BR112021014276A2

BR112021014276A2 - Anticorpos iga isolados, moléculas de fusão igg-iga isoladas, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, para tratar um indivíduo, para aumentar a expressão de dímeros, trímeros ou tetrâmeros, para aumentar a produção de polímeros, para aumentar a produção de dímeros, para aumentar a produção de um polímero, para diminuir a produção de polímeros, para aumentar a expressão transitória de um anticorpo, para expressar dímeros de moléculas de fusão, para expressar dímeros, trímeros ou tetrâmeros, para purificar um anticorpo, para purificar um estado oligomérico de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo

Info

Publication number: BR112021014276A2
Application number: BR112021014276-2A
Authority: BR
Inventors: Twyla Noelle LOMBANA; Julie A. Zorn; Marissa L. Matsumoto; Cristoph Spiess; Claudio CIFERRI; Alberto Estevez
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2021-09-28
Also published as: SG11202107981VA; EP3914291A2; WO2020154405A3; JP2023179403A; CA3126359A1; MX2021008621A; AU2020211974A1; WO2020154405A2; KR20210118881A; JP2022522985A; CN113329763A; IL284789A; US20220048990A1

Abstract

anticorpos iga isolados, moléculas de fusão igg-iga isoladas, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, para tratar um indivíduo, para aumentar a expressão de dímeros, trímeros ou tetrâmeros, para aumentar a produção de polímeros, para aumentar a produção de dímeros, para aumentar a produção de um polímero, para diminuir a produção de polímeros, para aumentar a expressão transitória de um anticorpo, para expressar dímeros de moléculas de fusão, para expressar dímeros, trímeros ou tetrâmeros, para purificar um anticorpo, para purificar um estado oligomérico de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo. a matéria divulgada no presente pedido fornece anticorpos, por exemplo, anticorpos iga e moléculas de fusão igg-iga e composições compreendendo tais anticorpos, bem como métodos para produzir e usar tais anticorpos e composições.

Description

ANTICORPOS IGA ISOLADOS, MOLÉCULAS DE FUSÃO IGG-IGA ISOLADAS, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, PARA TRATAR UM INDIVÍDUO, PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DE DÍMEROS, TRÍMEROS OU TETRÂMEROS, PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE POLÍMEROS, PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE DÍMEROS, PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE UM POLÍMERO, PARA DIMINUIR A PRODUÇÃO DE POLÍMEROS, PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO TRANSITÓRIA DE UM ANTICORPO, PARA EXPRESSAR DÍMEROS DE MOLÉCULAS DE FUSÃO, PARA EXPRESSAR DÍMEROS, TRÍMEROS OU TETRÂMEROS, PARA PURIFICAR UM ANTICORPO, PARA PURIFICAR UM ESTADO OLIGOMÉRICO DE UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO ANTICORPO” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos EUA de Nº 62/795.367, depositado em 22 de janeiro de 2019, e ao Pedido Provisório dos EUA Nº de 62/838.071, depositado em 24 de abril de 2019, cujos conteúdos são incorporados por referência em sua totalidade, e para qual prioridade é reivindicada.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente divulgação se refere a anticorpos, por exemplo, anticorpos IgA e moléculas de fusão IgG-IgA, e composições compreendendo tais anticorpos, bem como métodos de produção e uso de tais anticorpos e composições.

ANTECEDENTES

[0003] A imunoglobulina A (IgA) é uma classe principal de anticorpos presentes nas secreções da mucosa da maioria dos mamíferos e representa uma primeira linha de defesa contra a invasão por patógenos inalados e ingeridos nas superfícies mucosas vulneráveis. Em humanos, existem dois isotipos IgA, IgA1 e IgA2, distinguidos por uma extensão de 13 resíduos na região de dobradiça da cadeia pesada de IgA1 (HC) que está ausente nas moléculas de IgA2 (Leusen, Mol. Immunol. 68:35-9 (2015)).

Ambos os isotipos são abundantes em todos os órgãos e tecidos, exceto nos intestinos onde IgA2 é predominante e no soro onde o monômero IgA1 é encontrado quase exclusivamente (Kerr, Biochem. J. 271:285-96 (1990)).

Existem três alotipos de IgA2: m1 (Tsuzukida et al., Proc Natl Acad Sci USA 76:1104-8 (1979)), m2 (Toraño et al., Proc Natl Acad Sci USA 75:966-9 (1978)) e mn (Chintalacharuvu et al., J Immunol 152:5299-304 (1994)). Os alotipos m2 e mn formam dissulfetos de cadeia leve canônica (LC)-HC, enquanto a presença de uma prolina na posição 221 da HC em IgA2m1 resulta na formação de ligação dissulfeto LC-LC (Chintalacharuvu et al., J Immunol 157:3443-9 (1996)). A mutação da prolina 221 no alotipo IgA2m1 para arginina (P221R), que é encontrada nos alotipos m2 e mn, restaura a ligação LC-HC canônica (Lohse et al., Cancer Res 76:403-17 (2016) e Chintalacharuvu et al.

(1996)). A identidade de sequência entre os isotipos IgA1 e IgA2 é bastante alta em ~90% e ainda maior entre os alotipos IgA2, com apenas seis diferenças de resíduos entre m1 e m2 e duas diferenças de resíduos entre m1 ou m2 com mn (Chintalacharuvu et al. (1994)).

[0004] Ao contrário de outras classes de imunoglobulinas humanas, IgA tem a capacidade única de existir naturalmente como espécie monomérica e polimérica solúvel, enquanto apenas IgA polimérica (pIgA) pode se ligar a pIgR para subsequente transcitose (Yoo et al., Clin. Immunol. 116:3- 10(2005)). A oligomerização de IgA é facilitada por uma extensão terminal C de 18 resíduos da HC, denominada arremate e a cadeia de união de 137 aminoácidos (JC). O penúltimo resíduo do arremate de IgA, Cys471, do primeiro monômero de IgA medeia a formação de ligação dissulfeto com Cys15 da JC, enquanto Cys471 do segundo monômero de IgA medeia a formação de ligação dissulfeto com Cys69 da JC para formar um dímero de IgA covalente que é mantido juntos por um única JC (Zikan et al., Mol Immunol 23:541-4 (1986) e Halpern et al., J Immunol 111:1653-60 (1973)). Como cada monômero de IgA é composto de dois HCs, cada um com um arremate, o dímero de IgA tem dois resíduos Cys471 desemparelhados através dos quais monômeros de IgA adicionais podem ser ligados. Foram relatados oligômeros de IgA de ordem superior, como trímeros, tetrâmeros e pentâmeros (Suzuki et al., Proc Natl Acad Sci USA 112:7809-14 (2015)). Enquanto a IgA sérica é predominantemente monomérica, as IgAs poliméricas são produzidas por células plasmáticas na lâmina própria. A presença de JC em IgA polimérica é necessária para a ligação de pIgR no lado basolateral do epitélio e para o transporte ativo para o lado apical dos tecidos mucosos (Wu et al., Clin Dev Immunol 11:205-13 (2004)). Após a transcitose, o domínio extracelular de pIgR é clivado proteoliticamente criando o que é conhecido como o componente secretor (SC), que permanece covalentemente ligado à cadeia pesada de IgA polimérica por meio de uma ligação dissulfeto entre Cys467 em pIgR e Cys311 em um HC (Fallgreen-Gebauer et al., Biol Chem Hoppe-Seyler 374:1023–8 (1993) e Bastian et al., Adv Exp Med Biol 371A:581-3 (1995)). Este complexo é considerado IgA secretor (sIgA), o principal determinante da imunidade da mucosa (Mantis et al., Mucosal Immunol 4:603-11 (2011) e Johansen et al.

Mucosal Immunol 4:598-602 (2011)).

[0005] A pesquisa de imunoglobulina A (IgA) destacou múltiplas aplicações terapêuticas potenciais e mecanismos únicos de ação para anticorpos monoméricos e poliméricos de imunoglobulina A (IgA) em comparação com a terapêutica tradicional baseada em IgG (Yoo et al. (2005), Bakema et al., MAbs 3:352-61 (2011) e Leusen (2015)). Em oncologia, IgAs anti-EGFR e anti-CD20 monoméricos e poliméricos demonstraram morte de células tumorais superior em comparação com IgG, conduzida por citotoxicidade mediada por FcαRI ou ligação de receptor mais eficaz e modulação negativa (Pascal et al., Haematologica 97:1686-94 (2012), Boross et al., EMBO Molecular Medicine 5:1213-26 (2013) e Lohse et al. (2016)). A atividade citotóxica de IgA pode ser ainda mais aumentada por meio do acoplamento duplo de FcγR e FcαRI por fusão IgG/A ou moléculas híbridas (Li et al., Oncotarget (2017) e Kelton et al., Chem Biol 21:1603-9 (2015)). Para doenças infecciosas, o envolvimento de alvo multivalente de IgA permitiu a ligação e neutralização do antígeno superior em modelos de infecção por influenza (Suzuki et al. (2015)). Além disso, o dímero de IgA humana (dIgA) pode ser efetivamente entregue ao lúmen do rim em um modelo de camundongo com doença renal policística por meio da ligação ao receptor de imunoglobulina polimérica (pIgR), enquanto as moléculas de IgG não podem (Olsan et al., Journal of Biological Chemistry 290:15679-86 (2015)). O aproveitamento da atividade de transcitose específica de IgA pode permitir o acesso a alvos terapêuticos no lado luminal dos tecidos da mucosa que são ineficientemente direcionados pela terapêutica IgG atual (Bakema et al. (2011), Olsan et al. (2015) e Borrok et al., JCI Insight 3 (2018)).

[0006] A produção de IgA monomérica recombinante é mais desafiadora do que da bem estabelecida molécula de IgG. Os anticorpos IgA normalmente sofrem de má expressão e glicosilação heterogênea. Enquanto a IgG1 humana normalmente tem apenas dois locais de glicosilação ligados a N, um em cada domínio CH2, a IgA humana contém vários locais de glicosilação que podem ser suscetíveis à heterogeneidade de glicano (Leusen (2015)). IgA1 tem vários locais de glicosilação ligada a O na região de dobradiça e também dois locais de glicosilação ligada a N no domínio constante de HC. Embora as moléculas de IgA2 não sejam modificadas por glicanos ligados a O, elas contêm quatro (IgA2m1) ou cinco (IgA2m2 e IgA2mn) locais de glicosilação ligados a N (Yoo et al. (2005) e Bakema et al. (2011)). A JC também contém um local de glicosilação ligado a N. A montagem das três cadeias polipeptídicas (LC, HC e JC) leva a vários estados oligoméricos e contribui ainda para a complexidade geral da IgA polimérica recombinante (Rouwendal et al., MAbs 8:74-86 (2016) e Brunke et al., MAbs 5:936-45 (2013)). Com o aumento do tamanho de um oligômero de IgA, ocorre não apenas um aumento no número de locais de glicosilação, mas também o potencial para mais heterogeneidade de glicano.

[0007] IgA já demonstrou ter uma meia-vida de circulação curta (<1 dia a ~4 dias) em várias espécies (Challacombe et al., Immunology 36:331- 8 (1979) e Leusen (2015)). Ao contrário da IgG, a IgA não se liga ao receptor neonatal, FcRn e, portanto, não pode sofrer reciclagem endossomal e escapar da degradação lisossomal (Roopenian et al., Nat Rev Immunol 7:715-25 (2007)). Além da falta de ligação ao FcRn, glicanos imaturos ligados a N também podem contribuir para a redução da meia-vida sérica de IgA recombinante, tornando-os alvos suscetíveis de receptores endocíticos específicos de carboidratos, como o receptor de asialoglicoproteína (ASGPR) (Boross et al. (2013) e (Rifai et al., J Exp Med 191:2171-82 (2000)) e receptor de manose (Lee et al., Science 295:1898-901 (2002) e Heystek et al., J Immunol 168:102-7 (2002)). Estes receptores de eliminação, que são altamente concentrados no fígado, reconhecem glicoproteínas contendo glicanos ligados a N incompletamente sialilados e os removem da circulação (Tomana et al., Gastroenterology 94:762-70 (1988) e Daniels et al., Hepatology 9:229-34 (1989)).

[0008] Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de anticorpos IgA que tenham uma meia-vida mais longa e de métodos de produção para melhorar os níveis de expressão e geração de IgA polimérica.

DESCRIÇÃO RESUMIDA

[0009] A presente divulgação se refere a anticorpos IgA e composições compreendendo tais anticorpos, bem como métodos de produção e uso de tais anticorpos e composições.

[00010] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a anticorpos IgA isolados. Por exemplo, mas não como limitação, um anticorpo IgA isolado, ou um fragmento do mesmo, da presente divulgação compreende uma substituição no aminoácido V458. Em certas modalidades, o aminoácido V458 é substituído por uma isoleucina (isto é, V458I). Em certas modalidades, o anticorpo IgA isolado é um anticorpo IgA1, IgA2mn ou IgA2m1.

[00011] Em certas modalidades, um anticorpo IgA isolado, ou um fragmento do mesmo, da presente divulgação compreende uma substituição no aminoácido I458. Em certas modalidades, o aminoácido I458 é substituído por uma valina (isto é, I458V). Em certas modalidades, o anticorpo IgA isolado é um anticorpo IgA2m2.

[00012] A presente divulgação fornece ainda um anticorpo IgA isolado que compreende uma substituição no aminoácido N459 e/ou S461. Em certas modalidades, o aminoácido N459 é substituído por uma glutamina (ou seja, N459Q). Em certas modalidades, o aminoácido S461 é substituído por uma alanina (isto é, S461A). Em algumas modalidades, o anticorpo IgA é um anticorpo IgA1 ou IgA2m1.

[00013] A presente divulgação fornece ainda um anticorpo IgA isolado que compreende uma ou mais substituições em um aminoácido selecionado do grupo que consiste em N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459, S461 e uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o anticorpo IgA tem uma substituição no aminoácido N459 e é um anticorpo IgA1, IgA2m1 ou IgA2m2. Em certas modalidades, o anticorpo IgA tem uma substituição no aminoácido N166 e é um anticorpo IgA2m1 ou IgA2m2. Em certas modalidades, o anticorpo IgA tem uma substituição no aminoácido S212 e é um anticorpo IgA2m2. Em certas modalidades, o anticorpo IgA tem uma substituição no aminoácido N263 e é um anticorpo IgA1, IgA2m1 ou IgA2m2. Em certas modalidades, o anticorpo IgA tem substituições nos aminoácidos N337, I338, T339 e é um anticorpo IgA2m1 ou IgA2m2. Em certas modalidades, o anticorpo IgA tem substituições nos aminoácidos N337, I338, T339 e uma ou mais substituições em T168, N211, S212, S213, N263, T265, N459, S461 e uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o anticorpo IgA é um anticorpo IgA2m2 e compreende substituições nos aminoácidos N166, S212, N263, N337, I338, T339 e N459. Por exemplo, mas não como limitação, as substituições nos aminoácidos N166, S212, N263, N337, I338, T339 e N459 podem ser N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S e N459Q.

[00014] A presente divulgação fornece ainda moléculas de fusão IgG-IgA isoladas. Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA isolada pode compreender um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo P221 ou R221 até o terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA e onde o anticorpo IgG compreende ainda uma deleção do aminoácido K447. A presente divulgação fornece uma molécula de fusão IgG-IgA isolada compreendendo um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo C242 através do terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA. Em certas modalidades, o anticorpo IgG inclui uma deleção do aminoácido K447. Em certas modalidades, o anticorpo IgG é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4. Por exemplo, mas não como limitação, o anticorpo IgG pode ser um anticorpo IgG1. Em certas modalidades, o anticorpo

IgA é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgA1, um anticorpo IgA2m1, um anticorpo IgA2m2 e um anticorpo IgA2mn. Por exemplo, mas não como forma de limitação, o anticorpo IgA é um anticorpo IgA2m1.

[00015] A presente divulgação fornece ainda um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA divulgada no presente documento e células hospedeiras que incluem tais ácidos nucleicos. A presente divulgação fornece ainda métodos para produzir um anticorpo que inclui a cultura de uma célula hospedeira divulgada no presente documento de modo que o anticorpo IgA ou a molécula de fusão IgG-IgA seja produzida. O método pode incluir ainda recuperar o anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA da célula hospedeira.

[00016] A presente divulgação fornece composições farmacêuticas que incluem um anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA divulgada no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode incluir ainda agente terapêutico adicional.

[00017] A presente divulgação fornece ainda métodos para tratar um indivíduo com uma doença, em que o método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA divulgada no presente documento. Em certas modalidades, a doença é uma doença inflamatória, uma doença autoimune ou câncer.

[00018] A presente divulgação fornece métodos para aumentar a expressão de dímeros de IgA. Em certas modalidades, o método inclui aumentar a quantidade de DNA que codifica uma cadeia de união (JC) que é introduzida em uma primeira célula em relação à quantidade de DNA que codifica a cadeia leve (LC) e a cadeia pesada (HC), em que aumentou a expressão é relativa à quantidade de dímeros de IgA produzidos em uma segunda célula introduzida com quantidades iguais de JC, LC e DNA de HC.

Por exemplo, mas não como limitação, a proporção da quantidade de DNA que codifica a HC para a quantidade de DNA que codifica a LC para a quantidade de DNA que codifica a JC (HC:LC:JC) que é introduzida na primeira célula é cerca de 1:1:2 a cerca de 1:1:5.

[00019] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para aumentar a expressão de dímeros, trímeros ou tetrâmeros de IgA. Em certas modalidades, o método inclui diminuir a quantidade de DNA que codifica uma cadeia de união (JC) introduzida em uma primeira célula em relação à quantidade de DNA que codifica a cadeia leve (LC) e a cadeia pesada (HC), em que a expressão aumentada é em relação à quantidade de trímeros ou tetrâmeros de IgA produzidos em uma segunda célula introduzida com maiores quantidades de HC e LC DNA em relação à quantidade de JC DNA. Em certas modalidades, a proporção da quantidade de DNA que codifica a HC para a quantidade de DNA que codifica a LC para a quantidade de DNA que codifica a JC (HC:LC:JC) que é introduzida na primeira célula é de cerca de 1:1:0,25 a cerca de 1:1:0,5.

[00020] A presente divulgação fornece métodos para aumentar a produção de um polímero IgA1 ou IgA2m1. Em certas modalidades, o método compreende expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 com uma substituição no aminoácido V458, por exemplo, V458I, em que a produção aumentada é relativa à quantidade de polímeros IgA1 ou IgA2m1 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 que não tem uma substituição no aminoácido V458. A presente divulgação fornece ainda métodos para aumentar a produção de dímeros de IgA2m2 que compreendem expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA2m2 com uma substituição no aminoácido I458, por exemplo, I458V, em que a produção aumentada é relativa à quantidade de dímeros de IgA2m2 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA2m2 que não tem uma substituição no aminoácido I458. Em certas modalidades, os métodos para aumentar a produção de um polímero IgA1 ou IgA2m1 incluem expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 com uma substituição no aminoácido N459 e/ou S461, por exemplo, N459Q e/ou S461A, em que aumentou a produção é relativa à quantidade de polímeros IgA1 ou IgA2m1 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 que não tem uma substituição no aminoácido N459 ou S461. Em certas modalidades, os métodos para diminuir a produção de polímeros IgA2m2 incluem expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA2m2 com uma substituição no aminoácido C471, por exemplo, C471S, em que a produção diminuída é relativa à quantidade de polímeros IgA2m2 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA2m2 que não tem uma substituição no aminoácido C471. Em certas modalidades, os anticorpos IgA que incluem uma substituição no aminoácido C471, por exemplo, C471S, podem incluir ainda uma substituição em P221, por exemplo, P221R,

[00021] A presente divulgação fornece métodos para aumentar a expressão transitória de um anticorpo IgA2m2 compreendendo expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA2m2 que compreende uma substituição em um aminoácido selecionado do grupo que consiste em N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 e uma combinação dos mesmos, em que a expressão transitória aumentada é relativa à quantidade de expressão transitória produzida em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA2m2 que não tem uma substituição em um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 e uma combinação dos mesmos.

[00022] A presente divulgação fornece ainda métodos de expressão de dímeros de moléculas de fusão IgG-IgA que incluem a expressão de uma molécula de fusão IgG-IgA compreendendo um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA. Em certas modalidades, a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo P221 ou R221 através do terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA, em que o anticorpo IgG compreende uma deleção do aminoácido K447. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de expressão de dímeros, trímeros ou tetrâmeros de moléculas de fusão IgG-IgA que incluem a expressão de uma molécula de fusão IgG-IgA compreendendo um anticorpo IgG de comprimento completo fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo C242 até o terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA. Em certas modalidades, o anticorpo IgG compreende uma deleção do aminoácido K447.

[00023] A presente divulgação fornece métodos para purificar as moléculas de fusão IgA e IgG-IgA divulgadas no presente documento e/ou para purificar um estado oligomérico específico, por exemplo, dímero, trímero ou tetrâmero, das moléculas de fusão IgA e IgG-IgA divulgadas aqui. Em certas modalidades, um método para purificar um anticorpo IgA a partir de uma mistura compreendendo um anticorpo IgA e pelo menos uma proteína da célula hospedeira inclui aplicar a mistura a uma coluna compreendendo Proteína L para ligar o anticorpo IgA, lavando a coluna de Proteína L com um tampão de lavagem compreendendo PBS e eluir o anticorpo IgA da coluna de Proteína L por um tampão de eluição compreendendo ácido fosfórico. Em certas modalidades, um método para purificar um estado oligomérico de um anticorpo IgA ou uma molécula de fusão IgG-IgA a partir de uma mistura compreendendo um anticorpo IgA ou uma molécula de fusão IgG-IgA e pelo menos uma proteína da célula hospedeira pode incluir aplicar a mistura a uma coluna de purificação por afinidade compreendendo Proteína L ou Proteína A para ligar o anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA, lavando a coluna de purificação por afinidade com um tampão de lavagem, eluindo o anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA da coluna de purificação por afinidade por um tampão de eluição para formar um primeiro eluato e aplicar o primeiro eluato a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho para separar diferentes estados oligoméricos de IgA e para obter um fluxo que compreende um estado oligomérico do anticorpo IgA ou da molécula de fusão IgG-IgA.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00024] Figura 1A-1D. Sequências de proteínas de domínios constantes de cadeia pesada de IgA humana e cadeia J. (A) Alinhamento de sequências de proteínas para os domínios constantes da cadeia pesada humana CH1, CH2, CH3, dobradiça (Brezski et al. Curr Opin Immunol 40:62–9 (2016)) e arremate de IgA1, IgA2m1 e IgA2m2 (Toraño et al. 75:966–9 (1978)).

As incompatibilidades relativas à sequência de IgA1 são destacadas em cinza, os motivos de glicosilação ligada a N estão em caixas e os asteriscos indicam diferenças de aminoácidos em IgA2m2 de IgA1 e IgA2m1 no arremate. (B) Sequência de proteína da cadeia J humana com o motivo de glicosilação ligada a N dentro de uma caixa. (C) Sequência de proteína dos domínios de cadeia constante pesada humana CH1, CH2, CH3, dobradiça e arremate de IgA2mn.

Os locais de glicosilação ligados a N estão dentro de uma caixa. (D) Esquema dos estados oligoméricos de IgA com cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC). Os polímeros de IgA representam as espécies trímero, tetrâmero e pentâmero.

[00025] Figura 2A-2F. O estado oligomérico da IgA produzida de forma recombinante é afetado pela quantidade de DNA da cadeia J usada na transfecção e pela sequência de arremate da cadeia pesada. (A-C) Sobreposição de cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos normalizados de IgA purificada por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas com proporções variáveis de DNA de cadeia leve

(LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC) para os seguintes isotipos/alotipos: (A) IgA1, (B) IgA2m1 ou (C) IgA2m2. Os picos de monômero (M), dímero (D) e polímero (P) são indicados. Os valores foram normalizados com base no sinal mais alto de cada cromatograma. (DF) Quantidades relativas de monômero, dímero e espécies de trímero/tetrâmero produzidas para variantes de IgA, quantificadas por SEC analítico. (D) O efeito de mutações no arremate de IgA de IgA1, IgA2m1 e IgA2m2 nas posições 458 e 467 na formação de trímero/tetrâmero. O efeito de mutações que removem os locais de glicosilação ligada a N em (E) IgA1 ou (F) IgA2m2 na formação de trímero/tetrâmero.

