염색 전자 현미경검사에 의해 결정된 바와 같은, 고차 중합체 (피크 1, 삼합체, 사합체 및 오합체를 포함), 이합체 (피크 2) 및 단량체 (피크 3)에 상응하는 3개의 주된 피크가 분석적 SEC 용리 프로필에서 관찰되었다.
도 40. Capto L 친화성 칼럼 용출물에서 목격된 재조합 인간 항-mIL-13 IgA2m2 소중합체 종류의 혼합물의 분리가 HiLoad 16/600 Superose 6 예비 등급 (pg) 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시도되었다. 분석적 SEC에 연계된 다각도 광 산란 (MALS) 및 음성 염색 전자 현미경검사에 의해 결정된 바와 같은, 고분자량 응집체 (피크 1, 칼럼의 허공 용적에서 용리), 고차 중합체 (피크 2, 삼합체, 사합체 및 오합체를 아마도 포함), 이합체 (피크 3) 및 단량체 (피크 4)에 상응하는 4개의 주된 피크가 Superose 6 용리 프로필에서 관찰되었다. 피크 2 및 3으로부터 취해진 분획물로부터 계측된, 단백질의 몰 질량 (MW) 및 다분산성 지수 (PDI)가 표시된다.
도 41. 고차 중합체로부터 재조합 인간 항-mIL-13 IgA2m2 이합체의 분리가 HPLC 상에서 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 달성되었다. 분석적 SEC에 연계된 다각도 광 산란 (MALS) 및 음성 염색 전자 현미경검사에 의해 결정된 바와 같은, 고차 중합체 (피크 1, 삼합체, 사합체 및 오합체를 포함), 이합체 (피크 2) 및 단량체 (피크 3)에 상응하는 3개의 주된 피크가 분석적 SEC 용리 프로필에서 관찰되었다.
도 42a-42d. (a) 인간 항-mIL-13 IgA2m2의 Capto L 친화성 칼럼 용리가 HPLC 상에서 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석되었다. 분석적 SEC에 연계된 다각도 광 산란 (MALS) 및 음성 염색 전자 현미경검사에 의해 결정된 바와 같은, 고차 중합체 (피크 1, 삼합체, 사합체 및 오합체를 포함), 이합체 (피크 2) 및 단량체 (피크 3)에 상응하는 3개의 주된 피크가 관찰되었다. (b) 패널 (a)로부터 피크 1이 도 41의 경우에서와 같이 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å 칼럼 위에서 정제에 의해 단리되었다. MALS 검출기에 연계된 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼 상에서 정제 분석후 피크 1이 여기에서 도시된다. MALS에 의해 결정된 몰 질량 (MW) 및 다분산성 지수 (PDI)는 지배적으로 사합체성 IgA2m2의 예상된 질량과 일치한다. (c) 패널 (a)로부터 피크 2가 도 41의 경우에서와 같이 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å 칼럼 위에서 정제에 의해 단리되었다. MALS 검출기에 연계된 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼 상에서 정제 분석후 피크 2가 여기에서 도시된다. MALS에 의해 결정된 MW 및 PDI는 지배적으로 이합체성 IgA2m2의 예상된 질량과 일치한다. (d) 패널 (b) 및 (c)로부터 피크 1 및 2로부터 정제된 단백질이 비환원 (-DTT) 또는 환원 (+DTT) 조건 중 어느 한 가지 하에 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 환원된 표본에서 중쇄 (HC), 경쇄 (LC) 및 J 사슬 (JC)에 대한 예상된 질량에서 이주하는 띠가 관찰된다.
도 43a-43b. (a) 도 42b에서 피크 1로부터 인간 항-mIL-13 IgA2m2 입자의 음성 염색 전자 현미경검사 (EM)로부터 대표적인 미가공 이미지. (b) 표본이 지배적으로 사합체임을 지시하는, 도 42b에서 피크 1로부터 입자의 음성 염색 EM으로부터 무참조 2D 클래스.
도 44a-44b. (a) 도 42c에서 피크 2로부터 인간 항-mIL-13 IgA2m2 입자의 음성 염색 전자 현미경검사 (EM)로부터 대표적인 미가공 이미지. (b) 표본이 지배적으로 이합체임을 지시하는, 도 42c에서 피크 2로부터 입자의 음성 염색 EM으로부터 무참조 2D 클래스.
도 45. 도 42c에서 피크 2로부터 정제된 인간 항-mIL-13 IgA2m2 이합체의 질량 분광분석. 열 변성, 디티오트레이톨로 환원, 그리고 PNGaseF로 데글리코실화 후 수행된 질량 분광 분석은 정확한 연결 사슬 (JC), 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)의 존재를 확증한다.
도 46a-46c. (a) 인간 항-mIL-13 IgA1의 Capto L 친화성 칼럼 용리가 HPLC 상에서 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석되었다. 소중합체의 분리에 앞서, 고차 중합체 (피크 1, 삼합체, 사합체 및 오합체를 포함), 이합체 (피크 2) 및 단량체 (피크 3)에 상응하는 3개의 주된 피크가 관찰되었다. (b) 패널 (a)로부터 피크 2가 도 41의 경우에서와 같이 HPLC 상에서 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å 칼럼 위에서 정제에 의해 단리되었다. 다각도 광 산란 (MALS) 검출기에 연계된 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼 상에서 정제 분석후 피크 2가 여기에서 도시된다. MALS에 의해 결정된 몰 질량 (MW) 및 다분산성 지수 (PDI)는 지배적으로 이합체성 IgA1의 예상된 질량과 일치한다. (c) 패널 (b)로부터 피크 2로부터 정제된 단백질이 비환원 (-DTT) 또는 환원 (+DTT) 조건 중 어느 한 가지 하에 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 환원된 표본에서 중쇄 (HC), 경쇄 (LC) 및 J 사슬 (JC)에 대한 예상된 질량에서 이주하는 띠가 관찰된다.
도 47a-47c. (a) 인간 항-mIL-13 IgA2m1의 Capto L 친화성 칼럼 용리가 HPLC 상에서 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석되었다. 소중합체의 분리에 앞서, 고차 중합체 (피크 1, 삼합체, 사합체 및 오합체를 포함), 이합체 (피크 2) 및 단량체 (피크 3)에 상응하는 3개의 주된 피크가 관찰되었다. (b) 패널 (a)로부터 피크 2가 도 41의 경우에서와 같이 HPLC 상에서 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å 칼럼 위에서 정제에 의해 단리되었다. 다각도 광 산란 (MALS) 검출기에 연계된 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼 상에서 정제 분석후 피크 2가 여기에서 도시된다. MALS에 의해 결정된 몰 질량 (MW) 및 다분산성 지수 (PDI)는 지배적으로 이합체성 IgA2m1의 예상된 질량과 일치한다. (c) 패널 (b)로부터 피크 2로부터 정제된 단백질이 비환원 (-DTT) 또는 환원 (+DTT) 조건 중 어느 한 가지 하에 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 환원된 표본에서 중쇄 (HC), 경쇄 (LC) 및 J 사슬 (JC)에 대한 예상된 질량에서 이주하는 띠가 관찰된다.
도 48a-48c. (a) 중쇄에서 P221R 돌연변이를 내포하는 인간 항-mIL-13 IgA2m1의 Capto L 친화성 칼럼 용리가 HPLC 상에서 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석되었다. 소중합체의 분리에 앞서, 고차 중합체 (피크 1, 삼합체, 사합체 및 오합체를 포함), 이합체 (피크 2) 및 단량체 (피크 3)에 상응하는 3개의 주된 피크 관찰되었다. (b) 패널 (a)로부터 피크 2가 도 41의 경우에서와 같이 HPLC 상에서 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å 칼럼 위에서 정제에 의해 단리되었다. 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å 칼럼 상에서 정제 분석후 피크 2가 도시된다. (c) 패널 (b)로부터 피크 2로부터 정제된 단백질이 비환원 (-DTT) 또는 환원 (+DTT) 조건 중 어느 한 가지 하에 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 환원된 표본에서 중쇄 (HC), 경쇄 (LC) 및 J 사슬 (JC)에 대한 예상된 질량에서 이주하는 띠가 관찰된다.
도 49는 HER2+ 유방암 세포주 KPL-4, BT474-M1 및 SKBR3의 사멸을 유발하는, 단량체성 및 중합성 항-HER2 IgA 항체의 능력을 묘사한다.
도 50은 상이한 공여자로부터 호중구의 존재에서 SKBR3 유방암 세포의 사멸을 유발하는, 단량체성 및 중합성 항-HER2 IgA 항체의 능력을 묘사한다.
도 51은 SKBR3 유방암 세포의 사멸을 유발하는, 글리코실화된 및 비글리코실화된 IgA 중합체 및 단량체의 능력을 묘사한다.
도 52a-b. (a) 인간 FcαRI에 결합하는 IgA 소중합체 및 사합체의 Biacore 분석. (b) Biacore SPR에 의해 결정된 바와 같은, FcαRI에 대한 IgA 소중합체 및 사합체의 결합의 요약.
상세한 설명
명료함을 위해, 그리고 제한 없이, 본원에서 개시된 요부의 상세한 설명은 하기의 하위섹션으로 나눠진다:
I. 정의;
II. 항체;
III. 항체 생산과 정제의 방법;
IV. 치료 방법;
V. 제약학적 조성물;
VI. 제조 물품; 그리고
VII. 예시적인 구체예.
I. 정의
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정될 때 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미하는데, 이것은 상기 값이 어떻게 계측되거나 또는 결정되는 지, 다시 말하면, 계측 시스템의 제한에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들면, "약"은 당해 분야에서 관례에 따라, 3 이내 또는 3보다 큰 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안으로, "약"은 소정의 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 그리고 가장 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안으로, 특히, 생물학적 시스템 또는 과정에 대하여, 상기 용어는 값의 1 크기 자릿수 이내, 바람직하게는 5-배 이내, 그리고 더욱 바람직하게는 2-배 이내를 의미할 수 있다.
용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 별도로 명시되지 않으면 복수 대상을 포함합니다. 용어 "a" (또는 "an")뿐만 아니라 용어 "하나 또는 그 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 교체가능하게 이용될 수 있다. 게다가, "및/또는"는 본원에서 이용되는 경우에, 다른 특질 또는 성분과 함께 또는 다른 특질 또는 성분 없이 2개의 특정된 특질 또는 성분 각각의 특정한 개시로서 간주된다. 따라서, 본원에서 관용구, 예컨대 "A 및/또는 B"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A와 B", "A 또는 B", "A" (단독), 그리고 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 관용구, 예컨대 "A, B 및/또는 C"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음의 양상 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B와 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 그리고 C (단독).
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 그리고 항체 융합 분자 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv); 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 리뷰를 위해, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)을 참조한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 "IgA 항체"는 항체의 IgA 부류의 항체를 지칭하고, 그리고 IgA 아이소타입, IgA1 및 IgA2, 그리고 IgA2의 3가지 알로타입, m1, m2 및 mn을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "세포독성 작용제"는 세포 기능을 저해하거나 또는 예방하고 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성 작용제는 방사성동위원소 (예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성동위원소); 화학요법 작용제 또는 약물 (예를 들면, 메토트렉사트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입 작용제); 성장 저해제; 효소 및 이들의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소형 분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소뿐만 아니라 이들의 단편 및/또는 변이체; 그리고 아래에 개시된 다양한 항종양 또는 항암 작용제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
"작동체 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 작동체 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절; 그리고 B 세포 활성화.
작용제, 예를 들면, 제약학적 조성물의 "효과량"은 원하는 치료적 또는 방지적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 예를 들면, 그리고 제한 없이, "효과량"은 질환 및/또는 장애의 증상을 경감하고, 최소화하고 및/또는 예방하고, 생존을 연장하고 및/또는 질환 및/또는 장애의 재발 때까지의 기간을 연장할 수 있는, 본원에서 개시된 항체의 양을 지칭할 수 있다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는 데 이용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일정한 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 카르복실 말단까지 걸친다. 하지만, Fc 영역의 C 말단 리신 (Lys447) 또는 C 말단 글리신 (Gly446)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 일정한 구체예에서, 인간 IgA 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Pro221 (P221), Arg221 (R221), Val222 (V222), Pro223 (P223)으로부터 또는 Cys242 (C242)로부터 카르복실 말단까지 걸쳐있다 (도 1a 및 c를 참조). 본원에서 별도로 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. Fc 수용체는 FcαRI (IgA 항체의 Fc 영역을 인식) 및 FcγRII (IgG 항체의 Fc 영역을 인식)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")를 포함하는데, 이들은 주로 세포질 도메인에서 다른 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기초된 활성화 모티프 (ITAM)를 내포한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기초된 저해 모티프 (ITIM)를 내포한다 (참조: 예를 들면, Da
Figure pct00004
ron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs는 예를 들면, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 그리고 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)에서 리뷰된다. 장래에 확인될 것들을 비롯한 다른 FcRs는 본원에서 용어 "FcR"에 의해 포괄된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 신생아 수용체, FcRn을 또한 포함하는데, 이것은 모계 IgG 항체의 태아로의 전달 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성의 조절을 책임진다. FcRn에 결합을 계측하는 방법은 알려져 있다 (예를 들면, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.)를 참조한다. 인간 FcRn 높은 친화성 결합 폴리펩티드의 생체내에서 인간 FcRn에 결합 및 혈청 반감기는 예를 들면, 인간 FcRn을 발현하는 유전자도입 생쥐 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드가 투여되는 영장류에서 검정될 수 있다. WO 2000/042072 (Presta)는 FcRs에 향상된 또는 축소된 결합을 갖는 항체 변이체를 설명한다. 예를 들면, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)를 또한 참조한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 상보성 결정 영역 (CDRs) 이외에 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 영역을 내포하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전히 동일하지는 않을 수 있으며, 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 선별검사되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 선별된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3의 경우에서와 같은 하위군이다. 일정한 구체예에서, VL의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 카파 I이다. 일정한 구체예에서, VH의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비인간 CDRs로부터 아미노산 잔기 및 인간 FRs로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 양상에서, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 CDRs의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 FRs의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성 (본원에서 "상보성 결정 영역" 또는 "CDRs" 로서 또한 지칭됨)이고 및/또는 구조적으로 규정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고 및/또는 항원 접촉 잔기 ("항원 접촉")를 내포하는, 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 별도로 지시되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인에서 다른 잔기 (예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 넘버링된다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR: VH에서 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에서 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다.
"면역접합체"는 세포독성 작용제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한 가지 또는 그 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체를 지칭한다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, "개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐 및 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
"단리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일정한 구체예에서, 항체는 예를 들면, 전기이동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정될 때, 95% 또는 99% 이상의 순도로 정제된다. 항체 순도의 사정을 위한 방법에 관한 리뷰를 위해, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
"단리된" 핵산은 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄와 경쇄 (또는 이들의 단편)를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자, 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서 이런 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포 내에 하나 또는 그 이상의 위치에서 존재하는 이런 핵산 분자(들)를 지칭한다.
용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특이적으로 퓨린- 또는 피리미딘 염기 (다시 말하면, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (다시 말하면, 데옥시리보오스 또는 리보오스), 그리고 인산염 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기의 서열에 의해 설명되는데, 여기서 상기 염기는 핵산 분자의 일차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기의 서열은 전형적으로 5'에서 3'로 나타내진다. 본원에서, 용어 핵산 분자는 예를 들면, 상보성 DNA (cDNA) 및 유전체 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 그리고 이들 분자 중에서 2가지 또는 그 이상을 포함하는 혼성 중합체를 포괄한다. 핵산 분자는 선형 또는 환상일 수 있다. 이에 더하여, 용어 핵산 분자는 센스와 안티센스 가닥뿐만 아니라 단일 가닥과 이중 가닥 형태 둘 모두를 포함한다. 게다가, 본원에서 설명된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 내포할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 실례는 유도체화된 당 또는 인산염 중추 연쇄 또는 화학적으로 변형된 잔기를 갖는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이런 DNA (예를 들면, cDNA) 또는 RNA (예를 들면, mRNA) 벡터는 변형되지 않거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 mRNA가 개체 내로 주입되어 항체가 생체내에서 산출될 수 있도록, RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 증강하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다 (참조: 예를 들면, Stadler er al, Nature Medicine 2017, 2017년 6월 12일 온라인 공개됨, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2101823 B1).
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 지시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본원에서 개시된 요부에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.
"나신 항체"는 이종성 모이어티 (예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 나신 항체는 제약학적 조성물 내에 존재할 수 있다.
"선천적 항체"는 변하는 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 선천적 IgG 항체는 디설피드 결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종삼합체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 또한 불리는 가변 영역 (VH), 그 이후에 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 또한 불리는 가변 영역 (VL), 그 이후에 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "포장 삽입물"은 치료 산물의 상업적인 패키지 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는데, 이것은 이런 치료 산물의 이용에 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포한다.
참조 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 정렬의 목적으로 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 대안으로, 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 산출될 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 소스 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087 하에 등록되고 WO 2001/007611에서 설명된다.
별도로 지시되지 않으면, 본원에서 목적을 위해, 퍼센트 아미노산 서열 동일성 값은 BLOSUM50 비교 매트릭스를 갖는 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 그 이후 버전의 ggsearch 프로그램을 이용하여 산출된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36에 의해 저술되었고, 그리고 www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 또는 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta로부터 공개적으로 가용하다. 대안으로, 국부보다는 전역 정렬이 수행되도록 담보하기 위해 ggsearch (global protein:protein) 프로그램 및 디폴트 옵션 (BLOSUM50; 개방: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 이용하여, fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 접근가능한 공개 서버가 서열을 비교하는 데 이용될 수 있다. 퍼센트 아미노산 동일성은 출력 정렬 헤더에서 제공된다.
용어 "제약학적 조성물"은 그 안에 내포된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 그리고 이러한 조성물이 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 제조물을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "제약학적으로 허용되는 운반체"는 개체에게 비독성인, 제약학적 조성물에서 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 제약학적으로 허용되는 운반체는 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변이, 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 코스를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 그리고 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 코스 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 또는 향상된 예후를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추는 데 이용될 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FRs) 및 3개의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함한다. (참조: 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 참조: 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
II. 항체
일정한 구체예에서, 본원 발명은 향상된 혈청 체류를 나타내고 중합성 항체 생산을 증가시키기 위해 항체, 예를 들면, IgA 항체 및 IgG-IgA 융합 분자를 가공하는 방법에 부분적으로 기초된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 FcRn에 결합을 나타낸다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 증가된 IgR-매개된 통과세포외배출을 나타낸다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 FcαRI에 대한 감소된 결합 및/또는 결합 없음을 나타낸다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 투여 이후에 친염증성 반응을 최소화함으로써 치료 세팅에서 우수한 안전성을 제공할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 향상된 혈청 체류를 나타내는 항체, 예를 들면, IgA 항체 및 IgG-IgA 융합 분자를 제공한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 항체, 예를 들면, IgA 항체 및 IgG-IgA Fc 융합 분자는 약 1 일까지, 약 2 일까지, 약 3 일까지, 약 4 일까지 또는 약 5 일까지 동안 혈장에서 안정된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체, 예를 들면, IgA 항체 및 IgG-IgA 융합 분자는 약 4 일까지 동안 혈장에서 안정된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 감소된 글리코실화 또는 글리코실화 없음을 갖는 항체, 예를 들면, IgA 항체 및 IgG-IgA 융합 분자를 제공한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이 본원 발명의 항체는 변형되지 않은 IgA 또는 변형되지 않은 IgG-IgA 융합 분자와 비교하여 글리코실화에서 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 감소를 나타낸다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 약 0.5%보다 적게, 약 1%보다 적게, 약 2%보다 적게, 약 5%보다 적게 글리코실화되거나, 약 10%보다 적게 글리코실화되거나, 약 20%보다 적게 글리코실화되거나, 약 30%보다 적게 글리코실화되거나, 또는 약 40%보다 적게 글리코실화된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 0% 글리코실화를 갖는다, 다시 말하면, 비글리코실화된다.
A. 예시적인 항체
1. IgA 항체 변이체
본원 발명은 항체가 글리코실화되는 정도를 감소시키도록 변형된 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 및 IgA2mn 항체를 제공한다. 항체의 글리코실화 부위의 결실은 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위가 제거되도록 항체의 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 또는 6개 또는 그 이상의 글리코실화 부위, 예를 들면, N-연결된 글리코실화 부위 및/또는 O-연결된 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 N-연결된 글리코실화 모티프 N-X-S/T (여기서 X는 임의의 아미노산이다) 중에서 하나 또는 그 이상을 제거하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, N-연결된 글리코실화 부위의 제거는 글리코실화 부위의 모티프 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 변형, 예를 들면, 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, N, X 및/또는 S/T 아미노산은 글리코실화 부위의 모티프에서 변형, 예를 들면, 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, 상기 모티프의 3개의 아미노산 모두가 돌연변이될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 중쇄 불변 도메인으로부터 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 또는 5개 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 항체는 중쇄 불변 도메인의 아미노산 166, 211, 263 및/또는 337에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 또는 4개의 N-연결된 글리코실화 부위 모두를 제거하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 중쇄의 테일피스에서 1개 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다 (도 1a 참조). 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 항체는 중쇄의 테일피스의 아미노산 459에서 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA1 항체는 아미노산 263 및/또는 449에서 하나 또는 그 이상의 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA2m1 항체는 아미노산 166, 263, 337 및/또는 449에서 하나 또는 그 이상의 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 166, 211, 263, 337 및/또는 449에서 하나 또는 그 이상의 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체는 중쇄 불변 도메인 및 테일피스를 포함하는, 항체의 중쇄로부터 모든 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 비글리코실화될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 비글리코실화된 항체는 중쇄 불변 영역 및 테일피스를 포함하는, 항체의 중쇄 상에서 글리코실화를 갖지 않는 항체이다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 비글리코실화된 항체는 중쇄 불변 영역 및 테일피스를 포함하는 중쇄 상에서 글리코실화를 갖지 않고, 그리고 J 사슬 상에서 글리코실화를 갖지 않는 항체이다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 IgA 항체의 글리코실화를 감소시키기 위해, 아미노산 166, 168, 211, 212, 213, 263, 265, 337, 338, 339, 459 및/또는 461에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 11개 또는 그 이상, 또는 12개의 변형, 예를 들면, 치환을 갖는 IgA 항체를 제공한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명은 IgA 항체의 글리코실화를 감소시키기 위해, 아미노산 N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459 및/또는 S461에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 11개 또는 그 이상, 또는 12개의 변형, 예를 들면, 치환을 갖는 IgA 항체를 제공한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA1 항체는 아미노산 263, 265, 459 및/또는 461에서, 예를 들면, 아미노산 N263, T265, N459 및/또는 S461에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 또는 4개의 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA2m1 항체는 아미노산 166, 168, 263, 265, 337, 338, 339, 459 및/또는 461에서, 예를 들면, 아미노산 N166, T168, N263, T265, N337, I338, T339, N459 및/또는 S461에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 또는 8개의 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 166, 168, 211, 212, 213, 263, 265, 337, 338, 339, 459 및/또는 461에서, 예를 들면, 아미노산 N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459 및/또는 S461에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 11개 또는 그 이상, 또는 12개의 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 3개의 아미노산 337, 338 및 339 모두에서, 예를 들면, 아미노산 N337, I338 및 T339에서 변형된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 N166에서 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 N168에서 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 S211에서 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 S212에서 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 S213에서 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 N263에서 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 N265에서 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 3개의 아미노산 N337, I338 및 T339에서 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 N459에서 변형을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 아미노산 S461에서 변형을 갖는다.