[00026] Figura 3A-3D. Caracterização biofísica e estrutural de oligômeros IgA recombinantes. (A) Sobreposição de cromatogramas analíticos de exclusão de tamanho de monômeros, dímeros e tetrâmero de IgA1, IgA2m1, IgA2m1 P221R e IgA2m2 purificados. (B) Análise SDS-PAGE de monômeros (M), dímeros (D) e tetrâmero (T) de IgA1, IgA2m1, IgA2m1 P221R e IgA2m2 não reduzidos (DTT) e reduzidos (+DTT). Cadeia pesada (HC), cadeia leve (LC) e cadeia de união (*) são indicadas em amostras reduzidas e o dímero LC-LC de IgA2m1 é indicado com uma ponta de seta. (C-D, painéis superiores) Classes 2D livres de referência de microscopia eletrônica de coloração negativa para (C) dímero IgA2m2 ou (D) tetrâmero IgA2m2. (C-D, painéis inferiores) Uma partícula de imagem bruta em comparação com sua classe 2D atribuída é apresentada ao lado de um modelo de IgA sobreposto na classe 2D com os domínios Fc e fragmentos Fab destacados.

[00027] Figura 4A-4B. Os oligômeros IgA produzidos de forma recombinante são estáveis e funcionais in vitro. (A) Transcitose in vitro de monômeros, dímeros e tetrâmero anti-mIL-13 hIgA em células MDCK transfectadas com pIgR humano. Os polímeros de IgA transcitose, enquanto os monômeros não. (B) A termoestabilidade do fragmento Fab anti-mIL-13 IgAs,

IgG1 e IgG1 é medida por fluorimetria de varredura diferencial (DSF). Apenas uma transição de fusão foi observada para todas as amostras.

[00028] Figura 5A-5C. Os oligômeros IgA recombinantes demonstram rápida depuração sérica in vivo. (A) Perfis de concentração de soro-tempo de IgA ou IgG em camundongos. As exposições séricas globais de camundongos Balb/c administrados com uma única dose intravenosa de 5 mg/kg (IV) de moléculas de IgA ou IgG em 5 min, 15 min, 30 min, 1 hr, 1 dia, 3 dias, 7 dias e 14 dias após a dose. Todos os camundongos foram sangrados retro-orbitalmente sob isoflurano para avaliar o perfil de concentração sérica. O monômero de IgA sérico humano foi administrado a 10 mg/kg e é mostrado como uma linha tracejada. (B-C) Distribuição tecidual de IgA ou IgG em camundongos 1 hora após a injeção. Todos os gráficos são médias ± SEM para cada grupo com n=4. (B) As concentrações de anticorpos intactos foram sangue subtrativo normalizado por tecido, exceto sangue, como 125I (%ID/g de tecido). (C) As concentrações de valores de anticorpos catabolizados foram determinadas subtraindo o 125I (%ID/g de tecido) do 111In (%ID/g de tecido).

[00029] Figura 6A-6C. Glicosilação incompleta de moléculas de IgA recombinantes. (A) Esquemático do processamento de glicano ligado a N.

(B) Análise global de glicano ligado a N de IgA recombinante e IgA purificada de soro humano. A análise de glicano foi feita por análise de espectrometria de massa após desglicosilação do anticorpo e subsequente enriquecimento de glicano. Enquanto a IgA sérica humana mostra mais de 90% de sialilação, todas as moléculas de IgA expressas de forma recombinante têm menos de 60% de sialilação. (C) A análise de glicano ligado a N específico do local do dímero de IgA2m1 revela a composição de glicano heterogênea entre os diferentes locais de glicosilação ligada a N na cadeia pesada de IgA2m1 (HC) e na cadeia de união (JC).

[00030] Figura 7A-7E. As fusões IgG1-IgA2m1 Fc e IgA2m2 aglicosilado mostram exposições séricas aumentadas em comparação com IgA de tipo selvagem in vivo e demonstram capacidade de transcitose in vitro. (A) Esquema do tetrâmero de IgA2m2 com cadeia leve (LC, preto), cadeia pesada (HC, branco) e cadeia de união com 41 locais de glicosilação ligados a N (diamante) (esquerda) ou aglicosilados (direita). (B) Esquema dos formatos de dímero Fc IgG1, IgA2m1 ou IgG1-IgA2m1 com LC (preto), IgG1 HC (pontilhado), IgA2m1 HC (branco), JC e glicosilação ligada a N (diamante). (C) SEC analítica de dímeros ou tetrâmero Fc de IgG1-IgA2m1 iodado após 0 horas (preto), 24 horas (laranja) ou 96 horas (azul) de incubação em plasma de camundongo. O tetrâmero e dímero IgG1-L-P221R IgA2m1 Fc inicial mostram degradação semelhante ao pico do controle de IgG1 anti-HER2 (Trastuzumab), enquanto os dímeros IgG1ΔK-P221 Fc IgA2m1 ou Fc IgG1ΔK-C242 IgA2m1 reprojetados são estáveis. (D) Perfis de concentração de soro-tempo de IgA ou IgG em camundongos. As exposições séricas globais de camundongos Balb/c administrados com uma dose única de 30 mg/kg IV de moléculas de IgA. Os dados de concentração interna de um IgG1 humano típico (anti-gD) dosado previamente como uma única injeção intravenosa (IV) a 30 mg/kg são mostrados como uma linha tracejada. Todos os camundongos foram sangrados retro-orbitalmente ou por punção cardíaca sob isoflurano para avaliar o perfil de concentração sérica. (E) transcitose in vitro de hIgA em células MDCK transfectadas com pIgR humano.

[00031] Figura 8A-8B. Imagens EM de coloração negativa bruta de purificações de dímero e tetrâmero IgA2m2. (A) Uma imagem bruta por microscopia eletrônica de coloração negativa (EM) do dímero IgA2m2 purificado mostra boas partículas monodispersas. (B) Uma imagem bruta por coloração negativa EM do tetrâmero IgA2m2 purificado mostra boas partículas radiais monodispersas.

[00032] Figura 9. Distribuição intacta de anticorpos normalizada para concentrações plasmáticas. Distribuição tecidual de IgA ou IgG em camundongos 1 hora após a injeção. Todos os valores representam a %ID/g de tecido após a correção do sangue, normalizada para a %ID/mL de plasma.

Todos os gráficos são médias ± SD para cada grupo com n=4.

[00033] Figura 10. Distribuição nos tecidos do anticorpo intacto após 1 dia. As concentrações de tecido de anticorpos intactos foram sangue subtrativo normalizado por tecido expresso como 125I (%ID/g de tecido) e calculado um dia após a injeção. Todos os gráficos são médias ± SEM para cada grupo com n=4.

[00034] Figura 11. Distribuição no tecido do anticorpo degradado após 1 dia. Os valores de anticorpos catabolizados foram determinados subtraindo o 125I (%ID/g de tecido) do 111 In (%ID/g de tecido) e calculados 1 dia após a injeção. Todos os gráficos são médias ± SEM para cada grupo com n=4.

[00035] Figura 12. Esquemático do oligômero de fusão Fc IgG1- IgA2m1. A fusão IgG1-L-P221R IgA2m1 Fc (Borrok et al. MAbs 7:743–51 (2015)) foi feita como um dímero e tetrâmero, mas mostrou ter estabilidade fraca no plasma de camundongo (Figura 7C). Para eliminar um potencial local de clivagem da furina, a lisina terminal C (K) de IgG1 e o resíduo de leucina interveniente (L) foram deletados. Além disso, a sequência IgA2m1 de tipo selvagem (WT) foi restaurada com uma prolina na posição 221 para fazer a fusão Fc IgG1ΔK-P221 IgA2m1. O projeto de fusão Fc K-C242 IgA2m1 IgG1 é semelhante, mas a IgA2m1 Fc começa no resíduo C242, excluindo assim a dobradiça IgA2m1 (dobradiça).

[00036] Figura 13. Análise global de glicano de oligômeros de IgA projetados. Análise global de glicano ligado a N de dímeros CHO produzidos de forma recombinante de anti-mIL-13 IgG1ΔK fundido a P221 ou C242 IgA2m1 Fc e o tetrâmero anti-HER2 IgA2m2 aglicosilado. Os dímeros de anti-mIL-13

IgG1ΔK fundido a P221 ou C242 IgA2m1 Fc têm ambos ~ 20% de sialilação e como esperado, nenhuma glicosilação é detectada para o tetrâmero anti-HER2 IgA2m2 aglicosilado.

[00037] Figura 14. Sequências de proteínas de domínios constantes de cadeia pesada de IgA de humanos e outras espécies.

Alinhamento de sequências de proteínas para os domínios constantes da cadeia pesada humana CH1, CH2, CH3, dobradiça (Brezski et al. (2016)) e arremate (Toraño et al. (1978)). A conservação da sequência de proteínas entre as espécies é destacada em cinza, enquanto os motivos de glicosilação ligada a N estão em caixas.

[00038] Figura 15A-15C. (A) Cromatogramas analíticos de exclusão de tamanho de xmuIL13.huIgA1 purificado por afinidade a partir de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC) entre 1:1:0,25 a 1:1:2. (B) Cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuIL13.huIgA1 purificado por afinidade a partir de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC) entre 1:1:1 a 1:1:5. (C) Quantidades de espécies de dímero e tetrâmero produzidas para o anticorpo IgA.

[00039] Figura 16A-16B. (A) Cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuIL13.IgA2m1 purificado por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC). (B) Quantidades de espécies de dímero e tetrâmero produzidas para o anticorpo IgA.

[00040] Figura 17A-17B. (A) Cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuIL13.IgA2m1.P221R purificado por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC). (B) Quantidades de espécies de dímero e tetrâmero produzidas para o anticorpo IgA.

[00041] Figura 18A-18E. (A) Cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuIL13.huIgA2m2 purificado por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC). (B) Cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuIL13.huIgA2m2 purificado por afinidade a partir de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC) entre 1:1:1 a 1:1:5. (C) Quantidades de espécies de dímero e tetrâmero produzidas para o anticorpo IgA. (D) Cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuIL13.huIgA2m2 purificado por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC), cadeia de união (JC) e componente secretor (SC). (E) Confirmação de cadeia pesada, cadeia leve e cadeia J de xmuIL13.huIgA2m2 por espectrometria de massa.

[00042] A Figura 19 representa a análise Biacore dos seguintes anticorpos anti-IL-13 dos seguintes isotipos/alotipos: Dímero IgA1, dímero IgA2m1, dímero IgA2m2 e tetrâmero IgA2m2.

[00043] Figura 20A-20B. (A) Cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuGP120.3E5.huIgA1 purificado por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC). (B) Cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuGP120.3E5.IgA2m1.P221R purificado por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC).

[00044] A Figura 21 representa cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuGP120.3E5.huIgA2m2 purificado por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC).

[00045] A Figura 22 representa cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de xmuGP120.3E5.huIgA2m2 purificados por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC).

[00046] A Figura 23 representa cromatogramas analíticos de exclusão de tamanho de xgD.5B6.hIgA2m2 de camundongo purificado por afinidade a partir de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293 com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e cadeia de união (JC).

[00047] A Figura 24A-24C representa a modificação dos locais de glicosilação de IgA2m2 e da cadeia J. (A) Resumo das modificações feitas na cadeia pesada de IgA2m2 e na cadeia J e sua expressão in vitro em comparação com o tipo selvagem. (B) Resumo da expressão transitória de variantes de glicosilação única de IgA2m2. (C) Resumo da expressão transitória de variantes de glicosilação de IgA2m2 com múltiplas mutações.

[00048] A Figura 25 representa a análise das propriedades de ligação ao receptor de monômero de IgA de soro humano, tetrâmero de IgA2m2 de tipo selvagem e tetrâmero de IgA2m2 (aglicosilado) e cadeia J (glicosilada).

[00049] A Figura 26 representa a análise das propriedades de glicano de cada molécula de IgA.

[00050] Figura 27. Perfil de concentração de tempo da molécula de IgA após injeção única de 10 mg/kg IV em camundongos Balb/C fêmeas.

[00051] Figura 28A-28B. (A) Análise de mutações de cisteína para evitar ligações dissulfeto com o componente secretor ou a cadeia J. (B) C471, mas não C311, é necessário para o dímero IgA2m2 e a formação de oligômero de ordem superior ao adicionar a cadeia de união à cadeia leve e à cadeia pesada.

[00052] A Figura 29 representa a análise da co-transfecção do componente secretor, cadeia de união, cadeia leve e cadeia pesada.

[00053] Figura 30A-30E. (A) Níveis de expressão de variantes xmuIL13.IgA2m2 gerados para abolir a ligação de pIgR. (B) Cromatogramas analíticos de exclusão de tamanho de variantes xmuIL13.IgA2m2 de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293.

(C) Análise Biacore das variantes xmuIL13.IgA2m2 que se ligam a pIgR de camundongo. (D) Análise Biacore das variantes xmuIL13.IgA2m2 que se ligam a pIgR humano. (E) Análise Biacore das variantes xmuIL13.IgA2m2 que se ligam ao FcαRI humano.

[00054] A Figura 31A-31B representa a análise das condições de cultura de células para aumentar a sialilação de IgA2m2 anti-Jag1. (A) Matriz das condições de cultura de células para uma linha de células estável xJAG1.2B3.hIgA2m2. (B) Análise do efeito das condições de cultura de células na glicosilação de xJAG1.2B3.hIgA2m2.

[00055] A Figura 32 representa a estabilidade de variantes de IgA por fluorimetria de varredura diferencial (DSF).

[00056] A Figura 33A-33D representa a caracterização e engenharia de uma molécula de fusão de comprimento total anti-IL-13

IgG1.Leu-P221R.IgA2m1 Fc para aumentar a estabilidade do oligômero. (A) Cromatogramas de exclusão de tamanho analítico de moléculas de fusão de IL-13 IgG1.Leu-P221R.IgA2m1 Fc purificados por afinidade de transfecções transitórias em pequena escala realizadas em células Expi293, com proporções variáveis de DNA de cadeia leve (LC), cadeia pesada (HC) e a cadeia de união (JC). (B) Análise Biacore dos oligômeros de IgA que se ligam a pIgR de camundongo. (C) Síntese da ligação dos oligômeros de IgA para plgR de camundongo e plgR de humano. (D) Estabilidade dos oligômeros IgA por DSF.

[00057] Figura 34A-34C. (A) Projeto de construção de Fc de comprimento total de IgA de IgG1 para eliminar local de furina e instabilidade.

(B) Dados de expressão transitória de Fc de IL-13 IgG1-IgA anti-murino de comprimento total de construtos modificados. (C) Dados de estabilidade de plasma de camundongo para moléculas de IL-13 IgA anti-murina projetadas.

[00058] Figura 35A-35B. (A) Análise Wasatch da ligação do oligômero IgA ao FcαRI humano. (B) Resumo da ligação do oligômero IgA ao FcαRI conforme determinado por Ressonância de Plasmon de Superfície de Wasatch (SPR).

[00059] Figura 36A-36D. (A) Análise Wasatch da ligação de dímeros e tetrâmeros IgA2m2 produzidos por expressão transitória em células CHO e células Expi293 para pIgR de camundongo e humano. (B) Análise Wasatch da ligação de variantes de glicosilação de IgA2m2 a pIgR de camundongo. (C) Análise Wasatch da ligação de variantes de glicosilação de IgA2m2 a pIgR humano. (D) Resumo da ligação do oligômero IgA a pIgR de camundongo e humano conforme determinado por Wasatch SPR.

[00060] Figura 37A-37C. (A) Perfis de expressão de moléculas de fusão hIgG1-hIgA1. (B) Cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos de moléculas de fusão hIgG1-hIgA1. (C) Análise Biacore da ligação de moléculas de fusão hIgG1-hIgA1 a pIgR de camundongo e humano e FcαRI humano.

[00061] A Figura 38 representa a análise da remoção da glicosilação ligada a N de vários anticorpos IgA1.

[00062] Figura 39. IgA2m2 anti-mIL-13 humano expresso de forma recombinante foi purificado por afinidade em uma coluna Capto L. O eluato Capto L foi então analisado por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) usando uma coluna Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm em um HPLC. Três picos principais foram observados no perfil de eluição analítico de SEC correspondendo a polímeros de ordem superior (pico 1, incluindo trímero, tetrâmero e pentâmero), dímero (pico 2) e monômero (pico 3), conforme determinado por espalhamento de luz multi- ângulo (MALS) e microscopia eletrônica de coloração negativa.

[00063] Figura 40. A separação da mistura de espécies oligoméricas de IgA2m2 anti-mIL-13 humana recombinante observada no eluato da coluna de afinidade Capto L foi tentada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) usando uma coluna HiLoad 16/600 Superose 6 prep grade (pg). Quatro picos principais foram observados no perfil de eluição de Superose 6 correspondendo a agregados de alto peso molecular (pico 1, eluindo no volume vazio da coluna), polímeros de ordem superior (pico 2, provavelmente incluindo trímero, tetrâmero e pentâmero), dímero (pico 3) e monômero (pico 4) conforme determinado por espalhamento de luz multi- ângulo (MALS) acoplado a SEC analítico e microscopia eletrônica de coloração negativa. A massa molar (MW) e o índice de polidispersidade (PDI) das proteínas medidas a partir das frações tomadas nos picos 2 e 3 são indicadas.

[00064] Figura 41. A separação de dímeros de IgA2m2 anti-mIL- 13 humano recombinante de polímeros de ordem superior foi conseguida por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando uma coluna de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å em um HPLC. Três picos principais foram observados no perfil de eluição analítico de SEC,

correspondendo a polímeros de ordem superior (pico 1, incluindo trímero, tetrâmero e pentâmero), dímero (pico 2) e monômero (pico 3), conforme determinado por espalhamento de luz multi-ângulo (MALS) acoplado a SEC analítica e microscopia eletrônica de coloração negativa.

[00065] Figura 42A-42D. (A) A eluição da coluna de afinidade Capto L de IgA2m2 anti-mIL-13 humano foi analisada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) usando uma coluna de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å em um HPLC. Três picos principais foram observados correspondendo a polímeros de ordem superior (pico 1, incluindo trímero, tetrâmero e pentâmero), dímero (pico 2) e monômero (pico 3), conforme determinado por espalhamento de luz multi-ângulo (MALS) acoplado a SEC analítico e microscopia eletrônica de coloração negativa. (B) O pico 1 do painel (A) foi isolado por purificação em uma coluna de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å como na Figura 41. A análise pós-purificação do pico 1 em uma coluna Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm acoplada a um detector MALS é mostrada aqui. A massa molar (MW) e o índice de polidispersidade (PDI) determinados por MALS são consistentes com a massa esperada de IgA2m2 predominantemente tetramérica. (C) O pico 2 do painel (A) foi isolado por purificação em uma coluna Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm como na Figura 41. A análise pós-purificação do pico 2 em uma coluna Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm acoplada a um detector MALS é mostrada aqui. O MW e PDI determinados por MALS são consistentes com a massa esperada de IgA2m2 predominantemente dimérica. (D) A proteína purificada dos picos 1 e 2 dos painéis (B) e (C) foi analisada por SDS-PAGE em condições não redutoras (- DTT) ou redutoras (+DTT). Nas amostras reduzidas, as bandas que migram nas massas esperadas para a cadeia pesada (HC), cadeia leve (LC) e cadeia J

(JC) são observadas.

[00066] Figura 43A-43B. (A) Imagem bruta representativa de microscopia eletrônica de coloração negativa (EM) de partículas humanas anti- mIL-13 IgA2m2 do pico 1 na Figura 42B. (B) Classes 2D livres de referência de EM de coloração negativa de partículas do pico 1 na Figura 42B, indicando que a amostra é predominantemente tetrâmero.

[00067] Figura 44A-44B. (A) Imagem bruta representativa de microscopia eletrônica de coloração negativa (EM) de partículas humanas anti- mIL-13 IgA2m2 do pico 2 na Figura 42C. (B) Classes 2D livres de referência de EM de coloração negativa de partículas do pico 2 na Figura 42C, indicando que a amostra é predominantemente dímero.

[00068] Figura 45. Análise de espectrometria de massa do dímero humano anti-mIL-13 IgA2m2 purificado do pico 2 na Figura 42C. A análise de espectrometria de massa realizada após desnaturação por calor, redução com ditiotreitol e desglicosilação com PNGaseF confirma a presença da cadeia de união correta (JC), cadeia leve (LC) e cadeia pesada (HC).

[00069] Figura 46A-46C. (A) A eluição da coluna de afinidade Capto L de IgA1 anti-mIL-13 humano foi analisada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) usando uma coluna de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å em um HPLC. Antes da separação dos oligômeros, três picos principais foram observados correspondendo a polímeros de ordem superior (pico 1, incluindo trímero, tetrâmero e pentâmero), dímero (pico 2) e monômero (pico 3). (B) O pico 2 do painel (A) foi isolado por purificação em uma coluna Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm em um HPLC como na Figura 41. A análise de pós- purificação do pico 2 em uma coluna Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm acoplada a um detector de espalhamento de luz multi-ângulo (MALS) é mostrada aqui. A massa molar (MW) e o índice de polidispersidade (PDI) determinados por MALS são consistentes com a massa esperada de IgA1 predominantemente dimérica. (C) A proteína purificada do pico 2 do painel (B) foi analisada por SDS-PAGE em condições não redutoras (-DTT) ou redutoras (+DTT). Nas amostras reduzidas, as bandas que migram nas massas esperadas para a cadeia pesada (HC), cadeia leve (LC) e cadeia J (JC) são observadas.

[00070] Figura 47A-47C. (A) A eluição da coluna de afinidade Capto L de IgA2m1 anti-mIL-13 humano foi analisada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) usando uma coluna de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å em um HPLC. Antes da separação dos oligômeros, três picos principais foram observados correspondendo a polímeros de ordem superior (pico 1, incluindo trímero, tetrâmero e pentâmero), dímero (pico 2) e monômero (pico 3). (B) O pico 2 do painel (A) foi isolado por purificação em uma coluna Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm em um HPLC como na Figura 41. A análise de pós- purificação do pico 2 em uma coluna Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm acoplada a um detector de espalhamento de luz multi-ângulo (MALS) é mostrada aqui. A massa molar (MW) e o índice de polidispersidade (PDI) determinados por MALS são consistentes com a massa esperada de IgA2m1 predominantemente dimérica. (C) A proteína purificada do pico 2 do painel (B) foi analisada por SDS-PAGE em condições não redutoras (-DTT) ou redutoras (+DTT). Nas amostras reduzidas, as bandas que migram nas massas esperadas para a cadeia pesada (HC), cadeia leve (LC) e cadeia J (JC) são observadas.

[00071] Figura 48A-48C. (A) A eluição da coluna de afinidade Capto L de IgA2m1 anti-mIL-13 humano contendo a mutação P221R na cadeia pesada foi analisada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC Coluna 200 Å em um HPLC. Antes da separação dos oligômeros, três picos principais foram observados correspondendo a polímeros de ordem superior (pico 1, incluindo trímero, tetrâmero e pentâmero), dímero (pico 2) e monômero (pico 3). (B) O pico 2 do painel (A) foi isolado por purificação em uma coluna Water's XBridge Protein BEH SEC 450 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm em um HPLC como na Figura 41. A análise pós-purificação do pico 2 em uma coluna de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm Water's XBridge Protein BEH SEC 200 Å é mostrada. (C) A proteína purificada do pico 2 do painel (B) foi analisada por SDS-PAGE em condições não redutoras (-DTT) ou redutoras (+DTT). Nas amostras reduzidas, as bandas que migram nas massas esperadas para a cadeia pesada (HC), cadeia leve (LC) e cadeia J (JC) são observadas.