일정한 구체예에서, 아미노산 N은 A, G 또는 Q 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, 아미노산 S는 A 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, 아미노산 T는 A 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, 본원 발명의 IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 하기의 돌연변이 N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S 및 N459Q 중에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 또는 7개 모두를 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 IgA1 항체는 하기의 돌연변이 N263Q 및 N459Q 중에서 1개 또는 그 이상, 또는 2개 모두를 포함하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA2m1 항체는 하기의 돌연변이 N166A, N263Q, N337T, I338L, T339S 및 N459Q 중에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 또는 6개 모두를 포함하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 하기의 돌연변이 N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S 및 N459Q 중에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 또는 7개 모두를 포함하도록 변형될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체의 J 사슬은 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 예를 들면, 아미노산 49, 50 및 51을 포괄하는, 글리코실화 부위 모티프의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 변형함으로써, J 사슬의 아미노산 49에서 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이 J 사슬의 아미노산 N49 및/또는 아미노산 S51이 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 아미노산 N은 A, G 또는 Q 아미노산으로 돌연변이될 수 있고 및/또는 아미노산 S는 A 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이 본원 발명의 항체의 J 사슬은 N49A/G/Q 돌연변이 및/또는 S51A 돌연변이를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체의 J 사슬은 N49Q 돌연변이를 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 중쇄로부터 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 또는 5개 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 제거하도록 변형되고, 그리고 J 사슬로부터 1개의 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 중쇄의 아미노산 N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459 및/또는 S461에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 11개 또는 그 이상, 또는 12개의 변형, 예를 들면, 치환, 그리고 J 사슬의 아미노산 N49 및/또는 S51에서 1개 또는 2개의 변형, 예를 들면, 치환을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 중쇄의 아미노산 N166, S212, N263, N337, I338, T339 및/또는 N459에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 또는 7개 모두의 변형, 예를 들면, 치환, 그리고 J 사슬의 아미노산 N49 및/또는 S51에서 1개 또는 2개의 변형, 예를 들면, 치환을 갖는다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체는 IgA 항체의 글리코실화를 감소시키기 위해 아미노산 N459 또는 S461에서 하나 또는 그 이상의 변형을 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 아미노산 N459 및/또는 S461의 변형은 중합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체, 사합체 및 오합체를 산출하는 증가된 능력을 갖는 항체를 유발한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체, 예를 들면, IgA 항체는 아미노산 458에서 변형, 예를 들면, 치환을 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 아미노산 V458에서 치환을 갖는 IgA1, IgA2m1 및 IgA2mn 항체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 V458은 이소류신 (다시 말하면, V458I)으로 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 아미노산 I458에서 치환을 갖는 IgA2m2 항체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 I458은 발린 (다시 말하면, I458V)으로 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 변형 중에서 한 가지 또는 그 이상이 본원에서 설명된 바와 같이, 감소된 글리코실화 또는 글리코실화 없음을 갖는 항체 내에 존재할 수 있다,
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체, 예를 들면, IgA 항체는 아미노산 C471 및/또는 C311에서 변형, 예를 들면, 치환을 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 C471에서 돌연변이, 예를 들면, C471S를 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 C311에서 돌연변이, 예를 들면, C311S를 가질 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체의 변형은 일정한 향상된 특성을 갖는 항체 변이체를 창출하기 위해 만들어 질 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 감소된 글리코실화를 갖는 본원 발명의 항체는 향상된 혈청 체류를 나타낼 수 있다. 일정한 구체예에서, 감소된 글리코실화를 갖는 본원 발명의 항체는 중합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체, 사합체 및 오합체를 산출하는 증가된 능력을 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 감소된 글리코실화를 갖는 본원 발명의 항체는 IgA-특이적 hFc 수용체, FcαRI에 대한 감소된 결합, 예를 들면, FcαRI에 대한 결합 없음을 나타낼 수 있다. 일정한 구체예에서, 아미노산 458, 459 및/또는 S461에서 변형을 갖는 본원 발명의 항체는 이들 변형 중에서 한 가지도 갖지 않는 항체와 비교하여, 중합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체, 사합체 및 오합체를 산출하는 증가된 능력을 갖는다. 일정한 구체예에서, 아미노산 C471에서 변형을 갖는 본원에서 개시된 항체는 중합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체, 사합체 및 오합체를 산출하는 감소된 능력을 갖는다.
2. IgG-IgA 융합 분자
본원 발명은 본원에서 IgG-IgA 융합 분자로서 지칭되는, IgG 항체의 적어도 일부 및 IgA 항체의 적어도 일부를 포함하는 항체를 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 프로테아제, 예를 들면, 퓨린에 대한 증가된 내성, 활성 및/또는 증가된 혈청 반감기를 갖는다 (표 9 참조). 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 FcRn에 결합한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자의 IgG 항체는 전장 IgG 항체일 수 있다. 일정한 구체예에서, IgG 항체는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합하는 임의의 IgG 항체일 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다. 일정한 구체예에서, IgG 항체는 IgG1 항체이다. 일정한 구체예에서, IgG 항체는 IgG2 항체이다. 일정한 구체예에서, IgG 항체는 IgG3 항체이다. 일정한 구체예에서, IgG 항체는 IgG4 항체이다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 IgA 항체의 단편에 융합된 IgG 항체를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 IgA1, IgA2m1, IgA2mn 또는 IgA2m2 항체일 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 단편은 길이에서 약 300개 아미노산, 길이에서 약 250개 아미노산, 길이에서 약 200개 아미노산, 길이에서 약 150개 아미노산, 길이에서 약 100개 아미노산, 길이에서 약 80개 아미노산, 길이에서 약 60개 아미노산, 길이에서 약 40개 아미노산, 또는 길이에서 약 20개 아미노산일 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 단편은 길이에서 약 250개 아미노산이다. 일정한 구체예에서, IgA 단편은 길이에서 약 20개 아미노산, 예를 들면, 약 18개 아미노산이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 단편은 IgA 항체의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 단편은 IgA 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 단편은 IgA 항체의 힌지 영역을 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 단편은 IgA 항체의 테일피스를 더욱 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 IgG 항체 및 IgA 항체의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, IgG-IgA 융합 분자는 자체의 C 말단에서 본원에서 개시된 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 IgG 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgG-IgA 융합 분자는 자체의 C 말단에서 IgA 중쇄의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 중쇄 서열을 포함할 수 있다 (도 7b, 12 및 34a 참조).
일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 P221의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체의 아미노산 P221-Y472를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 항체, 예를 들면, IgA1 또는 IgA2m1 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 P221의 서열을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, P221 아미노산은 아르기닌 (R), 다시 말하면, P221R로 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 항체, 예를 들면, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 R221의 서열을 포함할 수 있다, 예를 들면, IgA 항체의 아미노산 R221-Y472를 포함할 수 있다. 대안으로, IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체의 힌지 영역을 결실하는 중쇄의 C 말단을 통해 C242의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 융합 분자의 IgA 부분은 IgA 항체의 아미노산 C242-Y472를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 V222의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2mn 또는 IgA2m2 항체의 아미노산 V222-Y472를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 P223의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2mn 또는 IgA2m2 항체의 아미노산 P223-Y472를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 C241의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체의 아미노산 C241-Y472를 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 P237의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2mn 또는 IgA2m2 항체의 아미노산 P237-Y472를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 P238의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체, 예를 들면, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체의 아미노산 P238-Y472를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 S238의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체, 예를 들면, IgA1 항체의 아미노산 S238-Y472를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 P239의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체의 아미노산 P239-Y472를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 P240의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체, 예를 들면, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체의 아미노산 P240-Y472를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분, 예를 들면, IgA 항체의 Fc 영역은 중쇄의 C 말단을 통해 S240의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체 부분은 IgA 항체, 예를 들면, IgA1 항체의 아미노산 S240을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 분자의 IgA 부분은 IgA 항체의 테일피스, 예를 들면, 아미노산 454-472를 포함하지 않는다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 한쪽 IgA 아이소타입으로부터 Fc 영역 및 두 번째 아이소타입으로부터 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 IgA2, 예를 들면, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체로부터 힌지 영역을 포함할 수 있고, 그리고 IgA1 항체로부터 Fc 영역을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, IgG 항체의 중쇄는 IgG 항체 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)의 C 말단 리신 아미노산, 예를 들면, 아미노산 K447을 제거하도록 변형되었다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명은 아미노산 K447을 결여하는 IgG 항체 및 IgA 항체의 아미노산 P221-Y472 또는 R221-Y472를 포함하는 IgA 부분을 포함하는 IgG-IgA 융합 분자를 제공한다.
일정한 구체예에서, IgG 항체 및 IgA 항체의 Fc 영역 사이에 접합부는 아미노산 서열 TQKSLSLSPGPVPPPPPCC (서열 번호: 1) 또는 이의 단편 또는 이의 보존성 치환을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, IgG 항체 및 IgA 항체의 Fc 영역 사이에 접합부는 아미노산 서열 TQKSLSLSPGC (서열 번호: 2) 또는 이의 단편 또는 이의 보존성 치환을 포함할 수 있다. 보존성 치환의 무제한적 실례는 표 1에서 제공된다. 일정한 구체예에서, IgG 항체 및 IgA 항체의 Fc 영역 사이에 접합부는 도 34a에서 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA Fc 융합은 약 1 일까지, 약 2 일까지, 약 3 일까지, 약 4 일까지 또는 약 5 일까지 동안 혈장에서 안정된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 IgG1-IgA Fc 융합은 약 4 일까지 동안 혈장에서 안정된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 글리코실화를 감소시키기 위해, 전술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 더욱 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 IgA 항체의 중쇄 및/또는 IgG-IgA 융합 분자의 J 사슬의 글리코실화를 제거하도록 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, IgG-IgA 융합 분자의 IgA 항체는 비글리코실화된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 FcRn에는 결합하지만 FcαRI에는 결합하지 않는다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 또는 그 이상의 치환을 더욱 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 아미노산 297에서 치환, 예를 들면, N297G를 더욱 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 아미노산 C471 및/또는 C311에서 치환을 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자는 아미노산 C471에서 돌연변이, 예를 들면, C471S를 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 IgG-IgA Fc 융합 분자는 아미노산 C311에서 돌연변이, 예를 들면, C311S를 가질 수 있다.
B. 키메라 및 인간화 항체
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 키메라 항체이다. 일정한 키메라 항체는 예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에서 설명된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 키메라 항체는 비인간 가변 영역 (예를 들면, 생쥐, 쥐, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 실례에서, 키메라 항체는 "부류 전환된" 항체일 수 있는데, 여기서 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화되었다. 키메라 항체는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 키메라 항체는 인간화 항체일 수 있다. 전형적으로, 비인간 항체는 부모 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVRs, 예를 들면, CDRs (또는 이들의 부분)가 비인간 항체로부터 유래되고, 그리고 FRs (또는 이들의 부분)가 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 또는 그 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의선택적으로, 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 리뷰되고, 그리고 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 합체를 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "보도된 선별" 접근법을 설명)에서 더욱 설명된다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 하기를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: "최고 적합" 방법을 이용하여 선별된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); 인간 성숙 (체성으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 그리고 FR 라이브러리를 선별하는 것으로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
C. 인간 항체
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 인간 항체일 수 있다. 인간 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다.
인간 항체는 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 포함하는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이런 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포한다. 이런 유전자도입 생쥐에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화된다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법에 관한 리뷰를 위해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예를 들면, XENOMOUSETM 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HUMAB® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 7,041,870, 그리고 VELOCIMOUSE® 기술을 설명하는 U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이런 동물에 의해 산출된 무손상 항체로부터 인간 가변 영역은 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 더욱 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한, 하이브리도마-기초된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 설명되었다. (참조: 예를 들면, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 산출된 인간 항체 역시 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가 방법은 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기법 (트리오마 기술) 역시 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
인간 항체는 또한, 인간-유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 산출될 수 있다. 이런 가변 도메인 서열은 이후, 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술은 아래에 설명된다.
D. 항체 변이체
본원에서 개시된 요부는 개시된 항체의 아미노산 서열 변이체를 더욱 제공한다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형은 항체의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 이들 서열 내로 삽입 및/또는 이들 서열 내에 잔기의 치환을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 최종 항체, 다시 말하면, 변형된 항체가 원하는 특징, 예를 들면, 항원 결합을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.
1. 치환, 삽입 및 결실 변이체
일정한 구체예에서, 항체 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심되는 부위는 HVRs 및 FRs를 포함한다. 보존성 치환의 무제한적 실례는 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에서 도시된다. 더 실제적인 변화의 무제한적 실례는 "예시적인 치환"의 표제 하에 표 1에서 제공되고, 그리고 아미노산 측쇄 부류에 관하여 아래에 더욱 설명된다. 아미노산 치환은 관심되는 항체 내로 도입될 수 있고, 그리고 산물은 원하는 활성, 예를 들면, 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 향상된 보체 의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)에 대해 선별검사될 수 있다.
표 1.
본래
잔기 		예시적인
치환 		바람직한
치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 군화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향정위에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
일정한 구체예에서, 비보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
일정한 구체예에서, 치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다, 예를 들면, 인간화 또는 인간 항체이다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선별되는 결과의 변이체(들)는 부모 항체에 비하여 일정한 생물학적 특성에서 변형, 예를 들면, 향상, 예컨대 하지만 제한 없이, 증가된 친화성, 감소된 면역원성을 가질 것이고 및/또는 부모 항체의 실제적으로 유지된 일정한 생물학적 특성을 가질 것이다. 치환 변이체의 무제한적 실례는 친화성 성숙된 항체인데, 이것은 예를 들면, 파지 전시-기초된 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에서 설명된 것들을 이용하여 편의하게 산출될 수 있다. 간단히 말하면, 하나 또는 그 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 그리고 변이체 항체는 파지에서 전시되고 특정 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화성)에 대해 선별검사된다.
일정한 구체예에서, 예를 들면, 항체 친화성을 향상시키기 위해 HVRs에서 변경 (예를 들면, 치환)이 만들어질 수 있다. 이런 변경은 HVR "핫스팟", 다시 말하면, 체성 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (예를 들면, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 및/또는 항원에 접촉하는 잔기에서 만들어질 수 있으며, 결과의 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 검사된다. 이차 라이브러리를 구축하고 이들로부터 재선별함에 의한 친화성 성숙은 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에서 설명되었다. 친화성 성숙의 일정한 구체예에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들면, 오류 가능성 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이)에 의해, 성숙을 위해 선택된 가변적 유전자 내로 도입될 수 있다. 이차 라이브러리가 이후 창출된다. 상기 라이브러리는 이후, 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별검사된다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 수반하는데, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들면, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이런 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실제적으로 감소시키지 않으면, 하나 또는 그 이상의 HVRs 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성을 실제적으로 감소시키지 않는 보존성 변경 (예를 들면, 본원에서 제시된 바와 같은 보존성 치환)이 HVRs에서 만들어질 수 있다. 이런 변경은 예를 들면, HVRs에서 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 앞서 제공된 변이체 VH와 VL 서열의 일정한 구체예에서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 내포한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들면, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)이 확인되고, 그리고 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는 지를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가 치환은 초기 치환에 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 항체 및 항원 사이에 접촉 포인트를 확인하기 위한 항원 항체 복합체의 결정 구조. 이런 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 내포하는 지를 결정하기 위해 선별검사될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 100개 또는 그 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들면, 항체-지향된 효소 전구약물 요법 (ADEPT)의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N 또는 C 말단에 융합을 포함한다.
2. Fc 영역 변이체
일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어, Fc 영역 변이체가 산출될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들면, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgA Fc 영역 또는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 전부는 아니지만 일부 작동체 기능을 소유하는 항체 변이체를 제공하는데, 이들 기능으로 인해 이것은 생체내에서 항체의 반감기가 중요하고, 반면 일정한 작동체 기능 (예를 들면, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 또는 유해한 적용을 위한 바람직한 후보가 된다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확증하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들면, 항체가 IgA-특이적 hFc 수용체, 다시 말하면, FcαRI 결합을 결여하지만, FcRn 결합 능력을 유지하도록 담보하기 위해, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지에서 표 3에 요약된다. 예를 들면, ADCC를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위한 시험관내 검정의 무제한적 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362 (예를 들면, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)을 참조한다) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)을 참조한다)에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (참조: 예를 들면, 유세포분석법의 경우에 ACTITM 비방사성 세포독성 검정 (Cell Technology, Inc. Mountain View, CA); 및 CYTOTOX 96® 비방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)). 이런 검정을 위한 유용한 작동체 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예컨대 Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확증하기 위해, C1q 결합 검정 또한 실행될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 사정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 소실/반감기 결정이 또한, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)). 일정한 구체예에서, 예를 들면, US 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (다시 말하면, 향상된 또는 축소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유발하는 Fc 영역에서 변경이 만들어질 수 있다.
감소된 작동체 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (U.S. 특허 번호 6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 번호 7,332,581).
FcRs에 향상된 또는 축소된 결합을 갖는 일정한 항체 변이체가 설명된다. 참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 그리고 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 예컨대 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체의 Fc 영역에서 만들어진 변경은 증가된 반감기, 그리고 모계 IgGs의 태아로의 전달을 책임지는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 향상된 결합을 갖는 변이체 항체 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))를 생산할 수 있고, US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 Fc 영역의 결합을 향상시키는, 그 안에 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이런 Fc 변이체는 다음의 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 또는 그 이상에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (US 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 실례와 관련하여, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 번호 5,648,260; U.S. 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 또한 참조한다.
3. 시스테인 가공된 항체 변이체
일정한 구체예에서, 시스테인 가공된 항체, 예를 들면 "thioMAbs"를 창출하는 것이 바람직할 수 있는데, 여기서 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다. 특정한 구체예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 따라서, 항체의 접근가능한 부위에서 위치되고, 그리고 상기 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여 본원에서 더욱 설명된 바와 같은 면역접합체를 창출하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 하기 잔기 중에서 하나 또는 그 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 가공된 항체는 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,521,541에서 설명된 바와 같이 산출될 수 있다.
4. 항체 유도체
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 당해 분야에서 공지되고 쉽게 가용한 추가 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 무제한적 실례는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인해, 제조 시에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지되거나 또는 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 숫자는 변할 수 있고, 그리고 하나 이상의 중합체가 부착되면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 숫자 및/또는 유형은 향상되는 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 이용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다.
일정한 구체예에서, 방사선에 노출에 의해 선별적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 구체예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 일정한 구체예에서, 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 그리고 일상적인 세포를 훼손하지 않지만 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질성 모이어티 근위의 세포가 사멸되는 온도까지 가열하는 파장을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
5. 면역접합체
본원에서 개시된 요부는 한 가지 또는 그 이상의 세포독성 작용제, 예컨대 화학요법 작용제 또는 약물, 성장 저해제, 단백질, 펩티드, 독소 (예를 들면, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된, 본원에서 개시된 항체를 포함하는 면역접합체를 또한 제공한다. 예를 들면, 개시된 요부의 항체는 하나 또는 그 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결될 수 있다 (예를 들면, 화학적 연계, 유전자 융합, 비공유 연관 또는 다른 것에 의해).
일정한 구체예에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체 (ADC)인데, 여기서 본원 발명의 항체는 메이탄시노이드 (참조: U.S. 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸라우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (참조: U.S. 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588 및 7,498,298); 돌라스타틴; 칼리키아마이신 또는 이의 유도체 (참조: U.S. 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer. Res. 58:2925-2928 (1998)); 안트라사이클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (참조: Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 U.S. 특허 번호 6,630,579); 메토트렉사트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 하나 또는 그 이상의 약물에 접합된다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 효소적으로 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 항체를 포함한다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 방사접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사접합체의 생산에 가용하다. 무제한적 실례는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사접합체가 검출에 이용될 때, 이것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상법, mri로서 또한 알려져 있음)를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 단편 및 세포독성 작용제의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 연계 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피온산염 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실산염 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들면, 디숙신이미딜 수베르산염), 알데히드 (예를 들면, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들면, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들면, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들면, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예를 들면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에서 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 참조: WO 94/11026. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "개열가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티드분해효소-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-내포 링커 (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); U.S. 특허 번호 5,208,020)가 이용될 수 있다. 링커의 무제한적 실례는 상기에 개시된다.
본원에서 개시된 면역접합체는 상업적으로 가용한 (예를 들면, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 그리고 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 교차연결제 시약으로 제조된 이와 같은 접합체를 명시적으로 예기하지만, 이들에 한정되지 않는다.
III. 항체 생산과 정제의 방법
A. 항체 생산의 방법
본원에서 개시된 항체는 당해 분야에서 임의의 가용한 또는 공지된 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 항체는 예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567에서 설명된 바와 같은 재조합 방법과 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 본원 발명의 항체, 예를 들면, IgA 항체 및 IgG-IgA 융합 분자를 산출하기 위한 상세한 절차는 아래의 실시예에서 설명된다.
본원에서 개시된 요부는 본원에서 개시된 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 더욱 제공한다. 예를 들면, 단리된 핵산은 본원 발명의 비글리코실화된 항체를 인코딩하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 단리된 핵산은 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 또는 6개 또는 그 이상의 글리코실화 부위, 예를 들면, N-연결된 글리코실화 부위 및/또는 O-연결된 글리코실화 부위를 제거하도록 변형된 IgA 항체를 인코딩하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 단리된 핵산은 아미노산 N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459 및/또는 S461에서 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 11개 또는 그 이상, 또는 12개의 변형, 예를 들면, 치환을 갖는 IgA 항체를 인코딩하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 단리된 핵산은 본원에서 개시된 IgG-IgA 융합 분자, 예를 들면, IgG-IgA Fc 융합 분자를 인코딩하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다.
일정한 구체예에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 벡터, 예를 들면, 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신에게 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 가지 유형은 "플라스미드"인데, 이것은 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터인데, 여기서 추가 DNA 분절이 바이러스 유전체 내로 결찰될 수 있다. 일정한 벡터 (예를 들면, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들면, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 유전체 내로 통합되고, 그리고 따라서, 숙주 유전체와 함께 복제된다. 게다가, 일정한 벡터, 발현 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 주동할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종, 플라스미드 (벡터)의 형태이다. 하지만, 개시된 요부는 동등한 기능을 제공하는 이런 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예를 들면, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관된 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 및/또는 상기 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포 내로 핵산의 도입은 형질감염, 전기천공, 미량주사, 핵산 서열을 내포하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로 감염, 세포 융합, 염색체-매개된 유전자 전달, 마이크로세포-매개된 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 실행될 수 있다. 일정한 구체예에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 경쇄를 포함하는 아미노산 서열, 항체의 중쇄를 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 J 사슬을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터; (2) (a) 항체의 경쇄를 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 중쇄를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 첫 번째 벡터, 그리고 (b) 항체의 J 사슬을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 두 번째 벡터; 또는 (3) (a) 항체의 경쇄를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 첫 번째 벡터, (b) 항체의 중쇄를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 두 번째 벡터, 그리고 (c) 항체의 J 사슬을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세 번째 벡터를 포함할 수 있다, 예를 들면 이들로 형질전환되었다. 일정한 구체예에서, 숙주 세포는 (a) 항체의 경쇄를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 첫 번째 벡터, (b) 항체의 중쇄를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 두 번째 벡터, (c) 항체의 J 사슬을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세 번째 벡터, 그리고 (d) 항체의 분비 성분을 포함하는 아미노산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 네 번째 벡터를 포함할 수 있다, 예를 들면 이들로 형질전환되었다.
일정한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 일정한 구체예에서, 숙주 세포는 293 세포, 예를 들면, Expi293 세포이다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체를 만드는 방법은 상기 항체의 발현에 적합한 조건 하에, 상기 항체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산이 도입된 숙주 세포를 배양하고, 그리고 숙주 세포 및/또는 숙주 세포 배양 배지로부터 항체를 임의적으로 회수하는 것을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체는 크로마토그래피 기술을 통해 숙주 세포로부터 회수된다.
본원 발명의 항체의 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 그리고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 또는 그 이상의 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이런 핵산은 전통적인 절차를 이용하여 (예를 들면, 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에서 설명된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 작동체 기능이 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 세균에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (대장균 (E. coli)에서 항체 단편의 발현을 설명하는, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254를 또한 참조한다). 발현 후, 항체는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 유발하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006). 글리코실화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다.
글리코실화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다.
일정한 구체예에서, 식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명).
일정한 구체예에서, 척추동물 세포 또한, 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그리고 제한 없이, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 무제한적 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)에서 설명된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에서 설명된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에서 설명된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 그리고 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 리뷰를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다.
일정한 구체예에서, 동물 시스템이 본원 발명의 항체를 생산하는 데 이용될 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 한 가지 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 생쥐에서 하이브리도마 생산은 매우 널리 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜과 기술은 당해 분야에서 공지된다. 융합 파트너 (예를 들면, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 알려져 있다 (참조: 예를 들면, Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York).