[00072] A Figura 49 representa a capacidade dos anticorpos IgA anti-HER2 monoméricos e poliméricos de resultar na morte das linhas celulares de câncer de mama HER2 + KPL-4, BT474-M1 e SKBR3.

[00073] A Figura 50 representa a capacidade dos anticorpos monoméricos e poliméricos anti-HER2 IgA de resultar na morte de células de câncer de mama SKBR3 na presença de neutrófilos de diferentes doadores.

[00074] A Figura 51 representa a capacidade de polímeros e monômeros de IgA glicosilados e aglicosilados de resultar na morte de células de câncer de mama SKBR3.

[00075] Figura 52A-B. (A) Análise Biacore de oligômeros e tetrâmeros de IgA que se ligam ao FcαRI humano. (B) Resumo da ligação de oligômeros e tetrâmeros de IgA a FcαRI conforme determinado por Biacore SPR.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00076] Para maior clareza e não como forma de limitação, a descrição detalhada da matéria presentemente divulgada é dividida nas seguintes subseções:

I. Definições; II. Anticorpos; III. Métodos para Produzir e Purificar Anticorpos; IV. Métodos de Tratamento; V. Composição Farmacêutica; VI. Artigos de Fabricação; e VII. Modalidades Exemplares.

I. DEFINIÇÕES

[00077] O termo "cerca de" ou "aproximadamente", conforme usado neste documento, pode significar dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular, conforme determinado por alguém técnico no assunto, que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, por exemplo, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, “cerca de” pode significar dentro de 3 ou mais de 3 desvios padrão, de acordo com a prática da técnica. Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até 20%, de preferência até 10%, mais preferencialmente até 5% e mais preferencialmente ainda até 1% de um determinado valor. Alternativamente, particularmente no que diz respeito a sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude, preferencialmente dentro de 5 vezes, e mais preferencialmente dentro de 2 vezes, de um valor.

[00078] Os termos “um”, “uma” e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Os termos "um" (ou "uma"), bem como os termos "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados indistintamente neste documento. Além disso, "e/ou", onde usado neste documento, deve ser considerado como divulgação específica de cada um dos dois recursos ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou", conforme usado em uma frase tal como "A e/ou B" neste documento, destina-se a incluir "A e B"; "A ou B"; "A" (sozinho) e "B" (sozinho).

Da mesma forma, o termo "e/ou", conforme usado em uma frase como "A, B e/ou C", destina-se a abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[00079] O termo “anticorpo” deste documento é usado neste documento no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos, fragmentos de anticorpo e moléculas de fusão de anticorpos, contanto que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.

[00080] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, vide Holliger e Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005).

[00081] O termo anticorpo "quimérico" refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[00082] A "classe" de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários destes podem ser ainda divididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados,,,  e, respectivamente.

[00083] O termo " anticorpos IgA" refere-se a anticorpos da classe de anticorpos IgA e incluem os isotipos IgA, IgA1 e IgA2, e os três alotipos de IgA2, m1, m2 e mn.

[00084] O termo “agente citotóxico”, como usado no presente documento, se refere a uma substância que inibe ou previne uma função celular e/ou provoca a morte ou destruição celular. Os agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes quimioterápicos ou fármacos (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides de vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucila, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes); agentes inibidores de crescimento; enzimas e seus fragmentos, tais como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes; e os vários agentes antitumorais ou anticancerígenos divulgados abaixo.

[00085] “Funções efetoras” se referem às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo.

Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: Ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.

[00086] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado. Por exemplo, e não como forma de limitação, uma

"quantidade eficaz" pode se referir a uma quantidade de um anticorpo, divulgado neste documento, que é capaz de aliviar, minimizar e/ou prevenir os sintomas da doença e/ou distúrbio, prolongar a sobrevivência e/ou prolongar o período até a recidiva da doença e/ou distúrbio.

[00087] O termo “região Fc” é usado no presente documento para definir uma região terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma modalidade, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana se estende a partir de Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina terminal C (Lys447), ou a glicina terminal C (Gly446) da região Fc, podem ou não estar presentes. Em certas modalidades, uma região Fc de cadeia pesada de IgA humana se estende de Pro221 (P221), Arg221 (R221), Val222 (V222), Pro223 (P223) ou de Cys242 (C242) para o terminal carboxila da cadeia pesada (ver Figura 1A e C). A menos que especificado de outra forma no presente documento, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração da UE, também chamado de índice da UE, como descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991.

[00088] O “receptor Fc” ou “FcR” descreve um receptor que se liga a região Fc de um anticorpo. Receptores Fc incluem, mas não estão limitados a, FcαRI (reconhecendo a região Fc de um anticorpo IgA) e FcRII (reconhecendo a região Fc de um anticorpo IgG). Os receptores FcRII incluem FcRIIA (um “receptor de ativação”) e FcRIIB (um “receptor de inibição”), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. O receptor de ativação FcRIIA contém um motivo de ativação baseado em imunorreceptor de tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. Receptor de inibição FcRIIB contém um motivo de inibição à base de tirosina imunorreceptor (ITIM) no seu domínio citoplasmático. (vide, por exemplo, Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcRs são revisados, por exemplo, em Ravetch e Kinet, Annu. Rev.

Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcR, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo “FcR” neste documento.

[00089] O termo "receptor Fc" ou "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de anticorpos IgG maternais para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J.

Immunol. 24:249 (1994)) e a regulação da homeostase das imunoglobulinas.

Métodos de medição de ligação a FcRn são conhecidos (ver, por exemplo, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213- 6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.). A ligação ao FcRn humano in vivo e uma meia-vida em soro de polipeptídeos de ligação de afinidade elevada a FcRn humano podem ser ensaiados, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens celulares transfectadas humanas que expressam FcRn humano ou em primatas aos quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. WO 2000/042072 (Presta) descreve variantes de anticorpo com ligação melhorada ou diminuída a FcRs. Vide também, por exemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).

[00090] “Estrutura” ("Framework") ou “FR” refere-se a resíduos do domínio variável diferentes das regiões determinantes de complementaridade (CDRs). O FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios de FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Por conseguinte, as sequências de CDR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-CDR-

H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4.

[00091] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são usados neste documento indistintamente para referirem-se a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativo ou tendo cadeias pesadas que contêm uma região Fc, conforme definido neste documento.

[00092] Os termos "célula hospedeira", "linhagem celular hospedeira" e "cultura de células hospedeiras", conforme usados de forma intercambiável neste documento, referem-se a células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a descendência resultante desta, independentemente do número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica em teor de ácido nucleico a uma célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada está incluída neste documento.

[00093] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por uma célula humana ou humana ou derivada de uma fonte não humana que usa repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências de codificação de anticorpos humanos. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humanos.

[00094] Um "framework de consenso humano" é um framework que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de framework de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção das sequências de VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável.

Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo conforme em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda, MD, (1991), volumes 1-3. Em uma modalidade, para a VL, o subgrupo é o subgrupo kappa I, conforme em Kabat et al., supra.

Em uma modalidade, para a VH, o subgrupo é o subgrupo kappa III, conforme em Kabat et al., supra.

[00095] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos de CDRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em certos aspectos, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as CDRs correspondem às de um anticorpo não humano e todos ou substancialmente todos os FRs correspondem aos de um anticorpo humano.

Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, se refere a um anticorpo que passou por humanização.

[00096] O termo "região hipervariável" ou "HVR", tal como usado no presente documento, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência (também referidas neste documento como "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs") e/ou que formam alças estruturalmente definidas ("alças hipervariáveis") e/ou que contém os resíduos entram em contato com o antígeno ("contatos ao antígeno"). Salvo indicação em contrário, os resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados neste documento de acordo com Kabat et al., supra. Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs: três na VH (H1, H2, H3) e três na VL

(L1, L2, L3).

[00097] Um "imunoconjugado" refere-se a um anticorpo conjugado a uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, mas não se limitando a, um agente citotóxico.

[00098] Um "paciente" ou "indivíduo", conforme usado indistintamente neste documento, é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domésticos (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos, tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos).

Em certas modalidades, o indivíduo ou sujeito é um humano.

[00099] Um anticorpo “isolado” é um que foi separado de um componente do seu ambiente natural. Em certas modalidades, um anticorpo é purificado para mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado por, por exemplo, eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográfica (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão dos métodos para avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

[000100] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente do seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossal ou em uma localização cromossomal diferente da sua localização cromossomal natural.

[000101] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo” se refere a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo das cadeias pesadas e leves (ou fragmentos do mesmo), incluindo tal molécula

(ou moléculas) de ácido nucleico em um único vetor ou em vetores separados, e tal molécula (ou moléculas) de ácido nucleico presente em um ou mais locais em uma célula hospedeira.

[000102] O termo "molécula de ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" inclui qualquer composto e/ou substância que compreende um polímero de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto por uma base, especificamente uma base de purina ou pirimidina (ou seja, citosina (C), guanina (G), adenina (A), timina (T) ou uracila (U)), um açúcar (ou seja, desoxirribose ou ribose) e um grupo fosfato. Frequentemente, a molécula de ácido nucleico é descrita pela sequência de bases, em que as referidas bases representam a estrutura primária (estrutura linear) de uma molécula de ácido nucleico. A sequência de bases é normalmente representada de 5' a 3'. Neste documento, o termo molécula de ácido nucleico abrange ácido desoxirribonucleico (DNA) incluindo, por exemplo, DNA complementar (cDNA) e DNA genômico, ácido ribonucleico (RNA), em particular, RNA mensageiro (mRNA), formas sintéticas de DNA ou RNA e polímeros mistos compreendendo duas ou mais dessas moléculas. A molécula de ácido nucleico pode ser linear ou circular. Além disso, o termo molécula de ácido nucleico inclui fitas senso e antissenso, bem como formas de fita simples e de fita dupla. Além disso, a molécula de ácido nucleico descrita neste documento pode conter nucleotídeos de ocorrência natural ou não natural. Exemplos de nucleotídeos de ocorrência não natural incluem bases de nucleotídeos modificados com açúcares derivatizados ou ligações da espinha dorsal de fosfato ou resíduos quimicamente modificados. As moléculas de ácido nucleico também abrangem moléculas de DNA e RNA que são adequadas como um vetor para a expressão direta de um anticorpo da invenção in vitro e/ou in vivo, por exemplo, em um hospedeiro ou paciente. Tais vetores de DNA (por exemplo, cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA) podem ser não modificados ou modificados. Por exemplo, o mRNA pode ser modificado quimicamente para intensificar a estabilidade do vetor de RNA e/ou a expressão da molécula codificada para que o mRNA possa ser injetado em um sujeito para gerar o anticorpo in vivo (vide, por exemplo, Stadler et al., Nature Medicine 2017, publicado online em 12 de junho de 2017, doi: 10.1038/nm.4356 ou EP 2101823 B1).

[000103] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado no presente documento, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou surgindo durante a produção de uma preparação de um anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpos monoclonais é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser preparados por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando a, métodos de hibridomas, métodos de DNA recombinante, métodos de apresentação em fagos e métodos que usam animais transgênicos que contenham todos ou parte dos loci de imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplares para a preparação de anticorpos monoclonais sendo descritos neste documento.

[000104] Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo que não é conjugado com uma fração heteróloga (por exemplo, uma fração citotóxica) ou marcador radioativo. O anticorpo nu pode estar presente em uma composição farmacêutica.

[000105] “Anticorpos nativos” se referem às moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variáveis. Por exemplo, anticorpos de IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de

150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que estão ligadas por dissulfeto. A partir do N- para terminal C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio pesado variável ou um domínio variável de cadeia pesada, seguida por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Da mesma forma, a partir do N- para terminal C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio leve variável ou um domínio variável da cadeia leve, seguida por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a uma de dois tipos, chamadas kappa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante.

[000106] O termo "bula", conforme usado neste documento, refere-se a instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contra-indicações e/ou advertências relativas ao uso de tais produtos terapêuticos.

[000107] "Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação a uma sequência de polipeptídeos de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após o alinhamento das sequências e introdução das lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência para os fins do alinhamento. O alinhamento para fins de determinação do porcentual de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da perícia na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, tal como BLAST, BLAST-2, Clustal W, software Megalign (DNASTAR) ou o pacote de programas FASTA. Os técnicos no assunto podem determinar os parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas.

Alternativamente, os valores percentuais de identidade podem ser gerados usando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc., e o código-fonte foi arquivado com a documentação do usuário no US Copyright Office, Washington DC, 20559, onde está registrado sob o Copyright Registration dos EUA de nº TXU510087 e é descrito em WO 2001/007611.

[000108] A menos que indicado de outra forma, para fins neste documento, os valores da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa ggsearch do pacote FASTA versão 36.3.8c ou posterior com uma matriz de comparação BLOSUM50. O pacote do programa FASTA foi criado por WR Pearson e DJ Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85: 2444-2448; WR Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol.

266:227- 258; e Pearson et. al. (1997) Genomics 46: 24-36 e está publicamente disponível em www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml ou www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta. Alternativamente, um servidor público acessível em fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi pode ser usado para comparar as sequências, usando o programa ggsearch (proteína global:proteína) e opções padrão (BLOSUM50; abrir: -10; ext: -2; Ktup = 2) para garantir que um alinhamento global, em vez de local, seja executado. A porcentagem da identidade de aminoácidos é fornecida no cabeçalho de alinhamento de saída.

[000109] O termo “composição farmacêutica” se refere a uma preparação que está em tal forma que permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo contida seja eficaz e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a composição seria administrada.

[000110] Um “veículo farmaceuticamente aceitável”, conforme usado neste documento, refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, que não é tóxico a um paciente. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante.

[000111] Como usado no presente documento, “tratamento” (e suas variações gramaticais como “tratar” ou “que tratam”) se refere à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo a ser tratado, e pode ser realizada tanto para profilaxia quanto durante o curso de tratamento de patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção da metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão ou melhor prognóstico. Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação podem ser usados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença.

[000112] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais (FRs) conservadas e três regiões de determinação de complementaridade (CDRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007).) Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um determinado antígeno podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J.

Immunol. 150:880 a 887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624 a 628 (1991).

[000113] O termo “vetor”, como usado no presente documento, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar um outro ácido nucleico ao qual está ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos no presente documento como “vetores de expressão”.

II. ANTICORPOS

[000114] Em certas modalidades, a presente divulgação é baseada, em parte, em métodos de engenharia de anticorpos, por exemplo, anticorpos IgA e moléculas de fusão IgG-IgA, para exibir retenção de soro melhorada e para aumentar a produção de anticorpos poliméricos. Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação exibem ligação a FcRn. Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação exibem transcitose mediada por IgR aumentada. Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação exibem ligação reduzida e/ou nenhuma ligação ao FcαRI.

Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação podem fornecer segurança superior em um ambiente terapêutico, minimizando a resposta pró- inflamatória após a administração.

[000115] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece anticorpos, por exemplo, anticorpos IgA e moléculas de fusão IgG- IgA, que exibem retenção de soro melhorada. Por exemplo, sem limitação, os anticorpos da presente divulgação, por exemplo, anticorpos IgA e moléculas de fusão IgG-IgA Fc, são estáveis no plasma por até cerca de 1 dia, até cerca de 2 dias, até cerca de 3 dias, até cerca de 4 dias ou até cerca de 5 dias. Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação, por exemplo, anticorpos IgA e moléculas de fusão IgG-IgA, são estáveis no plasma por até cerca de 4 dias.

[000116] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece anticorpos, por exemplo, anticorpos IgA e moléculas de fusão IgG- IgA, que têm glicosilação reduzida ou nenhuma glicosilação. Por exemplo, não como limitação, os anticorpos da presente divulgação exibem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de redução na glicosilação em comparação com IgA não modificada ou moléculas de fusão IgG-IgA não modificadas. Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação são menos do que cerca de 0,5%, menos do que cerca de 1%, menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 5% glicosilado, menos do que cerca de 10% glicosilado, menos do que cerca de 20% glicosilado, menos do que cerca de 30% glicosilado ou menos do que cerca de 40% glicosilado. Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação têm 0% de glicosilação, ou seja, são aglicosilados.

A. ANTICORPOS EXEMPLARES

1. VARIANTES DE ANTICORPO IGA

[000117] A presente divulgação fornece anticorpos IgA, por exemplo, anticorpos IgA1, IgA2m1, IgA2m2 e IgA2mn, que foram modificados para diminuir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A deleção dos locais de glicosilação de um anticorpo pode ser realizada alterando a sequência de aminoácidos do anticorpo de modo que um ou mais locais de glicosilação sejam removidos. Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser modificado para remover um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou seis ou mais locais de glicosilação, por exemplo, locais de glicosilação ligados a N e/ou locais de glicosilação ligados a O.

[000118] Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser modificado para remover um ou mais dos motivos de glicosilação NXS/T, onde X é qualquer aminoácido. Em certas modalidades, a remoção de um local de glicosilação ligado a N pode incluir a modificação, por exemplo, mutação, de um ou mais aminoácidos presentes no motivo do local de glicosilação. Por exemplo, mas não como limitação, o aminoácido N, X e/ou S/T pode ser modificado, por exemplo, mutado, no motivo do local de glicosilação. Em certas modalidades, todos os três aminoácidos do motivo podem ser mutados.

[000119] Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser modificado para remover um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais locais de glicosilação do domínio constante da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, um anticorpo da presente divulgação pode ser modificado para remover um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou todos os 4 locais de glicosilação ligados a N nos aminoácidos 166, 211, 263 e/ou 337 do domínio constante da cadeia pesada. Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser modificado para remover um ou mais locais de glicosilação no arremate da cadeia pesada (ver Figura 1A). Por exemplo, mas não como limitação, um anticorpo da presente divulgação pode ser modificado para remover o local de glicosilação ligada a N no aminoácido 459 do arremate da cadeia pesada. Em certas modalidades, um anticorpo IgA1 da presente divulgação pode ser modificado para remover um ou mais locais de glicosilação ligados a N nos aminoácidos 263 e/ou 449. Em certas modalidades, um anticorpo IgA2m1 da presente divulgação pode ser modificado para remover um ou mais locais de glicosilação ligados a N nos aminoácidos 166, 263, 337 e/ou 449. Em certas modalidades, um anticorpo IgA2m2 ou IgA2mn da presente divulgação pode ser modificado para remover um ou mais locais de glicosilação ligados a N nos aminoácidos 166, 211, 263, 337 e/ou 449. Em certas modalidades, um anticorpo pode ser modificado para remover todos os locais de glicosilação ligados a N da cadeia pesada do anticorpo, incluindo o domínio constante da cadeia pesada e o arremate.

[000120] Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser aglicosilado. Por exemplo, mas não como limitação, um anticorpo aglicosilado da presente divulgação é um anticorpo que não tem glicosilação na cadeia pesada do anticorpo, incluindo a região constante da cadeia pesada e o arremate. Em certas modalidades, um anticorpo aglicosilado da presente divulgação é um anticorpo que não tem glicosilação na cadeia pesada, incluindo a região constante da cadeia pesada e o arremate, e nenhuma glicosilação na cadeia J.

[000121] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um anticorpo IgA que tem um ou mais, dois ou mais, três ou mais,

quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais ou doze modificações, por exemplo, substituições, nos aminoácidos 166, 168, 211, 212, 213, 263, 265, 337, 338, 339, 459 e/ou 461 para reduzir a glicosilação do anticorpo IgA. Por exemplo, mas não como limitação, a presente divulgação fornece um anticorpo IgA que tem um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais ou doze modificações, por exemplo, substituições, nos aminoácidos N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459 e/ou S461 para reduzir a glicosilação do anticorpo IgA.

[000122] Em certas modalidades, um anticorpo IgA1 da presente divulgação tem uma ou mais, duas ou mais, três ou mais ou quatro modificações nos aminoácidos 263, 265, 459 e/ou 461, por exemplo, nos aminoácidos N263, T265, N459 e/ou S461. Em certas modalidades, um anticorpo IgA2m1 da presente divulgação tem uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais ou oito modificações nos aminoácidos 166, 168, 263, 265, 337, 338, 339, 459 e/ou 461, por exemplo, nos aminoácidos N166, T168, N263, T265, N337, I338, T339, N459 e/ou S461. Em certas modalidades, um anticorpo IgA2m2 ou IgA2mn da presente divulgação tem um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais ou doze modificações nos aminoácidos 166, 168, 211, 212, 213, 263, 265, 337, 338, 339, 459 e/ou 461, por exemplo, nos aminoácidos N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459 e/ou S461. Em certas modalidades, um anticorpo IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn da presente divulgação é modificado em todos os três aminoácidos 337, 338 e 339, por exemplo, nos aminoácidos N337, I338 e T339.

[000123] Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, tem uma modificação no aminoácido N166. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, tem uma modificação no aminoácido N168. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA2m2 ou IgA2mn, tem uma modificação no aminoácido S211. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA2m2 ou IgA2mn, tem uma modificação no aminoácido S212. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA2m2 ou IgA2mn, tem uma modificação no aminoácido S213. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, tem uma modificação no aminoácido N263. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, tem uma modificação no aminoácido N265. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, tem modificações nos três aminoácidos N337, I338 e T339. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, tem uma modificação no aminoácido N459. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, tem uma modificação no aminoácido S461.

[000124] Em certas modalidades, o aminoácido N pode ser mutado para um aminoácido A, G ou Q. Em certas modalidades, o aminoácido S pode ser mutado para um aminoácido A. Em certas modalidades, o aminoácido T pode ser mutado para um aminoácido A. Em certas modalidades, um anticorpo IgA da presente divulgação, por exemplo, anticorpo IgA2m2 ou IgA2mn, da presente divulgação pode ser modificado para compreender um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais ou todas as sete das seguintes mutações N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S e N459Q. Por exemplo, mas não como limitação, um anticorpo IgA1 da presente divulgação pode ser modificado para compreender uma ou mais ou todas as duas mutações N263Q e N459Q a seguir. Em certas modalidades, um anticorpo IgA2m1 da presente divulgação pode ser modificado para compreender um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou todas as seis das seguintes mutações N166A, N263Q, N337T, I338L, T339S e N459Q. Em certas modalidades, um anticorpo IgA2m2 ou IgA2mn da presente divulgação pode ser modificado para compreender um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais ou todas as sete das seguintes mutações N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S e N459Q.

[000125] Em certas modalidades, uma cadeia J de um anticorpo da presente divulgação pode ser modificada para remover um ou mais locais de glicosilação. Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser modificado para remover o local de glicosilação ligada a N no aminoácido 49 da cadeia J, por exemplo, modificando um ou mais aminoácidos do motivo do local de glicosilação, que abrange os aminoácidos 49, 50 e 51. Por exemplo, sem limitação, o aminoácido N49 e/ou o aminoácido S51 da cadeia J podem ser modificados. Em certas modalidades, o aminoácido N pode ser mutado para um aminoácido A, G ou Q e/ou o aminoácido S pode ser mutado para um aminoácido A. Por exemplo, sem limitação, uma cadeia J de um anticorpo da presente divulgação pode compreender uma mutação N49A/G/Q e/ou uma mutação S51A. Em certas modalidades, uma cadeia J de um anticorpo da presente divulgação pode compreender uma mutação N49Q.

[000126] Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser modificado para remover um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais locais de glicosilação da cadeia pesada e modificado para remover um local de glicosilação do J cadeia. Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação tem um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais ou doze modificações, por exemplo, substituições, nos aminoácidos N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459 e/ou S461 da cadeia pesada e uma ou duas modificações, por exemplo, substituições, nos aminoácidos N49 e/ou S51 da cadeia J. Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação tem um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais ou todas as sete modificações, por exemplo, substituições, nos aminoácidos N166, S212, N263, N337, I338, T339 e/ou N459 da cadeia pesada e uma ou duas modificações, por exemplo, substituições, nos aminoácidos N49 e/ou S51 da cadeia J.

[000127] Em certas modalidades, um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, da presente divulgação pode ter uma ou mais modificações nos aminoácidos N459 ou S461 para reduzir a glicosilação do anticorpo IgA. Em certas modalidades, uma modificação do aminoácido N459 e/ou S461 resulta em um anticorpo com uma capacidade aumentada de gerar polímeros, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros e pentâmeros.

[000128] Em certas modalidades, os anticorpos, por exemplo, anticorpos IgA, da presente divulgação podem ter uma modificação, por exemplo, substituição, no aminoácido 458. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece anticorpos IgA1, IgA2m1 e IgA2mn que têm uma substituição no aminoácido V458. Em certas modalidades, o aminoácido V458 pode ser mutado para uma isoleucina (ou seja, V458I). Em certas modalidades, a presente divulgação fornece anticorpos IgA2m2 que têm uma substituição no aminoácido I458. Em certas modalidades, o aminoácido I458 pode ser mutado para uma valina (isto é, I458V). Em certas modalidades, uma ou mais dessas modificações podem estar presentes em um anticorpo que tem glicosilação reduzida ou nenhuma glicosilação, conforme descrito neste documento.

[000129] Em certas modalidades, os anticorpos, por exemplo, anticorpos IgA, da presente divulgação podem ter uma modificação, por exemplo, substituição, no aminoácido C471 e/ou C311. Em certas modalidades, um anticorpo IgA pode ter uma mutação no aminoácido C471, por exemplo, C471S. Em certas modalidades, um anticorpo IgA pode ter uma mutação no aminoácido C311, por exemplo, C311S.

[000130] Em certas modalidades, as modificações de um anticorpo da presente divulgação podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas. Por exemplo, mas não como limitação, um anticorpo da presente divulgação que tem glicosilação reduzida pode exibir retenção de soro melhorada. Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação que tem glicosilação reduzida pode ter uma capacidade aumentada para gerar polímeros, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros e pentâmeros. Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação que tem glicosilação reduzida pode exibir ligação reduzida ao receptor hFc específico de IgA, FcαRI, por exemplo, nenhuma ligação a FcαRI. Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação que tem uma modificação no aminoácido 458, 459 e/ou S461 tem uma capacidade aumentada para gerar polímeros, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros e pentâmeros, em comparação com um anticorpo que não tem uma das modificações. Em certas modalidades, um anticorpo divulgado no presente documento que tem uma modificação no aminoácido C471 tem uma capacidade diminuída de gerar polímeros, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros e pentâmeros.

2. MOLÉCULAS DE FUSÃO IGG-IGA

[000131] A presente divulgação fornece ainda anticorpos que compreendem pelo menos uma porção de um anticorpo IgG e pelo menos uma porção de um anticorpo IgA, referido no presente documento como moléculas de fusão IgG-IgA. Em certas modalidades, as moléculas de fusão IgG-IgA da presente divulgação aumentaram a resistência à protease, por exemplo, furina, atividade e/ou meia-vida sérica aumentada (vide Tabela 9). Em certas modalidades, as moléculas de fusão IgG-IgA da presente divulgação se ligam a FcRn.

[000132] Em certas modalidades, o anticorpo IgG de uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode ser um anticorpo IgG de comprimento total. Em certas modalidades, o anticorpo IgG pode ser qualquer anticorpo IgG que se liga ao receptor Fc neonatal (FcRn). Por exemplo, mas não como limitação, o anticorpo IgG pode ser IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo IgG é um anticorpo IgG1. Em certas modalidades, o anticorpo IgG é um anticorpo IgG2. Em certas modalidades, o anticorpo IgG é um anticorpo IgG3. Em certas modalidades, o anticorpo IgG é um anticorpo IgG4.

[000133] Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode incluir um anticorpo IgG fundido a um fragmento de um anticorpo IgA. Em certas modalidades, o anticorpo IgA pode ser um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2mn ou IgA2m2. Em certas modalidades, o fragmento de IgA pode ter cerca de 300 aminoácidos de comprimento, cerca de 250 aminoácidos de comprimento, cerca de 200 aminoácidos de comprimento, cerca de 150 aminoácidos de comprimento, cerca de 100 aminoácidos de comprimento, cerca de 80 aminoácidos de comprimento, cerca de 60 aminoácidos de comprimento, cerca de 40 aminoácidos de comprimento ou cerca de 20 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades, o fragmento de IgA tem cerca de 250 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades, o fragmento de IgA tem cerca de 20 aminoácidos, por exemplo, cerca de 18 aminoácidos, de comprimento. Por exemplo, mas não como limitação, o fragmento de IgA pode incluir a região Fc do anticorpo IgA. Em certas modalidades, o fragmento de IgA pode incluir os domínios CH2 e CH3 do anticorpo IgA. Em certas modalidades, o fragmento de IgA pode incluir ainda a região de dobradiça de um anticorpo IgA. Em certas modalidades, o fragmento de IgA pode incluir ainda o arremate de um anticorpo IgA.

[000134] Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode incluir um anticorpo IgG e uma região Fc de um anticorpo IgA. Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA pode incluir um anticorpo IgG fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, divulgado neste documento. Por exemplo, mas não como limitação, uma molécula de fusão IgG-IgA pode incluir sequências de cadeia pesada de IgG de comprimento total fundidas em seu terminal C a uma região Fc de uma cadeia pesada de IgA (ver Figuras 7B, 12 e 34A).

[000135] Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de P221 até o terminal C da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, a porção do anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos P221-Y472 de um anticorpo IgA. Em certas modalidades, a região Fc do anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1 ou IgA2m1, pode compreender a sequência de P221 até o terminal C da cadeia pesada. Em certas modalidades, o aminoácido P221 pode ser mutado para uma arginina (R), ou seja, P221R. Em certas modalidades, a região Fc do anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA2m2 ou IgA2mn, pode compreender a sequência de R221 até o terminal C da cadeia pesada, por exemplo, pode incluir os aminoácidos R221-Y472 de um anticorpo IgA. Alternativamente, a região Fc do anticorpo IgA pode compreender a sequência de C242 através do terminal C da cadeia pesada, que deleta a região de dobradiça do anticorpo IgA. Por exemplo, mas não como limitação, a porção IgA da molécula de fusão pode incluir os aminoácidos C242-Y472 de um anticorpo IgA. Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de V222 através do terminal C da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, a porção do anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos V222-Y472 de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2mn ou IgA2m2. Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de P223 até o terminal C da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, a porção do anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos P223-Y472 de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2mn ou IgA2m2. Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de C241 até o terminal C da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, a porção do anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos C241-Y472 de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn.

[000136] Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de P237 até o terminal C da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, a porção do anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos P237-Y472 de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2mn ou IgA2m2. Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de P238 até o terminal C da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, a porção do anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos P238-Y472 de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo

IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn. Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de S238 através do terminal C da cadeia pesada.

Por exemplo, mas não como limitação, a porção do anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos S238-Y472 de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1. Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de P239 até o terminal C da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, a porção de anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos P239-Y472 de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn.

Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de P240 através do terminal C da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, a porção do anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos P240-Y472 de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn. Em certas modalidades, a porção de IgA, por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgA, da molécula de fusão pode compreender a sequência de S240 até o terminal C da cadeia pesada. Por exemplo, mas não como limitação, a porção do anticorpo IgA pode incluir os aminoácidos S240 de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1. Em certas modalidades, a porção de IgA da molécula de fusão não inclui a arremate de um anticorpo IgA, por exemplo, os aminoácidos 454-472.

[000137] Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode incluir uma região Fc de um isotipo IgA e uma região de dobradiça de um segundo isotipo. Por exemplo, mas não como limitação, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode incluir uma região de dobradiça de uma IgA2, por exemplo, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, anticorpo e incluir uma região Fc de um anticorpo IgA1.

[000138] Em certas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo IgG foi modificada para remover o aminoácido lisina terminal C, por exemplo, aminoácido K447 de um anticorpo IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Por exemplo, mas não como limitação, a presente divulgação fornece uma molécula de fusão IgG-IgA que inclui um anticorpo IgG que não possui o aminoácido K447 e uma porção de IgA que inclui os aminoácidos P221-Y472 ou R221-Y472 de um anticorpo IgA.

[000139] Em certas modalidades, a união entre o anticorpo IgG e a região Fc do anticorpo IgA pode compreender a sequência de aminoácidos TQKSLSLSPGPVPPPPPCC (SEQ ID NO: 1) ou um fragmento do mesmo ou suas substituições conservativas. Em certas modalidades, a união entre o anticorpo IgG e a região Fc do anticorpo IgA pode compreender a sequência de aminoácidos TQKSLSLSPGC (SEQ ID NO: 2) ou um fragmento do mesmo ou suas substituições conservativas. Exemplos não limitativos de substituições conservativas são fornecidos na Tabela 1. Em certas modalidades, a união entre o anticorpo IgG e a região Fc do anticorpo IgA pode compreender uma sequência de aminoácidos conforme divulgado na Figura 34A.

[000140] Em certas modalidades, as fusões de IgG-IgA Fc da presente divulgação são estáveis no plasma por até cerca de 1 dia, até cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, até cerca de 4 dias ou até cerca de 5 dias. Por exemplo, mas não como limitação, as fusões IgG1-IgA Fc da presente divulgação são estáveis no plasma por até cerca de 4 dias.

[000141] Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode incluir ainda uma ou mais substituições de aminoácidos, conforme descrito acima, para reduzir a glicosilação. Por exemplo, mas não como limitação, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode ser modificada para remover a glicosilação da cadeia pesada do anticorpo IgA e/ou a cadeia J da molécula de fusão IgG-IgA. Em certas modalidades, o anticorpo IgA da molécula de fusão IgG-IgA é aglicosilado. Em certas modalidades, as moléculas de fusão IgG-IgA da presente divulgação se ligam a FcRn, mas não se ligam a FcαRI.

[000142] Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode incluir ainda uma substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329. Por exemplo, mas não como limitação, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode incluir ainda uma substituição no aminoácido 297, por exemplo, N297G.

[000143] Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode incluir ainda uma substituição no aminoácido C471 e/ou C311. Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA da presente divulgação pode ter uma mutação no aminoácido C471, por exemplo, C471S. Em certas modalidades, uma molécula de fusão IgG-IgA Fc da presente divulgação pode ter uma mutação no aminoácido C311, por exemplo, C311S.

B. ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS

[000144] Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na patente dos EUA de nº 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Em certas modalidades, um anticorpo quimérico da presente divulgação compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe trocada” em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno.

[000145] Em certas modalidades, um anticorpo quimérico da presente divulgação pode ser um anticorpo humanizado. Normalmente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, enquanto retém a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais HVRs, por exemplo, CDRs (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano e FRs (ou porções das mesmas) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou a afinidade do anticorpo.

[000146] Anticorpos humanizados e métodos para fabricá-los são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619- 1633 (2008), e são descritos adicionalmente, por exemplo, em Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); Patentes dos EUA de nºs 5.821.337, 7.527.791,

6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods, 36:25-34 (2005) (descrevendo o enxerto da região determinante da especificidade (SDR)); Padlan, Mol.

Immunol., 28:489-498 (1991) (descrevendo "ressurgimento"); Dall'Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005) (descrevendo "embaralhamento de FR"); e Osbourn et al., Methods, 36:61-68 (2005) e Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de “seleção guiada” para embaralhamento de FR).

[000147] As regiões estruturais humanas que podem ser usadas para humanização incluem, sem limitação: regiões estruturais selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (vide, por exemplo, Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); e Presta et. al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiões estruturais maduras (mutadas somaticamente) humanas ou regiões estruturais da linhagem germinativa humana (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem., 272: 10678 a 10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem., 271:22611 a 22618 (1996)).

C. ANTICORPOS HUMANOS

[000148] Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin.

Pharmacol. 5:368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).

[000149] Os anticorpos humanos podem ser preparados por administrar um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais normalmente contêm todos ou uma porção dos loci de imunoglobulina humana, que substituem os loci de imunoglobulina endógena, ou que estão presentes de forma extracromossomical ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Em tais camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulina endógena geralmente foram inativados. Para uma revisão de métodos para obter anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, Nat.

Biotech. 23:1117-1125 (2005). Vide também, por exemplo, as patentes dos EUA de nº 6.075.181 e 6.150.584, que descrevem a tecnologia XENOMOUSETM; patente dos EUA de nº 5.770.429, que descreve a tecnologia HUMAB®; patente dos EUA de nºs 7.041.870, que descreve a tecnologia K-M MOUSE® e Publicação de Pedido de Patente dos EUA de nº 2007/0061900, que descreve a tecnologia VELOCIMOUSE®). As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos geradas por tais animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, através da combinação com uma região constante humana diferente.

[000150] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos à base de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas. (Vide, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991).) Anticorpos humanos gerados por meio de tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006).

Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente dos EUA de nº 7.189.826 (descrevendo a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhas celulares de hibridoma) e em Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (descrevendo hibridomas humano-humano).

A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia Trioma) é também descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927 a 937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

[000151] Os anticorpos humanos também podem ser gerados isolando sequências de domínio variável de clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição em fago derivadas de humanos. Essas sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas para a seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.

D. VARIANTES DE ANTICORPO

[000152] A matéria presentemente divulgada fornece ainda variantes de sequência de aminoácidos dos anticorpos divulgados. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas introduzindo modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou por síntese de peptídeos. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o anticorpo final, ou seja, modificado, possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.

1. VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E EXCLUSÃO

[000153] Em certas modalidades, variantes de anticorpo podem ter uma ou mais substituições de aminoácidos. Locais de interesse para a mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1, sob o título "substituições preferidas". Exemplos não limitantes de mudanças mais substanciais são fornecidos na Tabela 1 sob o título de "substituições exemplares" e conforme descrito abaixo em referência às classes de cadeia lateral de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/melhorada, imunogenicidade diminuída, citotoxicidade dependente de complemento melhorada (CDC) ou citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC).

TABELA 1. Resíduo Substituições Substituições Original Preferidas Preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

[000154] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com propriedades comuns de cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação de cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[000155] Em certas modalidades, as substituições não conservativas implicarão na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[000156] Em certas modalidades, um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental, por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano. Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para estudo posterior terá(ão) modificações, por exemplo, melhorias, em certas propriedades biológicas, tais como, mas não se limitando a, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida, em relação ao anticorpo parental e/ou terá(ão) substancialmente retido certas propriedades biológicas do anticorpo original. Um exemplo não limitante de uma variante substitucional é um anticorpo amadurecido por afinidade, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação por afinidade baseadas em exibição em fago, tais como aquelas descritas neste documento. Em suma, um ou mais resíduos de HVR são mutados, os anticorpos variantes são exibidos no fago e rastreados para uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação).

[000157] Em certas modalidades, alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em "pontos de acesso" de HVR, ou seja, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (vide, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), e/ou resíduos que entram em contato com o antígeno, com a VH ou VL variante resultante sendo testada quanto à afinidade de ligação. A maturação por afinidade por construção e resseleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al., em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). Em certas modalidades de maturação por afinidade, a diversidade pode ser introduzida nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erros, embaralhamento de cadeia ou mutagênese direcionada por oligonucleotídeo). É então criada uma biblioteca secundária. A biblioteca é então rastreada para identificar quaisquer variantes de anticorpo com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, nas quais vários resíduos de HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de cada vez) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando mutagênese ou modelagem de varredura de alanina.

CDR-H3 e CDR-L3 em particular são frequentemente direcionadas.

[000158] Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs, desde que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade de o anticorpo se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas como fornecidas neste documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs.

Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos que entram em contato com o antígeno nas HVRs. Em certas modalidades da variante de sequências de VH e VL fornecidas acima, cada HVR é inalterada, ou não contém mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[000159] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina", como descrito por Cunningham e Wells, (1989), Science, 244:1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições iniciais.

Alternativamente, ou adicionalmente, é fornecida uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[000160] As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carbóxi-terminais que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrasequência de um ou vários resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila terminal N. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para terapia dirigida por anticorpo-enzima-pró-fármaco (ADEPT)) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.

2. VARIANTES DA REGIÃO FC

[000161] Em certas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido neste documento, gerando assim uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.

[000162] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece uma variante de anticorpo que apresenta algumas funções efetoras, mas não todas, o que a torna uma candidata desejável para aplicações nas quais a meia-vida do anticorpo in vivoé importante, mas algumas funções efetoras (como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais.

Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser realizados para confirmar a redução/depleção das atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação ao receptor Fc (FcR) podem ser realizados para garantir que o anticorpo não possua ligação ao receptor hFc específico de IgA, ou seja, FcαRI, mas mantém a capacidade de ligação a FcRn. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está em suma na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991). Por exemplo, as células primárias para mediar células ADCC e NK expressam somente FcγRIII, enquanto os monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente dos EUA de nº 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); Patente dos EUA de nº 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med., 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (vide, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI TM para citometria de fluxo (Cell Technology, Inc. Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativa CYTOTOX 96® (Promega, Madison, WI). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:652-656 (1998). Os ensaios de ligação a C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, não possui atividade CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, MS et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, MS e MJ Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). A ligação a FcRn e as determinações de eliminação/meia-vida in vivo também podem ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova, SB et al., Int'l. Immunol.

18(12):1759-1769 (2006)). Em certas modalidades, as alterações podem ser feitas na região Fc que resulta na ligação a C1q alterada (ou seja, melhorada ou diminuída) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente dos EUA de nº 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).

[000163] Os anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente dos EUA de nº 6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o denominado mutante Fc "DANA" com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente dos EUA de nº 7.332.581).

[000164] Certas variantes de anticorpo com ligação melhorada ou diminuída aos FcRs são descritas. Vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 6.737.056; WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem., 9(2):6591-6604 (2001).

[000165] Em certas modalidades, uma variante de anticorpo da presente divulgação compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração da UE de resíduos).

[000166] Em certas modalidades, a alteração feita na região Fc de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo biespecífico, divulgado aqui, pode produzir um anticorpo variante com meia-vida aumentada e ligação melhorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos em US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições na mesma, o que melhora a ligação da região Fc a FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição de resíduo 434 da região Fc (Patente dos EUA de nº

7.371.826).

[000167] Vide também Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente dos EUA de nº 5.648.260; Patente dos EUA de nº 5.624.821; e WO 94/29351 relativo a outros exemplos de variantes da região Fc.

3. VARIANTES DE ANTICORPO MANIPULADAS COM CISTEÍNA

[000168] Em certas modalidades, pode ser desejável criar anticorpos projetados com cisteína, por exemplo, "tioMAbs", em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em modalidades particulares, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis do anticorpo. Ao substituir esses resíduos por cisteína, os grupos tiol reativos são posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras frações, tais como frações de fármaco ou frações de ligante-fármaco, para criar um imunoconjugado, conforme descrito mais adiante neste documento. Em certas modalidades, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração da EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração da EU) da região Fc de cadeia pesada.

Os anticorpos projetados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na Patente dos EUA de nº 7.521.541.

4. DERIVADOS DE ANTICORPO

[000169] Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação podem ser ainda modificados para conter frações não proteicas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As porções adequadas para derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona) polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. O propionaldeído de polietilenoglicol pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se mais do que um polímero estiver ligado, podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a serem melhoradas, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.

[000170] Em certas modalidades, são fornecidos conjugados de um anticorpo e fração não proteica que podem ser seletivamente aquecidos por exposição à radiação. Em uma modalidade, a fração não proteica é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). Em certas modalidades, a radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e inclui, mas não está limitada a, comprimentos de onda que não prejudicam as células comuns, mas que aquecem a fração não proteica a uma temperatura na qual as células próximas à fração não proteica do anticorpo são mortas.

5. IMUNOCONJUGADOS

[000171] A matéria presentemente divulgada também fornece imunoconjugados os quais incluem um anticorpo, divulgado neste documento, conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterápicos ou fármacos, agentes inibidores de crescimento, proteínas, peptídeos, toxinas (por exemplo, toxinas de proteínas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas) ou isótopos radioativos. Por exemplo, um anticorpo da matéria divulgada pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou por outra forma) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação.

[000172] Em certas modalidades, um imunoconjugado é um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) no qual um anticorpo da presente divulgação é conjugado a um ou mais fármacos, incluindo, mas não se limitando a, um maitansinóide (vide Patentes dos EUA de nºs 5.208.020,

5.416.064 e Patente Europeia EP 0 425 235 B1); uma auristatina, tal como frações de fármacos DE e DF de monometilauristatina (MMAE e MMAF) (vide Patentes dos EUA de nºs 5.635.483 e 5.780.588, e 7.498.298); uma dolastatina; uma caliqueamicina ou derivado da mesma (vide Patentes dos EUA de nºs 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710,

5.773.001 e 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); e Lode et al., Cancer Res., 58:2925-2928 (1998)); uma antraciclina, tal como daunomicina ou doxorrubicina (vide Kratz et al., Current Med. Chem., 13:477- 523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters, 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem., 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters, 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem., 45:4336-4343 (2002); e Patente dos EUA de nº 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano, tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; um tricoteceno; e CC1065.

[000173] Em certas modalidades, um imunoconjugado inclui um anticorpo conforme descrito no presente documento conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento da mesma, incluindo, mas não se limitando a, cadeia A da difteria, fragmentos ativos não vinculativos da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A de abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas dianthin, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

[000174] Em certas modalidades, um imunoconjugado inclui um anticorpo, como descrito neste documento, conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Os exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando um radioconjugado é usado para detecção, ele pode incluir um átomo radioativo para estudos cintilográficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou um marcador de rotação para imagem por ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagem por ressonância magnética, mri), tal como iodo -123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio- 15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

[000175] Os conjugados de um fragmento de anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional, tais como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditio) (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N- maleimidometil) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como HCl de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como hexanodiamina de bis(p-azidobenzoil)), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), di- isocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis- ativos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapenta-acético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionuclotídeos ao anticorpo. Vide WO 94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" facilitando a liberação de um fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante lábil a ácidos, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetílico ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res., 52:127-131 (1992); Patente dos EUA de nº

5.208.020) podem ser usados. Exemplos não limitativos de ligantes são divulgados acima.

[000176] Os imunuoconjugados divulgados neste documento expressamente contemplam, mas não estão limitados a, tais conjugados preparados com reagentes de reticulação incluindo, mas não se limitando a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).

III. MÉTODOS PARA PRODUZIR E PURIFICAR ANTICORPOS A. MÉTODOS PARA PRODUZIR ANTICORPOS

[000177] Os anticorpos divulgados aqui podem ser produzidos usando qualquer técnica disponível ou conhecida na técnica. Por exemplo, mas não como forma de limitação, os anticorpos podem ser produzidos usando métodos e composições recombinantes, por exemplo, como descrito na Patente dos EUA de nº 4.816.567. Os procedimentos detalhados para gerar os anticorpos da presente divulgação, por exemplo, anticorpos IgA e moléculas de fusão IgG-IgA, são descritos nos Exemplos abaixo.

[000178] A matéria presentemente divulgada fornece ainda um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo divulgado neste documento. Por exemplo, o ácido nucleico isolado pode codificar uma sequência de aminoácidos que codifica um anticorpo aglicosilado da presente divulgação. Em certas modalidades, um ácido nucleico isolado da presente divulgação pode codificar uma sequência de aminoácidos que codifica um anticorpo IgA que foi modificado para remover um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou seis ou mais locais de glicosilação, por exemplo, locais de glicosilação ligada a N e/ou locais de glicosilação ligada a O. Em certas modalidades, um ácido nucleico isolado da presente divulgação pode codificar uma sequência de aminoácidos que codifica um anticorpo IgA que tem um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais ou doze modificações, por exemplo, substituições, nos aminoácidos N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459 e/ou S461. Em certas modalidades, um ácido nucleico isolado da presente divulgação pode codificar uma sequência de aminoácidos que codifica uma molécula de fusão IgG-IgA, por exemplo, molécula de fusão IgG-IgA Fc, divulgada neste documento.