1. 중합성 IgA 생산의 방법
본원 발명은 중합성 IgA를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 방법은 2개 또는 그 이상의 IgA 단량체, 예를 들면, 약 2개 내지 약 5개의 IgA 단량체를 내포하는 IgA 중합체를 생산하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 방법은 IgA 이합체, 삼합체, 사합체 및/또는 오합체를 생산하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 방법은 세포 내로 도입되는, 예를 들면, 형질감염되는 J 사슬을 인코딩하는 DNA의 양 대 경쇄 (LC) 및/또는 중쇄 (HC)를 인코딩하는 DNA의 양의 비율을 변경하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 이런 방법은 세포 내로 도입되는, 예를 들면, 형질감염되는 J 사슬을 인코딩하는 DNA의 양 대 LC, HC 및 분비 성분 (SC)을 인코딩하는 DNA의 양의 비율을 변경하는 단계를 포함한다.
본원 발명은 IgA 이합체의 생산을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, IgA 이합체의 생산을 증가시키기 위한 방법은 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 DNA의 양에 비하여, 세포 내로 도입되는, 예를 들면, 형질감염되는 J 사슬을 인코딩하는 DNA의 양을 증가시키는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 증가된 발현은 동등한 양의 J 사슬, 중쇄 및 경쇄 DNA가 도입된, 예를 들면, 이들로 형질감염된 세포에서 생산된 IgA 이합체의 양에 상대적이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 이들 방법은 IgA1, IgA2m1, IgA2m1.P221R 이합체, IgA2m2 및 IgA2mn 이합체를 생산하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 방법은 IgA 이합체의 생산을 증가시키기 위한 약 1:1:2, 약 1:1:3, 약 1:1:4 또는 약 1:1:5인, 중쇄를 인코딩하는 DNA의 양 대 경쇄를 인코딩하는 DNA의 양 대 J 사슬을 인코딩하는 DNA의 양의 비율 (HC:LC:JC), 예를 들면, 약 1:1:2 내지 약 1:1:5의 비율로 숙주 세포 내로 도입하는, 예를 들면, 숙주 세포를 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 방법은 경쇄를 인코딩하는 DNA의 양 및/또는 중쇄를 인코딩하는 DNA의 양보다 약 2 배 큰, 약 3 배 큰, 약 4 배 큰 또는 약 5 배 큰, J 사슬을 인코딩하는 DNA의 양으로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다.
본원 발명은 IgA 중합체의 생산을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명은 IgA 이합체, 삼합체, 사합체 및/또는 오합체의 생산을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, IgA 중합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체, 사합체 및/또는 오합체의 생산을 증가시키기 위한 방법은 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 DNA의 양에 비하여, 세포 내로 도입되는 J 사슬을 인코딩하는 DNA의 양을 감소시키는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 증가된 생산은 J 사슬 DNA의 양에 비하여, 동등한 양의 중쇄와 경쇄 DNA가 도입된, 예를 들면, 이들로 형질감염된 세포에서 생산된 IgA 중합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체, 사합체 및/또는 오합체의 양에 상대적이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 이들 방법은 IgA1, IgA2m1, IgA2m1 P221R, IgA2m2 또는 IgA2mn 중합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체, 사합체 및/또는 오합체를 생산하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 방법은 IgA 삼합체, 사합체 및/또는 오합체의 생산을 증가시키기 위해 약 1:1:0.25 또는 약 1:1:0.5인, 중쇄를 인코딩하는 DNA의 양 대 경쇄를 인코딩하는 DNA의 양 대 J 사슬을 인코딩하는 DNA의 양의 비율 (HC:LC:JC), 예를 들면, 약 1:1:0.25 내지 약 1:1:0.5의 비율로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, J 사슬을 인코딩하는 DNA의 양은 경쇄를 인코딩하는 DNA의 양 및/또는 중쇄를 인코딩하는 DNA의 양보다 약 3 배 이하, 약 2 배 이하 또는 약 1 배 이하로 크다. 일정한 구체예에서, J 사슬을 인코딩하는 DNA의 양은 경쇄를 인코딩하는 DNA의 양 및/또는 중쇄를 인코딩하는 DNA의 양의 약 0.5 배 이하 또는 약 0.25 배 이하일 수 있다.
일정한 구체예에서, IgA1, IgA2m1 및/또는 IgA2mn 삼합체, 사합체 및 오합체의 생산을 증가시키기 위한 방법은 세포에서, 아미노산 V458에서 치환을 갖는 IgA1 항체, IgA2m1 항체 및/또는 IgA2mn 항체를 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 아미노산 V458은 이소류신 (다시 말하면, V458I)으로 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA1, IgA2m1 및/또는 IgA2mn 삼합체, 사합체 및 오합체의 생산에서 증가는 세포에서, 아미노산 V458에서 치환을 갖지 않는 IgA1 항체, IgA2m1 항체 및/또는 IgA2mn 항체의 발현으로부터 발생하는 IgA1, IgA2m1 및/또는 IgA2mn 삼합체, 사합체 및 오합체의 생산에 상대적이다.
일정한 구체예에서, IgA2m2 이합체의 생산을 증가시키기 위한 방법은 아미노산 I458에서 치환을 갖는 IgA2m2 항체를 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 아미노산 I458은 발린 (다시 말하면, I458V)으로 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA2m2 이합체의 생산에서 증가는 아미노산 I458에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체의 발현으로부터 발생하는 IgA2m2 이합체의 생산에 상대적이다.
일정한 구체예에서, IgA 중합체의 생산을 증가시키기 위한 방법은 예를 들면, 글리코실화 부위를 제거하도록 변형되지 않은 IgA 항체에 의한 IgA 중합체의 생산에 비하여, 예를 들면, 아미노산 치환 (전술된 바와 같음)에 의해 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 IgA 항체로부터 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 중합체의 생산을 증가시키기 위한 방법은 아미노산 N459 및/또는 S461에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA 항체는 아미노산 N459에서 치환을 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 S461에서 치환을 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA 항체는 아미노산 N459 및/또는 S461에서 치환을 가질 수 있다. 이런 치환의 무제한적 실례는 N459의 A, G 또는 Q로의 돌연변이를 포함한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 S461은 A로 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, IgA1 중합체의 생산을 증가시키기 위한 방법은 아미노산 N459 및/또는 S461에서 치환, 예를 들면, 아미노산 N459 및 S461에서 치환을 갖는 IgA1 항체를 발현하는 단계를 포함하고, 예를 들면 여기서 증가된 발현은 아미노산 N459 및/또는 S461에서 치환을 갖지 않는 IgA1 항체의 발현에 의해 생산된 IgA1 중합체의 양에 상대적이다. 일정한 구체예에서, IgA2 중합체, 예를 들면, IgA2m1, IgA2m2 및 IgA2mn 중합체의 생산을 증가시키기 위한 방법은 아미노산 N459 및/또는 S461에서 치환, 예를 들면, 아미노산 N459 및 S461에서 치환을 갖는 IgA2 항체를 발현하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, IgA2 중합체의 생산에서 증가는 아미노산 N459 및/또는 S461에서 치환을 갖지 않는 IgA2 항체의 발현으로부터 발생하는 IgA2 중합체의 생산에 상대적이다.
일정한 구체예에서, IgA 중합체의 생산을 감소시키기 위한 (예를 들면, IgA 단량체의 생산을 증가시키기 위한) 방법은 아미노산 C471에서 치환, 예를 들면, C471S 돌연변이를 갖는 IgA 항체, 예를 들면, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체를 발현하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgA2m2 중합체의 생산을 감소시키기 위한 방법은 아미노산 C471에서 치환, 예를 들면, C471S 돌연변이를 갖는 IgA2m2 항체를 발현하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, IgA 중합체, 예를 들면, IgA2m2 중합체의 생산에서 감소는 아미노산 C471에서 치환을 갖지 않는 IgA 항체, 예를 들면, IgA2m2 항체의 발현으로부터 발생하는 IgA 중합체, 예를 들면, IgA2m2 중합체의 생산에 상대적이다.
2. 중합성 IgG-IgA 융합 분자 생산의 방법
본원 발명은 본원 발명의 IgG-IgA 융합 분자를 생산하기 위한 방법을 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 본원에서 개시된 IgG-IgA 융합 분자의 이합체를 산출하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 본원에서 개시된 IgG-IgA 융합 분자의 중합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체 및/또는 사합체를 생산하기 위한 방법을 제공한다.
일정한 구체예에서, 이들 방법은 IgG-IgA 융합 분자의 이합체의 생산에 관계한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgG-IgA 융합 분자의 이합체를 발현하는 방법은, 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 IgG-IgA 융합 분자를 발현하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 P221 또는 R221을 포함하는 서열을 포함하고, 그리고 IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 포함한다.
일정한 구체예에서, 이들 방법은 본원에서 개시된 IgG-IgA 융합 분자의 중합체의 생산에 관계한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, IgG-IgA 융합 분자의 중합체를 발현하는 방법은, 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 IgG-IgA 융합 분자를 발현하는 단계를 포함하고, 여기서 IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 C242를 포함하는 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법에 의해 생산된 IgG-IgA 융합 분자의 중합체는 IgG-IgA 융합 분자의 이합체, 삼합체 및/또는 사합체를 포함한다.
B. 항체 정제의 방법
본원 발명은 본원에서 개시된 항체를 정제하기 위한 방법을 더욱 제공한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명은 본원에서 개시된 항체의 소중합체성 상태를 분리하기 위한, 예를 들면, 상기 항체의 사합체성 상태로부터 이합체성 상태를 분리하기 위한 방법을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체를 정제하기 위한 방법은 단백질 친화성 칼럼을 이용하여, 이들 항체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 방법은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, SEC는 본원에서 개시된 항체의 특정한 소중합체성 상태, 예를 들면, IgA 항체 및/또는 IgG-IgA 융합 분자를 정제하고 및/또는 단리하기 위해 수행될 수 있다. 일정한 구체예에서, SEC는 본원에서 개시된 항체의 한 가지 소중합체성 상태, 예를 들면, 이합체성 상태, 삼합체성 상태, 사합체성 상태 및/또는 오합체성 상태를 정제하고 및/또는 단리하기 위해 수행될 수 있다.
일정한 구체예에서, 단백질 친화성 칼럼은 MabSelect Sure (GE Healthcare) 칼럼일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체, 예를 들면, 한 가지 소중합체성 상태를 일차적으로 내포하는 IgA 표본은 MabSelect Sure (GE Healthcare)를 이용하여 친화성 정제되고, 그 이후에 HiLoad Superdex 칼럼 (GE Healthcare)을 이용한 SEC가 뒤따를 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체, 예를 들면, 본원에서 개시된 IgA 항체는 단백질 L (GE Healthcare), 그 이후에 SEC로 정제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 단백질 L 칼럼은 트리스 완충액 (25 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM NaN3)을 포함하는 첫 번째 세척 완충액으로 세척될 수 있다. 일정한 구체예에서, 단백질 L 칼럼은 내독소를 제거하기 위해, 트리톤 X-114 완충액 (25 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-114, 2 mM NaN3)을 포함하는 두 번째 세척 완충액으로 더욱 세척될 수 있다. 일정한 구체예에서, 단백질 L 칼럼은 트리스 완충액을 포함하는 세 번째 세척 완충액으로 세척되고, KP 완충액 (0.4 M 인산칼륨, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.02% Tween20, 2 mM NaN3)을 포함하는 네 번째 세척 완충액으로 세척되고 및/또는 트리스 완충액을 포함하는 다섯 번째 세척 완충액으로 세척될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 단백질 L 칼럼은 PBS를 포함하는 세척 완충액으로 1회 또는 그 이상 세척될 수 있다.
일정한 구체예에서, 항체는 1 M 아르기닌, 0.4 M 숙신산염, pH 9.0으로 중화될 수 있는, 150 mM 아세트산, pH 2.7을 포함하는 완충액을 이용하여 단백질 L 칼럼으로부터 용리될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 항체는 pH 3.0에서 50 mM 인산을 포함하는 완충액을 이용하여 단백질 L 칼럼으로부터 용리될 수 있다. 일정한 구체예에서, 용리된 항체는 pH 11에서 20X PBS로 중화될 수 있다.
일정한 구체예에서, 복합적 소중합체를 포함하는 IgA 표본에서, 단백질 L 용출물은 예를 들면, 항체의 특정 소중합체성 상태 (예를 들면, 이합체성, 삼합체성 및/또는 사합체성 상태)를 단리하기 위해, 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm XBridge Protein BEH 450 Å SEC 칼럼 (Waters)을 이용하여 더욱 정제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 0.2 M 아르기닌, 0.137 M 숙신산염, pH 5.0을 이동상으로서 이용한 Agilent 1260 Infinity HPLC를 이용하여 100 μL보다 크지 않은 주입 용적에서 1 mg 이하의 총 단백질이 1 mL/분으로 칼럼 위에서 이동되었고, 그리고 200 μL 분획물이 수집되었다. 일정한 구체예에서, SEC 칼럼으로부터 획득된 분획물은 지배적으로 한 가지 소중합체성 상태를 단리하기 위해 선택적으로 한 데 모아질 수 있다. 1회 또는 그 이상의 작업이 수행될 수 있고, 그리고 각 작업으로부터 소정의 소중합체의 분획물이 함께 모아질 수 있다.
IV. 치료 방법
본원에서 개시된 요부는 개시된 항체, 예를 들면, IgA 및 IgG-IgA 융합 분자를 이용하기 위한 방법을 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 이들 방법은 본원에서 개시된 항체의 치료적 용도에 관계한다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 요부의 하나 또는 그 이상의 항체는 개체에서 질환 및/또는 장애를 치료하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 항체는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암을 치료하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 암을 치료하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, FcαRI에 결합을 결여하고 FcαRI를 활성화할 수 없는 본원 발명의 항체는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암을 치료하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 치료 효과를 위해 및/또는 치료 표적에 접근하기 위해 항체의 통과세포외배출을 필요로 하는 질환 및/또는 장애를 치료하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 항체는 점막의 전역에서 항체의 통과세포외배출을 필요로 하는 질환 및/또는 장애를 치료하는 데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 특정한 질환 및/또는 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법에서 이용을 위한 항체를 제공하고, 상기 방법은 항체 또는 이것을 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 특정 분자 경로 및/또는 기전을 저해하는 데 이용을 위한 항체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 특정 분자 경로 및/또는 기전을 저해하는 방법에서 이용을 위한 항체를 제공하고, 상기 방법은 특정 분자 경로 및/또는 기전을 저해하기 위한 항체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 특정 분자 경로 및/또는 기전을 활성화하는 데 이용을 위한 항체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 특정 분자 경로 및/또는 기전을 활성화하는 방법에서 이용을 위한 항체를 제공하고, 상기 방법은 특정 분자 경로 및/또는 기전을 저해하기 위한 항체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, "개체", "환자" 또는 "피험자"는 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐 및 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
본원 발명은 개체에서 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조 또는 준비에서 항체의 용도를 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 약제는 특정 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 약제는 특정 질환 및/또는 장애를 치료하는 방법에서 이용을 위한 것이고, 상기 방법은 상기 약제의 효과량을 질환을 앓는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 약제는 특정 분자 경로 및/또는 기전을 저해하거나 또는 활성화하기 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 약제는 개체에서 특정 분자 경로 및/또는 기전을 저해하거나 또는 활성화하는 방법에서 이용을 위한 것이고, 상기 방법은 특정 분자 경로 및/또는 기전을 저해하기 위한 약제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일정한 구체예에서, 개시된 치료 방법에서 이용을 위한 항체는 본원에서 설명된 바와 같은 제약학적 조성물 내에 존재할 수 있다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 본원에서 설명된 바와 같은 제약학적으로 허용되는 운반체를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 본원 발명의 항체 중에서 한 가지 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
부가적으로 또는 대안으로, 제약학적 조성물은 두 번째 치료제를 포함할 수 있다. 개시된 항체 중에서 한 가지 또는 그 이상이 다른 치료제와 함께 투여될 때, 한 가지 또는 그 이상의 항체 및 다른 치료제는 어느 한 쪽 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다. 전술된 이런 병용 요법은 병용 투여 (여기서 2가지 또는 그 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제제 내에 포함된다), 그리고 별개 투여를 포괄하고, 이러한 사례에서, 본원 발명의 항체의 투여는 추가 치료제 또는 치료제들의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3 주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 일 이내에 일어난다.
본원 발명의 항체 (및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병소내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 투여가 단기 또는 장기인지에 부분적으로 따라서, 임의의 적합한 루트, 예를 들면, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸쳐 복수 투여, 일시 투여, 그리고 펄스 주입을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 예기된다.
본원 발명의 항체는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이러한 문맥에서 고려되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 일정, 그리고 개업 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그러할 필요는 없지만, 문제되는 장애를 예방하거나 치료하는 데 현재 이용되는 한 가지 또는 그 이상의 작용제와 함께 임의적으로 조제된다. 이런 다른 작용제의 효과량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 그리고 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로, 본원에서 설명된 바와 동일한 용량에서 및 투여 루트로, 또는 본원에서 설명된 용량의 약 1 내지 99%에서, 또는 경험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정되는 임의의 용량에서 및 임의의 루트에 의해 이용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 본원 발명의 항체의 적절한 용량 (단독으로 또는 한 가지 또는 그 이상의 다른 추가 치료제와 조합으로 이용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도와 코스, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 필요에 따라 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체는 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원에서 개시된 바와 같은 항체 및/또는 항체를 내포하는 제약학적 조성물은 하루 2회, 하루 1 회, 2 일마다 1회, 3 일마다 1회, 4 일마다 1회, 5 일마다 1회, 6 일마다 1회, 주 1회, 2 주마다 1회, 3 주마다 1회, 월 1회, 2 개월마다 1회, 3 개월마다 1회, 6 개월마다 1회 또는 연 1회 개체에게 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, 질환의 유형과 중증도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1mg/kg-10mg/kg)의 항체가 예를 들면, 1회 또는 그 이상의 별개 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것인지에 상관없이, 환자에게 투여를 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일량은 전술된 인자에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수도 있다. 일정한 구체예에서, 일일량은 약 100 mg/kg보다 클 수 있다. 일정한 구체예에서, 용량은 1-1000 μg/ml 및 일부 방법에서 25-300 μg/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정될 수 있다.
수 일 또는 그 이상에 걸쳐 반복된 투여의 경우에, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 수 있었다. 항체의 한 가지 예시적인 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 안에 있을 것이다. 일정한 구체예에서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중에서 한 가지 또는 그 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 대안으로, 항체는 지속된 방출 제제로서 투여될 수 있는데, 이러한 사례에서는 덜 빈번한 투여가 필요하다. 용량과 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라서 변할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3 주마다 (예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 복용량의 상기 항체를 제공받도록) 투여될 수 있다. 초기 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 또는 그 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, 상기 방법은 개체를 모니터링하고 치료의 유용성을 결정하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
V. 제약학적 조성물
본원에서 개시된 요부는 제약학적으로 허용되는 운반체와 함께, 본원에서 개시된 항체, 예를 들면, IgA 및 IgG-IgA Fc 융합 단백질 중에서 한 가지 또는 그 이상을 내포하는 제약학적 조성물을 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 본원에서 개시된 요부의 복수 (예를 들면, 2개 또는 그 이상)의 항체 및/또는 이들의 항원 결합 부분의 조합을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 개시된 제약학적 조성물은 동결 건조된 제제 또는 수성 용액의 형태에서, 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 하나 또는 그 이상의 임의적 제약학적으로 허용되는 운반체 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 조합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 동결 건조된 항체 제제는 US 특허 번호 6,267,958에서 설명된다. 일정한 구체예에서, 수성 항체 제제는 US 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에서 설명된 것들을 포함할 수 있는데, 후자 제제는 히스티딘-아세트산염 완충액을 포함한다. 일정한 구체예에서, 항체는 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.1% 이상, 약 99.2% 이상, 약 99.3% 이상, 약 99.4% 이상, 약 99.5% 이상, 약 99.6% 이상, 약 99.7% 이상, 약 99.8% 이상 또는 약 99.9% 이상의 순도일 수 있다.
제약학적으로 허용되는 운반체는 일반적으로, 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 그리고 하기를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 이하의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 그리고 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 제약학적으로 허용되는 운반체는 세포간 약물 분산 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루론산분해효소 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루론산분해효소 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 더욱 포함한다. rHuPH20을 포함하는 일정한 예시적인 sHASEGPs 및 이용 방법은 US 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에서 설명된다. 한 양상에서, sHASEGP는 한 가지 또는 그 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
운반체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들면, 주사 또는 주입에 의해)에 적합할 수 있다. 투여 루트에 따라서, 항체는 화합물을 산 및 상기 화합물을 비활성화할 수 있는 다른 자연 조건의 작용으로부터 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.
본원 발명의 제약학적 조성물은 또한, 병용 요법으로 투여될 수 있다, 다시 말하면, 다른 작용제와 조합될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 제약학적 조성물은 또한, 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 한 가지 이상의 활성 성분, 예를 들면, 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 내포할 수 있다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 첫 번째 치료제에 의해 치료되는 동일한 질환을 치료하기 위한 두 번째 활성 성분을 포함할 수 있다. 이런 활성 성분은 적절하게는, 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다. 예를 들면, 그리고 제한 없이, 본원 발명의 제제는 또한, 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 내포할 수 있다. 예를 들면, 동일한 질환의 치료에 유용한 두 번째 치료제를 더욱 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 활성 성분은 적절하게는, 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다.
본원 발명의 조성물은 당해 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 루트 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라서 변한다. 활성 화합물은 화합물을 급속한 방출로부터 보호하는 운반체, 예컨대 이식물, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 제어된 방출 제제로 제조될 수 있다. 생물분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세트산염, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리유산이 이용될 수 있다. 이런 제제의 제조를 위한 많은 방법은 예를 들면, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978에 의해 설명된다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 미국 식품의약국의 의약품 제조 품질 관리 기준 (GMP) 조건 하에 제조된다.
개시된 항체를 내포하는 지속된 방출 제조물이 또한 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 항체를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 일정한 구체예에서, 활성 성분은 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.
본원 발명의 항체를 일정한 투여 루트에 의해 투여하기 위해, 상기 화합물을 이의 비활성화를 예방하기 위한 물질로 코팅하거나, 또는 상기 화합물을 상기 물질과 공동투여하는 것이 필요할 수도 있다. 예를 들면, 화합물은 적합한 운반체, 예를 들면, 리포솜, 또는 희석제에 담겨 개체에게 투여될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 희석제는 식염수 및 수성 완충액을 포함한다. 리포솜은 수중 유중수 CGF 유제뿐만 아니라 전통적인 리포솜을 포함한다 (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7:27 (1984)).
제약학적으로 허용되는 운반체는 무균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 수성 용액 또는 분산액 및 무균 분말을 포함한다. 제약학적으로 활성 물질에 대한 이런 매체와 작용제의 이용은 당해 분야에서 공지된다. 임의의 전통적인 매체 또는 작용제가 활성 화합물과 양립하지 않는 경우가 아닌 한에 있어서, 본원 발명의 제약학적 조성물에서 이들의 이용이 예기된다. 보충 활성 화합물이 또한, 조성물 내로 통합될 수 있다.
치료 조성물은 제조와 보관의 조건 하에 전형적으로 무균이고, 실제적으로 등장성이고, 그리고 안정되어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로유제, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정연한 구조로서 조제될 수 있다. 운반체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이들의 적합한 혼합물을 내포하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅, 예컨대 레시틴의 이용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 작용제, 예컨대 당, 다가알코올, 예를 들면, 만니톨 및 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 내에 포함함으로써 달성될 수 있다.
무균 주사가능 용액은 적합한 용매에서 필요한 양으로 한 가지 또는 그 이상의 개시된 항체를 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중에서 한 가지 또는 이들의 조합과 통합함에 의해, 그 이후에 살균 미세여과, 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기초 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조와 동결 건조 (동결건조) 기술인데, 이들은 활성 성분 플러스 이들의 이전에 무균 여과된 용액으로부터 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출한다.