[000179] Em certas modalidades, o ácido nucleico pode estar presente em um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão.

Conforme usado neste documento, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada.

Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, portanto, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores, vetores de expressão, são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos (vetores). No entanto, a matéria divulgada se destina a incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus com replicação defeituosa, adenovírus e vírus adeno-associados) que servem a funções equivalentes.

[000180] Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica um anticorpo da presente divulgação e/ou um ou mais vetores, incluindo o ácido nucleico, pode ser introduzido em uma célula hospedeira. Em certas modalidades, a introdução de um ácido nucleico em uma célula pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas não se limitando a, transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção com um vetor viral ou bacteriófago, contendo as sequências de ácido nucleico, fusão de células, transferência de genes mediada por cromossomos, transferência de genes mediada por microcélulas, fusão de esferoplastos, etc. Em certas modalidades, uma célula hospedeira pode incluir, por exemplo, ter sido transformada com (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de ácido que compreende a cadeia leve do anticorpo, uma sequência de aminoácidos que compreende a cadeia pesada do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a cadeia J do anticorpo; (2) (a) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a cadeia leve do anticorpo e uma sequência de aminoácidos compreendendo a cadeia pesada do anticorpo e (b) um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a cadeia J do anticorpo; ou (3) (a) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a cadeia leve do anticorpo, (b) um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a cadeia pesada do anticorpo e (c) um terceiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a cadeia J do anticorpo. Em certas modalidades, uma célula hospedeira pode incluir, por exemplo, ter sido transformada com, (a) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a cadeia leve do anticorpo, (b) um segundo vetor que compreende um ácido nucleico ácido que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a cadeia pesada do anticorpo, (c) um terceiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a cadeia J do anticorpo e (d) um quarto vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um aminoácido que compreende o componente secretor do anticorpo.

[000181] Em certas modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula 293, por exemplo, célula Expi293.

[000182] Em certas modalidades, os métodos para produzir um anticorpo da presente divulgação incluem a cultura de uma célula hospedeira, na qual um ou mais ácidos nucleicos que codificam o anticorpo foram introduzidos, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo da célula hospedeira e/ou meio de cultura da célula hospedeira. Em certas modalidades, o anticorpo é recuperado da célula hospedeira por meio de técnicas de cromatografia.

[000183] Para a produção recombinante de um anticorpo da presente divulgação, um ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, como descrito acima, pode ser isolado e inserido em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Tal ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeos que têm capacidade de especificamente se ligarem a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).

[000184] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas descritas neste documento. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, Patentes dos EUA de nº 5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523. (Vide também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli.) Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser posteriormente purificado.

[000185] Além de procariotas, micróbios eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam anticorpos, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com uma padrão de glicosilação total ou parcialmente humano. Vide Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); e Li, H. et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006). As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados também podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados).

Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insetos.

Numerosas cepas de baculovirais foram identificadas, as quais podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[000186] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insetos. Numerosas cepas de baculovirais foram identificadas, as quais podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[000187] Em certas modalidades, as culturas de células vegetais podem ser usadas como células hospedeiras. Consulte, por exemplo, as Patentes no US 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para produzir anticorpos em plantas transgênicas).

[000188] Em certas modalidades, as células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, e não como forma de limitação, as linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Os exemplos não limitantes de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293, como descrito, por exemplo, em Graham et al., J.

Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4, conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais caninas (MDCK; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.

383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhas celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); e linhas celulares de mieloma, como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki, P. e Wu,

A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

[000189] Em certas modalidades, um sistema animal pode ser usado para produzir um anticorpo da presente divulgação. Um sistema animal para a preparação de hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido.

Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos (vide, por exemplo, Harlow e Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York).

1. MÉTODOS PARA PRODUZIR IGA POLIMÉRICA

[000190] A presente divulgação fornece métodos para produzir IgA polimérica. Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação podem ser usados para produzir polímeros de IgA que contêm dois ou mais monômeros de IgA, por exemplo, de cerca de dois a cerca de cinco monômeros de IgA. Por exemplo, mas não como limitação, os métodos da presente divulgação podem ser usados para produzir dímeros, trímeros, tetrâmeros e/ou pentâmeros de IgA. Em certas modalidades, tais métodos incluem alterar a proporção da quantidade de DNA que codifica a cadeia J para a quantidade de DNA que codifica a cadeia leve (LC) e/ou cadeia pesada (HC) que é introduzida, por exemplo, transfectada, em uma célula. Em certas modalidades, tais métodos incluem alterar a proporção da quantidade de DNA que codifica a cadeia J para a quantidade de DNA que codifica a LC, HC e componente secretor (SC) que é introduzido, por exemplo, transfectado, em uma célula.

[000191] A presente divulgação fornece métodos para aumentar a produção de dímeros de IgA. Em certas modalidades, o método para aumentar a produção de dímeros de IgA inclui aumentar a quantidade de DNA que codifica a cadeia J que é introduzida, por exemplo, transfectada, em uma célula em relação à quantidade de DNA que codifica a cadeia leve e a cadeia pesada. Em certas modalidades, a expressão aumentada é relativa à quantidade de dímeros de IgA produzidos em uma célula introduzida, por exemplo, transfectada, com quantidades iguais de DNA de cadeia J, cadeia pesada e cadeia leve. Por exemplo, mas não como limitação, os métodos podem ser usados para produzir dímeros IgA1, IgA2m1, IgA2m1.P221R, dímeros IgA2m2 e IgA2mn. Em certas modalidades, o método pode incluir a introdução, por exemplo, a transfecção de uma célula hospedeira com uma proporção da quantidade de DNA que codifica a cadeia pesada para a quantidade de DNA que codifica a cadeia leve e a quantidade de DNA que codifica a cadeia J (HC:LC:JC) que é cerca de 1:1:2, cerca de 1:1:3, cerca de 1:1:4 ou cerca de 1:1:5 para aumentar a produção de dímeros de IgA, por exemplo, uma proporção de cerca de 1:1:2 a cerca de 1:1:5. Em certas modalidades, o método pode incluir a transfecção de uma célula com uma quantidade de DNA que codifica a cadeia J que é cerca de 2 vezes maior, cerca de 3 vezes maior, cerca de 4 vezes maior ou cerca de 5 vezes maior do que a quantidade de DNA que codifica a cadeia leve e/ou a quantidade de DNA que codifica a cadeia pesada.

[000192] A presente divulgação fornece métodos para aumentar a produção de polímeros de IgA. Por exemplo, mas não como limitação, a presente divulgação fornece métodos para aumentar a produção de dímeros, trímeros, tetrâmeros e/ou pentâmeros de IgA. Em certas modalidades, o método para aumentar a produção de polímeros de IgA, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros e/ou pentâmeros, inclui diminuir a quantidade de DNA que codifica a cadeia J que é introduzida em uma célula em relação à quantidade de DNA que codifica a luz corrente e corrente pesada.

Em certas modalidades, a produção aumentada é relativa à quantidade de polímeros de IgA, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros e/ou pentâmeros produzidos em uma célula introduzida, por exemplo, transfectada, com quantidades iguais de DNA de cadeia pesada e leve em relação à quantidade do DNA da cadeia J. Por exemplo, mas não como limitação, os métodos podem ser usados para produzir polímeros IgA1, IgA2m1, IgA2m1 P221R, IgA2m2 ou IgA2mn, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros e/ou pentâmeros. Em certas modalidades, o método pode incluir a transfecção de uma célula hospedeira com uma proporção da quantidade de DNA que codifica a cadeia pesada para a quantidade de DNA que codifica a cadeia leve e a quantidade de DNA que codifica a cadeia J (HC:LC:JC) que é cerca de 1:1:0,25 ou cerca de 1:1:0,5, por exemplo, uma proporção de cerca de 1:1:0,25 a cerca de 1:1:0,5, para aumentar a produção de trímeros, tetrâmeros e/ou pentâmeros de IgA. Em certas modalidades, a quantidade de DNA que codifica a cadeia J pode ser menos do que cerca de 3 vezes maior, menos do que cerca de 2 vezes maior ou menos do que cerca de 1 vez maior do que a quantidade de DNA que codifica a cadeia leve e/ou a quantidade de DNA codificação da cadeia pesada. Em certas modalidades, a quantidade de DNA que codifica a cadeia J pode ser inferior a cerca de 0,5 vezes ou inferior a cerca de 0,25 vezes da quantidade de DNA que codifica a cadeia leve e/ou a quantidade de DNA que codifica a cadeia pesada.

[000193] Em certas modalidades, os métodos para aumentar a produção de trímeros, tetrâmeros e pentâmeros IgA1, IgA2m1 e/ou IgA2mn podem incluir expressar, em uma célula, um anticorpo IgA1, um anticorpo IgA2m1 e/ou IgA2mn que tem uma substituição no aminoácido V458. Em certas modalidades, o aminoácido V458 pode ser mutado para uma isoleucina (ou seja, V458I). Em certas modalidades, o aumento na produção de trímeros, tetrâmeros e pentâmeros IgA1, IgA2m1 e/ou IgA2mn é relativo à produção de trímeros IgA1, IgA2m1 e/ou IgA2mn, tetrâmeros e pentâmeros resultantes da expressão de um anticorpo IgA1, anticorpo IgA2m1 e/ou anticorpo IgA2mn, em uma célula, que não tem uma substituição no aminoácido V458.

[000194] Em certas modalidades, os métodos para aumentar a produção de dímeros de IgA2m2 podem incluir a expressão de um anticorpo IgA2m2 que tem uma substituição no aminoácido I458. Em certas modalidades, o aminoácido I458 pode ser mutado para uma valina (isto é, I458V). Em certas modalidades, o aumento na produção de dímeros de IgA2m2 é relativo à produção de dímeros de IgA2m2 resultantes da expressão de um anticorpo IgA2m2 que não tem uma substituição no aminoácido I458.

[000195] Em certas modalidades, o método para aumentar a produção de polímeros IgA pode incluir a remoção de um ou mais locais de glicosilação do anticorpo IgA, por exemplo, por substituição de aminoácido (como descrito acima), por exemplo, em relação à produção de polímeros IgA por um anticorpo IgA que não foi modificado para remover um local de glicosilação. Em certas modalidades, o método para aumentar a produção de polímeros de IgA pode incluir uma ou mais substituições nos aminoácidos N459 e/ou S461. Por exemplo, mas não como limitação, o anticorpo IgA pode ter uma substituição no aminoácido N459. Em certas modalidades, o anticorpo IgA pode ter uma substituição no aminoácido S461. Em certas modalidades, o anticorpo IgA pode ter substituições nos aminoácidos N459 e/ou S461.

Exemplos não limitativos de tais substituições incluem a mutação de N459 para A, G ou Q. Em certas modalidades, o aminoácido S461 pode sofrer mutação para A. Em certas modalidades, um método para aumentar a produção de polímeros IgA1 inclui a expressão de um anticorpo IgA1 com uma substituição nos aminoácidos N459 e/ou S461, por exemplo, uma substituição nos aminoácidos N459 e S461, por exemplo, em que a expressão aumentada é relativa à quantidade de polímeros IgA1 produzidos pela expressão de um anticorpo IgA1 que não tem uma substituição em aminoácidos N459 e/ou S461.

Em certas modalidades, um método para aumentar a produção de polímeros IgA2, por exemplo, polímeros IgA2m1, IgA2m2 e IgA2mn, inclui a expressão de um anticorpo IgA2 com uma substituição nos aminoácidos N459 e/ou S461, por exemplo, uma substituição nos aminoácidos N459 e S461. Em certas modalidades, o aumento na produção de polímeros IgA2 é relativo à produção de polímeros IgA2 resultantes da expressão de um anticorpo IgA2 que não tem uma substituição nos aminoácidos N459 e/ou S461.

[000196] Em certas modalidades, um método para reduzir a produção de polímeros IgA (por exemplo, aumentar a produção de monômeros IgA) inclui a expressão de um anticorpo IgA, por exemplo, um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn, com uma substituição no aminoácido C471, por exemplo, uma mutação C471S. Por exemplo, mas não como limitação, um método para reduzir a produção de polímeros IgA2m2 inclui a expressão de um anticorpo IgA2m2 com uma substituição no aminoácido C471, por exemplo, uma mutação C471S. Em certas modalidades, a diminuição na produção de polímeros IgA, por exemplo, polímeros IgA2m2, é relativa à produção de polímeros IgA, por exemplo, polímeros IgA2m2, resultante da expressão de um anticorpo IgA, por exemplo, anticorpo IgA2m2, que não tem uma substituição no aminoácido C471.

2. MÉTODOS PARA PRODUZIR MOLÉCULA DE FUSÃO IGG-IGA POLIMÉRICA

[000197] A presente divulgação fornece ainda métodos para produzir moléculas de fusão IgG-IgA da presente divulgação. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para gerar dímeros de moléculas de fusão IgG-IgA divulgadas no presente documento. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para produzir polímeros, por exemplo, dímeros, trímeros e/ou tetrâmeros, de moléculas de fusão IgG- IgA divulgadas neste documento.

[000198] Em certas modalidades, os métodos são direcionados à produção de dímeros de uma molécula de fusão IgG-IgA. Por exemplo, mas não como limitação, um método de expressar dímeros de moléculas de fusão IgG-IgA pode incluir expressar uma molécula de fusão IgG- IgA compreendendo um anticorpo IgG de comprimento completo fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo P221 ou R221 através do terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA e o anticorpo IgG compreende uma deleção do aminoácido K447.

[000199] Em certas modalidades, os métodos são direcionados à produção de polímeros de uma molécula de fusão IgG-IgA divulgada neste documento. Por exemplo, mas não como limitação, um método de expressar polímeros de moléculas de fusão IgG-IgA compreende a expressar uma molécula de fusão IgG-IgA compreendendo um anticorpo IgG de comprimento completo fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo C242 através do terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA. Em certas modalidades, o anticorpo IgG inclui uma deleção do aminoácido K447. Em certas modalidades, os polímeros das moléculas de fusão IgG-IgA produzidas pelo método incluem dímeros, trímeros e/ou tetrâmeros da molécula de fusão IgG-IgA.

B. MÉTODOS PARA PURIFICAR ANTICORPOS

[000200] A presente divulgação fornece ainda métodos para purificar os anticorpos divulgados no presente documento. Por exemplo, mas não como limitação, a presente divulgação fornece métodos para separar os estados oligoméricos dos anticorpos divulgados neste documento, por exemplo, separar o estado dimérico do estado tetramérico do anticorpo.

[000201] Em certas modalidades, os métodos para purificar os anticorpos da presente divulgação podem incluir purificar os anticorpos usando uma coluna de afinidade de proteína. Em certas modalidades, os métodos podem incluir ainda a realização de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Por exemplo, mas não como limitação, SEC pode ser realizada para purificar e/ou isolar estados oligoméricos específicos de um anticorpo divulgado neste documento, por exemplo, um anticorpo IgA e/ou uma molécula de fusão IgG-IgA. Em certas modalidades, a SEC pode ser realizada para purificar e/ou isolar um estado oligomérico, por exemplo, um estado dimérico, um estado trimérico, um estado tetramérico e/ou um estado pentamérico de um anticorpo divulgado neste documento.

[000202] Em certas modalidades, a coluna de afinidade de proteína pode ser uma coluna MabSelect Sure (GE Healthcare). Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação, por exemplo, amostras de IgA que contêm principalmente um estado oligomérico, podem ser purificados por afinidade usando MabSelect Sure (GE Healthcare) seguido por SEC com uma coluna HiLoad Superdex (GE Healthcare).

[000203] Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação, por exemplo, os anticorpos IgA divulgados neste documento, podem ser purificados com Proteína L (GE Healthcare) seguido por SEC. Em certas modalidades, a coluna de Proteína L pode ser lavada com um primeiro tampão de lavagem que compreende tampão Tris (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, NaN3 2 mM). Em certas modalidades, a coluna de Proteína L pode ser ainda lavada com um segundo tampão de lavagem compreendendo tampão Triton X-114 (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,1% Triton X-114, NaN3 2 mM) para remover a endotoxina. Em certas modalidades, a coluna de Proteína L pode ser lavada com um terceiro tampão de lavagem que inclui tampão Tris, lavado com um quarto tampão de lavagem que inclui tampão KP (fosfato de potássio 0,4 M, pH 7,0, EDTA 5 mM,

Tween20 0,02%, 2 mM NaN3) e/ou lavado com um quinto tampão de lavagem que compreende tampão Tris. Alternativamente ou adicionalmente, a coluna de Proteína L pode ser lavada uma ou mais vezes com um tampão de lavagem compreendendo PBS.

[000204] Em certas modalidades, os anticorpos podem ser eluídos da coluna de Proteína L usando um tampão que compreende ácido acético 150 mM, pH 2,7, que pode ser neutralizado com arginina 1 M, succinato 0,4 M, pH 9,0. Alternativamente ou adicionalmente, os anticorpos podem ser eluídos da coluna de Proteína L usando um tampão que compreende ácido fosfórico 50 mM a pH 3,0. Em certas modalidades, os anticorpos eluídos podem ser neutralizados com PBS 20X em pH 11.

[000205] Em certas modalidades, as amostras de IgA que compreendem oligômeros complexos, o eluato da Proteína L pode ser posteriormente purificado usando uma coluna de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm XBridge Protein BEH 450 Å SEC (Waters), por exemplo, para isolar um estado oligomérico particular (por exemplo, dimérico, trimérico e/ou tetramérico) do anticorpo. Em certas modalidades, menos de 1 mg de proteína total em um volume de injeção não superior a 100 μL foi executado na coluna a 1 mL/min usando um HPLC Agilent 1260 Infinity com 0,2 M de arginina, 0,137 M de succinato, pH 5,0 como o dispositivo móvel fase e frações de 200 μL foram coletadas. Em certas modalidades, as frações da coluna SEC podem ser seletivamente agrupadas para isolar predominantemente um estado oligomérico. Uma ou mais execuções podem ser realizadas e as frações de um determinado oligômero de cada execução podem ser agrupadas.

IV. MÉTODO DE TRATAMENTO

[000206] O assunto presentemente divulgado fornece ainda métodos para usar os anticorpos divulgados, por exemplo, as moléculas de fusão IgA e IgG-IgA. Em certas modalidades, os métodos são direcionados para usos terapêuticos dos anticorpos presentemente divulgados.

[000207] Em certas modalidades, um ou mais anticorpos do assunto presentemente divulgado podem ser usados para o tratamento de uma doença e/ou distúrbio em um sujeito. Por exemplo, mas não como limitação, um anticorpo da presente divulgação pode ser usado para tratar uma doença inflamatória, uma doença autoimune e câncer. Em certas modalidades, anticorpos de acordo com a presente divulgação podem ser usados para tratar câncer. Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação que não se ligam ao FcαRI e não podem ativar o FcαRI podem ser usados para tratar uma doença inflamatória, uma doença autoimune e câncer. Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação podem ser usados para tratar doenças e/ou distúrbios que requerem transcitose do anticorpo para efeito terapêutico e/ou para acessar um alvo terapêutico. Por exemplo, mas não como limitação, um anticorpo da presente divulgação pode ser usado para tratar doenças e/ou distúrbios que requerem a transcitose do anticorpo através de uma membrana mucosa.

[000208] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um anticorpo para uso em um método para tratar um indivíduo com uma doença e/ou distúrbio específicos, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo ou composições dos mesmos.

Em certas modalidades, o método compreende ainda administrar ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um anticorpo para uso na inibição de uma determinada via e/ou mecanismo molecular. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um anticorpo para uso em um método para inibir uma determinada via molecular e/ou mecanismo em um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo eficaz para inibir a via e/ou mecanismo molecular específico. Em certas modalidades,

a presente divulgação fornece um anticorpo para uso na ativação de uma via e/ou mecanismo molecular particular. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um anticorpo para uso em um método para ativar de uma via e/ou mecanismo molecular particular em um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo eficaz para inibir a via e/ou mecanismo molecular específico.

[000209] Um "indivíduo", "paciente" ou "sujeito", conforme usado indistintamente neste documento, se refere a um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, o indivíduo ou sujeito é um humano.

[000210] A presente divulgação fornece ainda o uso de um anticorpo na fabricação ou preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença e/ou distúrbio em um paciente. Em certas modalidades, o medicamento é para o tratamento de uma doença e/ou distúrbio específico. Em certas modalidades, o medicamento é para uso em um método para tratar uma doença e/ou distúrbio particulares, compreendendo administrar a um indivíduo com a doença uma quantidade eficaz do medicamento. Em certas modalidades, o método compreende ainda administrar ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas modalidades, o medicamento é para inibir ou ativar uma determinada via e/ou mecanismo molecular. Em certas modalidades, o medicamento é para uso em um método para inibir ou ativar um caminho e/ou mecanismo molecular específico em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz do medicamento para inibir o caminho e/ou mecanismo molecular específico.

[000211] Em certas modalidades, um anticorpo para uso nos métodos terapêuticos divulgados pode estar presente em uma composição farmacêutica, conforme descrito neste documento. Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode incluir um transporte farmaceuticamente aceitável, conforme descrito neste documento. Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode incluir um ou mais dos anticorpos da presente divulgação.

[000212] Adicionalmente ou alternativamente, a composição farmacêutica pode incluir um segundo agente terapêutico. Quando um ou mais dos anticorpos divulgados são administrados com outro agente terapêutico, o um ou mais anticorpos e o outro agente terapêutico podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente. Tais terapias de combinação observadas acima abrangem a administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos nas mesmas formulações ou em formulações separadas) e administração separada, em cujo caso, a administração do anticorpo da presente divulgação pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou depois da administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em certas modalidades, a administração de um anticorpo da presente divulgação e administração de um agente terapêutico adicional ocorre dentro de cerca de um mês, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, uma da outra.

[000213] Um anticorpo da presente divulgação (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado, para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários pontos de tempo, administração em bolus e infusão de pulso são contemplados neste documento.

[000214] Os anticorpos da presente divulgação seriam formulados, doseados e administrados de uma forma consistente com as boas práticas médicas. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, o estado clínico do doente individual, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o agendamento da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O anticorpo não precisa ser mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Essas são geralmente usadas nas mesmas dosagens e com vias de administração descritas neste documento, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas aqui, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/clinicamente determinada como apropriada.

[000215] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da presente divulgação (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, o tipo de anticorpo, a gravidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e a critério do médico assistente. Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser administrado com base na necessidade. Em certas modalidades, o anticorpo pode ser administrado ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

Por exemplo, mas não como limitação, o anticorpo e/ou composição farmacêutica contém um anticorpo, conforme divulgado neste documento, que pode ser administrado a um sujeito duas vezes por dia, uma vez por dia, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez a cada quatro dias, uma vez a cada cinco dias, uma vez a cada seis dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada seis meses ou uma vez por ano.

[000216] Em certas modalidades, dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 µg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em certas modalidades, a dosagem diária pode ser maior do que cerca de 100 mg/kg. Em certas modalidades, a dosagem pode ser ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de 1-1000 μg/ml e em alguns métodos 25-300 μg/ml.

[000217] Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento poderia ser geralmente mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em certas modalidades, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que uma administração menos frequente é necessária. A dosagem e a frequência podem variar com base na meia-vida do anticorpo no paciente. Em certas modalidades, tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de tal modo que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas.

[000218] Em certas modalidades, o método pode incluir ainda monitorar o sujeito e determinar a eficácia do tratamento. Por exemplo, o progresso desta terapia pode ser facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

V. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[000219] O assunto presentemente divulgado fornece ainda composições farmacêuticas contendo um ou mais dos anticorpos presentemente divulgados, por exemplo, as proteínas de fusão IgA e IgG-IgA Fc, com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem incluir uma combinação de múltiplos (por exemplo, dois ou mais) anticorpos e/ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos do assunto presentemente divulgado.

[000220] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas divulgadas podem ser preparadas por uma combinação de um anticorpo com o grau desejado de pureza com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Por exemplo, mas não como limitação, as formulações de anticorpos liofilizados são descritas na Patente dos EUA de nº 6.267.958. Em certas modalidades, as composições de anticorpo aquosas podem incluir aquelas descritas na Patente dos EUA de nº 6.171.586 e WO2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de acetato de histidina. Em certas modalidades, o anticorpo pode ser de uma pureza maior do que cerca de 80%, maior do que cerca de 90%, maior do que cerca de 91%, maior do que cerca de 92%, maior do que cerca de 93%, maior do que cerca de 94%, maior do que cerca 95%, maior do que cerca de 96%, maior do que cerca de 97%, maior do que cerca de 98%, maior do que cerca de 99%, maior do que cerca de 99,1%, maior do que cerca de 99,2%, maior do que cerca de 99,3%, maior do que cerca de 99,4%, maior do que cerca de 99,5%, maior do que cerca de 99,6%, maior do que cerca de 99,7%, maior do que cerca de 99,8% ou maior do que cerca de 99,9%.

[000221] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregues e incluem, mas não estão limitados a: tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como parabeno de metila ou propila; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou surfactantes não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares incluem ainda agentes de dispersão de fármacos instersticiais, tais como glicoproteinas hialuronidase solúveis ativas em meio neutro (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certos exemplos de sHASEGPs e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Publicações de Patentes dos EUA de nºs 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[000222] O veículo pode ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o anticorpo pode ser revestido com um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[000223] As composições farmacêuticas da presente divulgação também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Em certas modalidades, a composição farmacêutica divulgada neste documento também pode conter mais de um ingrediente ativo, conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, for exemplo, aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente uns aos outros. Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode incluir um segundo ingrediente ativo para o tratamento da mesma doença tratada pelo primeiro agente terapêutico. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido. Por exemplo, mas não a título de limitação, a formulação no presente documento também pode conter mais do que um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência, aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável fornecer ainda uma segunda terapêutica útil para o tratamento da mesma doença. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.

[000224] Uma composição da presente divulgação pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A via e/ou modo de administração variam dependendo dos resultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegem o composto contra a liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são descritos por exemplo, Sistemas de Entrega de Fármacos de Liberação Sustentada e Controlada, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são fabricadas sob as condições de Boas Práticas de Fabricação (GMP) da U.S. Food and Drug Administration.

[000225] As preparações de liberação sustentada contendo um anticorpo divulgado também podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes essas que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Em certas modalidades, os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, albumina microesferas, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical

Sciences, 16ª edição, Osol, A. Ed. (1980).

[000226] Para administrar um anticorpo da presente divulgação por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou coadministrar o composto com, um material para prevenir sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um sujeito em um veículo apropriado, por exemplo, lipossomas ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina e soluções de tampão aquosas. Os lipossomas incluem emulsões CGF água-em-óleo-em- água, bem como lipossomas convencionais (Strejan et al., J. Neuroimmunol.

7:27 (1984)).

[000227] Os transportes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, seu uso nas composições farmacêuticas da presente divulgação é contemplado. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

[000228] As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis, substancialmente isotônicas e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármacos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. Em muitos casos,

é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[000229] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando um ou mais anticorpos divulgados na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização por microfiltração, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo ou criodessecação (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada e estéril do mesmo.

[000230] As composições terapêuticas também podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma composição terapêutica da presente divulgação pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados, por exemplo, nas Patentes dos EUA nºs 5.399.163,

5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 ou 4.596.556.

Exemplos de implantes e módulos úteis na presente divulgação incluem: Patente dos EUA de nº 4.487.603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação a uma taxa controlada; Patente dos EUA de nº 4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através da pele; Patente dos EUA de nº

4.447.233, que divulga uma bomba de infusão de medicamento para fornecer medicamento a uma taxa de infusão precisa; Patente dos EUA de nº

4.447.224, que divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para administração contínua de fármacos; Patente dos EUA de nº 4,439,196, que divulga um sistema de fornecimento osmótico de fármacos com compartimentos de múltiplas câmaras; e Patente dos EUA de nº 4.475.196, que divulga um sistema de fornecimento osmótico de fármacos. Muitos outros implantes, sistemas de entrega e módulos são conhecidos.

[000231] Para as composições terapêuticas, as formulações da presente divulgação incluem aquelas adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica de farmácia. A quantidade de anticorpos, que podem ser combinados com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única varia dependendo do indivíduo sendo tratado e do modo particular de administração.

A quantidade de anticorpo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única geralmente é aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, em cem por cento, esta quantidade varia de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento do ingrediente ativo, de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, ou de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento.

[000232] As formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de composições da presente divulgação incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, adesivos e inalantes. O composto ativo pode ser misturado em condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e com quaisquer conservantes, tampões ou propulsores que possam ser necessários.

[000233] As frases "administração parenteral" e "administrado(a) parenteralmente" significam modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinhal, epidural e intraesternal e infusão.

[000234] Estas composições farmacêuticas também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de micro- organismos pode ser assegurada por procedimentos de esterilização, supra e pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

[000235] Em certas modalidades, quando os anticorpos da presente divulgação são administrados como produtos farmacêuticos, a humanos e animais, eles podem ser dados sozinhos ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, de cerca de 0,01% a cerca de 99,5% (ou cerca de 0,1 a cerca de 90%) de um anticorpo, descrito no presente documento, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

VI. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[000236] O assunto presentemente divulgado refere-se ainda a artigos de materiais de fabricação, por exemplo, contendo um ou mais dos anticorpos presentemente divulgados, úteis para o tratamento e/ou prevenção da doença e/ou distúrbios descritos acima.

[000237] Em certas modalidades, o artigo de fabricação inclui um recipiente, um rótulo ou bula no recipiente ou associado a ele. Exemplos não limitantes de recipientes adequados incluem garrafas, frascos, seringas, bolsas de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente pode conter uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica).

[000238] Em certas modalidades, pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo do assunto presentemente divulgado. O rótulo ou a bula podem indicar que a composição seja usada para tratar a condição de escolha.

[000239] Em certas modalidades, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da presente divulgação; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um outro agente citotóxico ou terapêutico. Em certas modalidades, o artigo de fabricação pode compreender ainda uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição particular.

[000240] Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender ainda um recipiente adicional, por exemplo, um segundo ou terceiro recipiente, incluindo um tampão farmaceuticamente aceitável, como, mas não limitado a, água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. O artigo de fabricação pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

VII. MODALIDADES EXEMPLARES

[000241] A. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um anticorpo IgA isolado, ou um fragmento do mesmo, em que o anticorpo IgA compreende uma substituição no aminoácido V458, N459 e/ou S461.

[000242] A1. Anticorpo IgA isolado anterior, de acordo com A, em que o aminoácido V458 é substituído por uma isoleucina (V458I), o aminoácido N459 é substituído por uma glutamina (N459Q), uma glicina (N459G) ou uma alanina (N459A) e/ou aminoácido S461 é substituído por uma alanina (S461A).

[000243] B. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um anticorpo IgA isolado, ou um fragmento do mesmo, em que o anticorpo IgA compreende uma substituição no aminoácido I458.

[000244] B1. Anticorpo IgA isolado anterior, de acordo com B, em que o aminoácido I458 é substituído por uma valina (I458V).

[000245] C. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um anticorpo IgA isolado, ou um fragmento do mesmo, em que o anticorpo IgA compreende uma ou mais substituições em um aminoácido selecionado do grupo que consiste em N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459, S461 e uma combinação dos mesmos.

[000246] C1. Anticorpo IgA isolado anterior, de acordo com C, em que as substituições nos aminoácidos N166, S212, N263, N337, I338, T339 e N459 são N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S e N459Q.

[000247] C2. Anticorpo IgA isolado anterior, de acordo com qualquer um de A-C1, em que o anticorpo IgA é um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn.

[000248] C3. Anticorpo IgA isolado anterior, de acordo com qualquer uma de C e C1, em que o anticorpo IgA tem substituições nos aminoácidos N337, I338 e T339 e uma ou mais substituições em T168, N211, S212, S213, N263, T265, N459, S461 e um combinação dos mesmos.

[000249] C4. Anticorpo IgA isolado anterior, de acordo com C3, em que o anticorpo IgA é um anticorpo IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn.

[000250] C5. Anticorpo IgA isolado anterior, de acordo com qualquer uma de A-C4, em que o anticorpo IgA é humanizado, um anticorpo quimérico ou anticorpo humano.

[000251] D. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece uma molécula de fusão IgG-IgA isolada compreendendo um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc de o anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo P221 ou R221 através do terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA, e em que o anticorpo IgG compreende ainda uma deleção do aminoácido K447.

[000252] E. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece uma molécula de fusão IgG-IgA isolada compreendendo um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc de o anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo C242 até o terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA.

[000253] E1. A molécula de fusão IgG-IgA isolada anterior, de acordo com E, em que o anticorpo IgG compreende ainda uma deleção do aminoácido K447.

[000254] E2. A molécula de fusão IgG-IgA isolada anterior, de acordo com qualquer uma de D-E1, em que o anticorpo IgG é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4.

[000255] E3. A molécula de fusão IgG-IgA isolada anterior, de acordo com qualquer uma de D-E2, em que o anticorpo IgG é um anticorpo IgG1.

[000256] E4. A molécula de fusão IgG-IgA isolada anterior, de acordo com qualquer uma de D-E3, em que o anticorpo IgA é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgA1, um anticorpo IgA2m1, um anticorpo IgA2m2 e um anticorpo IgA2mn.

[000257] E5. A molécula de fusão IgG-IgA isolada anterior, de acordo com qualquer uma de D-E4, em que o anticorpo IgA é um anticorpo IgA2m1.

[000258] F. Em certas modalidades não limitantes, a matéria presentemente divulgada fornece um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo IgA, de acordo com qualquer uma de A a C4, ou a molécula de fusão IgG-IgA, de acordo com qualquer uma de D a E5.

[000259] G. Em certas modalidades não limitantes, a matéria presentemente divulgada fornece uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico, conforme definido em F.

[000260] H. Em certas modalidades não limitantes, a matéria presentemente divulgada fornece um método para produzir um anticorpo IgA ou IgG-IgA que compreende a cultura da célula hospedeira, conforme definido em G, de modo que o anticorpo IgA ou molécula de fusão de IgG-IgA seja produzido.

[000261] H1. Método anterior, de acordo com H, compreendendo ainda a recuperação do anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA da célula hospedeira.

[000262] H2. Anticorpo IgA anterior ou molécula de fusão IgG-IgA produzido a partir de H ou recuperado de H1.

[000263] I. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece uma composição farmacêutica que compreende um ou mais anticorpos IgA, de acordo com qualquer um de A-C4 e H2, ou uma ou mais moléculas de fusão IgG-IgA, de acordo com qualquer um de D-E5 e H2, e um transporte farmaceuticamente aceitável.

[000264] I1. Composição farmacêutica anterior, de acordo com I, compreendendo ainda um agente terapêutico adicional.

[000265] J. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método de tratamento de um indivíduo com uma doença, em que o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos IgA de qualquer um de A- C4 e H2, ou uma ou mais moléculas de fusão IgG-IgA, conforme definido em qualquer um de D-E5 e H2.

[000266] J1. Método anterior, de acordo com J, em que a doença é uma doença inflamatória, uma doença autoimune ou câncer.

[000267] K. Anticorpo IgA anterior, de acordo com qualquer um de A-C4 e H2, ou a molécula de fusão IgG-IgA, de acordo com qualquer um de D-E5 e H2, para uso como um medicamento.

[000268] L. Anticorpo IgA anterior, conforme definido em qualquer um de A-C4 e H2, ou a molécula de fusão IgG-IgA, conforme definida em qualquer um de D-E5 e H2, para uso no tratamento de uma doença.

[000269] M. Anticorpo IgA anterior ou molécula de fusão IgG- IgA, conforme definido em L, em que a doença é uma doença inflamatória, uma doença autoimune ou câncer.

[000270] N. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um uso do anticorpo IgA, conforme definido em qualquer um de A-C4 e H2, ou a molécula de fusão IgG-IgA, conforme definido em qualquer um de D-E5 e H2, na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença.

[000271] N1. Uso anterior, de acordo com N, em que a doença é uma doença inflamatória, uma doença autoimune ou câncer.

[000272] O. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método para aumentar a expressão de dímeros de IgA compreendendo aumentar a quantidade de DNA que codifica uma cadeia de união (JC) que é introduzida em uma primeira célula em relação à quantidade de DNA que codifica a cadeia leve (LC) e a cadeia pesada (HC), em que a expressão aumentada é relativa à quantidade de dímeros de IgA produzidos em uma segunda célula introduzida com quantidades iguais de DNA de JC, LC e HC.

[000273] O1. Método anterior, de acordo com O, em que a proporção da quantidade de DNA que codifica a HC para a quantidade de DNA que codifica a LC para a quantidade de DNA que codifica a JC (HC: LC: JC) que é introduzido na primeira célula é de cerca de 1:1:2 a cerca de 1:1:5.

[000274] P. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método para aumentar a expressão de dímeros, trímeros ou tetrâmeros de IgA compreendendo a diminuição da quantidade de DNA que codifica uma cadeia de união (JC) introduzida em uma primeira célula em relação ao quantidade de DNA que codifica a cadeia leve (LC) e a cadeia pesada (HC), em que a expressão aumentada é relativa à quantidade de trímeros ou tetrâmeros de IgA produzidos em uma segunda célula introduzida com maiores quantidades de DNA de HC e LC em relação à quantidade de DNA de JC.

[000275] P1. Método anterior, de acordo com P, em que a proporção da quantidade de DNA que codifica a HC para a quantidade de DNA que codifica a LC para a quantidade de DNA que codifica a JC (HC:LC:JC) que é introduzido na primeira célula é de cerca de 1:1:0,25 a cerca de 1:1:0,5.

[000276] Q. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método para aumentar a produção de polímeros IgA1 ou IgA2m1 compreendendo expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 tendo uma substituição no aminoácido V458, em que aumentou a produção é relativa à quantidade de polímeros IgA1 ou IgA2m1 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 que não tem uma substituição no aminoácido V458.

[000277] Q1. Método anterior, de acordo com Q, em que o aminoácido é substituído por uma isoleucina (V458I).

[000278] R. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método para aumentar a produção de dímeros de IgA2m2 compreendendo a expressão, em uma primeira célula, de um anticorpo IgA2m2 com uma substituição no aminoácido I458, em que o aumento da produção é relativo a a quantidade de dímeros de IgA2m2 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA2m2 que não tem uma substituição no aminoácido I458.

[000279] R1. Método anterior, de acordo com R, em que o aminoácido é substituído por uma valina (I458V).

[000280] S. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método para aumentar a produção de um polímero IgA1 ou IgA2m1 compreendendo a expressão, em uma primeira célula, de um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 tendo uma substituição no aminoácido N459 ou S461, em que a produção aumentada é relativa à quantidade de polímeros IgA1 ou IgA2m1 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 que não tem uma substituição no aminoácido N459 ou S461.

[000281] S1. Método anterior, de acordo com S, em que o aminoácido N459 é substituído por uma mutação N459Q, N459G ou N459A e/ou o aminoácido S461 é substituído por uma mutação S461A.

[000282] T. Método para diminuir a produção de polímeros IgA2m2 compreendendo expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA2m2 com uma substituição no aminoácido C471, em que a produção diminuída é relativa à quantidade de polímeros IgA2m2 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA2m2 que não tem uma substituição no aminoácido C471.

[000283] T1. Método anterior, de acordo com T, em que o aminoácido C471 é substituído por uma mutação C471S.

[000284] U. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método para aumentar a expressão transitória de um anticorpo IgA2m2 compreendendo expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA2m2 que compreende uma substituição em um aminoácido selecionado do grupo que consiste de N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 e uma combinação dos mesmos, em que a expressão transitória aumentada é relativa à quantidade de expressão transitória produzida em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA2m2 que não tem uma substituição em um aminoácido selecionado do grupo que consiste em N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 e uma combinação dos mesmos.

[000285] V. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método de expressão de dímeros de moléculas de fusão IgG-IgA compreendendo a expressão de uma molécula de fusão IgG-IgA compreendendo um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a um Região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo P221 ou R221 até o terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA, e em que o anticorpo IgG compreende uma deleção do aminoácido K447.

[000286] W. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método de expressão de dímeros, trímeros ou tetrâmeros de moléculas de fusão IgG-IgA compreendendo a expressão de uma molécula de fusão IgG-IgA compreendendo um anticorpo IgG de comprimento completo fundido em seu terminal C para uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo C242 através do terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA.

[000287] W1. Método anterior, de acordo com W, em que o anticorpo IgG compreende uma deleção do aminoácido K447.

[000288] X. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método para purificar um anticorpo IgA a partir de uma mistura compreendendo um anticorpo IgA e pelo menos uma proteína da célula hospedeira compreendendo: (a) aplicar a mistura a uma coluna compreendendo Proteína L para ligar ao anticorpo IgA; (b) lavar a coluna de Proteína L com um tampão de lavagem compreendendo PBS; e (c) eluir o anticorpo IgA da coluna de Proteína L por um tampão de eluição compreendendo ácido fosfórico.

[000289] Y. Em certas modalidades não limitativas, o assunto presentemente divulgado fornece um método para purificar um estado oligomérico de um anticorpo IgA ou uma molécula de fusão IgG-IgA de uma mistura compreendendo um anticorpo IgA ou uma molécula de fusão IgG-IgA e em pelo menos uma proteína da célula hospedeira compreendendo: (a) aplicar a mistura a uma coluna de purificação por afinidade compreendendo Proteína L ou Proteína A para ligar ao anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA; (b) lavar a coluna de purificação por afinidade com um tampão de lavagem; (c) eluir o anticorpo IgA ou a molécula de fusão IgG-IgA da coluna de purificação por afinidade por um tampão de eluição para formar um primeiro eluato; e (d) aplicar o primeiro eluato a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho para separar diferentes estados oligoméricos do anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA e obter um fluxo que compreende um estado oligomérico do anticorpo IgA ou da molécula de fusão IgG-IgA.

[000290] Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos da matéria divulgada atualmente e não devem ser considerados como limitações de forma alguma.

EXEMPLO 1: AVALIAÇÃO DO PAPEL DA GLICOSILAÇÃO E DA LIGAÇÃO DE FCRN NOS

PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE IGA POLIMÉRICA EM CAMUNDONGOS

[000291] Os anticorpos IgA têm amplo potencial como uma nova plataforma terapêutica com base em sua atividade citotóxica mediada por receptor superior, neutralização potente de patógenos e capacidade de transcitose através de barreiras mucosas por meio de transporte mediado por receptor de imunoglobulina polimérica (pIgR), em comparação com fármacos tradicionais baseados em IgG. No entanto, a transição de IgA para o desenvolvimento clínico foi desafiada por expressão e caracterização complexas, bem como depuração sérica rápida que se pensa ser mediada pela eliminação do receptor de glicano de monômero de IgA produzido de forma recombinante com glicanos ligados a N incompletamente sialilados. No presente exemplo, é fornecida uma caracterização bioquímica, biofísica e estrutural abrangente de IgA humana monomérica, dimérica e polimérica produzida de forma recombinante. Além disso, duas estratégias para superar a rápida depuração sérica de IgA polimérica são identificadas: (1) remoção de locais de glicosilação ligados a N criando uma IgA polimérica aglicosilada ou parcialmente aglicosilada e (2) engenharia de ligação de FcRn com a geração de fusões de Fc de IgG-IgA polimérica.

MÉTODOS:

[000292] Clonagem de plasmídeo e alinhamentos de sequência. As sequências de domínio variável de anticorpo usadas incluem um anticorpo HER2 anti-humano humanizado (Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9 (1992)) e um anticorpo anti-IL-13 murino (Genentech). As sequências de proteínas de cadeias pesadas constantes de IgA humana IgA1, IgA2m1 e IgA2m2, outras espécies de IgA e cadeia J humana foram obtidas de Uniprot (www.uniprot.org) ou NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein). Outras espécies que foram obtidas incluem uma mutação em IgA2m1, isto é, P221R, que estabiliza o dissulfeto de cadeia leve-cadeia pesada como relatado anteriormente (Chintalacharuvu et al., J Immunol 157:3443-9 (1996)). Os genes que codificam uma fusão dos domínios variáveis do anticorpo à cadeia leve humana e aos domínios constantes da cadeia pesada IgA1, IgA2m1 e IgA2m2 humana foram sintetizados e clonados no vetor pRK de mamífero (Eaton et al., Biochemistry 25:8343-7 (1986)). A mutagênese dirigida ao local foi usada para introduzir mutações pontuais. Todos os plasmídeos foram verificados quanto à sequência. Os alinhamentos de sequência foram feitos usando GSeqWeb (Genentech) e Excel (Microsoft).

[000293] Expressão e Purificação de Anticorpos em Pequena Escala. As células Expi293T ™ foram transfectadas transitoriamente na escala de 30 mL com 15 µg de DNA de LC e HC para monômeros de IgA ou um total de 30 µg de DNA de proporções variáveis de LC, HC e JC para oligômeros de IgA (Bos et al., Journal of Biotechnology 180:10–6 (2014) e Bos et al.,

Biotechnol Bioeng 112:1832–42 (2015)). IgAs foram purificados por afinidade em lote com Proteína L (GE Healthcare), pois todos os anticorpos continham cadeias leves kappa. O eluato da proteína L foi caracterizado por SEC-HPLC analítico (coluna Tosoh Bioscience LLC TSKgel SuperSW3000, Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLC). Um volume constante foi carregado na coluna e a área sob cada curva foi quantificada usando o software Chromeleon Chromatography Data System (Thermo Scientific).

[000294] Expressão e Purificação de Anticorpos em Larga Escala. As fusões IgA, IgG e IgG-IgA Fc foram transitoriamente expressas em células CHO DP12, conforme descrito anteriormente (Wong et al., Biotechnol Bioeng 106:751–63 (2010)). Para clones de baixa expressão, foram geradas linhas de células TI estáveis. As fusões IgG e IgG-IgA Fc foram purificadas por afinidade usando MabSelect Sure (GE Healthcare) seguido por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) com uma coluna HiLoad Superdex 200 pg (GE Healthcare). IgAs foram purificados por afinidade usando Capto L (GE Healthcare) seguido por SEC. Para amostras de IgA onde as razões de DNA influenciaram com sucesso a expressão para principalmente um estado oligomérico, uma coluna HiLoad Superdex 200 pg (GE Healthcare) foi usada para SEC. Para amostras de IgA contendo misturas complexas de oligômeros, uma coluna Xbridge Protein BEH 450 Å SEC de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm (Waters) foi usada para melhor separação dos picos de dímero e tetrâmero.

[000295] SEC-MALS. IgAs poliméricos foram executados em uma coluna Xbridge Protein BEH 200 Å SEC de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm (Waters) e injetados diretamente em um detector de espalhamento de luz multi- ângulo DAWN HELEOS/Optilab T-rEX II (Wyatt) para determinação de massa molar e medição de polidispersidade.

[000296] Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF). DSF foi realizado conforme descrito anteriormente (Lombana et al., Sci Rep 5:17488

(2015)).

[000297] Ensaio de transcitose in vitro. Células de rim canino Madin-Darby (MDCKII) (European Collection of Authenticated Cell Cultures, Salisbury, UK) foram transduzidas com retrovírus contendo cDNA que codifica para o gene pIgR humano (Retro-X, Takara Bio; OriGene, Rockvile, MD). A expressão do gene pIgR foi confirmada por qRT-PCR e Western Blotting. As células MDCKII que expressam pIgR foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina e 100 µg/ml de estreptomicina (Thermo Fisher, Carlsbad, CA) e 2 µg/ml de puromicina (Takara Bio, Mountain View, CA). Para o ensaio de transcitose, as células foram semeadas em 0,4 µm de inserção de cultura de células Millicell de 24 poços (Millipore, Burlington, MA) e cultivadas por 4 dias. No dia da experiência, as células foram lavadas duas vezes com FluoroBrite DMEM (Thermo Fisher) e foram adicionados 6 µg de moléculas de IgA aos compartimentos basolaterais. Após 24 horas de incubação, os meios dos compartimentos apical e basolateral foram coletados para análise por ELISA.