치료 조성물은 또한, 당해 분야에서 알려진 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 치료 조성물은 바늘 없는 피하 주사 장치, 예컨대 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, 또는 4,596,556에서 개시된 장치로 투여될 수 있다. 본원 발명에서 유용한 이식물 및 모듈의 실례는 약제를 제어된 속도로 분여하기 위한 이식가능한 마이크로-주입 펌프를 개시하는 U.S. 특허 번호 4,487,603; 약을 피부를 통해 투여하기 위한 치료 장치를 개시하는 U.S. 특허 번호 4,486,194; 약제를 정밀한 주입 속도로 전달하기 위한 약제 주입 펌프를 개시하는 U.S. 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유량 이식가능한 주입 기구를 개시하는 U.S. 특허 번호 4,447,224; 멀티-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 U.S. 특허 번호 4,439,196; 그리고 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 U.S. 특허 번호 4,475,196을 포함한다. 많은 다른 이런 이식물, 전달 시스템, 그리고 모듈은 알려져 있다.
치료 조성물을 위해, 본원 발명의 제제는 경구, 코, 국소 (협측 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 것들을 포함한다. 제제는 단위 약형에서 편의하게 제공될 수 있고, 그리고 약학 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 약형을 생산하기 위해 운반체 물질과 조합될 수 있는 항체의 양은 치료되는 개체 및 특정 투여 방식에 따라서 변한다. 단일 약형을 생산하기 위해 운반체 물질과 조합될 수 있는 항체의 양은 일반적으로, 치료 효과를 발생시키는 조성물의 양이다. 일반적으로, 이러한 양은 100 퍼센트 중에서, 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트, 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 또는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 활성 성분의 범위 안에 있다.
본원 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 약형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 무균 상태 하에, 제약학적으로 허용되는 운반체, 그리고 필요할 수도 있는 임의의 보존제, 완충액 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
관용구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된"은 경장 및 국소 투여 이외에, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 그리고 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척주내, 경막외 및 흉골내 주사와 주입을 제한 없이 포함한다.
이들 제약학적 조성물은 또한, 어쥬번트 예컨대 보존제, 침윤제, 유화제 및 분산제를 내포할 수 있다. 미생물의 존재의 예방은 위와 같은 살균 절차, 그리고 다양한 항균제와 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함 둘 모두에 의해 담보될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이에 더하여, 주사가능 제약학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 달성될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체가 약제로서 인간 및 동물에게 투여될 때, 이들은 제약학적으로 허용되는 운반체와 함께, 예를 들면, 약 0.01% 내지 약 99.5% (또는 약 0.1 내지 약 90%)의 본원에서 설명된 항체가 단독으로 또는 상기 항체를 내포하는 제약학적 조성물로서 제공될 수 있다.
VI. 제조 물품
본원에서 개시된 요부는 예를 들면, 전술된 질환 및/또는 장애의 치료 및/또는 예방에 유용한, 본원에서 개시된 항체 중에서 한 가지 또는 그 이상을 내포하는 제조 물품 재료에 더욱 관계한다.
일정한 구체예에서, 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기의 무제한적 실례는 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하고, 예방하고 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유할 수 있고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다).
일정한 구체예에서, 조성물 내에 적어도 한 가지 활성제는 본원에서 개시된 요부의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 이용된다는 것을 지시할 수 있다.
일정한 구체예에서, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 내포된 첫 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 본원 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 그 안에 내포된 두 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 지시하는 포장 삽입물을 더욱 포함할 수 있다.
대안으로 또는 부가적으로, 제조 물품은 게다가, 제약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 하지만 제한 없이, 정균성 주사용수 (BWFI), 인산염 완충된 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 추가 용기, 예를 들면, 두 번째 또는 세 번째 용기일 수 있다. 제조 물품은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.
VII. 예시적인 구체예
A. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 아미노산 V458, N459 및/또는 S461에서 치환을 포함하는 단리된 IgA 항체, 또는 이의 단편을 제공한다.
A1. A의 앞서 말한 단리된 IgA 항체, 여기서 아미노산 V458은 이소류신 (V458I)으로 치환되고, 아미노산 N459는 글루타민 (N459Q), 글리신 (N459G) 또는 알라닌 (N459A)으로 치환되고 및/또는 아미노산 S461은 알라닌 (S461A)으로 치환된다.
B. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 아미노산 I458에서 치환을 포함하는 단리된 IgA 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
B1. B의 앞서 말한 단리된 IgA 항체, 여기서 아미노산 I458은 발린 (I458V)으로 치환된다.
C. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459, S461 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하는 단리된 IgA 항체, 또는 이의 단편을 제공한다.
C1. C의 앞서 말한 단리된 IgA 항체, 여기서 아미노산 N166, S212, N263, N337, I338, T339 및 N459에서 치환은 N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S 및 N459Q이다.
C2. A-C1 중 어느 하나의 앞서 말한 단리된 IgA 항체, 여기서 IgA 항체는 IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체이다.
C3. C 및 C1 중 어느 하나의 앞서 말한 단리된 IgA 항체, 여기서 IgA 항체는 아미노산 N337, I338 및 T339에서 치환을 갖고, 그리고 T168, N211, S212, S213, N263, T265, N459, S461 및 이들의 조합에서 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는다.
C4. C3의 앞서 말한 단리된 IgA 항체, 여기서 IgA 항체는 IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체이다.
C5. A-C4 중 어느 하나의 앞서 말한 단리된 IgA 항체, 여기서 IgA 항체는 인간화, 키메라 항체 또는 인간 항체이다.
D. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는, 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 단리된 IgG-IgA 융합 분자를 제공하고, 여기서 IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 P221 또는 R221을 포함하는 서열을 포함하고, 그리고 IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 더욱 포함한다.
E. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는, 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 단리된 IgG-IgA 융합 분자를 제공하고, 여기서 IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 C242를 포함하는 서열을 포함한다.
E1. E의 앞서 말한 단리된 IgG-IgA 융합 분자, 여기서 IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 더욱 포함한다.
E2. D-E1 중 어느 하나의 앞서 말한 단리된 IgG-IgA 융합 분자, 여기서 IgG 항체는 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 및 IgG4 항체로 구성된 군에서 선택된다.
E3. D-E2 중 어느 하나의 앞서 말한 단리된 IgG-IgA 융합 분자, 여기서 IgG 항체는 IgG1 항체이다.
E4. D-E3 중 어느 하나의 앞서 말한 단리된 IgG-IgA 융합 분자, 여기서 IgA 항체는 IgA1 항체, IgA2m1 항체, IgA2m2 항체 및 IgA2mn 항체로 구성된 군에서 선택된다.
E5. D-E4 중 어느 하나의 앞서 말한 단리된 IgG-IgA 융합 분자, 여기서 IgA 항체는 IgA2m1 항체이다.
F. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 A-C4 중 어느 하나의 IgA 항체 또는 D-E5 중 어느 하나의 IgG-IgA 융합 분자를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
G. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 F의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
H. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgA 항체 또는 IgG-IgA를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자가 생산되도록 G의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
H1. 숙주 세포로부터 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자를 회수하는 단계를 더욱 포함하는, H의 앞서 말한 방법.
H2. H로부터 생산되거나 또는 H1로부터 회수된 앞서 말한 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자.
I. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 A-C4 및 H2 중 어느 하나의 하나 또는 그 이상의 IgA 항체, 또는 D-E5 및 H2 중 어느 하나의 하나 또는 그 이상의 IgG-IgA 융합 분자 및 제약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
I1. 추가 치료제를 더욱 포함하는, I의 앞서 말한 제약학적 조성물.
J. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 A-C4 및 H2 중 어느 하나의 하나 또는 그 이상의 IgA 항체, 또는 D-E5 및 H2 중 어느 하나의 하나 또는 그 이상의 IgG-IgA 융합 분자의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
J1. J의 앞서 말한 방법, 여기서 질환은 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암이다.
K. 약제로서 이용을 위한 A-C4 및 H2 중 어느 하나의 앞서 말한 IgA 항체 또는 D-E5 및 H2 중 어느 하나의 IgG-IgA 융합 분자.
L. 질환을 치료하는 데 이용을 위한 A-C4 및 H2 중 어느 하나의 앞서 말한 IgA 항체 또는 D-E5 및 H2 중 어느 하나의 IgG-IgA 융합 분자.
M. L의 앞서 말한 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자, 여기서 질환은 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암이다.
N. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 A-C4 및 H2 중 어느 하나의 IgA 항체 또는 D-E5 및 H2 중 어느 하나의 IgG-IgA 융합 분자의 용도를 제공한다.
N1. N의 앞서 말한 용도, 여기서 질환은 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암이다.
O. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgA 이합체의 발현을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 인코딩하는 DNA의 양에 비하여 첫 번째 세포 내로 도입되는 연결 사슬 (JC)을 인코딩하는 DNA의 양을 증가시키되, 증가된 발현이 동등한 양의 JC, LC 및 HC DNA가 도입되는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA 이합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다.
O1. O의 앞서 말한 방법, 여기서 첫 번째 세포 내로 도입되는 HC를 인코딩하는 DNA의 양 대 LC를 인코딩하는 DNA의 양 대 JC를 인코딩하는 DNA의 양의 비율 (HC:LC:JC)은 약 1:1:2 내지 약 1:1:5이다.
P. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgA 이합체, 삼합체 또는 사합체의 발현을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 인코딩하는 DNA의 양에 비하여 첫 번째 세포 내로 도입되는 연결 사슬 (JC)을 인코딩하는 DNA의 양을 감소시키되, 증가된 발현이 JC DNA의 양에 비하여 더 많은 양의 HC 및 LC DNA가 도입되는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA 삼합체 또는 사합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다.
P1. P의 앞서 말한 방법, 여기서 첫 번째 세포 내로 도입되는 HC를 인코딩하는 DNA의 양 대 LC를 인코딩하는 DNA의 양 대 JC를 인코딩하는 DNA의 양의 비율 (HC:LC:JC)은 약 1:1:0.25 내지 약 1:1:0.5이다.
Q. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 생산을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 아미노산 V458에서 치환을 갖는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 첫 번째 세포에서 발현하되, 증가된 생산이 아미노산 V458에서 치환을 갖지 않는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다.
Q1. Q의 앞서 말한 방법, 여기서 아미노산은 이소류신 (V458I)으로 치환된다.
R. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgA2m2 이합체의 생산을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 아미노산 I458에서 치환을 갖는 IgA2m2 항체를 첫 번째 세포에서 발현하되, 증가된 생산이 아미노산 I458에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA2m2 이합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다.
R1. R의 앞서 말한 방법, 여기서 아미노산은 발린 (I458V)으로 치환된다.
S. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 생산을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 아미노산 N459 또는 S461에서 치환을 갖는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 첫 번째 세포에서 발현하되, 증가된 생산이 아미노산 N459 또는 S461에서 치환을 갖지 않는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다.
S1. S의 앞서 말한 방법, 여기서 아미노산 N459는 N459Q, N459G 또는 N459A 돌연변이로 치환되고 및/또는 아미노산 S461은 S461A 돌연변이로 치환된다.
T. IgA2m2 중합체의 생산을 감소시키는 방법, 상기 방법은 아미노산 C471에서 치환을 갖는 IgA2m2 항체를 첫 번째 세포에서 발현하되, 감소된 생산이 아미노산 C471에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 IgA2m2 중합체의 양에 상대적인 단계를 포함한다.
T1. T의 앞서 말한 방법, 여기서 아미노산 C471은 C471S 돌연변이로 치환된다.
U. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgA2m2 항체의 일시적인 발현을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에서 치환을 포함하는 IgA2m2 항체를 첫 번째 세포에서 발현하되, 증가된 일시적인 발현이 N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산되는 일시적인 발현의 양에 상대적인 단계를 포함한다.
V. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgG-IgA 융합 분자의 이합체를 발현하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 IgG-IgA 융합 분자를 발현하되, IgA 항체의 Fc 영역이 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 P221 또는 R221을 포함하는 서열을 포함하고, 그리고 IgG 항체가 아미노산 K447의 결실을 포함하는 단계를 포함한다.
W. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgG-IgA 융합 분자의 이합체, 삼합체 또는 사합체를 발현하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 IgG-IgA 융합 분자를 발현하되, IgA 항체의 Fc 영역이 IgA 항체의 중쇄의 C 말단을 통해 C242를 포함하는 서열을 포함하는 단계를 포함한다.
W1. W의 앞서 말한 방법, 여기서 IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 포함한다.
X. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgA 항체 및 적어도 하나의 숙주 세포 단백질을 포함하는 혼합물로부터 IgA 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 혼합물을 IgA 항체에 결합하는 단백질 L을 포함하는 칼럼에 적용하는 단계;
(b) 단백질 L 칼럼을 PBS를 포함하는 세척 완충액으로 세척하는 단계; 그리고
(c) IgA 항체를 인산을 포함하는 용리 완충액에 의해 단백질 L 칼럼으로부터 용리하는 단계.
Y. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자 및 적어도 하나의 숙주 세포 단백질을 포함하는 혼합물로부터 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자의 소중합체성 상태를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 혼합물을 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자에 결합하는 단백질 L 또는 단백질 A를 포함하는 친화성 정제 칼럼에 적용하는 단계;
(b) 친화성 정제 칼럼을 세척 완충액으로 세척하는 단계;
(c) IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자를 용리 완충액에 의해 친화성 정제 칼럼으로부터 용리하여 첫 번째 용출물을 형성하는 단계; 그리고
(d) 첫 번째 용출물을 크기 배제 크로마토그래피 칼럼에 적용하여 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자의 상이한 소중합체성 상태를 분리하고 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자의 소중합체성 상태를 포함하는 통과액을 획득하는 단계.
하기 실시예는 본원에서 개시된 요부를 단지 예시하고, 그리고 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다.
실시예 1: 생쥐에서 중합성 IgA의 약동학적 파라미터에 대한 글리코실화 및 FcRn 결합의 역할의 사정
IgA 항체는 전통적인 IgG-기초된 약물과 비교하여, 그들의 우수한 수용체-매개된 세포독성 활성, 병원체의 강력한 중화, 그리고 중합성 면역글로불린 수용체 (pIgR)-매개된 수송을 통한 점막 장벽을 교차하여 통과세포외배출하는 능력에 근거하여 신규한 치료 플랫폼으로서 광범위한 잠재력을 갖는다. 하지만, IgA의 임상적 개발로의 이전은 복합적인 발현과 특징화뿐만 아니라 불완전하게 시알화된 N-연결된 글리칸을 보유하는 재조합적으로 생산된 IgA 단량체의 글리칸 수용체 스캐빈징에 의해 매개되는 것으로 생각되는 급속한 혈청 소실에 의해 도전을 받았다. 본 실시예에서는 재조합적으로 생산된 단량체성, 이합체성 및 중합성 인간 IgA의 포괄적인 생화학적, 생물물리학적 및 구조적 특징화가 제공된다. 이에 더하여, 중합성 IgA의 급속한 혈청 소실을 극복하기 위한 2가지 전략이 확인된다: (1) 비글리코실화된 또는 부분적으로 비글리코실화된 중합성 IgA를 창출하는, N-연결된 글리코실화 부위의 제거 및 (2) 중합성 IgG-IgA Fc 융합을 산출하는, FcRn 결합의 가공.
방법:
플라스미드 클로닝 및 서열 정렬. 이용된 항체 가변 도메인 서열은 인간화 항인간 HER2 항체 (Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9 (1992)) 및 뮤린 항뮤린 IL-13 항체 (Genentech)를 포함한다. 인간 IgA 불변 중쇄 사슬 IgA1, IgA2m1 및 IgA2m2, 다른 IgA 종류 및 인간 J 사슬의 단백질 서열은 Uniprot (www.uniprot.org) 또는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)으로부터 획득되었다. 획득된 다른 종류는 기존 문헌 (Chintalacharuvu et al., J Immunol 157:3443-9 (1996))에서 보고된 바와 같이, 경쇄-중쇄 이황화물을 안정시키는 IgA2m1에서 돌연변이, 다시 말하면, P221R을 포함한다. 인간 경쇄 및 인간 IgA1, IgA2m1 및 IgA2m2 중쇄 불변 도메인에 항체 가변 도메인의 융합을 인코딩하는 유전자가 합성되고 포유류 pRK 벡터 내로 클로닝되었다 (Eaton et al., Biochemistry 25:8343-7 (1986)). 특정 부위 돌연변이유발이 점 돌연변이를 도입하는 데 이용되었다. 모든 플라스미드의 서열이 실증되었다. 서열 정렬은 GSeqWeb (Genentech) 및 Excel (Microsoft)을 이용하여 행위되었다.
소규모 항체 발현 및 정제. Expi293T™ 세포가 30 mL 규모에서, IgA 단량체의 경우 15 μg의 LC 및 HC 둘 모두의 DNA, 또는 IgA 소중합체의 경우 총 30 μg의 변하는 비율의 LC, HC 및 JC의 DNA로 일시적으로 형질감염되었다 (Bos et al., Journal of Biotechnology 180:10-6 (2014) 및 Bos et al., Biotechnol Bioeng 112:1832-42 (2015)). IgAs는 단백질 L (GE Healthcare)을 이용하여 배치에서 친화성 정제되었는데, 그 이유는 모든 항체가 카파 경쇄를 내포하였기 때문이다. 단백질 L 용출물이 분석적 SEC-HPLC (Tosoh Bioscience LLC TSKgel SuperSW3000 칼럼, Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLC)에 의해 특징화되었다. 일정한 용적이 칼럼 위에 부하되었고, 그리고 각 곡선 아래 면적이 Chromeleon 크로마토그래피 데이터 시스템 소프트웨어 (Thermo Scientific)를 이용하여 정량되었다.
대규모 항체 발현 및 정제. IgA, IgG 및 IgG-IgA Fc 융합이 기존 문헌 (Wong et al., Biotechnol Bioeng 106:751-63 (2010))에서 설명된 바와 같이, CHO DP12 세포에서 일시적으로 발현되었다. 낮은 발현 클론의 경우, TI 안정된 세포주가 산출되었다. IgG 및 IgG-IgA Fc 융합은 MabSelect Sure (GE Healthcare)를 이용하여 친화성 정제되고, 그 이후에 HiLoad Superdex 200 pg 칼럼 (GE Healthcare)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)가 뒤따랐다. IgAs는 Capto L (GE Healthcare)을 이용하여 친화성 정제되고, 그 이후에 SEC가 뒤따랐다. DNA 비율이 주로 한 가지 소중합체성 상태로의 발현을 향해 성공적으로 편향된 IgA 표본의 경우, HiLoad Superdex 200 pg 칼럼 (GE Healthcare)이 SEC에 이용되었다. 소중합체의 복합 혼합물을 내포하는 IgA 표본의 경우, 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Xbridge Protein BEH 450 Å SEC 칼럼 (Waters)이 이합체 및 사합체 피크의 더 우수한 분리에 이용되었다.
SEC-MALS. 중합성 IgAs가 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Xbridge Protein BEH 200 Å SEC 칼럼 (Waters) 위에서 이동되고, 그리고 몰 질량 결정 및 다분산성 계측을 위해 DAWN HELEOS/Optilab T-rEX II (Wyatt) 다각도 광 산란 검출기 위에 직접적으로 주입되었다.
시차 주사 형광측정법 (DSF). DSF는 기존 문헌 (Lombana et al., Sci Rep 5:17488 (2015))에서 설명된 바와 같이 수행되었다.
시험관내 통과세포외배출 검정. Madin-Darby 개 신장 (MDCKII) 세포 (European Collection of Authenticated Cell Cultures, Salisbury, U.K.) 세포가 인간 pIgR 유전자를 코딩하는 cDNA를 내포하는 레트로바이러스 (Retro-X, Takara Bio; OriGene, Rockvile, MD)로 형질도입되었다. pIgR 유전자의 발현이 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯팅에 의해 확증되었다. pIgR을 발현하는 MDCKII 세포는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (Thermo Fisher, Carlsbad, CA), 그리고 2 μg/ml 푸로마이신 (Takara Bio, Mountain View, CA)으로 보충된 DMEM에서 유지되었다. 통과세포외배출 검정을 위해, 세포가 0.4 μm Millicell 24-웰 세포 배양 삽입물 (Millipore, Burlington, MA) 상에 파종되고 4 일 동안 배양되었다. 실험 당일에, 이들 세포는 FluoroBrite DMEM (Thermo Fisher)으로 2회 세척되었고, 그리고 6 μg의 IgA 분자가 기저측 구획에 첨가되었다. 24-시간의 배양 후, 정점 및 기저측 구획 둘 모두로부터 배지가 ELISA에 의한 분석을 위해 수집되었다.
전자 현미경검사. 실온에서 10 분 동안 0.015% 글루타르알데히드 (Polysciences, Inc.)에서 배양함으로써, 정제된 항-IL-13 IgA2m2 이합체 및 사합체 표본이 먼저 교차연결되었다. 일단 고정되면, 이들 표본은 10 ng/μL의 농도를 달성하기 위해 TBS 완충액을 이용하여 희석되었다. 이후, 2% (w/v) 우라닐 아세트산염 음성 염료 (Electron Microscopy Sciences)로 처리되기 전, 연속 탄소의 박층으로 덮인 새로 글로우 방전된 400 그물망 구리 격자에서 4 μl의 각 표본이 40s 동안 배양되었다. IgA 이합체 및 사합체가 이후, 25,000x (2.2 Å/픽셀)의 배율에서, 120 keV에서 작동하는 Tecnai Spirit T12 (Thermo Fisher)를 이용하여 영상화되었다. 이미지가 낮은 선량 조건 하에 Gatan 4096 x 4096 픽셀 CCD 카메라를 이용하여 기록되었다. IgA 이합체 및 사합체 둘 모두에 대해 약 5000개 입자가 이후, 선택되고, 그리고 128-픽셀 입자 박스 크기를 이용하여 EMAN2 패키지 (Tang et al., J Struct Biol 157:38-46 (2007)) 내에 e2boxer.py 소프트웨어를 이용하여 추출되었다. RELION 이미지 소프트웨어 패키지 (Scheres J Struct Biol 180:519-30 (2012)) 내에 무참조 2D 분류가 양쪽 표본의 평균화된 이미지를 산출하는 데 이용되었다.
전역 N-연결된 글리칸 조성 분석 (LC-MS 분석). 10 μg의 각 IgA 표본이 1:1 용적 비율에서 8 M 구아니딘 HCl로 변성되고, 그리고 95 ℃에서 10 분 동안 100 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 환원되었다. 표본이 2 M 구아니딘 HCl의 최종 농도까지 100 mM 트리스 HCl, pH 7.5로 희석되고, 그 이후에 2 μl의 P0705S PNGase F (New England BioLabs)로 37 ℃에서 하룻밤 N-연결된 데글리코실화가 뒤따랐다. 데글리코실화 후, 150 ng의 각 표본이 Agilent 1260 Infinity LC 시스템 위에 주입되고 2% 내지 32% 용매 B의 등용매성 구배 (용매 A: 0.1% 포름산 및 0.02% 트리플루오로아세트산을 내포하는 99.88% 물; 용매 B: 9.88% 물 플러스 0.1% 포름산 및 0.02% 트리플루오로아세트산을 내포하는 90% 아세토니트릴)에 의해 용리되었다. HPLC 시스템이 Agilent G4240A Chip Cube MS 시스템을 통해 G6520B Q-TOF 질량분광계에 연계되었다. 이들 표본은 글리칸 농축되고, 그리고 Chip Cube MS 시스템에서 G4240-64025 mAb-Glyco 칩 내에 만들어진 다공성 흑연화 탄소 칼럼을 이용하여 분리되었다. 데이터 획득: 1.9 kV 분무 전압; 325℃ 가스 온도; 5 l/분 건조 가스 흐름; 160 V 단편화기 전압; 65 V 부유물 제거장치 전압; 750 V 옥트 1 RF Vpp 전압; 400 내지 3000 m/z 스캔 범위; 양성 극성; 연장된 역동적 범위 (2 GHz) 기기 방식을 이용한 MS1 중심 데이터 획득; 3 스펙트럼/s; 333.3 ms/스펙트럼; 3243 과도상태/스펙트럼; 그리고 0의 CE 세팅. 획득된 질량 스펙트럼 데이터는 정확한 질량의 10 ppm의 질량 내성 및 글리칸 확인을 위한 예상된 체류 시간과의 조합을 활용하여 Agilent MassHunter 정성 분석 소프트웨어에서 글리칸 라이브러리에 대해 검색되었다. N-연결된 글리칸은 각 글리칸의 추출된 화합물 크로마토그램에서 AUC에 근거하여 각 표본 내에 모든 확인된 N-연결된 글리칸에 비하여 표지-없이 정량되었다.
N-연결된 당펩티드 부위 지도화 분석 (LC-MS/MS 분석). 10 μg의 IgA가 37 ℃에서 1 시간 동안 10 mM DTT로 환원되고, 실온에서 20 분 동안 10 mM 요오드아세트아미드로 알킬화되고, 37 ℃에서 하룻밤 동안 0.2 μg의 트립신 (Promega) 및 0.2 μg의 키모트립신 (Thermo Fisher Scientific)으로 별개로 소화되고, 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 퀀칭되고, 그리고 C18 (3M Empore C18 추출 디스크) 스테이지 팁 (50% 아세토니트릴, 49.9% 물, 0.1% TFA)으로 청소가 실행되었다. 200 fmol의 표본이 자동샘플러를 통해 Waters NanoAcquity UPLC 시스템 위에 주입되고, 그리고 45℃에서 Waters Acquity M-Class BEH C18 칼럼 (0.1 mm x 100 mm, 1.7 μm 수지)에서 분리되었다. 2% 내지 40% 용매 B의 구배가 용리에 이용되었다 (용매 A: 99.9% 물, 0.1% 포름산; 용매 B 99.9% 아세토니트릴, 0.1% 포름산).
분리된 펩티드가 데이터 획득을 위해 하기 파라미터: 60000 분해능; 375-1600 m/z 스캔 범위; 양성 극성; 중심 방식; 0.25 활성화 Q 및 10 ms 활성화 시간에서 1 m/z 분리 너비; CID 활성화; 그리고 35의 CE 세팅을 이용하여 Orbitrap Elite 질량분광계 (Thermo Fisher Scientific) 내로 나노스프레이 이온화를 통해 온라인 분석되었다. 데이터는 선구 이온이 FTMS에서 분석되고, 그리고 상위 15개의 가장 풍부한 이온이 ITMS에서 단편화 및 분석을 위해 선택되는 데이터 의존 방식으로 수집되었다. 획득된 질량 스펙트럼 데이터는 Protein Metrics Byonic 소프트웨어를 이용하여 단백질 서열에 대해 검색되고 Protein Metrics Byologic 소프트웨어에서 분석되었다. 각 글리코실화 부위에 대한 펩티드 동정이 MS2 단편화 스펙트럼, 이온 추출 크로마토그램 (XIC) 및 체류 시간의 조합에 기초하여 수동으로 검증되었다. N-연결된 당펩티드는 XICs의 AUC 적분에 의해, 변형되지 않은 펩티드에 비하여 표지-없이 정량되었다.
생쥐 연구. 암컷 Balb/C 생쥐 (6-8 주령)가 Charles River laboratories에 의해 획득되었다. 도착 시에, 모든 생쥐는 21 ℃ 실온에서 표준 12 시간 밝음/12 시간 어둠 주기 하에 병원체-없는 동물 시설에서 유지되었고, 사료 및 물에 대한 접근은 제한이 없었다. 모든 생쥐는 개별 항체 (IgG 또는 IgA)의 단일 정맥내 (IV) 주사를 제공받았다. 혈액 표본 (150-200 μL)이 주사후 다양한 시점에서 이소플루란 마취 하에 안와후 부비강 또는 심장 천자 중 어느 한 가지를 통해 수집되었다. 표본이 혈청 분리관 내로 수집되었다. 혈액이 주위 온도에서 적어도 20 분 동안 응고되도록 허용되었다. 응고된 표본은 1 시간의 수집 시간 내에 시작되는 원심분리 때까지 실온에서 유지되었다. 각 표본은 2-8℃에서 5 분 동안 1500-2000 x g의 상대 원심력으로 원심분리되었다. 혈청이 원심분리 후 20 분 내에 혈액 표본으로부터 분리되고, 그리고 표지화된 2.0mL 폴리프로필렌, 원추형 바닥 마이크로원심분리 튜브 내로 이전되었다.
건강한 것으로 보이고 명백한 이상이 없는 동물만 연구에 이용되었다. 수행된 모든 동물 작업은 Genentech의 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의해 리뷰되고 승인되었다.
통과세포외배출 및 약동학적 연구를 위한 IgA ELISA. IgA 항체 수준이 샌드위치 ELISA에 의해 계측되었다. 384-마이크로역가 평판의 웰이 25 μl의 코팅 완충액 (0.05 M 탄산나트륨, pH 9.6)에서 2 μg/ml의 염소 항인간 카파 항체 (SouthernBiotech, Cat# 2060-01)로 4 ℃에서 하룻밤 동안 코팅되고, 그 이후에 37 ℃에서 2 시간 동안 PBS에서 50 μl의 0.5% BSA로 차단되었다. 표본 완충액 (1x PBS, pH 7.4, 0.5% BSA, 0.35 M NaCl, 0.05% Tween20, 0.25% CHAPS, 5 mM EDTA)에서 희석된 표본 (25 μl)이 이후, 차단된 평판에 첨가되고 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 배양 후, 25 μl의 양고추냉이 과산화효소-접합된 염소 항인간 IgA (SouthernBiotech, Cat# 2053-05)가 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 평판이 이후, 25 μl의 TMB (Moss, Cat# TMBE-1000)과 함께 15 분 동안 배양되었고, 그리고 반응이 25 μl 1M H3PO4로 중지되었다. 평판 판독기를 이용하여, 흡광도가 450 nm 에서 계측되고, 환원 시에 630 nm에서 계측되었다. 단계 중간에, 평판이 200 μl의 세척 완충액 (PBS에서 0.05% Tween-20)으로 6회 세척되었다. 정량을 위한 참조로서, 각 IgA 분자에 대한 연속 희석된 원료 물질 (20 ng/ml-0.15 ng/ml)을 이용하여 표준 곡선이 확립되었다. IgA ELISA는 10 % 생쥐 혈청 및 10 % 조직 용해물까지 생물학적 매트릭스를 관용한다.
방사선화학. 요오드-125 [125I]가 Perkin Elmer (Boston, MA)로부터, 0.1 N 수산화나트륨에서 요오드화나트륨으로서 획득되었다. 1 mCi의 125I (~3 μL)가 간접적인 요오도젠 방법 (Pierce Chemical Co.., Rockford, IL)을 이용하여 125I로, ~10 μCi/μg의 고유 활성도에서 티로신 잔기를 통해 무작위로 표지화하는 데 이용되었다. 111In 표지화된 항체 (~8 μCi/μg)의 방사성합성이 37 ℃에서 1 시간 동안 0.3 M 아세트산암모늄 pH 7에서 111In 및 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)-접합된 (리신을 통해 무작위로) mAb의 항온처리를 통해 달성되었다. 모든 방사성면역접합체의 정제가 PBS에서 평형화된 NAP5 칼럼을 이용하여 달성되고 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확증되었다.
항체가 간접적인 요오도젠 첨가 방법 (Chizzonite et al., J Immunol; 147:1548-56 (1991))을 이용하여 방사성요오드화되었다. 방사성표지화된 단백질이 PBS에서 전평형화된 NAP5™ 칼럼 (GE Healthcare Life Sciences, 카탈로그 17-0853-01)을 이용하여 정제되었다. 방사성요오드화 이후에, 표지화된 항체는 표지화되지 않은 항체와 비교하기 위해 SEC-HPLC에 의해 특징화되었다. 연속적으로 연결된 Agilent 1100 시리즈 HPLC (Agilent Technology, Santa Clara, CA) 및 Yarra SEC-3000, 3 μM 300mm x 7.8mm (Phenomenex, Torrance, CA, 카탈로그 00H-4513-K0) 크기 배제 칼럼 위에 표본이 주입되고, 그리고 20 분 동안 0.8 mL/분의 유속에서 인산염 완충액 식염수 (PBS pH 7.0)로 용리되었다. 용리가 280 nm에서 흡수에 의해, 그리고 인라인 Gabi 감마 계수기 (Elysia-Raytest, Germany)에서 용리된 분획물의 방사성을 계측함으로써 모니터링되었다.
조직 분포 연구 설계 및 분석. 프로토콜, 하우징, 그리고 마취는 실험동물인증협회 규정에 따라서, Genentech 실험 동물 지원과의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다.
20-30 g 체중 범위 및 6-7 주령 범위에서 암컷 BALB-c 생쥐가 Jackson/West (CA)로부터 획득되었다. 각각 12마리 생쥐의 6개 군이 본 연구에 이용되었다. 125I의 갑상선 격리를 예방하기 위해, 100 μL의 30 mg/mL 요오드화나트륨이 투약보다 1 시간 및 24 시간 앞서 복막내 투여되었다. 모든 생쥐는 5 mg/kg의 총 용량을 위해, 125I - 및 111In -표지화된 항체 (각각 5 μCi) 플러스 개별 변형되지 않은 항체의 혼합물로 구성되는 단일 IV 주사를 제공받았다. 4마리 생쥐의 코호트가 주사 후 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 4 시간, 12 시간, 1 일, 2일 및 3 일에 이소플루란 (효과가 나타날 때까지 흡입) 하에 안와후로 채혈되었다. 1 시간, 1 일 및 3 일에; 4마리 동물이 케타민 (75-80 mg/kg) /자일렌 (7.5-15 mg/kg)의 마취 하에 개흉술에 의해 안락사되었다. 하기 조직이 수집되고, 차가운 PBS에서 헹굼되고, 건성 블롯팅되고, 계량되고, 동결되었다: 뇌, 간, 폐, 신장, 비장, 심장, 위, 소장, 근육, 피부, 지방, 대장. 표본 방사성이 자동 배경 및 감쇠 보정과 함께 111In (245 keV; 감쇠 t1/2 = 2.8 일) 및 125I (35 keV; 감쇠 t1/2 = 59.4 일)에 대한 에너지 윈도우에서 1480 WIZARD™ 감마 계수기를 이용하여 방사성에 대해 계수되었다. 데이터는 GraphPad Prism(Windows용 버전 7.00, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com)을 이용하여 분석되고 도표화되었다.
생쥐 혈장 안정성. 생쥐 혈장 (항응고성 리튬 헤파린 포함)이 BioIVT (Westbury, NY)로부터 획득되었고, 그리고 완충액 대조가 소 혈청 알부민 (SigmaAldrich; St. Louis, MO, 카탈로그 A2058)을 PBS (PBS + 0.5% BSA)와 혼합함으로써 만들어졌다. 방사성표지화된 항체가 5μCi의 방사성표지화된 추적자에서 생쥐 혈장 또는 완충액 대조 내로 혼합되고, 그리고 이후 37℃ 및 5% CO2에 세팅된 인큐베이터에서 배양되었다. 배양의 0, 24 및 96 시간의 설정된 시점에서, 표본이 인큐베이터로부터 제거되고, 그리고 분석 때까지 -80℃ 냉동기에서 보관되었다.
이들 표본은 PBS에서 1:1 표본 희석을 이용한 전술된 SEC-HPLC 방법에 의해 분석되었다. 제로 시간에서 부모 피크로부터 변화를 모니터링하기 위해, 이들 시점 사이에서 결과의 크로마토그램이 비교되었다.
Wasatch에 의한 항체 동역학. 96 x 96 어레이-기초된 SPR 영상화 시스템 (Carterra USA)이 정제된 IgA, IgG-IgA Fc 융합 또는 IgG의 25 ℃에서 동역학을 분석하는 데 이용되었다. 항체가 10 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4.5에서 10 μg/ml로 희석되고, 그리고 아민 연계를 이용하여, 연속 유동 마이크로스팟터에 의해 SPR 센서프리즘 CMD 200M 칩 (XanTec Bioanalytics, Germany) 위에 직접적으로 고정되었다. 작업 완충액 (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 1 mM EDTA)에서 희석된 항원이 3 분 동안 다양한 농도로 주입되고 10 분 동안 분리되도록 허용되었으며, 10 mM 글리신 pH 2.5를 이용하여 주기 사이에 재생되었다. 항원은 R&D Systems (mIL-13, 413-ML-025/CF; mpIgR, 2800-PG-050; hpIgR, 2717-PG-050; hFcαRI, 3939-FA-050), Sino Biologicals (hHER2, 10004-H08H), 또는 Genentech로부터 획득되고, 종 특이적 베타-2 마이크로글로불린 (m/hFcRn)과 공동발현되었다. 데이터는 Wasatch 동역학적 소프트웨어 도구로 처리되었다.
Biacore에 의한 항체 동역학. 항-IL-13 또는 항-HER2 IgA2m2 항체의 결합 동역학이 Biacore T200 기기 (GE Healthcare)에서 표면 플라스몬 공명을 이용하여 계측되었다. 모든 동역학 실험은 25 ℃에서, 30 μL/분의 유속에서, 그리고 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 및 1 mM EDTA의 작업 완충액으로 수행되었다. 인간 Fab 포획 키트 (GE Healthcare)로부터 Fab 결합체가 아민-기초된 연계를 통해 CM5 센서 칩 위에 고정되었다. 50-100 ug/mL의 농도를 갖는 IgA 항체가 210 초 동안 5 uL/분으로 포획되었다. 항체에 대한 재조합 인간 FcαRI 항원 (R&D Systems, 3939-FA-050) 결합이 1000 nM, 333 nM 및 111 nM의 농도를 이용하여 계측되었다. 결합에 대한 센서그램이 90 초의 주입 시간, 그 이후에 120 초의 해리 시간 및 글리신 pH 2.1의 2회 60 초 주입으로 주기 사이에 표면의 재생을 이용하여 기록되었다. 1:1 랭뮤어 결합 모형이 동역학 및 결합 상수를 계산하는 데 이용되었다.
결과:
IgA 소중합체 형성에 영향을 주는 인자. 단량체성 IgA의 재조합 생산은 충분히 이해되고, 그리고 IgG의 생산과 유사하게, 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)의 공동발현에 의해 달성될 수 있다. 대조적으로, 중합성 IgA의 조립은 LC, HC 및 연결 사슬 (JC)의 공동발현을 필요로 하고, 그리고 결과의 IgA 소중합체성 상태는 충분히 특징화되지 않는다. IgA 소중합체의 조립 과정에 관한 더 충분한 이해를 획득하기 위해, IgA1, IgA2m1, IgA2m1.P221R (이황화물 안정화된 LC-HC 대합) 및 IgA2m2를 비롯한, 다양한 인간 IgA 아이소타입 및 알로타입의 발현 (도 1a)이 특징화되었다. 항생쥐 인터류킨-13 (mIL-13) 항체의 뮤린 가변 도메인이 인간 카파 LC 및 IgA HC 불변 도메인과의 키메라로서 클로닝되었다. 키메라 LCs 및 HCs는 이후, 인간 JC의 존재와 부재에서 공동발현되었다 (도 1b). 단백질 L로 친화성 정제 후, 동시형질감염된 JC의 부재에서 생산된 IgA는 30 mL Expi293T 일시적인 발현으로부터 상대적으로 순수한 단량체를 산출하였다. 이들 실험에서, 세포는 동등한 대량의 LC 및 HC DNA로 형질감염되었다. 대조적으로, 동등한 대량의 LC, HC 및 JC DNA의 형질감염은 IgA 단량체, 이합체, 그리고 3개 내지 5개의 IgA 단량체를 내포하는 중합체에 상응하는 다양한 소중합체 종류를 생산하였다 (도 1d 및 도 2a-c). IgA1, IgA2m1 및 IgA2m1.P221R은 지배적으로 이합체성 IgA를 생산하는 것으로 밝혀졌고 (도 2a-b), 반면 IgA2m2는 거의 동등한 양의 이합체 및 중합체를 생산하였다 (도 2c). 리터 규모까지 정률증가 시에, CHO 일시적인 발현에서 소중합체의 유사한 분포가 관찰되었다.
IgA 이합체를 이차 정제에 의해 중합체로부터 분리하는 것은 더 큰 규모에서는 어려운 것으로 입증되었다. 조립을 이합체 형성을 향해 편향시키려는 시도에서, 증가된 JC 발현 수준을 증진하기 위해, LC 및 HC DNA 양 둘 모두에 비하여 JC DNA의 양이 증가되었다. 이것은 이합체 종류의 상대적 백분율에서 증가 및 중합체 종류의 상대적 백분율에서 감소를 유발하였다 (도 2a-c; 도 15-17 및 20을 또한 참조한다). 반대로, LC 및 HC DNA 양 둘 모두에 비하여 JC DNA의 양을 감소시키는 것은 고차 중합체 (삼합체/사합체/오합체)의 증가된 백분율을 유발하였다 (도 18 및 21-23). JC DNA 양에 근거하여 소중합체 종류에 영향을 주는 능력은 IgA2m2 종류의 경우에 가장 확연하였다. 게다가, 분비 성분, 연결 사슬, 경쇄 및 중쇄의 동시형질감염은 분비 성분 없이 연결 사슬, 경쇄 및 중쇄의 동시형질감염과 비교하여, 고차 소중합체를 산출하였다 (도 29).
IgA2m2가 IgA1 또는 IgA2m1보다 더 큰 소중합체를 형성하는 더 높은 성향을 갖는 이유를 이해하기 위해, 상이한 아이소타입/알로타입에 대한 HC 테일피스의 아미노산 서열이 비교되었다. IgA1 및 IgA2m1 테일피스의 서열은 동일한 반면, IgA2m2는 2개 잔기에 의해 다르다. 잔기 458 및 467은 IgA1 및 IgA2m1에서 둘 모두 발린이고, 반면 IgA2m2는 이들 위치에서, 각각 이소류신 및 알라닌을 갖는다 (도 1a, 별표). 이런 이유로, 이들 2개의 아미노산 차이가 더 큰 소중합체를 형성하는 재조합 IgA2m2의 독특한 성향을 설명할 수 있는 지가 조사되었다. 실제로, 이소류신이 IgA1 또는 IgA2m1 내에 위치 458에서 발린을 대체할 때, 더 많은 중합체가 생산되었고, 그리고 이것은 잔기 467에서 알라닌 또는 발린과는 무관하였다 (도 2d). 반대로, IgA2m2 내에 위치 458이 이소류신으로부터 발린으로 변화될 때, 중합성 종류의 함량은 감소되고 이합체 함량이 우호적으로 증가되었다.
분비 성분 또는 연결 사슬과의 이황화 결합을 예방하기 위해 IgA2m2 항체의 중쇄 내에 일정한 시스테인 잔기의 돌연변이가 산출되었고, 그리고 소중합체 형성에 대한 이런 돌연변이의 효과를 결정하기 위해 분석되었다. Cys311의 세린으로의 돌연변이는 분비 성분과의 이황화 결합을 예방하고, 그리고 Cys471의 세린으로의 돌연변이는 연결 사슬과의 이황화 결합을 예방한다. 도 28b에서 도시된 바와 같이, 연결 사슬을 경쇄와 중쇄에 부가할 때 IgA2m2 이합체 및 고차 소중합체 형성을 위해 C471의 돌연변이는 필요하지만 C311의 돌연변이는 그렇지 않았다.
글리코실화는 IgA 소중합체화에서 일정한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다 (Chuang et al., J Immunol 158:724-32 (1997)). 따라서, IgA1 및 IgA2m2에서 각각의 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하기 위한 돌연변이가 만들어졌다. IgA1 또는 IgA2m2의 테일피스에서 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하는 4가지 별개의 돌연변이 (N459A/G/Q 또는 S461A) 또한 생산되는 중합체의 양을 증가시켰고, 반면 테일피스 외부에서 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이는 소중합체 형성을 변경하지 않았다 (각각, 도 2e 및 2f; 또한 도 38 참조). 이런 이유로, 형질감염에서 DNA 비율을 조정하는 것에 더하여, IgA 중합체 형성은 테일피스 아미노 잔기 458에서 이소류신을 가짐으로써, 또는 IgA 테일피스의 N-연결된 글리코실화를 예방함으로써 증가될 수 있다.
IgA 단량체 및 소중합체의 대규모 정제 및 생물물리학적 특징화. 소규모 발현을 통해 획득된 IgA 소중합체 형성에 대한 통찰을 이용하여, 단량체성, 이합체성 및 사합체성 IgA가 CHO 일시적인 발현을 이용하여 정률증가되었다. IgA1, IgA2m1, IgA2m1.P221R 및 IgA2m2의 단량체성 및 이합체성 종류뿐만 아니라 IgA2m2의 사합체성 종류가 단리되었다 (도 3a). 이들 표본의 비-환원된 SDS-PAGE 분석은 IgA 단량체, 이합체 및 사합체 각각에 대한 ~150 kDa, ~310 kDa 및 ~610 kDa의 예상된 질량과 일치하는 분자량의 우세한 띠를 보여주었다 (도 3b). 이들 예상된 질량은 글리코실화가 없는 아미노산 서열에 기초되었고, 그리고 소중합체마다 1개의 JC의 통합을 가정한다. 정제된 소중합체 종류의 몰 질량 역시 SEC-MALS에 의해 계측되었고, 그리고 이합체성 및 사합체성 IgA의 예상된 질량과 일치하는 것으로 밝혀졌다 (표 2). 정제된 IgA 표본의 환원된 SDS-PAGE 분석은 ~25 kDa 및 ~55 kDa 각각에서 단량체에 대한 LC 및 HC 띠의 존재를 확증하고, 반면 소중합체성 표본에서는 25 kDa 바로 아래에서 JC에 대한 띠가 또한 검출될 수 있다 (도 3b). LC, HC 및 JC의 정체는 환원 및 효소적 데글리코실화 후 질량 분광분석에 의해 추가적으로 확증되었다 (도 18e). 음성 염색 전자 현미경검사 (EM)가 또한, 단리된 종류의 소중합체성 상태를 더욱 검증하는 데 이용되었다. IgA2m2 이합체 (도 3c) 및 사합체 (도 3d)의 음성 염색 이미지는 각각, 2개 또는 지배적으로 4개의 IgA 분자의 존재를 확증한다. 이합체에서, 2개의 IgA 분자는 그들의 Fc 도메인에 의해 가늘고 긴 입자 내로 꼬리에서 꼬리로 연결되고, 반면 사합체에서 4개의 Fc 도메인 사이에 상호작용은 4개의 IgA 분자의 치밀한 복합체를 발생시킨다. 양쪽 표본의 미가공 이미지는 단정한, 단분산 입자의 존재를 보여주었다 (도 8).
표 2. SEC-MALS에 의해 계측될 때 재조합 IgA의 몰 질량
예측된 MW
(Da) 		SEC-MALS MW
(g/mol) 		다분산성 (Mw/Mn)
항-mIL-13 IgA1 이합체 3.160 x 105 3.277 x 105 +/- 0.802% 1.001 +/- 1.127%
항-mIL-13 IgA2m1 이합체 3.114 x 105 3.264 x 105 +/- 0.675% 1.001 +/- 0.951%
항-mIL-13 IgA2m2 이합체 3.117 x 105 3.437 x 105 +/- 0.646% 1.002 +/- 0.911%
항-mIL-13 IgA2m2 사합체 6.078 x 105 6.580 x 105 +/- 0.510% 1.005 +/- 0.720%
몰 질량 및 다분산성 계측을 위해 Wyatt DAWN HELEOS II/Optilab T-rEX 다각도 광 산란 (MALS) 검출기에 연계된 Waters Xbridge Protein BEH 200 Å 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 칼럼 위에 단백질이 주입되었다. IgA 분자의 예측된 분자량 (MW)은 아미노산 조성에만 기초되고, 이합체 또는 사합체마다 1개의 JC의 통합을 가정하고, 그리고 임의의 잠재적인 N- 또는 O-연결된 글리칸을 설명하지 못한다.