[000298] Microscópio eletrônico. Amostras purificadas de dímero e tetrâmero anti-IL-13 IgA2m2 foram primeiro reticuladas por incubação em glutaraldeído a 0,015% (Polysciences, Inc.) por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de fixadas, as amostras foram diluídas usando tampão TBS para atingir uma concentração de 10 ng/µL. Em seguida, 4 µl de cada amostra foram incubados por 40s em grades de cobre de malha 400 descarregadas recentemente com brilho, cobertas com uma camada fina de carbono contínuo antes de serem tratadas com 2% (p/v) de coloração negativa de acetato de uranila (Ciências de Microscopia Eletrônica). Dímeros e tetrâmeros de IgA foram então fotografados usando um Tecnai Spirit T12 (Thermo Fisher) operando a 120 keV, com uma ampliação de 25.000x (2,2 Å/pixel). As imagens foram gravadas usando uma câmera CCD Gatan de 4096 x 4096 pixels em condições de baixa dosagem. Cerca de 5000 partículas para dímero e tetrâmeros de IgA foram então selecionadas e extraídas usando o software e2boxer.py dentro do pacote EMAN2 (Tang et al., J Struct Biol 157:38–46 (2007)) usando um tamanho de caixa de partícula de 128 pixels. A classificação 2D gratuita de referência, dentro do pacote de software de imagem RELION (Scheres J Struct Biol 180:519–30 (2012)) foi usada para gerar imagens médias de ambas as amostras.

[000299] Análise Global de Composição de Glicano ligado a N (análise LC-MS). Dez μg de cada amostra de IgA foram desnaturados com guanidina HCl 8 M na proporção de volume de 1:1 e reduzidos com ditiotreitol 100 mM (DTT) por 10 min a 95°C. As amostras foram diluídas com Tris HCl 100 mM, pH 7,5, para uma concentração final de guanidina HCl 2 M, seguida por desglicosilação ligada a N durante a noite a 37°C com 2 μl de P0705S PNGase F (New England BioLabs). Após a desglicosilação, 150 ng de cada amostra foram injetados em um sistema Agilent 1260 Infinity LC e eluídos por um gradiente isocrático de 2% a 32% do solvente B (solvente A: 99,88% de água contendo 0,1% de ácido fórmico e 0,02% de ácido trifluoroacético; solvente B: 90% de acetonitrila contendo 9,88% de água mais 0,1% de ácido fórmico e 0,02% de ácido trifluoroacético). O sistema de HPLC foi acoplado por meio de um sistema Agilent G4240A Chip Cube MS a um espectrômetro de massa G6520B Q-TOF. As amostras foram enriquecidas com glicano e separadas usando colunas de carbono grafitado poroso construídas dentro de um chip G4240-64025 mAb-Glyco no sistema Chip Cube MS. Aquisição de dados: Tensão de pulverização de 1,9 kV; Temperatura do gás 325°C; Fluxo de gás de secagem de 5 l/min; Tensão do fragmentador de 160 V; Voltagem do skimmer 65 V; Tensão 750 V oct 1 RF Vpp; Faixa de varredura de 400 a 3000 m/z; polaridade positiva; Aquisição de dados de centróide MS1 usando modo de instrumento de faixa dinâmica estendida (2 GHz); 3 espectros/s; 333,3 ms/espectro; 3243 transientes/espectro; e uma configuração de CE de 0. Os dados espectrais de massa adquiridos foram pesquisados em uma biblioteca de glicano no software Agilent MassHunter Qualitative Analysis utilizando uma combinação de massa precisa com uma tolerância de massa de 10 ppm e tempo de retenção esperado para identificação de glicano. Os glicanos ligados a N foram quantificados sem marcação em relação a todos os glicanos ligados a N identificados em cada amostra com base na AUC no cromatograma do composto extraído de cada glicano.

[000300] Análise de mapeamento de local de glicopeptídeo ligado a N (análise LC-MS/MS). Dez μg de IgA foram reduzidos com DTT 10 mM a 37°C por 1 hora, alquilada com iodoacetamida 10 mM em temperatura ambiente por 20 minutos, digerida com 0,2 μg de tripsina (Promega) e 0,2 μg de quimiotripsina (Thermo Fisher Scientific) separadamente a 37°C durante a noite, extinta com 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) e submetida a limpeza com C18 (discos de extração 3M Empore C18) de ponta de estágio (50% de acetonitrila, 49,9% de água, 0,1% de TFA). 200 fmol de amostra foram injetados em um sistema Waters NanoAcquity UPLC por meio de um amostrador automático e separados a 45°C em uma coluna Waters Acquity M- Class BEH C18 (0,1 mm × 100 mm, resina de 1,7 μm). Um gradiente de 2% a 40% do solvente B foi usado para a eluição (solvente A: 99,9% de água, 0,1% de ácido fórmico; solvente B 99,9% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico).

[000301] Os peptídeos separados foram analisados on-line via ionização de nanopulverização em um espectrômetro de massa Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific) usando os seguintes parâmetros para aquisição de dados: Resolução de 60000; Intervalo de varredura de 375-1600 m/z; polaridade positiva; modo centróide; Largura de isolamento de 1 m/z com Q de 0,25 de ativação e tempo de ativação de 10 ms; Ativação CID; e uma configuração de CE de 35. Os dados foram coletados no modo dependente de dados com os íons precursores sendo analisados no FTMS e os 15 íons mais abundantes sendo selecionados para fragmentação e análise no ITMS. Os dados espectrais de massa adquiridos foram pesquisados contra a sequência da proteína usando o software Protein Metrics Byonic e analisados no software Protein Metrics Byologic. A identificação do peptídeo para cada local de glicosilação foi validada manualmente com base em uma combinação de espectros de fragmentação MS2, cromatograma de íon extraído (XIC) e tempo de retenção. Os glicopeptídeos ligados a N foram quantificados sem marcação em relação ao seu peptídeo não modificado por integração da AUC dos XICs.

[000302] Estudos em camundongos. Camundongos Balb/C fêmeas (6-8 semanas de idade) foram obtidos por laboratórios Charles River.

Após a chegada, todos os camundongos foram mantidos em uma instalação para animais livre de patógenos sob um ciclo padrão de 12 h de luz/12 h de escuridão a 21°C de temperatura ambiente com acesso a comida e água ad libitum. Todos os camundongos receberam uma única injeção intravenosa (IV) do respectivo anticorpo (IgG ou IgA). Amostras de sangue (150-200 µL) foram coletadas via retro- seio orbital ou punção cardíaca sob anestesia com isoflurano em vários momentos após a injeção. As amostras foram coletadas em tubos separadores de soro. Foi permitido que o sangue coagulasse à temperatura ambiente por pelo menos 20 minutos. As amostras coaguladas foram mantidas à temperatura ambiente até centrifugação, com início dentro de 1 hora após o momento da coleta. Cada amostra foi centrifugada a uma força centrífuga relativa de 1500-2000 x g por 5 minutos a 2-8˚C. O soro foi separado da amostra de sangue dentro de 20 minutos após a centrifugação e transferido para o 2.0-mL rotulado polipropileno, cônico- tubos de microcentrífuga de fundo.

[000303] Apenas animais que pareciam ser saudáveis e que estavam livres de anormalidades óbvias foram usados para o estudo. Todo o trabalho realizado com animais foi revisado e aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais (IACUC) da Genentech.

[000304] IgA ELISA para estudos de transcitose e farmacocinética. Os níveis de anticorpos IgA foram medidos por ELISA sanduíche. Poços de placas de 384 microtitulação foram revestidos durante a noite a 4°C com 2 μg/ml de anticorpo de cabra anti-Kappa humano (SouthernBiotech, Cat# 2060-01) em 25 μl de tampão de revestimento (carbonato de sódio 0,05 M, pH 9,6), seguido pelo bloqueio com 50 μl de 0,5% BSA em PBS por 2 horas a 37°C. Amostras (25 μl) diluídas em tampão de amostra (1x PBS, pH 7,4, 0,5% BSA, 0,35 M NaCl, 0,05% Tween20, 0,25% CHAPS, 5 mM EDTA) foram então adicionados às placas bloqueadas e incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, 25 μl de IgA anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano (SouthernBiotech, Cat# 2053-05) foram adicionados e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram então incubadas com 25 μl de TMB (Moss, Cat# TMBE-1000) por 15 min e a reação foi interrompida com 25 μl de 1M H3PO4. A absorvância foi medida a 450 nm com redução a 630 nm usando um leitor de placas. Entre as etapas, as placas foram lavadas seis vezes com 200 μl de tampão de lavagem (0,05% Tween-20 em PBS). Como referência para quantificação, uma curva padrão foi estabelecida usando material estoque diluído em série (20 ng/ml-0,15 ng/ml) para cada molécula de IgA. O IgA ELISA tolera matrizes biológicas até 10% de soro de camundongo e 10% de lisados de tecido.

[000305] Radioquímica. O iodo-125 [125I] foi obtido como iodeto de sódio em hidróxido de sódio 0,1 N de Perkin Elmer (Boston, MA). 1 mCi de 125I (~3 µL) foi usado para marcar aleatoriamente através de resíduos de tirosina a uma atividade específica de ~10 μCi/μg com 125I usando o método de iodogênio indireto (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). A radiossíntese de anticorpos marcados com 111In (~ 8 μCi/μg) foi obtida através da incubação de 111In e ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) - conjugado (aleatoriamente através de lisinas) mAb em acetato de amônio 0,3 M pH 7 a 37°C durante 1 hora. A purificação de todos os radioimunoconjugados foi alcançada usando colunas NAP5 equilibradas em PBS e confirmadas por cromatografia de exclusão por tamanho.

[000306] Os anticorpos foram radioiodados usando um método indireto de adição de iodogênio (Chizzonite et al., J Immunol; 147:1548–56 (1991)). As proteínas radiomarcadas foram purificadas usando colunas NAP5 ™ (GE Healthcare Life Sciences, cat. 17-0853-01) pré- equilibrado em PBS. Após a radioiodação, os anticorpos marcados foram caracterizados por SEC-HPLC para comparar com os anticorpos não marcados. As amostras foram injetadas em um HPLC Agilent série 1100 (Agilent Technology, Santa Clara, CA) e um Yarra SEC-3000, 3 µM 300 mm x 7,8 mm (Phenomenex, Torrance, CA, cat. 00H-4513-K0) colunas de exclusão de tamanho conectadas em série e eluídas com solução salina de tampão de fosfato (PBS pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 0,8 mL/min por 20 minutos. A eluição foi monitorada por absorção a 280 nm e pela medição da radioatividade das frações eluídas em um contador gama Gabi em linha (Elysia-Raytest, Alemanha).

[000307] Desenho e análise do estudo de distribuição de tecidos. O protocolo, o alojamento e a anestesia foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Genentech, em conformidade com os regulamentos da Associação para Avaliação e Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório.

[000308] Camundongos BALB-c fêmeas com um peso corporal de 20-30 g e um intervalo de idade de 6-7 semanas foram obtidos em Jackson/West (CA). Seis grupos de 12 camundongos cada foram usados para este estudo. Para prevenir o sequestro da tireóide de 125I, 100 µL de 30 mg/mL de iodeto de sódio foram administrados por via intraperitoneal 1 e 24 horas antes da dosagem. Todos os camundongos receberam uma única injeção IV consistindo em uma mistura de anticorpos marcados com 125I e 111In (5 μCi de cada) mais o respectivo anticorpo não modificado para uma dose total de 5 mg/kg. Coortes de 4 camundongos foram sangrados retro-orbitalmente sob isoflurano (inalação para efeito) em 5 min, 15 min, 30 min, 1 hora, 4 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias e 3 dias após a injeção. Em 1 hora, 1 dia e 3 dias; 4 animais foram sacrificados sob anestesia com cetamina (75-80 mg/kg)/xileno (7,5-15 mg/kg) por toracotomia. Os seguintes tecidos coletados, enxaguados em PBS frio, secos com mata-borrão, pesados e congelados: Cérebro, fígado, pulmão, rim, baço, coração, estômago, intestino delgado, músculo, pele, gordura, intestino grosso. A radioatividade da amostra foi contada para radioatividade usando um 1480 WIZARD ™ Gamma Counter nas janelas de energia para 111In (245 keV; decaimento t1/2 = 2,8 dias) e 125I (35 keV; decaimento t1/2 = 59,4 dias) com fundo automático e correção de decaimento.

Os dados foram analisados e representados graficamente usando GraphPad Prism (versão 7.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www.graphpad.com).

[000309] Estabilidade de Plasma de Camundongo. Plasma de camundongo (com heparina de lítio anticoagulante) foi obtido da BioIVT (Westbury, NY) e um controle de tampão foi feito pela mistura de albumina de soro bovino (Sigma- Aldrich; St. Louis, MO, cat. A2058) com PBS (PBS + 0,5% BSA). Os anticorpos radiomarcados foram misturados ao plasma de camundongo ou controle de tampão a 5 µCi do traçador radiomarcado e, em seguida, foram incubados em uma incubadora a 37oC com 5% de CO2. No ponto de tempo definido de 0, 24 e 96 horas de incubação, as amostras foram retiradas da incubadora e armazenadas em freezer -80oC até a análise.

[000310] As amostras foram analisadas pelo método SEC- HPLC descrito acima com uma diluição de amostra 1:1 em PBS. Os cromatogramas de resultado foram comparados entre os pontos de tempo para monitorar as mudanças do pico pai no tempo zero.

[000311] Antibody Kinetics da Wasatch. Um sistema de imagem SPR baseado em matriz 96 × 96 (Carterra EUA) foi usado para analisar a cinética em 25 C de fusões de IgA, IgG-IgA Fc ou IgG purificadas.

Os anticorpos foram diluídos a 10 μg/ml em tampão de acetato de sódio 10 mM pH 4,5 e usando acoplamento de amina, foram imobilizados diretamente em um chip SPR sensorprism CMD 200M (XanTec Bioanalytics, Alemanha) usando um Microspotter de Fluxo Contínuo. Antígenos diluídos em tampão de corrida (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM EDTA) foram injetados em várias concentrações por 3 minutos e permitiu a dissociação por 10 minutos, com regeneração entre os ciclos usando 10 mM de glicina pH 2,5. Os antígenos eram da R&D Systems (mIL-13, 413-ML-025/CF; mpIgR, 2800-PG-050; hpIgR, 2717-PG-050; hFc RI, 3939-FA-050), Sino Biologicals (hHER2, 10004-H08H) ou Genentech, co-expresso com espécies específicas microglobulina eta-2 (m/hFcRn). Os dados foram processados com a ferramenta de software cinético Wasatch.

[000312] Antibody Kinetics da Biacore. A cinética de ligação dos anticorpos anti-IL-13 ou anti-HER2 IgA2m2 foi medida usando ressonância plasmônica de superfície em um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare).

Todos os experimentos de cinética foram realizados a uma taxa de fluxo de 30 μL/minutos a 25C, e com um tampão de 10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20 e 1 mM de EDTA. Fab Binder do Human Fab Capture Kit (GE Healthcare) foi imobilizado em um chip sensor CM5 via acoplamento baseado em amina. Anticorpos IgA com concentração de 50-100 ug/mL foram capturados a 5 uL/min por 210 segundos. A ligação do antígeno

FcαRI humano recombinante (R&D Systems, 3939-FA-050) ao anticorpo foi medida usando concentrações de 1000 nM, 333 nM e 111 nM. Sensorgramas para ligação foram registrados usando um tempo de injeção de 90 segundos, seguido por 120 segundos de tempo de dissociação e regeneração da superfície entre ciclos com duas injeções de 60 segundos de glicina pH 2,1.

Um modelo de ligação Langmuir 1:1 foi usado para calcular a cinética e as constantes de ligação.

RESULTADOS:

[000313] Fatores que afetam a formação de oligômeros de IgA. A produção recombinante de IgA monomérica é bem compreendida e pode ser alcançada por coexpressão de cadeia leve (LC) e cadeia pesada (HC), semelhante à produção de IgG. A montagem de IgA polimérica, em contraste, requer coexpressão de LC, HC e cadeia de união (JC) e os estados oligoméricos de IgA resultantes são menos bem caracterizados. Para obter uma melhor compreensão do processo de montagem de oligômeros de IgA, a expressão de vários isotipos e alotipos de IgA humana, incluindo IgA1, IgA2m1, IgA2m1.P221R (emparelhamento LC-HC estabilizado por dissulfeto) e IgA2m2 (Figura 1A) foram caracterizados. Os domínios variáveis murinos de um anticorpo anti-interleucina-13 de camundongo (mIL-13) foram clonados como quimeras com os domínios constantes humanos kappa LC e IgA HC. Os LCs e HCs quiméricos foram então co-expressos na presença e ausência da JC humano (Figura 1B). Após purificação por afinidade com Proteína L, IgA produzida na ausência de JC cotransfectado rendeu monômero relativamente puro de expressões transitórias Expi293T de 30 mL. Nessas experiências, as células foram transfectadas com quantidades de massa iguais de DNA de LC e HC. Em contraste, a transfecção de quantidades de massa igual de LC, HC e JC de DNA produziu uma variedade de espécies oligoméricas, correspondendo a monômero IgA, dímero e polímero que contém três a cinco monômeros IgA

(Figura 1D e Figura 2A-C). Verificou-se que IgA1, IgA2m1 e IgA2m1.P221R produzem IgA predominantemente dimérico (Figura 2A-B), enquanto IgA2m2 produziu quantidades aproximadamente iguais de dímero e polímero (Figura 2C). Uma distribuição semelhante de oligômeros foi observada em expressões transitórias CHO em escala até a escala do litro.

[000314] A separação do dímero de IgA do polímero por purificação secundária provou ser um desafio em grande escala. Em uma tentativa de polarizar a montagem em direção à formação de dímero, a quantidade de DNA de JC em relação às quantidades de DNA de LC e HC foi aumentada para promover níveis de expressão de JC aumentados. Isso resultou em um aumento na porcentagem relativa de espécies de dímero e uma diminuição na porcentagem relativa de espécies de polímero (Figura 2A- C; consulte também as Figuras 15-17 e 20). Por outro lado, a diminuição da quantidade de DNA de JC em relação às quantidades de DNA de LC e HC resultou em um aumento da porcentagem de polímero de ordem superior (trímero/tetrâmero/pentâmero) (Figura 18 e 21 a 23). A capacidade de influenciar as espécies oligoméricas com base na quantidade de DNA de JC foi mais pronunciada para as espécies IgA2m2. Além disso, a cotransfecção do componente secretor, a cadeia de ligação, a cadeia leve e a cadeia pesada rendeu oligômero de ordem superior, em comparação com a co-transfecção da cadeia de ligação, cadeia leve e cadeia pesada, sem o componente secretor (Figura 29).

[000315] Para entender por que IgA2m2 tem uma maior propensão para formar oligômeros maiores do que IgA1 ou IgA2m1, as sequências de aminoácidos dos apêndices de HC para os diferentes isotipos/alotipos foram comparadas. Enquanto as sequências dos apêndices de IgA1 e IgA2m1 são idênticas, IgA2m2 difere em dois resíduos. Os resíduos 458 e 467 são ambos valinas em IgA1 e IgA2m1, enquanto IgA2m2 tem uma isoleucina e uma alanina nessas posições, respectivamente (Figura 1A, asteriscos). Portanto, foi investigado se essas duas diferenças de aminoácidos poderiam explicar a predisposição única de IgA2m2 recombinante para formar oligômeros maiores. De fato, quando a isoleucina foi substituída por valina na posição 458 em IgA1 ou IgA2m1, mais polímero foi produzido e isso era independente de alanina ou valina no resíduo 467 (Figura 2D). Por outro lado, quando a posição 458 em IgA2m2 foi alterada de isoleucina para valina, o teor de espécies poliméricas foi reduzido em favor de um maior teor de dímero.

[000316] Mutações de certos resíduos de cisteína na cadeia pesada de um anticorpo IgA2m2 foram geradas para prevenir ligações dissulfeto com o componente secretor ou a cadeia de união e analisadas para determinar o efeito de tais mutações na formação de oligômero. A mutação de Cys311 para serina impede a ligação dissulfeto com o componente secretor e a mutação da mutação Cys471 para serina impede a ligação dissulfeto com a cadeia de união. Como mostrado na Figura 28B, a mutação de C471, mas não C311, foi necessária para o dímero IgA2m2 e a formação de oligômero de ordem superior ao adicionar a cadeia de união à cadeia leve e à cadeia pesada.

[000317] A glicosilação é conhecida por desempenhar um papel na oligomerização de IgA (Chuang et al., J Immunol 158:724-32 (1997)).

Consequentemente, as mutações foram feitas para remover cada local de glicosilação ligado a N em IgA1 e IgA2m2. Quatro mutações separadas (N459A/G/Q ou S461A) que removeram o local de glicosilação ligada a N no arremate de IgA1 ou IgA2m2 também aumentaram a quantidade de polímero produzido, enquanto mutações para remover locais de glicosilação fora do arremate não alteraram a formação de oligômero (Figuras 2E e 2F, respectivamente; consulte também a Figura 38). Portanto, além de modular as razões de DNA na transfecção, a formação de polímero de IgA pode ser aumentada tendo isoleucina no resíduo amino 458 da arremate ou evitando a glicosilação ligada a N da arremate de IgA.

[000318] Purificação em Larga Escala e Caracterização Biofísica de Monômeros e Oligômeros de IgA. Usando insights sobre a formação de oligômero de IgA obtida através da expressão em pequena escala, IgA monomérica, dimérica e tetramérica foram aumentadas usando a expressão transitória de CHO. As espécies monoméricas e diméricas de IgA1, IgA2m1, IgA2m1.P221R e IgA2m2, bem como as espécies tetraméricas de IgA2m2, foram isoladas (Figura 3A). A análise SDS-PAGE não reduzida dessas amostras mostrou bandas predominantes de pesos moleculares consistentes com as massas esperadas de ~150 kDa, ~310 kDa e ~610 kDa para um monômero IgA, dímero e tetrâmero, respectivamente (Figura 3B). Essas massas esperadas foram baseadas na sequência de aminoácidos sem glicosilação e assumem a incorporação de um JC por oligômero. As massas molares das espécies oligoméricas purificadas também foram medidas por SEC-MALS e consideradas consistentes com as massas esperadas de IgA dimérica e tetramérica (Tabela 2). A análise SDS-PAGE reduzida das amostras de IgA purificadas confirma a presença de bandas LC e HC para monômeros a ~25 kDa e ~55 kDa, respectivamente, enquanto nas amostras oligoméricas uma banda para JC logo abaixo de 25 kDa também pode ser detectada (Figura 3B). A identidade do LC, HC e JC foi adicionalmente confirmada por espectrometria de massa após redução e desglicosilação enzimática (Figura 18E). A microscopia eletrônica de coloração negativa (EM) também foi usada para validar ainda mais o estado oligomérico das espécies isoladas. Imagens de coloração negativa do dímero IgA2m2 (Figura 3C) e tetrâmero (Figura 3D) confirmam a presença de duas ou predominantemente quatro moléculas de IgA, respectivamente. No dímero, duas moléculas de IgA estão ligadas arremate a arremate por seus domínios Fc em uma partícula alongada,

enquanto nas interações de tetrâmero entre quatro domínios Fc dão origem a um complexo compacto de quatro moléculas de IgA. Imagens brutas de ambas as amostras mostraram a presença de partículas monodispersas bem comportadas (Figura 8).