항-mIL-13 IgA 단량체, 이합체 및 사합체는 항-mIL-13 IgG1과 유사한 친화성으로 뮤린 IL-13에 결합하였는데 (표 3 및 도 19), 이것은 Fab 영역이 적절하게 접힘되고 재조합 IgAs에서 기능적이라는 것을 지시한다. 예상한 대로, 생쥐 및 인간 pIgR 결합은 단지 IgA 소중합체의 경우에만 목격되었고, 반면 단량체성 및 소중합체성 항-mIL-13 IgA는 둘 모두 인간 FcαRI에 유사한 친화성으로 결합하였다 (표 3). 이에 더하여, CHO 세포 또는 Expi293 세포에서 일시적인 발현으로부터 정제된 IgA2m2는 생쥐 및 인간 pIgR에 유사한 결합을 나타냈다 (도 36a). pIgR 결합 능력으로 인해, 모든 IgA 소중합체는 인간 pIgR을 이소성으로 발현하는 MDCK 세포주를 이용하여 시험관내에서 통과세포외배출될 수 있었지만 단량체는 그렇지 않았다 (도 4a 및 7e). 추가적으로, 이들 IgA 단량체 및 소중합체 모두 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 계측될 때, 항-mIL-13 인간 IgG1과 비교하여 증가된 안정성, 그리고 IgG1 Fab 단편과 비교하여 유사하거나 또는 증가된 안정성을 보여주었다 (도 4b).
표 3. 항원 및 수용체에 대한 항생쥐 IL-13 IgA 및 IgG 분자의 결합 친화성.
K D (nM)
생쥐 IL-13 생쥐 pIgR 인간 pIgR 인간 FcαRI
IgA1 단량체 0.78 ± 0.05 NB NB 425 ± 7
IgA2m1 단량체 1.09 ± 0.03 NB NB 429 ± 6
IgA2m1 P221R 단량체 1.16 ± 0.01 NB NB 443 ± 8
IgA2m2 단량체 0.70 ± 0.01 NB NB 455 ± 5
IgA1 이합체 0.34 ± 0.01 2.66 ± 1.45 8.80 ± 0.55 369 ± 3
IgA2m1 이합체 0.18 ± 0.01 2.54 ± 0.15 5.05 ± 0.88 499 ± 7
IgA2m1 P221R 이합체 0.84 ± 0.01 5.59 ± 0.03 15.5 ± 0.10 462 ± 4
IgA2m2 이합체 0.81 ± 0.01 2.45 ± 0.98 13.9 ± 0.10 597 ± 5
IgA2m2 사합체 0.97 ± 0.02 0.69 ± 0.05 1.93 ± 0.02 533 ± 5
IgG1 0.88 ± 0.05 NB NB NB
NB: 결합 없음. 모든 실험 적어도 n=3회 수행되었다.
재조합 IgA의 약동학적 프로필 및 생체분포. 개시된 재조합 IgA 소중합체의 혈청 농도 시간 프로필이 분석되었고, 그리고 재조합 단량체를 이용하여 기존 문헌 (Boross et al. (2013), Rouwendal et al. (2016) 및 Lohse et al., Br J Haematol 112:4170 (2017))에서 보고된 데이터에 필적하는 것들로 결정되었다 (도 5a 및 표 4). 재조합 IgA 소중합체의 단일 투여 후, 매우 급속한 혈청 소실 (> 200 mL/일/kg)이 관찰되었다. 혈청 정제된 인간 IgA 단량체는 더 느린 전체 소실, 그리고 고도로 시알화된 IgA 단량체에 대해 기존 문헌 (Rouwendal et al. (2016))에서 보고된 것과 전반적으로 일치하는 혈청 PK 프로필을 나타냈다. 혈청 농도 시간 프로필을 특징화하는 것에 더하여, 생쥐에서 이중 I-125 및 In-111 표지화된 항체를 이용한 방사성표지화된 생체분포 연구가 또한 수행되었다. 이중 추적자 접근법은 기존 문헌 (Boswell et al., Bioconjugate Chem 21:2153-63 (2010), Mandikian et al., Mol Cancer Ther 17:776-85 (2018) 및 Rajan et al., MAbs 9:1379-88 (2017))에서 설명된 바와 같이, 리소좀 분해 (I-125) 및 내재화된/이화된 항체 (In-111 마이너스 I-125)에 앞서 무손상 항체를 구별하는 능력을 제공하였다 (도 5b-c). 간단히 말하면, 요오드는 세포로부터 밖으로 급속하게 확산하고 요오드화된 항체가 리소좀 분해를 겪은 후 소실되고, 반면 In-111 표지화된 항체는 리소좀 분해 이후에 In-111-부가물의 세포간 축적을 보여준다. IgA 항체가 IgG1와 비교하여 이렇게 급속하게 소실되었기 때문에, 조직 분포 데이터의 직접적인 비교가 어려운데, 그 이유는 미가공 조직 값이 세포간 및 혈관 농도 둘 모두를 나타내기 때문이다. 이런 이유로, 무손상 항체 분포 데이터는 조직에서 세포간 농도만을 나타내기 위해 기존 문헌 (Boswell et al., Mol Pharmaceutics 11:1591-8 (2014))에서 설명된 바와 같이 혈액 보정되었다. IgG1과 비교하여 무손상 IgA 소중합체의 약간 농축이 비록 낮은 수준이긴 하지만, 1 시간 후 간, 위, 소장, 대장 및 피부 (이들 모두 pIgR 발현 조직)에서 관찰되었다 (Asano et al., Scand J Immunol 60:267-72 (2004) 및 Wang et al., Scand J Immunol 83:235-43 (2016)) (도 5b). 높은 수준의 IgA 분해 또한 간 및 소장에서 1 시간의 투약 후 연구된 형식의 전역에서 목격되었다 (도 5c). 이들 형식 사이에서 관찰된 총 혈중 농도에서 차이를 설명하기 위해, 개별 조직 대 혈장 농도의 비율 역시 설명되었다 (도 9). 1 일 후, 이들 조직에서 무손상 IgA 항체는 거의 남아있지 않았고 (도 10), 그리고 비록 In-111이 장관 세포에서 후기 시점에 잘 축적되지 않기 때문에 소장에서 이화가 검출될 수 없었을 수도 있지만, 간에서 최대 이화가 검출되었다 (도 11) (Boswell et al., British Journal of Pharmacology 168:445??57 (2013)). 특정 이론에 한정됨 없이, IgA의 분해 및 궁극적인 소실 기전을 감소시키는 것이 IgG와 비교하여, IgA 분자의 점막 조직 내로의 흡수를 더욱 향상시킬 수 있는 것으로 가정되었다.
단량체성 IgA 분자의 N-연결된 글리칸 상에서 시알화 함량은 특정한 글리칸 수용체를 통한 항체 소실과 부정적으로 상관하는 것으로 보고되었다 (Rouwendal et al. (2016)). 따라서, 개시된 IgA 분자는 그들의 전체 시알화 함량을 결정하기 위해 분석되었다. 글리칸은 처리의 수준에 근거하여 범주로 분류되었는데, 복합체 및 시알화가 IgA 분자에 대해 가장 요망되었다 (도 6a). IgA1, IgA2m1, IgA2m1.P221R, IgA2m2의 재조합적으로 생산된 이합체뿐만 아니라 IgA2m2 단량체 및 사합체는 약 20-50% 시알화되었다 (도 6b, 도 25 및 도 26, 그리고 표 5). 이것은 IgA 분자가 글리칸 수용체에 의해 인식될 수 있는 불완전하게 처리된 글리칸을 내포한다는 것을 지시한다. 추가적으로, IgA2m1 이합체 상에서 각 부위에서 시알화 함량이 조사되었고, 그리고 JC 상에서 부위를 비롯한, 모든 부위가 불완전하게 처리된 글리칸을 내포하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 불완전 글리칸 처리가 단지 하나의 특정한 부위에서만 발생하지는 않는다는 것을 암시한다 (도 6c 및 표 6). 개시된 재조합 IgA 분자와는 대조적으로, 인간 혈청으로부터 정제된 IgA는 95%의 시알화 함량을 갖고 (도 6b 및 표 5), 그리고 SEC-MALS에 의해 결정된 바와 같이 단량체성이었다. 혈청 IgA가 지배적으로 단량체성인 것으로 알려져 있기 때문에 (Kerr (1990)), 이것은 고도로 시알화된 분자에 대해 농축될 수 있는데, 그 이유는 시알화 함량이 항체의 전신 노출과 긍정적으로 상관하기 때문이다. 특정 이론에 한정됨 없이, 인간 정제된 IgA 단량체의 이러한 증가된 시알화 수준은 재조합 IgA 단량체에 비하여 생쥐에서 상기 분자의 감소된 혈청 소실과 상관할 것으로 생각된다. 실제로, 이것은 사실인 것으로 증명되었는데, 이것은 간에서 특정한 글리칸 수용체에 결합이 IgA 단량체에 대한 중요한 소실 기전일 수 있음을 암시한다 (도 5a, 도 25 및 도 27).
표 4. Balb/C 생쥐에 IgA 단량체/소중합체의 5 mg/kg IV 일시 주사 후 약동학적 파라미터 추정치 (평균)
C max
(μg/mL) 		AUC last
(일*μg/mL) 		CL
(mL/일/kg) 		반감기 (일)
IgA2m2 단량체 76.42 8.674 573.2 0.36
IgA1 이합체 85.17 14.61 341.3 0.31
IgA2m1 이합체 92.53 13.40 372.9 0.26
IgA2m1 P221R 이합체 107.8 17.55 284.5 0.27
IgA2m2 이합체 144.7 20.88 238.9 0.31
IgA2m2 사합체 60.47 6.127 788.1 0.22
인간 혈청 IgA 단량체# 203.3 203.0 45.74 0.97
IgG1 100.1 339.3 14.30 2.89
AUClast = 농도 시간 곡선 아래 면적, 최종 계측가능 농도; CL = 소실; Cmax = 관찰된 최고 농도; IV = 정맥내; #Balb/c 생쥐에 10 mg/kg IV 일시 주사가 투약됨. 주의: 모든 생쥐 PK 데이터에 대해 희소 PK 분석이 수행되었기 때문에, 군마다 개별 생쥐로부터 획득된 데이터가 한 데 모아졌고, 그리고 SD가 보고되지 않았다.
감소된 pIgR 결합을 갖는 IgA 변이체의 산출. pIgR 결합에 대한 돌연변이의 효과를 결정하기 위해, IgA2m2의 변이체가 산출되었다. 아미노산 Y411, V413 및 T414의 알라닌으로의 돌연변이 (본원에서 "411-414AAA"로서 지칭됨), P440R 돌연변이, C311S 돌연변이 또는 이들의 조합을 갖는 IgA2m2 변이체가 산출되었다. 이런 변이체의 발현 수준은 도 30a에서 제공된다. 도 30b는 소규모 정제된 항-IL-13 IgA2m2 변이체의 SEC 특징화를 제공한다. 도 30c-d에서 도시된 바와 같이, 아미노산 Y411, V413 및 T414의 돌연변이를 갖는 IgA2m2 변이체는 생쥐 pIgR 또는 인간 pIgR에 결합하지 않고, 반면 P440R 변이체는 뮤린 pIgR에 대한 10-배 감소된 친화성 및 인간 pIgR에 대한 결합능에서 유의미한 상실을 유발하였다. 이에 더하여, 아미노산 411, 413 및 414의 돌연변이를 갖는 IgA2m2 변이체 역시 FcαRI에 결합하지 않는다 (도 30e).
표 5. 단량체성 및 중합성 IgA 분자의 전역 N-연결된 글리칸 분석.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
IgA 항체의 시알화 함량을 증가시키기 위한 세포 배양 조건의 변경. IgA 항체를 발현하는 세포의 배양 조건이 항체의 시알화 함량을 증가시키기 위해 변경되었다. 검사된 세포 배양 조건은 도 31a에서 제공된다. 도 31b에서 도시된 바와 같이, 7-일 수확에서 IgA2m2 항체의 시알화는 갈락토오스 및 N-아세틸만노사민 (ManNac)의 존재에서 시알산전달효소 (ST) 및 갈락토오스전달효소 (GT)의 첨가 시에 증가되었다.
표 6. IgA2m1 이합체의 부위 특이적 N-연결된 글리칸 분석.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
글리코실화 부위 및 FcRn 가공을 통한 재조합 IgA의 약동학적 프로필 향상. 생쥐에서 재조합 중합성 IgA의 소실을 감소시키기 위해 2가지 병렬적 접근법이 취해졌다. 첫 번째, 글리칸이 없는 분자 (비글리코실화됨)를 생산하기 위해, IgA2m2에서 5개의 N-연결된 글리코실화 모티프 모두 및 JC에서 단일 부위가 돌연변이유발에 의해 제거되었다 (도 7a 및 도 25). 비글리코실화된 IgA 중합체는 글리칸 수용체에 의해 인식되지 않고, 그리고 글리칸 수용체-매개된 소실 기전과 무관한 약물동력학의 연구를 가능하게 할 것이다. 도 36b-d에서 도시된 바와 같이, 개별 IgA2m2 글리코실화 변이체는 생쥐 pIgR 및 인간 pIgR에 유사한 결합을 갖는다. IgA2m2에서 N-연결된 글리코실화 모티프 N-X-S/T의 제거를 위해, 이것이 발생하는 3가지 사례에서 N이 A/G/Q로 돌연변이되거나, 또는 S/T가 A로 돌연변이되거나, 또는 상기 모티프가 비글리코실화된 IgA1 서열로 되돌려졌다 (도 1a). JC 잔기 N49가 A/G/Q로 돌연변이되거나, 또는 S51이 A로 돌연변이되었다. 개별 IgA2m2 돌연변이 N166A, S212P, N263Q, N337T.I338L.T339S 및 N459Q, 그리고 N49Q JC 돌연변이가 가장 높은 수준의 일시적인 발현을 제공하지만, IgA2m2에서 5개 글리코실화 부위 모두를 제거하기 위한 돌연변이의 조합이 불량한 발현을 유발하고 J 사슬 N49Q 돌연변이의 추가 부가가 이것을 완전히 전폐하는 것으로 밝혀졌다. 도 24a-c를 또한 참조한다. 키메라 면역글로불린은 종종, 단일 종으로부터 것들에 비하여, 포유류 세포에서 더 낮은 발현 수준을 보여준다. 이런 이유로, 인간화 IgAs를 산출하기 위해 뮤린 항-mIL13 가변 도메인이 인간화 항-HER2로 전환되었지만, 이것은 일시적인 발현 수준을 향상시키지 못하였다. 이런 이유로, 소중합체 종류의 혼합물로서 정제되는 비글리코실화된 인간 항-HER2 IgA2m2 중합체의 발현 수준을 증가시키기 위해, CHO 표적화된 통합 (TI) 안정된 세포주가 생산되었다.
두 번째, FcRn 결합을 리소좀 분해를 감소시키는 방안으로서 활용하기 위해 2개의 IgG1-IgA Fc 융합이 가공되었다 (도 7b). 이전 연구는 이러한 접근법이 IgA 단량체 혈청 소실을 IgG1에 필적하는 수준까지 구제한다는 것을 암시하였다 (Li et al. (2017) 및 Borrok et al. (2015)). 초기에, 기존 문헌 (Borrok et al. (2015))에서 보고된 IgG1-IgA2m1 P221R Fc 융합의 이합체성 및 사합체성 버전이 만들어졌지만, 이들은 4 일에 생쥐 혈장에서 불안정성을 나타내는 것으로 관찰되었다 (도 7c). 일차 절두 산물은 분석적 SEC에서 전장 항-HER2 IgG1 (트라스투주맙)과 유사한 시점에서 용리되었는데, 이것은 이러한 불안정성이 IgG1-IgA2m1 P221R Fc 접합부에서 개열하는 엔도프로테아제에 의해 유발된다는 것을 암시하였다. 접합부의 아미노산 서열이 검사되었고, 그리고 퓨린-유사 개열 부위와 유사한 양으로 하전된 잔기의 스트레치가 확인되었다 (도 12). 단백질분해성 개열을 경감하기 위해, 접합부에서 이들 양으로 하전된 잔기가 IgG1 중쇄의 C 말단 K447의 제거에 의해 제거되었고, 그리고 선천적 IgA2m1 잔기, P221 (P221R 돌연변이 대신에), 또는 IgA2m1 힌지를 결실하는 C242 중 어느 한 가지를 포함하는 IgA2m1 Fc가 시작되었다 (도 12 및 도 34a). C242 Fc 시작 또한 포함되었는데, 그 이유는 이것이 IgA1 Fc 결정 구조 작제물의 첫 번째 잔기이고, 따라서 안정된 절두된 단백질인 것으로 추정되었기 때문이다 (Herr et al., Nature 423:614-20 (2003)). 재가공된 IgG1△K-P221 IgA2m1 Fc 및 IgG1△K-C242 IgA2m1 Fc 융합이 이합체로서 생산될 때, 이들 둘 모두 4 일까지 동안 생쥐 혈장에서 안정된 것으로 밝혀졌다 (도 7c). 도 34b는 전장 항-IL-13 IgG1-IgA Fc 융합에 대한 일시적인 발현 데이터를 제공한다. 가공된 융합 분자 중에서 일부는 IgG1 및 본래 작제물과 비교하여 향상된 발현을 나타낸다 (도 34b 및 도 37a). 게다가, 도 33a에서 도시된 바와 같이, LC 및 HC DNA의 양과 비교하여 JC DNA의 양을 증가시키는 것은 고차 소중합체 종류보다 더 많은 이합체 종류의 생산을 유발하였다.
IgG1-IgA1 융합은 또한, 하부 힌지 잔기 E233 또는 L234에서 IgG1을 C241 또는 C242에서 IgA1의 Fc에 융합함으로써 산출되었다. 도 37b에서 도시된 바와 같이, IgG1-IgA1 융합은 IgA1와 유사하게, 지배적으로 이합체로서 발현되었다. 이에 더하여, IgG1-IgA1 융합은 IgA1과 유사한 방식으로 인간 및 생쥐 pIgR 및 인간 FcαRI에 결합하였다 (도 37c).
가공된 IgA 항체 및 IgG1-IgA 융합 분자는 IgA1 이합체와 비교하여 안정성에서 상실 없음을 확증하는 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 안정성에 대해 분석되었다 (도 32).
가공된 IgA 항체 및 IgG1-IgA 융합 분자는 전역 글리칸 함량, 항원 결합 및 수용체 결합에 대해 더욱 특징화되었다. 비글리코실화된 항-HER2 IgA2m2 중합체는 실제로 글리코실화를 갖지 않고, 반면 항-mIL-13 IgG1△K-P221 IgA2m1 Fc 및 IgG1△K-C242 IgA2m1 Fc 융합은 단지 ~20% 복합체, 시알화된 글리칸을 내포하였다 (도 13 및 표 8). 비글리코실화된 항-HER2 IgA2m2 중합체는 인간 (h)HER2, 뮤린 (m)pIgR 및 hpIgR에 대해, 글리코실화된 IgA2m2 사합체와 유사한 결합 친화성을 갖는 것으로 나타났고, 반면 이것은 Wasatch SPR 검정에 의해 결정된 바와 같이, IgA-특이적 hFc 수용체, hFcαRI에 결합하지 않았다 (표 7; 또한 도 33b-c를 참조한다). 흥미롭게도, IgA2m2 HC 상에서 글리코실화를 결여하지만, J-사슬 상에서 글리코실화를 유지하는 IgA2m2 사합체 또한 Wasatch SPR 검정에 의해 결정된 바와 같이 hFcαRI에 결합할 수 없었는데 (도 35a-b), 이것은 IgA HC의 글리코실화가 수용체 결합을 위해 필요하다는 것을 암시한다. 하지만, 제약 산업에서 통상적으로 이용되는 SPR 시스템인 Biacore SPR 시스템을 이용하여 밝혀진 바와 같이, IgA 중합체의 글리코실화 상태는 hFcαRI에 결합에 영향을 주지 않았다 (도 52a-b). 도 52a-b에서 도시된 바와 같이, 비글리코실화된 항-HER2 IgA2m2 중합체 ("xHER2 4D5.IgA2m2 사합체 N168A.S214P.N252Q.N326T.I327L.T328S.N461Q, J-N71Q"로서 지칭됨) 및 부분적으로 데글리코실화된 항-IL-13 IgA2m2 소중합체는 Biacore SPR 검정에 의해 결정된 바와 같이 hFcαRI 결합을 유지하였다. 특정 이론에 한정됨 없이, 이들 2가지 SPR 시스템, 다시 말하면, Wasatch 및 Biacore 시스템으로부터 획득된 결과에서 차이는 이들 방법에서 개시된 바와 같이, SPR 시스템에서 이용되는 칩에 항체를 고정시키는 데 이용되는 상이한 전략에 부분적으로 기인할 수 있다.
게다가, 항-mIL-13 IgG1△K-P221 IgA2m1 Fc 및 IgG1K-C242 IgA2m1 Fc 이합체 둘 모두 Wasatch SPR 검정에 의해 결정된 바와 같이, mIL-13, mFcRn 및 hFcRn에 대해, 항-mIL-13 IgG1과 유사한 결합 친화성 (표 7)뿐만 아니라 mpIgR, hpIgR 및 hFcαRI에 대한, IgA2m1 이합체와 유사한 결합 친화성 (표 3 및 7)을 가졌다. 따라서, 이들 IgG1-Ig2m1A Fc 융합은 IgG 및 중합성 IgA 둘 모두의 원하는 속성을 유지한다.
표 7. Wasatch 결합 검정을 이용한, 항원 및 수용체에 대한 IgG1-IgA2m1 Fc 융합 이합체 및 비글리코실화된 IgA2m2 사합체의 결합 친화성.
K D (nM)
생쥐
IL-13 		인간 HER2 생쥐 pIgR 인간 pIgR 생쥐 FcRn *
pH 6.0 		인간 FcRn *
pH 6.0 		인간 FcαRI
항-HER2 IgA2m2 사합체 NB 0.21 ± 0.08 0.35 ± 0.01 0.50 ± 0.06 NB NB 1,590 ± 200
항-HER2 IgA2m2 사합체 비글리코실화됨 NB 0.27 ± 0.07 0.55 ± 0.10 0.72 ± 0.06 NB NB NB
항-IL-13 IgG1△K-
P221 IgA2m1 Fc 이합체		 1.46 ± 0.33 NB 3.32 ± 1.07 7.67 ± 0.42 6,800 ± 556 8,400 ± 294 1,070 ± 69.8
항-IL-13 IgG1△K-
C242 IgA2m1 Fc 이합체		 1.38 ± 0.15 NB 3.32 ± 1.62 4.41 ± 1.72 7,400 ± 830 9,900 ± 838 938 ± 93.9
항-IL-13 IgG1 1.15 ± 0.17 NB NB NB 7,800 ± 499 9,800 ± 1, 081 NB
인간 혈청 IgA 단량체 NB NB NB NB NB NB 1,750 ± 92.9
NB: 결합 없음. *KD가 항정 상태 동역학을 이용하여 계산되었다. 모든 실험은 적어도 n=3회 수행되었다.
표 8. IgG1-IgA2m1 Fc 융합 소중합체 및 비글리코실화된 IgA2m2 사합체의 전역 N-연결된 글리칸 분석.
Figure pct00011
Figure pct00012
시험관내 pIgR 매개된 통과세포외배출 및 혈청 농도 시간 프로필이 이들 새로 산출된 형식 둘 모두의 생쥐에서 계측되었다. IgG1-IgA2m1 Fc 융합은 생쥐에서 전체 IgA 혈청-노출에서 가장 현저한 향상을 보여주지만 (도 7d, 도 34c 및 표 9), 가장 높은 수준의 시험관내 통과세포외배출을 보여주는 비글리코실화된 IgA2m2 중합체와 비교하여 가장 낮은 수준의 시험관내 통과세포외배출을 보여주었다 (도 7e).
표 9. Balb/C 생쥐에 IgA 소중합체의 30 mg/kg IV 일시 주사 후 약동학적 파라미터 추정치 (평균).
C max
(μg/mL) 		AUC last
(일*μg/mL) 		CL
(mL/일/kg) 		반감기 (일)
항-HER2 IgA2m2 사합체 48.9 617.8 612.8 0.87
항-HER2 IgA2m2 사합체 비글리코실화됨 159 1063.7 320.7 0.68
항-IL-13 IgG1△K-P221 IgA2m1 Fc 이합체 176 962.5 236.8 3.42
항-IL-13 IgG1△K-C242 IgA2m1 Fc 이합체 177 739.9 192.3 1.94
항-IL-13 IgA2m1 이합체 115 1371.8 430.9 0.41
AUClast = 농도 시간 곡선 아래 면적, 최종 계측가능 농도; CL = 소실; Cmax = 관찰된 최고 농도; IV = 정맥내. 주의: 모든 생쥐 PK 데이터에 대해 희소 PK 분석이 수행되었기 때문에, 군마다 개별 생쥐로부터 획득된 데이터가 한 데 모아졌고, 그리고 SD가 보고되지 않았다.
논의:
IgA는 IgG에 의해 제공되는 현재의 기능성을 뛰어넘어 단일클론 항체의 치료 범위를 연장하는 잠재력을 갖는다. 부분적으로, 이것은 단량체성 및 중합성 종류 둘 모두를 형성하는 IgA의 다재다능에 의해 가능해진다. 지난 몇 년 동안, 단량체성 IgA의 재조합 생산에서 유의미한 진전이 이루어졌고 (Leusen (2015), Dicker et al., Bioengineered (2016), Vasilev et al., Biotechnol Adv (2015) 및 Virdi et al., Cell Mol Life Sci (2015)), 향상된 혈청 소실을 유발하는 N-연결된 글리칸의 증가된 시알화 함량을 갖는 충분히 특징화된 물질을 단리하기 위한 견실한 경로가 제공되었다 (Rouwendal et al. (2016)). 단량체성 IgA의 강한 세포독성 특성이 종양학 징후에 대한 매력적인 특질이긴 하지만, 중합성 IgA는 pIgR-매개된 통과세포외배출을 통해 상피 장벽을 뛰어넘어 표적에 도달하는 것이 요구된다. 본원에서 설명된 연구에 앞서, 재조합적으로 만들어진 단량체 및 소중합체의 혼합물만 통과세포외배출을 연구하는 생체내 실험에 이용되었다 (Olsan et al. (2015) 및 Rifai et al. (2000)). 본 실시예에서 설명된 실험은 이합체성 및 사합체성 IgA의 농축을 가능하게 하는 견실한 발현과 정제 루트를 확립한다. 특히, 형질감염에서 이용된 JC DNA의 양 또는 IgA 꼬리 영역의 글리코실화 상태를 조정하는 것은 소중합체 종류의 분포에 영향을 줄 수 있었다. 흥미롭게도, IgA 꼬리 상에서 N-연결된 글리코실화 부위는 종 사이에서 극히 보존되는 유일한 부위이고 (도 14), 생체내에서 고차 IgA 소중합체 형성을 제어하는 방안을 제공한다. 재조합 IgA의 정제를 위해, 단백질 L 친화성 크로마토그래피, 그 이후에 HPLC-SEC가 이용되었고, 그리고 이합체를 사합체로부터 쉽게 분리할 수 있었다.
재조합적으로 발현된 IgA 단량체 상에서 시알화의 수준을 증가시키는 것은 글리칸 수용체-매개된 이화를 극복함으로써 혈청 소실을 감소시키는 것으로 이전에 증명되었다 (Rouwendal et al. (2016)). 대안 전략으로서, 소중합체성 IgA의 혈청 소실에 대한 글리칸의 기여가 제거되었고, 그리고 완전히 비글리코실화된 IgA2m2 중합체가 생산되었다. N-연결된 글리칸의 결여는 표면 플라스몬 공명에 의해 사정된 바와 같이, pIgR에 결합에 영향을 주지 않았다. 놀랍게도, 시험관내 MDCK 통과세포외배출 검정에서 글리코실화된 사합체 또는 이합체와 비교하여 비글리코실화된 종류가 통과세포외배출을 유의미하게 향상시킨다는 것이 관찰되었다. 이러한 향상은 N-연결된 글리칸이 항체 Fc 영역으로부터 제거되지만, 탄수화물이 뮤린 J-사슬 상에 여전히 존재하는 인간 IgA1 이합체를 이용한 이전 연구에서는 관찰되지 않았다 (Chuang et al., (1997)). 특정 이론에 한정됨 없이, 한 가지 해석은 글리칸의 결여가 글리칸 수용체에 결합을 제거하고, 따라서 pIgR 결합을 통한 비섭동되고 더 효율적인 통과세포외배출을 제공한다는 것이다. 흥미롭게도, FcαRI에 대한 사합체성 IgA2m2의 결합은 글리코실화에 의존하였는데, 이것은 감소된 숫자의 글리코실화 부위를 내포하도록 가공된 단량체성 IgA2m1에 대해 관찰된 결합에 대한 효과의 결여와 대조적이다. 비록 중합성 IgA의 세포독성 효과가 분석되진 않았지만, FcαRI를 활성화하지 않으면서 통과세포외배출할 수 있는 IgA 치료제가 염증성 질환에 대해 바람직한데, 그 이유는 이것이 호중구 이주로부터 친염증성 반응을 예방할 것이기 때문이다 (Aleyd et al., Immunol Rev 268:123-38 (2015)).
본원에서 개시된 실험에서 재조합적으로 생산된 글리코실화된 IgA 소중합체 및 단량체는 단량체성 및 중합성 IgA에 대해 기존 문헌 (Rouwendal et al. (2016) 및 Chuang et al., (1997))에서 관찰된 것과 유사하게, 혈청으로부터 급속하게 소실되었다. 빠른 소실은 글리칸 수용체에 잠재적인 결합 및 리소좀에서 차후 분해에 기인하였다. 글리코실화된 IgA를 이용한 생체분포 연구는 이러한 결론을 뒷받침하고, 간 및 소장에서 최대 이화를 지시하였다. 글리칸을 갖는 것의 기여를 더 잘 이해하기 위해, 글리칸이 없는 IgA 중합체 (비글리코실화됨)가 산출되었고, 그리고 이의 생체내 PK 프로필이 글리코실화된 버전과 직접적으로 비교되었다. 비글리코실화된 IgA2m2 중합체는 글리코실화된 중합체와 비교하여 전체 생쥐 혈청 노출에서 감지가능한 차이를 나타내지 않았다 (<2-배). 이것은 N-연결된 글리칸을 갖는 것이 생쥐에서 IgA 중합체의 소실에 기여하는 데 최소한의 역할만을 수행한다는 것을 암시한다. 비글리코실화된 IgA 소중합체가 혈청 소실을 향상시키지 못하는 이유를 이해하는 데 추가 연구가 필요하긴 하지만, pIgR-매개된 통과세포외배출 및/또는 소실이 생쥐에서 중합성 IgA의 전체 혈청 농도 및 이들의 운명을 결정하는 데 유의미한 역할을 수행할 수 있는 것으로 보인다. 실제로, pIgR에 대한 사합체성 IgA의 평형 결합 친화성은 적어도 피코몰 범위 안에 있고, 풍부한 pIgR 수용체에 효율적인 결합, 그 이후에 통과세포외배출을 가능하게 한다. 하지만, 분자의 혈청 농도 시간 프로필 및 비글리코실화된 중합성 IgA의 성향을 더 잘 해석하기 위해, 조직 분포 프로필을 살펴보는 상세한 생체분포 연구가 필요할 것이다. 설치류에서 중합성 IgA 분자의 약동학적 특성 및 생체분포를 연구할 때 한 가지 중요한 경고는 pIgR의 발현 패턴이 설치류 및 인간 사이에 상이하여, 궁극적인 임상적 해석을 잠재적으로 혼란스럽게 만든다는 것이다. 특히, 설치류 및 토끼의 간세포에서 pIgR의 높은 발현은 인간에서 일어나지 않는 것으로 생각되는 중합성 IgA의 담즙성 소실 기전과 연관되었는데 (Daniels et al. (1989)), 인간에서는 그 대신에 pIgR 발현이 담관의 세포에서 발견된다 (Tomana et al. (1988)). 이런 이유로, 생쥐에서 중합성 IgA 분자의 생체분포 및 소실에서 pIgR이 수행하는 정확한 역할이 별도로 평가되어야 한다.
가속화된 혈청 소실을 방지하고 노출을 향상시키기 위해 취해진 대안 전략은 IgG1-IgA2m1 Fc 융합을 가공하는 것을 통하는 것이었다. FcRn에 결합하는 능력은 엔도솜에서 재활용을 가능하게 하고, 따라서 리소좀 분해를 위한 분류를 방지한다. 단량체성 IgG-IgA Fc 융합을 이용한 이전 보고서는 IgG에 필적하는 혈청 소실을 보고하였다 (Li et al. Oncotarget (2017) 및 Borrok et al. (2015)). 이에 더하여, 알부민 결합 펩티드에 융합된 단량체성 IgA에 대해 약물동력학에서 향상이 또한 관찰되었다 (Meyer et al., MAbs 8:87-98 (2016)). IgA 중합체로부터 글리칸을 제거함으로써 큰 기여가 관찰되지 않았기 때문에, 글리코실화된 융합 단백질이 생산되었다. 이합체성 IgG1-IgA2 Fc 융합이 향상된 전체 혈청 노출을 보여주긴 하지만, 이것은 단량체성 IgG-IgA Fc 융합에 대해 관찰된 바와 같이 IgG에 필적하지는 않았다 (Li et al. Oncotarget (2017) 및 Borrok et al. (2015)). 표면 플라스몬 공명에 의해, 이합체성 IgG1-IgA2m1 Fc 융합은 비록 MDCK 모형에서 감소된 시험관내 통과세포외배출을 갖긴 하지만, FcRn 및 pIgR에 결합할 수 있는 것으로 증명되었다. FcRn에 결합이 종말 반감기를 연장하긴 하지만, pIgR과의 IgG1-IgA2m1 Fc 이합체 상호작용은 특히 초기 단계에서 소실 기전을 제공할 수 있었는데, 이것은 pIgR-매개된 통과세포외배출 및/또는 소실을 유발하여, IgG와 비교하여 감소된 혈청 농도에 기여하였다.
혈청에서 IgA는 골수 세포로부터 분비된 IgA1 단량체로 지배적으로 구성되고, 반면 중합성 IgA2는 통과세포외배출의 위치에서 고유판 내에 혈장 세포로부터 분비된다 (Yoo et al. 116:3-10 (2005)). 중합성 IgA 및 pIgR 사이에 높은 친화성은 순환으로부터 중합성 IgA의 빠른 스캐빈징을 자연적으로 야기하여, IgA-항원 복합체로서 순환으로부터 유해한 항원의 효과적인 소실을 제공할 수 있고 (Shroff et al., Infect Immun 63:3904-13 (1995)), 그리고 치료 세팅에서 사이토킨 수용체에 효현작용할 때 특히 유익할 수 있는, 약물 활성을 규정된 조직 및 짧은 지속 기간으로만 제한하는 데 활용될 수 있다. 생쥐에서 혈청으로부터 pIgR을 통한 중합성 IgA의 빠른 소실은 pIgR-결함성 NOD 생쥐의 혈청에서 대략 20-배 증가된 IgA 농도에 의해 더욱 뒷받침된다 (Simpfendorfer et al., PLoS ONE 10:e0121979 (2015)).
실시예 2: 재조합 IgA 항체의 정제
카파 경쇄를 내포하는 재조합 IgAs가 CHO 세포에서 분비된 단백질로서 발현되고, 그리고 Capto L (GE Healthcare) 칼럼을 이용하여 세포 배양 상층액으로부터 친화성 포획되었다. 포획 후, 이들 칼럼은 5 칼럼 용적 (CVs)의 트리스 완충액 (25 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM NaN3), 내독소를 제거하기 위한 20 CVs의 트리톤 X-114 완충액 (25 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-114, 2 mM NaN3), 5 CVs의 트리스 완충액, 5 CVs의 KP 완충액 (0.4 M 인산칼륨, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.02% Tween20, 2 mM NaN3), 그리고 10 CVs의 트리스 완충액으로 세척되었다. IgAs는 150 mM 아세트산, pH 2.7로 용리되고, 그리고 1/5 용적의 1 M 아르기닌, 0.4 M 숙신산염, pH 9.0으로 즉시 중화되었다.
친화성 정제 이후에, 재조합 IgAs가 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 정제되었다. 주로 한 가지 소중합체성 상태 (> 90%의 단일 유형의 소중합체)가 존재하는 재조합 IgA 표본의 경우, HiLoad Superdex 200 pg 칼럼 (GE Healthcare)이 SEC에 이용되고, 그 이후에 원치 않는 소중합체성 상태의 오염체를 방지하기 위한 피크 저감이 뒤따랐다. 거의 등가량에서 소중합체의 복합 혼합물 (예를 들면, ~40% 이합체 및 ~60% 고차 중합체)을 내포하는 IgA 표본의 경우, 여러 정제 접근법이 검사되었다. 도 39에서 도시된 바와 같은 소중합체의 인간 항-mIL-13 IgA2m2 혼합물이 하기와 같이 설명된 상이한 유형의 정제를 검사하는 데 이용되었다.
HiLoad Superose 6 16/600 pg 칼럼 (GE Healthcare)을 이용한 SEC는 도 40에서 도시된 바와 같이, 고차 소중합체로부터 IgA 이합체를 분리하기 위한 더 높은 분자량 범위에서 불충분한 분해능을 제공하였다. Superose 6 용리 프로필에서, 피크 1은 칼럼의 허공 용적에 상응하는 ~35-39 mL 인근에서 용리하고, 그리고 이런 이유로 아마도 응집된 단백질이다. 피크 2 및 3은 피크 3이 피크 2의 트레일링 에지 상에서 어깨로서 나타나도록 유의미하게 중첩된다. 전술된 바와 같은 SEC-MALS에 의한, 피크 2의 리딩 에지 및 피크 3의 트레일링 에지 인근에서 분획물의 분석은 각각, 735,000 g/mol 및 375,300 g/mol의 몰 질량을 제공하였다. 인간 항-mIL-13 IgA2m2 단량체의 예상된 분자량은 ~148 kDa이고, 이합체의 경우 ~312 kDa, 삼합체의 경우 ~460 kDa, 사합체의 경우 ~608 kDa, 그리고 오합체의 경우 ~756 kDa이다. 이것은 피크 2 및 3이 아마도 오합체, 사합체, 삼합체 및 이합체의 혼합물을 내포한다는 것을 암시한다. ~60 mL 주변에서 추후 용리하는 피크 4는 아마도 단량체성 IgA에 상응한다.
HiLoad Superdex 200 pg 칼럼 (GE Healthcare) 또는 HiLoad Sephacryl 400 pg 칼럼 (GE Healthcare) 중 어느 한 가지를 이용한 SEC 또한 고차 소중합체로부터 IgA 이합체의 불충분한 분해능을 제공하였다. 소중합체를 SP HP 칼럼 (GE Healthcare)을 이용한 양이온-교환 크로마토그래피, Q FF 칼럼 (GE Healthcare)을 이용한 음이온-교환 크로마토그래피, 그리고 5 μm, 7.8 x 75 mm ProPac HIC-10 칼럼 (Dionex)을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 분리하려는 시도 또한 성공적이지 않았다.
대조적으로, 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm XBridge Protein BEH 450 Å SEC 칼럼 (Waters)을 이용하여 소규모 정제를 실행하는 것은 인간 항-mIL-13 IgA2m2에 대해 도 41에서 도시된 바와 같이 고차 소중합체로부터 IgA 이합체의 최고 분리를 제공하였다. 분해능을 최대화하기 위해, 0.2 M 아르기닌, 0.137 M 숙신산염, pH 5.0을 이동상으로서 이용한 Agilent 1260 Infinity HPLC를 이용하여 100 μL보다 크지 않은 주입 용적에서 1 mg 이하의 총 단백질이 1 mL/분으로 칼럼 위에서 이동되었고, 그리고 200 μL 분획물이 수집되었다. 이후, 지배적으로 한 가지 소중합체성 상태를 단리하기 위해, 분획물이 선택적으로 한 데 모아졌다. 복수의 작업이 수행되었고, 그리고 각 작업으로부터 소정의 소중합체의 한 데 모아진 분획물이 조합되었다
한 데 모아진 분획물에서 발견된 IgA 실체, 순도 및 소중합체성 상태는 아래에 설명된 바와 같은, 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm XBridge Protein BEH 200 Å SEC 칼럼 (Waters)을 이용한 SEC-MALS (도 42), 아래에 설명된 바와 같은 SDS-PAGE (도 42), 아래에 설명된 바와 같은 음성 염색 전자 현미경검사 (도 43 및 44) 및 아래에 설명된 바와 같은 질량 분광분석 (도 45)에 의해 특징화되었다. SEC-MALS는 0.2 M 아르기닌, 0.137 M 숙신산염, pH 5.0을 이동상으로서 이용한 Agilent 1260 Infinity HPLC를 이용하여 1 mL/분으로 3.5 μm, 7.8 mm x 300 mm Waters XBridge Protein BEH 200 Å 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 칼럼 위에 재조합 IgAs를 주입함으로써 수행되었다. Capto L 친화성 정제로부터 재조합 항-mIL-13 IgA2m2의 실례 분석적 SEC 프로필은 도 39에서 도시된다. 분석적 SEC 칼럼으로부터 용리된 단백질은 소정의 표본 내에 존재하는 다양한 IgA 소중합체성 상태의 몰 질량 및 다분산성을 계측하기 위해, Wyatt DAWN HELEOS II/Optilab T-rEX 다각도 광 산란 (MALS) 검출기 위에 직접적으로 주입되었다.
항-mIL-13 IgA2m2 항체의 경우, Waters XBridge Protein BEH 200 Å SEC 칼럼을 이용한 분석적 SEC에서 3개의 주된 피크가 확인되었다 (도 42a). 인간 항-mIL-13 IgA2m2 단량체의 예상된 분자량은 ~148 kDa이고, 이합체의 경우 ~312 kDa, 삼합체의 ~460 kDa, 사합체의 경우 ~608 kDa, 그리고 오합체의 경우 ~756 kDa이다. 모든 예상된 분자량은 아미노산 서열 조성에 기초되고 잠재적인 N-연결된 또는 O-연결된 글리칸을 고려하지 않는데, 그 이유는 당 조성이 종종 외생이고 가변적이기 때문이다. Waters XBridge Protein BEH 450 Å SEC 칼럼 상에서 분리 후, 피크 1의 몰 질량은 MALS에 의해 658,000 g/mol +/- 0.510 %로서 결정되었다 (도 42b). 이것은 피크 1이 지배적으로 사합체성 IgA2m2라는 것을 암시한다. 피크 2의 몰 질량은 MALS에 의해 343,700 g/mol +/- 0.646 %로서 결정되었다 (도 42c). 이것은 피크 2가 지배적으로 이합체성 IgA2m2이라는 것을 암시한다. 이합체보다 늦게 용리하는 피크 3은 아마도 단량체성 IgA이다 (도 42a).
도 42b 및 42c로부터 각각, 비-환원된, 정제된 피크 1 및 2의 SDS-PAGE 분석은 IgA 사합체 및 이합체 각각에 대한 예상된 분자량 인근에서 이주하는 우세한 띠를 보여주었다 (도 42d). 이것은 MALS에 의해 확인된 몰 질량과 일치한다 (도 42b 및 42c). DTT로 환원 시에, 겔에서 3개의 띠가 관찰된다 (도 42d). 중쇄 (HC)의 예상된 분자량은 50.2 kDa이고, 경쇄 (LC)의 경우 23.8 kDa이고, 그리고 연결 사슬 (JC)의 경우 15.6 kDa이다. 모든 예상된 분자량은 아미노산 서열 조성에 기초되고 잠재적인 N-연결된 또는 O-연결된 글리칸을 고려하지 않는데, 그 이유는 당 조성이 종종 외생이고 가변적이기 때문이다. 이들 3개의 띠는 3개 사슬 모두의 거의 예측된 분자량으로 이동하였으며, HC 및 JC가 약간 더 크게 이동하였다. HC는 5개의 예측된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖고, 그리고 JC는 1개의 예측된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는데, 이것은 만약 점유되면, 분자량을 증가시키고 겔 상에서 이주를 감소시킬 것이다. SDS-PAGE는 재조합 IgA 단백질을, 10 mM 디티오트레이톨 (DTT)과 함께 또는 이것 없이, 그리고 70 ℃에서 10 분 동안 가열된 LDS 표본 완충액 (Thermo Fisher Scientific)과 혼합함으로써 수행되었다. 표본은 이후, MES 완충액 (Thermo Fisher Scientific)에서 4-12% Bolt Bis-Tris Plus 겔 (Thermo Fisher Scientific) 상에서 이동되고 ClearPAGE Instant Blue 염료 (Expedeon)로 염색되었다.
도 42b 및 42c로부터 각각, 인간 항-mIL-13 IgA2m2 정제된 피크 1 및 2는 음성 염색 전자 현미경검사 (EM)에 의해 분석되었다. 정제된 IgA2m2 표본은 먼저, 실온에서 10 분 동안 0.015% 글루타르알데히드 (Polysciences, Inc.)에서 배양함으로써 교차연결되었다. 일단 고정되면, 이들 표본은 10 ng/μL의 농도를 달성하기 위해 TBS 완충액을 이용하여 희석되었다. 이후, 2% (w/v) 우라닐 아세트산염 음성 염료 (Electron Microscopy Sciences)로 처리되기 전, 연속 탄소의 박층으로 덮인 새로 글로우 방전된 400 그물망 구리 격자에서 4 μl의 각 표본이 40s 동안 배양되었다. IgAs가 이후, 25,000x (2.2 Å/픽셀)의 배율에서, 120 keV에서 작동하는 Tecnai Spirit T12 (Thermo Fisher)를 이용하여 영상화되었다. 이미지가 낮은 선량 조건 하에 Gatan 4096 x 4096 픽셀 CCD 카메라를 이용하여 기록되었다. 각 IgA 표본에 대해 약 5000개 입자가 이후, 선택되고, 그리고 128-픽셀 입자 박스 크기를 이용하여 EMAN2 패키지 내에 e2boxer.py 소프트웨어를 이용하여 추출되었다. RELION 이미지 소프트웨어 패키지 내에 무참조 2D 분류가 양쪽 표본의 평균화된 이미지를 산출하는 데 이용되었다. 무참조 2D 클래스와 함께 미가공 이미지 파일이 정제된 피크 1 및 2로부터 IgAs에 대해 도시된다 (도 43 및 44). 피크 1은 지배적으로 사합체성 IgA2m2이며, 일부 오합체, 삼합체 및 이합체가 또한 존재한다 (도 43). 피크 2는 이합체성 IgA2m2이다 (도 44).
질량 분광분석은 예상된 분자량의 5 Da 내에 JC, LC 및 HC의 존재를 확증하였는데, JC 및 HC의 아미노 말단 잔기가 피로글루타민산을 형성하였다. 질량 분광분석은 IgA를 환원시키고 변성시키기 위해, 97 ℃에서 30 분 동안 5 mM DTT의 존재에서 0.5 mg/mL으로 상기 단백질을 가열함으로써 수행되었다. 표본은 이후, 얼음 위에서 냉각되고, 그 이후에 1,000 단위의 PNGaseF (NEB)로 37 ℃에서 하룻밤 데글리코실화가 뒤따랐다. 환원된, 변성된 및 데글리코실화된 IgA는 이후, Agilent 1290 Infinity UHPLC를 이용하여 1 mL/분으로 3 μm, 4.6 x 50 mm 역상 크로마토그래피 PLRP-S 칼럼 (Agilent) 위에 주입되었다. 6 분에 걸쳐 5%-60% 완충액 B 구배가 물에서 0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA) (완충액 A) 및 아세토니트릴에서 0.05% TFA (완충액 B)로 수행되었다. 역상 칼럼으로부터 용리된 단백질은 원형 질량 계측을 위해 Agilent 6230 전기분무 이온화 비행 시간 질량분광계 (ESI-TOF) 위에 직접적으로 주입되었다.
도 41-45에서 IgA2m2에 대해 설명된 성공에 더하여, 이러한 분리 기술은 또한, IgA1 (도 46), IgA2m1 야생형 (도 47), 그리고 경쇄와 중쇄 사이에 이황화 결합을 복원하는 P221R 돌연변이를 내포하는 IgA2m1 (도 48)을 비롯하여, 검사된 모든 다른 아이소타입 및 알로타입에 적용가능하였다.
실시예 3: 재조합 IgA 항체 및 IgG-IgA 융합 분자의 시험관내 분석
암 세포 사멸을 촉발하는 IgA 항체 및 IgG-IgA 융합 분자의 능력이 CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 검정을 이용하여, HER2+ 유방암 세포주 KPL-4, BT474-M1 및 SKBR3에서 시험관내 분석되었다. 상기 검정은 하기와 같이 수행되었다. 건강한 공여자로부터 말초혈이 EDTA를 항응고제로서 이용하여 수집되었다. 작동체 세포로서 이용된 인간 호중구는 제조업체의 설명에 따라서, EasySep™ 직접적인 인간 호중구 단리 키트 (STEMCELL Technologies)를 이용함으로써 말초혈로부터 단리되었다. 호중구 및 HER2-증폭된 표적 세포 (SK-BR3; 웰마다 10,000개 세포의 밀도에서)는 검은색, 투명 바닥 96 웰 평판 (Corning)에서 48 시간 동안 검사 시약의 존재에서 20:1 비율로 배양되었다. 표적 세포 생존력이 세포 역가 글로우 발광 세포 생존력 시약 (Promega cat#G7570)을 이용하여 발광 상대적 발광 단위 (RLU)에 의해 계측되었다. 표적 세포 사멸 활성이 하기와 같이 계산되었다: ((처리가 없는 RLU - 처리가 있는 RLU)/처리가 없는 RLU) x 100%.
도 49에서 도시된 바와 같이, SKBR3 및 BT474-M1 세포주는 항-HER IgA2m1 단량체 (도 49에서 "4D5.IgA2m1.P221R.C471S 단량체"로서 지칭됨)에 민감하였다. 특히, 항-HER IgA2m1 단량체는 BT474-M1 세포의 생존력에 대한 효과와 비교하여 SKBR3 세포의 유의미한 사멸을 유발하였다. 하지만, KPL-4 세포주는 항-IgA 항체에 민감하지 않았다. 암 세포의 사멸을 유발하는 IgA 항체의 능력이 호중구의 공여자에 대해 특이적인 지를 더욱 분석하기 위해, 2명의 별개의 공여자로부터 호중구가 세포 생존력 검정에서 이용되었다. 도 50에서 도시된 바와 같이, 2명의 상이한 공여자로부터 호중구는 단량체성 항-HER2 IgA 항체 및 단량체성 IgG-IgA 융합 분자의 존재에서 SKBR3 세포의 사멸을 매개할 수 있었는데, 이것은 이들 항체 및 융합 분자의 효능이 공여자 특이적이지 않다는 것을 지시한다. 중합성 항-HER2 IgA 항체는 단량체성 항-HER2 IgA 항체와 비교하여 더 적은 세포 사멸을 유발하였다 (도 50).
항체의 글리코실화 상태가 암 세포 사멸을 유발하는 능력에 영향을 주는 지를 결정하기 위해 추가 실험이 수행되었다. 글리코실화된 단량체성 및 사합체성 항-HER IgA 항체는 SKBR3 세포의 유의미한 사멸을 유발하였다 (도 51). 하지만, 비글리코실화된 사합체성 항-HER IgA 항체는 표적화된 SKBR3 세포의 사멸을 유발하지 않았다. 특정 이론에 한정됨 없이, 이들 결과는 글리코실화가 IgA 항체의 유용성에 영향을 줄 수 있다는 것을 암시한다.
묘사되고 청구된 다양한 구체예에 더하여, 개시된 요부는 본원에서 개시되고 청구된 특질의 다른 조합을 갖는 다른 구체예에 또한 관계한다. 따라서, 본원에서 제시된 특정 특질은 개시된 요부가 본원에서 개시된 특질의 임의의 적합한 조합을 포함하도록, 개시된 요부의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 조합될 수 있다. 개시된 요부의 특정한 구체예에 관한 전술한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제시되었다. 이것은 완전하거나 또는 개시된 요부를 개시된 구체예로만 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 변형과 변이가 개시된 요부의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서, 개시된 요부의 조성물과 방법에서 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 개시된 요부는 첨부된 청구항의 범위 안에 있는 변형과 변이 및 이들의 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되는데, 이들의 내용은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> IMMUNOGLOBULIN A ANTIBODIES AND METHODS OF PRODUCTION AND USE <130> 00B206.0867 <140> PCT/US2020/014617 <141> 2020-01-22 <150> 62/838,071 <151> 2019-04-24 <150> 62/795,367 <151> 2019-01-22 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Pro Pro 1 5 10 15 Pro Cys Cys <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 353 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val 35 40 45 Thr Ala Arg Asn Phe 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Val Ile Met 325 330 335 Ser Glu Gly Asp Gly Ile Cys Tyr 340 <210> 10 <211> 339 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 10 Glu Ser Ala Lys Asp Pro Thr Ile Tyr Pro Leu Arg Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ser Ser Asp Pro Val Thr Ile Gly Cys Leu Ile Gln Asn Tyr Phe 20 25 30 Pro Ser Gly Thr Met Asn Val Thr Trp Gly Lys Ser Gly Lys Asp Ile 35 40 45 Ser Val Ile Asn Phe Pro Pro Ala Pro Ala Ser Gly Pro Tyr Thr Met 50 55 60 Cys Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Ala Glu Cys Pro Lys Gly Thr Ser 65 70 75 80 Val Lys Tyr Tyr Val Gln Tyr Asn Thr Ser Pro Val Arg Glu Leu Ser 85 90 95 Val Glu Cys Pro Gly Pro Lys Pro Ser Leu Val Cys Arg Pro Arg Leu 100 105 110 Ser Leu Gln Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala 115 120 125 Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Gly Leu Lys Glu Pro Thr Gly Ala Val 130 135 140 Phe Thr Trp Gln Pro Thr Thr Gly Lys Asp Ala Val Gln Lys Glu Ala 145 150 155 160 Val Gln Asp Ser Cys Gly Cys Tyr Thr Val Ser Ser Val Leu Pro Gly 165 170 175 Cys Ala Glu Arg Trp Asn Asn Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Thr 180 185 190 His Pro Glu Phe Glu Thr Pro Leu Thr Gly Glu Ile Ala Lys Val Thr 195 200 205 Glu Asn Thr Phe Pro Pro Gln Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu 210 215 220 Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Arg Gly 225 230 235 240 Phe Asn Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Asn Glu Glu 245 250 255 Leu Pro Ser Glu Ser Tyr Leu Val Phe Glu Pro Leu Arg Glu Pro Gly 260 265 270 Glu Gly Ala Ile Thr Tyr Leu Val Thr Ser Val Leu Arg Val Ser Ala 275 280 285 Glu Thr Trp Lys Gln Gly Ala Gln Tyr Ser Cys Met Val Gly His Glu 290 295 300 Ala Leu Pro Met Ser Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ser Gly 305 310 315 320 Lys Pro Thr Asn Val Asn Val Ser Val Ile Met Ser Glu Gly Asp Gly 325 330 335 Ile Cys Tyr <210> 11 <211> 348 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Rabbit IgA sequence" <400> 11 Ala Ala Thr Asn Leu Glu Leu Phe Pro Met Thr Cys Pro Arg Pro Arg 1 5 10 15 Pro Glu Gln Thr Val Val Val Gly Cys Leu Ile Arg Gly Phe Phe Pro 20 25 30 Leu Asp Pro Leu Ser Val Ser Trp Asp Val Ser Gly Glu Asn Val Arg 35 40 45 Val Tyr Asn Phe Pro Pro Ala Gln Ser Gly Thr Ser Gly Leu Asn Thr 50 55 60 Ala Cys Ser Leu Leu Ser Leu Pro Ser Asp Gln Cys Pro Ala Asp Asp 65 70 75 80 Asn Val Thr Cys His Val Val His Asn Asn Glu Gly Gln Asp Leu Pro 85 90 95 Val Pro Cys His Pro Glu Cys Arg Glu Pro Ile Ile Asp Pro Thr Pro 100 105 110 Cys Pro Thr Thr Cys Gly Glu Pro Ser Leu Ser Leu Gln Arg Pro Asp 115 120 125 Ile Gly Asp Leu Leu Leu Glu Ser Lys Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu 130 135 140 Ser Gly Leu Lys Asp Pro Glu Gly Ala Val Phe Thr Trp Glu Pro Thr 145 150 155 160 Asn Gly Asn Glu Pro Val Gln Gln Ser Thr Gln Ser Tyr Pro Cys Gly 165 170 175 Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn 180 185 190 Ala Gly Thr Glu Phe Thr Cys Thr Val Thr His Pro Glu Ile Glu Gly 195 200 205 Gly Ser Leu Thr Ala Thr Ile Ser Arg Gly Ile Ile Ile Pro Pro Leu 210 215 220 Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Asp Glu Leu Ala Leu Asn Ala Leu 225 230 235 240 Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu 245 250 255 Val Tyr Trp Thr Asn Lys Gly Val Asn Val Pro Glu Asn Ser Phe Leu 260 265 270 Leu Trp Lys Pro Leu Pro Glu Pro Gly Gln Glu Pro Thr Thr Tyr Ala 275 280 285 Ile Thr Ser Leu Leu Arg Val Pro Ala Glu Asp Trp Asn Gln Asn Glu 290 295 300 Ser Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Gly Leu Ala Glu His Phe Thr 305 310 315 320 Gln Arg Thr Ile Asn Arg Glu Ala Gly Arg Pro Thr His Val Asn Val 325 330 335 Ser Val Val Val Ala Asp Val Glu Gly Val Cys Tyr 340 345 <210> 12 <211> 341 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 12 Ser Glu Thr Ser Pro Lys Ile Phe Pro Leu Thr Leu Gly Ser Ser Glu 1 5 10 15 Pro Ala Gly Tyr Val Val Ile Ala Cys Leu Val Arg Asp Phe Phe Pro 20 25 30 Ser Glu Pro Leu Thr Val Thr Trp Ser Pro Ser Arg Glu Gly Val Ile 35 40 45 Val Arg Asn Phe Pro Pro Ala Gln Ala Gly Gly Leu Tyr Thr Met Ser 50 55 60 Ser Gln Leu Thr Leu Pro Val Glu Gln Cys Pro Ala Asp Gln Ile Leu 65 70 75 80 Lys Cys Gln Val Gln His Leu Ser Lys Ser Ser Gln Ser Val Asn Val 85 90 95 Pro Cys Lys Val Leu Pro Ser Asp Pro Cys Pro Gln Cys Cys Lys Pro 100 105 110 Ser Leu Ser Leu Gln Pro Pro Ala Leu Ala Asp Leu Leu Leu Gly Ser 115 120 125 Asn Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Leu Lys Lys Ser Glu Gly 130 135 140 Val Ser Phe Thr Trp Gln Pro Ser Gly Gly Lys Asp Ala Val Gln Ala 145 150 155 160 Ser Pro Thr Arg Asp Ser Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Ile Leu 165 170 175 Pro Gly Cys Ala Asp Pro Trp Asn Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Thr 180 185 190 Ala Ala His Ser Glu Leu Lys Ser Ala Leu Thr Ala Thr Ile Thr Lys 195 200 205 Pro Lys Val Asn Thr Phe Arg Pro Gln Val His Leu Leu Pro Pro Pro 210 215 220 Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Val 225 230 235 240 Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Gly 245 250 255 Gln Glu Leu Pro Arg Asp Lys Tyr Leu Val Trp Glu Ser Leu Pro Glu 260 265 270 Pro Gly Gln Ala Ile Pro Thr Tyr Ala Val Thr Ser Val Leu Arg Val 275 280 285 Asp Ala Glu Asp Trp Lys Gln Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly 290 295 300 His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu 305 310 315 320 Ala Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala 325 330 335 Glu Gly Ile Cys Tyr 340 <210> 13 <211> 353 <212> PRT <213> Gorilla sp. <400> 13 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Pro Asp Gly Asp Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val 35 40 45 Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly 65 70 75 80 Lys Ser Val Thr Cys His Val Asn His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp 85 90 95 Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro 100 105 110 Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Pro Cys Cys His Pro Arg Leu Ser 115 120 125 Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn 130 135 140 Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe 145 150 155 160 Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Glu Gly Pro Pro Glu 165 170 175 Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys 180 185 190 Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr 195 200 205 Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn 210 215 220 Met Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu 225 230 235 240 Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser 245 250 255 Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro 260 265 270 Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly 275 280 285 Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp 290 295 300 Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu 305 310 315 320 Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro 325 330 335 Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys 340 345 350 Tyr <210> 14 <211> 340 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr 1 5 10 15 Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val 35 40 45 Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly 65 70 75 80 Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Ser Ser Gln Asp 85 90 95 Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro 100 105 110 Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser 115 120 125 Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly 130 135 140 Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly 145 150 155 160 Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu 165 170 175 Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr 180 185 190 Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys 195 200 205 Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser 210 215 220 Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg 225 230 235 240 Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro 260 265 270 Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala 275 280 285 Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His 290 295 300 Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala 305 310 315 320 Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp 325 330 335 Gly Thr Cys Tyr 340 <210> 15 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr 1 5 10 15 Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro 20 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 19 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Pro Gly Lys Leu Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro 20 25 30 Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser 35 40 45 Glu Ala 50 <210> 20 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 20 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Pro Gly Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu 20 25 30 Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala 35 40 <210> 21 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 21 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro Arg Leu 20 25 30 Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala 35 40 45

Claims (49)

  1. 아미노산 V458, N459 및/또는 S461에서의 치환을 포함하는 단리된 IgA 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    아미노산 V458이 이소류신으로 치환 (V458I)되고/거나,
    아미노산 N459가 글루타민으로 치환 (N459Q)되거나, 글리신으로 치환 (N459G)되거나 또는 알라닌으로 치환 (N459A)되고/거나,
    아미노산 S461이 알라닌으로 치환 (S461A)된 것인
    단리된 IgA 항체.
  3. 아미노산 I458에서의 치환을 포함하는 단리된 IgA 항체 또는 이의 단편.
  4. 제3항에 있어서, 아미노산 I458이 발린으로 치환 (I458V)된 것인 단리된 IgA 항체.
  5. N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459, S461 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에서 하나 이상의 치환을 포함하는 단리된 IgA 항체 또는 이의 단편.
  6. 제5항에 있어서, 아미노산 N166, S212, N263, N337, I338, T339 및 N459에서의 치환이 N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S 및 N459Q인 단리된 IgA 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, IgA1, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체인 단리된 IgA 항체.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    아미노산 N337, I338, 및 T339에서의 치환을 갖고,
    T168, N211, S212, S213, N263, T265, N459, S461 및 이들의 조합에서 하나 이상의 치환을 갖는 것인
    단리된 IgA 항체.
  9. 제8항에 있어서, IgA2m1, IgA2m2 또는 IgA2mn 항체인 단리된 IgA 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화, 키메라 항체 또는 인간 항체인 단리된 IgA 항체.
  11. 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 단리된 IgG-IgA 융합 분자이며,
    IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체 중쇄의 C 말단을 통해 P221 또는 R221을 포함하는 서열을 포함하고,
    IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 추가로 포함하는 것인
    단리된 IgG-IgA 융합 분자.
  12. 자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 단리된 IgG-IgA 융합 분자이며,
    IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체 중쇄의 C 말단을 통해 C242를 포함하는 서열을 포함하는 것인 단리된 IgG-IgA 융합 분자.
  13. 제12항에 있어서, IgG 항체가 아미노산 K447의 결실을 추가로 포함하는 것인 단리된 IgG-IgA 융합 분자.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 항체가 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 및 IgG4 항체로 구성된 군에서 선택되는 것인 단리된 IgG-IgA 융합 분자.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 항체가 IgG1 항체인 단리된 IgG-IgA 융합 분자.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, IgA 항체가 IgA1 항체, IgA2m1 항체, IgA2m2 항체 및 IgA2mn 항체로 구성된 군에서 선택되는 것인 단리된 IgG-IgA 융합 분자.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, IgA 항체가 IgA2m1 항체인 단리된 IgG-IgA 융합 분자.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는
    제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 IgG-IgA 융합 분자
    를 인코딩하는 단리된 핵산.
  19. 제18항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  20. 제19항의 숙주 세포를, IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자가 생산되도록 배양하는 단계
    를 포함하는, IgA 항체 또는 IgG-IgA를 생산하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    숙주 세포로부터 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자를 회수하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제20항으로부터 생산되거나 또는 제21항으로부터 회수된 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자.
  23. 제1항 내지 제10항 또는 제22항 중 어느 한 항의 하나 이상의 IgA 항체, 또는
    제11항 내지 제17항 또는 제22항 중 어느 한 항의 하나 이상의 IgG-IgA 융합 분자, 및
    제약학적으로 허용되는 운반체
    를 포함하는 제약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    추가 치료제
    를 추가로 포함하는 제약학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제10항 또는 제22항 중 어느 한 항의 하나 이상의 IgA 항체, 또는
    제11항 내지 제17항 또는 제22항 중 어느 한 항의 하나 이상의 IgG-IgA 융합 분자
    의 효과량을 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 질환이 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암인 방법.
  27. 약제로서 사용하기 위한,
    제1항 내지 제10항 또는 제22항 중 어느 한 항의 IgA 항체, 또는
    제11항 내지 제17항 또는 제22항 중 어느 한 항의 IgG-IgA 융합 분자.
  28. 질환을 치료하는데 사용하기 위한,
    제1항 내지 제10항 또는 제22항 중 어느 한 항의 IgA 항체, 또는
    제11항 내지 제17항 또는 제22항 중 어느 한 항의 IgG-IgA 융합 분자.
  29. 제28항에 있어서, 질환이 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암인 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자.
  30. 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서
    제1항 내지 제10항 또는 제22항 중 어느 한 항의 IgA 항체, 또는
    제11항 내지 제17항 또는 제22항 중 어느 한 항의 IgG-IgA 융합 분자
    의 용도.
  31. 제30항에 있어서, 질환이 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암인 용도.
  32. IgA 이합체(dimer)의 발현을 증가시키는 방법이며,
    첫 번째 세포 내로 도입되는 연결 사슬 (JC) 인코딩 DNA의 양을, 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC) 인코딩 DNA의 양에 비하여 증가시키는 단계
    를 포함하고, 여기서 증가된 발현은 동일한 양의 JC, LC 및 HC DNA가 도입된 두 번째 세포에서 생산되는 IgA 이합체의 양에 상대적인 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 첫 번째 세포 내로 도입되는, HC 인코딩 DNA의 양 대 LC 인코딩 DNA의 양 대 JC 인코딩 DNA의 양의 비 (HC:LC:JC)가 약 1:1:2 내지 약 1:1:5인 방법.
  34. IgA 이합체, 삼합체(trimer) 또는 사합체(tetramer)의 발현을 증가시키는 방법이며,
    첫 번째 세포 내로 도입되는 연결 사슬 (JC) 인코딩 DNA의 양을, 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC) 인코딩 DNA의 양에 비하여 감소시키는 단계
    를 포함하고, 여기서 증가된 발현은 JC DNA의 양에 비하여 더 많은 양의 HC 및 LC DNA가 도입된 두 번째 세포에서 생산되는 IgA 삼합체 또는 사합체의 양에 상대적인 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 첫 번째 세포 내로 도입되는, HC 인코딩 DNA의 양 대 LC 인코딩 DNA의 양 대 JC 인코딩 DNA의 양의 비 (HC:LC:JC)가 약 1:1:0.25 내지 약 1:1:0.5인 방법.
  36. IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 생산을 증가시키는 방법이며,
    첫 번째 세포에서 아미노산 V458에서 치환을 갖는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 발현시키는 단계
    를 포함하고, 여기서 증가된 생산은 아미노산 V458에서 치환을 갖지 않는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산된 IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 양에 상대적인 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 아미노산이 이소류신으로 치환 (V458I)된 것인 방법.
  38. IgA2m2 이합체의 생산을 증가시키는 방법이며,
    첫 번째 세포에서 아미노산 I458에서 치환을 갖는 IgA2m2 항체를 발현시키는 단계
    를 포함하고, 여기서 증가된 생산은 아미노산 I458에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산된 IgA2m2 이합체의 양에 상대적인 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 아미노산이 발린으로 치환 (I458V)된 것인 방법.
  40. IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 생산을 증가시키는 방법이며,
    첫 번째 세포에서 아미노산 N459 또는 S461에서 치환을 갖는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 발현시키는 단계
    를 포함하고, 여기서 증가된 생산은 아미노산 N459 또는 S461에서 치환을 갖지 않는 IgA1 또는 IgA2m1 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산된 IgA1 또는 IgA2m1 중합체의 양에 상대적인 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    아미노산 N459가 N459Q, N459G 또는 N459A 돌연변이로 치환되고/거나,
    아미노산 S461이 S461A 돌연변이로 치환된 것인
    방법.
  42. IgA2m2 중합체의 생산을 감소시키는 방법이며,
    첫 번째 세포에서 아미노산 C471에서 치환을 갖는 IgA2m2 항체를 발현시키는 단계
    를 포함하고, 여기서 감소된 생산은 아미노산 C471에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산된 IgA2m2 중합체의 양에 상대적인 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 아미노산 C471이 C471S 돌연변이로 치환된 것인 방법.
  44. IgA2m2 항체의 일시적 발현을 증가시키는 방법이며,
    첫 번째 세포에서 N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에서 치환을 포함하는 IgA2m2 항체를 발현시키는 단계
    를 포함하고, 여기서 증가된 일시적 발현은 N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에서 치환을 갖지 않는 IgA2m2 항체를 발현하는 두 번째 세포에서 생산된 일시적 발현의 양에 상대적인 것인 방법.
  45. IgG-IgA 융합 분자의 이합체를 발현시키는 방법이며,
    자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 IgG-IgA 융합 분자를 발현시키는 단계
    를 포함하고,
    IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체 중쇄의 C 말단을 통해 P221 또는 R221을 포함하는 서열을 포함하고,
    IgG 항체는 아미노산 K447의 결실을 포함하는 것인 방법.
  46. IgG-IgA 융합 분자의 이합체, 삼합체 또는 사합체를 발현시키는 방법이며,
    자체의 C 말단에서 IgA 항체의 Fc 영역에 융합된 전장 IgG 항체를 포함하는 IgG-IgA 융합 분자를 발현시키는 단계
    를 포함하고,
    IgA 항체의 Fc 영역은 IgA 항체 중쇄의 C 말단을 통해 C242를 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, IgG 항체가 아미노산 K447의 결실을 포함하는 것인 방법.
  48. IgA 항체 및 적어도 하나의 숙주 세포 단백질을 포함하는 혼합물로부터 IgA 항체를 정제하는 방법이며,
    (a) 상기 혼합물을, IgA 항체에 결합하는 단백질 L(Protein L)을 포함하는 칼럼에 적용하는 단계,
    (b) 상기 단백질 L 칼럼을 PBS를 포함하는 세척 완충액으로 세척하는 단계, 및
    (c) 인산을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 상기 단백질 L 칼럼으로부터 IgA 항체를 용리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  49. IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자 및 적어도 하나의 숙주 세포 단백질을 포함하는 혼합물로부터 소중합체성 상태(oligomeric state)의 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자를 정제하는 방법이며,
    (a) 상기 혼합물을, IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자에 결합하는 단백질 L 또는 단백질 A(Protein A)를 포함하는 친화성 정제 칼럼에 적용하는 단계,
    (b) 상기 친화성 정제 칼럼을 세척 완충액으로 세척하는 단계,
    (c) 용리 완충액을 사용하여 상기 친화성 정제 칼럼으로부터 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자를 용리하여 첫 번째 용출물을 형성하는 단계, 및
    (d) 상기 첫 번째 용출물을 크기 배제 크로마토그래피 칼럼에 적용하여, 상이한 소중합체성 상태의 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자를 분리하고 IgA 항체 또는 IgG-IgA 융합 분자의 소중합체성 상태를 포함하는 통과액(flowthrough)을 획득하는 단계
    를 포함하는 방법.
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