TABELA 2. MASSA MOLAR DE IGA RECOMBINANTE MEDIDA POR SEC-MALS MW previsto SEC-MALS MW Polidispersidade (Da) (g/mol) (Mw/Mn) Dímero de IgA1 anti-mIL-13 3,160 x 105 3,277 x 105 +/- 1,001 +/- 1,127% 0,802% Dímero de IgA2m1 anti- 3,114 x 105 3,264 x 105 +/- 1,001 +/- 0,951% mIL-13 0,675% Dímero IgA2m2 anti-mIL-13 3,117 x 105 3,437 x 105 +/- 1,002 +/- 0,911% 0,646% Tetrâmero anti-mIL-13 6,078 x 105 6,580 x 105 +/- 1,005 +/- 0,720% IgA2m2 0,510%

[000319] As proteínas foram injetadas em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho analítica Waters Xbridge Protein BEH 200 Å acoplada a um detector de dispersão de luz multi-ângulo (MALS) Wyatt DAWN HELEOS II/Optilab T-rEX (MALS) para medição de massa molar e polidispersidade. O peso molecular previsto (MW) das moléculas de IgA é baseado apenas na composição de aminoácidos, assume a incorporação de um JC por dímero ou tetrâmero e não leva em consideração qualquer potencial glicano ligado a N ou O.

[000320] Os monômeros anti-mIL-13 IgA, dímeros e tetrâmero ligados a IL-13 murina com afinidade semelhante à anti-mIL-13 IgG1 (Tabela 3 e Figura 19), indicando que as regiões Fab estão devidamente dobradas e funcionais no recombinante IgAs. Como esperado, a ligação de pIgR de camundongo e humano foi observada apenas para os oligômeros de IgA, enquanto IgA anti-mIL-13 monomérica e oligomérica se ligaram com afinidade semelhante ao FcαRI humano (Tabela 3). Além disso, IgA2m2 purificado da expressão transitória em células CHO ou células Expi293 exibiu ligação semelhante a pIgR de camundongo e humano (Figura 36A). Devido às capacidades de ligação de pIgR, todos os oligômeros de IgA, mas não os monômeros, foram capazes de transcitose in vitro usando uma linha de células MDCK que expressa ectopicamente pIgR humano (Figuras 4A e 7E). Além disso, todos os monômeros e oligômeros de IgA mostraram estabilidade aumentada em comparação com o IgG1 humano anti-mIL-13 e estabilidade semelhante ou aumentada em comparação com o fragmento Fab de IgG1, conforme medido por fluorimetria de varredura diferencial (DSF) (Figura 4B).

TABELA 3. AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS IGA E IGG ANTI-IL-13 DE CAMUNDONGO AO ANTÍGENO E RECEPTORES. KD (nM) Camundongo IL- PIgR PIgR humano FcαRI humano 13 camundongo Monômero IgA1 0,78 ± 0,05 NB NB 425 ± 7 Monômero IgA2m1 1,09 ± 0,03 NB NB 429 ± 6 Monômero IgA2m1 1,16 ± 0,01 NB NB 443 ± 8 P221R Monômero IgA2m2 0,70 ± 0,01 NB NB 455 ± 5 Dímero IgA1 0,34 ± 0,01 2,66 ± 1,45 8,80 ± 0,55 369 ± 3 Dímero IgA2m1 0,18 ± 0,01 2,54 ± 0,15 5,05 ± 0,88 499 ± 7 Dímero IgA2m1 P221R 0,84 ± 0,01 5,59 ± 0,03 15,5 ± 0,10 462 ± 4 Dímero IgA2m2 0,81 ± 0,01 2,45 ± 0,98 13,9 ± 0,10 597 ± 5 Tetrâmero IgA2m2 0,97 ± 0,02 0,69 ± 0,05 1,93 ± 0,02 533 ± 5 IgG1 0,88 ± 0,05 NB NB NB

[000321] NB: Nenhuma Ligação. Todos os experimentos foram realizados pelo menos n=3.

[000322] Perfis farmacocinéticos e biodistribuição de IgA recombinante. Os perfis de tempo de concentração de soro dos oligômeros de IgA recombinantes divulgados foram analisados e determinados a serem comparáveis aos dados relatados anteriormente usando monômeros recombinantes (Figura 5A e Tabela 4) (Boross et al. (2013), Rouwendal et al.

(2016) e Lohse et al., Br J Haematol 112:4170 (2017)). A depuração sérica muito rápida (> 200 mL/dia/kg) foi observada após uma única administração de oligômeros IgA recombinantes. O monômero de IgA humana purificado no soro exibiu uma depuração geral mais lenta e um perfil de PK do soro geralmente em linha com o relatado anteriormente para um monômero de IgA altamente sialilado (Rouwendal et al. (2016)). Além de caracterizar os perfis de tempo de concentração sérica, um estudo de biodistribuição radiomarcado em camundongos com anticorpos marcados com I-125 e In-111 duplo também foi realizado. A abordagem de traçador duplo forneceu a capacidade de distinguir entre o anticorpo intacto antes da degradação lisossomal (I-125) e o anticorpo internalizado/catabolizado (In-111 menos I-125), conforme descrito anteriormente (Figuras 5B-C) (Boswell et al., Bioconjugate Chem 21:2153–63 (2010), Mandikian et al., Mol Cancer Ther 17:776–85 (2018) e Rajan et al., MAbs 9:1379–88 (2017)). Resumidamente, o iodo se difunde rapidamente para fora das células e é eliminado após os anticorpos iodados sofrerem degradação lisossomal, enquanto os anticorpos marcados com In-111 mostram acúmulo intercelular de adutos de In-111 após a degradação lisossomal. Uma vez que os anticorpos IgA foram eliminados tão rapidamente em comparação com o IgG1, as comparações diretas dos dados de distribuição nos tecidos são difíceis, pois os valores do tecido bruto representam as concentrações tanto intersticiais quanto vasculares. Portanto, os dados de distribuição de anticorpos intactos foram corrigidos pelo sangue conforme descrito anteriormente para representar apenas as concentrações intersticiais nos tecidos (Boswell et al., Mol Pharmaceutics 11:1591–8 (2014)). Pequeno enriquecimento de oligômeros de IgA intactos em comparação com IgG1 foi observado após 1 hora no fígado, estômago, intestino delgado, intestino grosso e pele (todos os tecidos que expressam pIgR (Asano et al., Scand J Immunol 60:267-72 (2004) e Wang et al., Scand J Immunol 83:235–43 (2016)), embora em níveis baixos (Figura 5B).

Altos níveis de degradação de IgA também foram observados nos formatos estudados após 1 hora de dosagem no fígado e no intestino delgado (Figura 5C). Para contabilizar a diferença nas concentrações sanguíneas totais observadas entre os formatos, a proporção entre as concentrações de tecido individual e plasma também foi descrita (Figura 9). Após 1 dia, quase nenhum anticorpo IgA intacto foi deixado nos tecidos (Figura 10) e o maior catabolismo no fígado foi detectado (Figura 11), embora o catabolismo no intestino delgado possa não ter sido detectado, pois o In-111 não acumula muito bem em pontos de tempo posteriores nas células intestinais (Boswell et al., British Journal of Pharmacology 168: 445–57 (2013)). Sem estar vinculado a uma teoria em particular, foi levantada a hipótese de que a redução da degradação e eventuais mecanismos de depuração de IgA poderiam melhorar ainda mais a captação de moléculas de IgA no tecido da mucosa em comparação com IgG.

[000323] Foi relatado que o teor de sialilação nos glicanos ligados a N de moléculas de IgA monoméricas se correlaciona negativamente com a depuração de anticorpos por meio de receptores de glicano específicos (Rouwendal et al. (2016)). Assim, as moléculas de IgA divulgadas foram analisadas para determinar seu teor geral de sialilação. Os glicanos foram classificados em categorias com base no nível de processamento com complexo e sialilado sendo os mais desejados para as moléculas de IgA (Figura 6A). Os dímeros produzidos de forma recombinante de IgA1, IgA2m1, IgA2m1.P221R, IgA2m2, bem como monômero e tetrâmero de IgA2m2, foram cerca de 20-50% sialilados (Figura 6B, Figura 25 e Figura 26, e Tabela 5). Isso indica que as moléculas de IgA contêm glicanos processados de forma incompleta que podem ser reconhecidos pelos receptores de glicano. Além disso, o teor de sialilação em cada local no dímero IgA2m1 foi examinado e foi descoberto que todos os locais, incluindo o local na JC, continham glicanos processados incompletamente, sugerindo que o processamento incompleto de glicano não está ocorrendo em apenas um local específico (Figura 6C e Tabela 6). Em contraste com as moléculas de IgA recombinantes divulgadas, a IgA purificada de soro humano tem um teor de sialilação de 95% (Figura 6B e Tabela 5) e era monomérica conforme determinado por SEC-MALS. Como a IgA sérica é conhecida por ser predominantemente monomérica (Kerr (1990)),

ela pode ser enriquecida com moléculas altamente sialiladas, uma vez que o teor de sialilação se correlaciona positivamente com a exposição sistêmica de anticorpos. Sem estar limitado por uma teoria particular, acredita-se que este nível de sialilação aumentado do monômero de IgA purificado humano se correlacionaria com a eliminação da molécula no soro diminuída em camundongos em relação ao monômero de IgA recombinante. De fato, isso foi demonstrado ser verdade, o que sugere que a ligação a receptores específicos de glicano no fígado pode ser um importante mecanismo de depuração para monômero de IgA (Figura 5A, Figura 25 e Figura 27).

TABELA 4. ESTIMATIVAS DE PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS (MÉDIA) APÓS UM BOLUS IV DE 5 MG/KG DE MONÔMEROS/OLIGÔMEROS DE IGA PARA CAMUNDONGOS BALB/C Cmáx ÚltimaAUC CL Meia-vida (µg/mL) (dia*µg/mL) (mL/dia/kg) (dias) Monômero IgA2m2 76,42 8,674 573,2 0,36 Dímero IgA1 85,17 14,61 341,3 0,31 Dímero IgA2m1 92,53 13,40 372,9 0,26 Dímero IgA2m1 P221R 107,8 17,55 284,5 0,27 Dímero IgA2m2 144,7 20,88 238,9 0,31 Tetrâmero IgA2m2 60,47 6,127 788,1 0,22 Monômero IgA de soro 203,3 203,0 45,74 0,97 humano # IgG1 100,1 339,3 14,30 2,89

[000324] ÚltimaAUC = área sob a concentração−curva de tempo, última concentração mensurável; CL = liberação; Cmax = concentração máxima observada; IV = intravenosa; #Dosado em bolus IV de 10 mg/kg para camundongos Balb/c. Nota: Como a análise de PK esparsa foi realizada para todos os dados de PK de camundongos, os dados de camundongos individuais por grupo foram agrupados e SD não foi relatado.

[000325] Geração de variantes de IgA que reduziram a ligação de pIgR. Variantes de IgA2m2 foram geradas para determinar o efeito de mutações na ligação de pIgR. Variantes de IgA2m2 que têm uma mutação dos aminoácidos Y411, V413 e T414 para alanina (referida neste documento como "411-414AAA"), uma mutação P440R, uma mutação C311S ou combinações dos mesmos foram geradas. Os níveis de expressão de tais variantes são fornecidos na Figura 30A. A Figura 30B fornece a caracterização de SEC de variantes de IgA2m2 anti-IL-13 purificadas em pequena escala.

Como mostrado na Figura 30C-D, as variantes de IgA2m2 que têm uma mutação dos aminoácidos Y411, V413 e T414 não se ligam a pIgR de camundongo ou pIgR humano, enquanto a variante de P440R resultou em uma afinidade diminuída em 10 vezes para pIgR murino e uma perda significativa na capacidade de ligação a pIgR humano. Além disso, as variantes de IgA2m2 que possuem uma mutação dos aminoácidos 411, 413 e 414 também não se ligam a FcαRI (Figura 30E).

TABELA 5. ANÁLISE GLOBAL DE GLICANO LIGADO A N DE MOLÉCULAS DE IGA MONOMÉRICAS E POLIMÉRICAS. Soro IgA2m1 IgA2m2 IgA1 IgA2m1 IgA2m2 IgA2m2 humano P221R Monômero Dímero Dímero Dímero Tetrâmero Monômero Dímero IgA 1,4% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 1,7% 1,1% 0% 0,9% 0% 2,2% 0% 2,7% 13,6% 11,8% 6,4% 4,7% 3,9% 0% 2,6% 6,6% 4,7% 3,4% 3,2% 4,2% 0% 2,3% 0% 0,8% 0,5% 0% 1,5% 0% 1,3% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 1,1% 0% 0% 0% 0% 0% 0% asialil Manose Alta 0% 0% 0% 0,9% 0% 0% 0% 0% 3,9% 16,8% 14,0% 13,2% 15,1% 0% ado e híbrid plexo Com 0,6% 4,7% 2,2% 1,0% 1,6% 0,8% 0% o ,

Soro IgA2m1 IgA2m2 IgA1 IgA2m1 IgA2m2 IgA2m2 humano P221R Monômero Dímero Dímero Dímero Tetrâmero Monômero Dímero IgA

0% 1,3% 1,0% 0% 0% 0% 0%

1,9% 8,3% 7,6% 1,8% 2,0% 3,2% 0%

1,0% 2,3% 0,8% 0,8% 0% 0% 0%

0,8% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

0% 0% 0,9% 0% 0,8% 0,9% 2,3%

0% 0% 0% 0% 0% 0% 1,2%

1,2% 2,8% 1,9% 2,8% 3,3% 0,5% 0%

32,8% 12,7% 5,8% 6,7% 9,3% 8,3% 0%

2,6% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

0% 0% 0,9% 0% 1,7% 0% 0%

10,5% 2,6% 2,9% 2,8% 3,4% 3,6% 0%

8,4% 0% 0% 0% 0% 0,9% 0%

1,2% 0% 0% 0% 0% 0% 0,6%

0% 0,8% 0% 0% 0% 0% 1,0%

0% 0% 0% 1,3% 0,8% 0% 0%

0% 0% 0,6% 0% 0% 0% 0%

0% 1,3% 2,3% 1,7% 3,0% 2,7% 0%

0% 0% 0% 0% 0% 0% 1,4% Complexo, Sialilado

0% 1,8% 0% 0% 0,7% 0% 0%

0% 0% 0,9% 0% 0% 0% 0%

0% 14,7% 0% 0% 2,1% 0% 6,0%

Soro IgA2m1 IgA2m2 IgA1 IgA2m1 IgA2m2 IgA2m2 humano P221R Monômero Dímero Dímero Dímero Tetrâmero Monômero Dímero IgA 0% 0,7% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 6,0% 0% 1,2% 0% 0,9% 1,1% 0,7% 0% 0% 0% 1,0% 0% 0% 0% 0% 1,0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0,5% 0,8% 3,7% 0% 0% 0% 33,6% 10,2% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 7,0% 0,5% 3,4% 3,8% 0% 1,0% 14,1% 7,1% 32,7% 49,9% 45,6% 48,9% 2,1% 0% 1,5% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 2,0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 25,4% 0% 0,9% 0% 0,8% 0% 0% 0% 0% 1,6% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0,5% 0% 0% 0% 0,7% 7,2% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 10,1% 0% 0% 0% 0% 0% 1,7% 0%

[000326] Modificar as condições de cultura de células para aumentar o teor de sialilação dos anticorpos IgA. As condições de cultura de células que expressam anticorpos IgA foram modificadas para aumentar o teor de sialilação dos anticorpos. As condições de cultura de células que foram testadas são fornecidas na Figura 31A. Como mostrado na Figura 31B, a sialilação dos anticorpos IgA2m2 aumentou após a adição de sialitransferase (ST) e galactosiltransferase (GT) na presença de galactose e N- acetilmanosamina (ManNac) com uma colheita de 7 dias.

TABELA 6. ANÁLISE DE GLICANO LIGADO A N ESPECÍFICO DE LOCAL DE DÍMERO DE IGA2M1. HC N166 HC N263 HC N337 HC N459 JC N49 Aglicosilado 0% 0% 0% 41,4% 0% 0% 0,6% 0% 0% 1,7% 1,8% 12,5% 1,7% 4,2% 1,6% 0% 12,1% 0% 5,6% 2,9% 0,8% 6,1% 0% 0,7% 0% 0% 3,5% 0% 0% 9,7% Manose Alta 1,0% 1,2% 0% 0% 0% 11,4% 0% 0% 2,6% 0% 1,0% 10,0% 1,3% 0,6% 1,2% 0% 4,3% 0% 0% 3,0% 0,7% 11,1% 1,8% 1,5% 0,9% 2,6% 6,3% 1,0% 0,8% 4,6% 0,7% 2,8% 0,7% 1,7% 8,6% Complexo, asialilado e híbrido 1,3% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 4,8% 0% 0% 0% 1,0% 0% 0% 0% 0% 0% 1,1%

HC N166 HC N263 HC N337 HC N459 JC N49

0% 0% 0% 0% 2,7%

3,1% 0% 2,9% 0% 0%

16,8% 0% 24,8% 1,7% 10,6%

0% 0% 1,8% 1,3% 1,0%

1,3% 0% 1,2% 0% 1,6%

11,6% 0% 17,6% 19,7% 1,8%

4,5% 0% 9,7% 0,6% 3,9%

0,8% 0% 0% 0% 0%

0% 0% 1,1% 0,6% 0,6%

0% 0% 0,8% 0% 0%

0% 0% 0,6% 0% 2,7%

0% 3,6% 0% 0,7% 0%

4,2% 0% 0% 0,7% 1,9%

0% 7,8% 0% 1,1% 0%

0,7% 0% 0% 0% 0%

0% 4,0% 0% 2,2% 0%

0% 4,2% 0% 0,9% 2,3%

1,3% 10,1% 0,8% 1,0% 1,5% Complexo, Sialilado

6,5% 0% 10,6% 1,2% 0%

1,5% 0% 0% 0% 0%

11,9% 0% 16,9% 2,0% 0%

HC N166 HC N263 HC N337 HC N459 JC N49 0,7% 0% 0% 0% 0% 1,7% 0% 0% 0% 0% 11,4% 0% 3,9% 2,6% 0,8% 0% 0% 0% 0,8% 0% 0% 0% 0% 0,7% 0% 0,7% 0% 0,6% 0,6% 0,6% 0% 0% 0% 0% 0,7% 0% 0% 0% 0% 6,0% 0% 0% 0% 1,2% 21,1%

[000327] Melhorar o perfil farmacocinético de IgA recombinante através do sítio de glicosilação e engenharia FcRn. Duas abordagens paralelas foram feitas para reduzir a depuração de IgA polimérica recombinante em camundongos. Em primeiro lugar, todos os cinco motivos de glicosilação ligados a N em IgA2m2 e o único local na JC foram removidos por mutagênese para produzir uma molécula sem glicanos (aglicosilados) (Figura 7A e Figura 25). Um polímero IgA aglicosilado não será reconhecido pelos receptores de glicano e permitirá o estudo da farmacocinética independente dos mecanismos de depuração mediados pelo receptor de glicano. Como mostrado na Figura 36B-D, as variantes de glicosilação de IgA2m2 individuais têm ligação semelhante a pIgR de camundongo e pIgR humano. Para a remoção dos motivos de glicosilação ligados a N N-X-S/T em IgA2m2, N foi mutado para A/G/Q ou o S/T foi mutado para A ou revertido o motivo para a sequência de IgA1 não glicosilada nos três casos em que isso ocorre (Figura 1A). O resíduo JC N49 foi mutado para A/G/Q ou S51 foi mutado para A.

Verificou-se que as mutações IgA2m2 individuais N166A, S212P, N263Q, N337T.I338L.T339S e N459Q, e a mutação N49Q JC para dar a maior níveis de expressão transitória, no entanto, a combinação de mutações para remover todos os cinco locais de glicosilação em IgA2m2 resultou em expressão pobre e a adição posterior da mutação N49Q da cadeia J a aboliu completamente.

Consulte também a Figura 24A-C. Imunoglobulinas quiméricas frequentemente mostram níveis de expressão mais baixos em células de mamíferos em relação às de uma única espécie. Portanto, os domínios variáveis de anti-mIL13 murino foram trocados para anti-HER2 humanizado para gerar IgAs humanizadas, no entanto, isso não melhorou os níveis de expressão transitória. Portanto, uma linha celular estável de integração direcionada a CHO (TI) foi produzida para aumentar o nível de expressão do polímero anti-HER2 IgA2m2 humano aglicosilado que foi purificado como uma mistura de espécies oligoméricas.

[000328] Em segundo lugar, duas fusões IgG1-IgA Fc foram projetadas a fim de explorar a ligação FcRn como uma forma de reduzir a degradação lisossomal (Figura 7B). Estudos anteriores sugeriram que esta abordagem resgatou a depuração do monômero de IgA para níveis comparáveis a IgG1 (Li et al. (2017) e Borrok et al. (2015)). Inicialmente, as versões diméricas e tetraméricas da fusão IgG1-IgA2m1 P221R Fc relatada anteriormente (Borrok et al. (2015)) foram feitas, mas observaram que estas apresentaram instabilidade no plasma de camundongo em 4 dias (Figura 7C).

O produto de truncamento primário eluiu em SEC analítico em um tempo semelhante ao anti-HER2 IgG1 de comprimento total (trastuzumabe), sugerindo que essa instabilidade foi causada pela clivagem de endoproteases na união Fc de IgG1-IgA2m1 P221R. A sequência de aminoácidos da união foi inspecionada e um trecho de resíduos carregados positivamente que se assemelhava a um local de clivagem do tipo furina foi identificado (Figura 12). Para mitigar a clivagem proteolítica, esses resíduos carregados positivamente na união foram eliminados pela remoção do K447 terminal C da cadeia pesada de IgG1 e iniciaram o Fc de IgA2m1 com P221, o resíduo de IgA2m1 nativo (em vez da mutação P221R) ou C242, que exclui a dobradiça IgA2m1 (Figura 12 e Figura 34A). O início de C242 Fc também foi incluído, pois era o primeiro resíduo da construção de estrutura de cristal Fc de IgA1, então foi presumido como uma proteína truncada estável (Herr et al., Nature 423:614–20 (2003)).

Quando as fusões IgG1ΔK-P221 IgA2m1 Fc e IgG1ΔK-C242 IgA2m1 Fc reprojetadas foram produzidas como dímeros, ambas foram consideradas estáveis no plasma de camundongo por até 4 dias (Figura 7C). A Figura 34B fornece os dados de expressão transitória para fusões de Fc anti-IL-13 IgG1- IgA de comprimento total. Algumas das moléculas de fusão projetadas exibem expressão melhorada em comparação com IgG1 e a construção original (Figura 34B e Figura 37A). Além disso, como mostrado na Figura 33A, o aumento da quantidade de DNA de JC em comparação com a quantidade de DNA de LC e HC resultou na produção de mais espécies de dímeros do que de espécies oligoméricas de ordem superior.

[000329] As fusões IgG1-IgA1 também foram geradas pela fusão de IgG1 no resíduo de dobradiça inferior E233 ou L234 ao Fc de IgA1 em C241 ou C242. Conforme mostrado na Figura 37B, as fusões IgG1-IgA1 foram predominantemente expressas como dímeros, semelhantes a IgA1. Além disso, as fusões IgG1-IgA1 ligaram-se a pIgR humano e de camundongo e FcαRI humano de maneira semelhante a IgA1 (Figura 37C).

[000330] Os anticorpos IgA projetados e moléculas de fusão IgG1-IgA foram analisados quanto à estabilidade por fluorimetria de varredura diferencial (DSF), confirmando nenhuma perda na estabilidade em comparação com o dímero IgA1 (Figura 32).

[000331] Os anticorpos IgA projetados e moléculas de fusão IgG1-IgA foram ainda caracterizados quanto ao teor global de glicano, ligação ao antígeno e ligação ao receptor. O polímero IgA2m2 anti-HER2 aglicosilado de fato não teve glicosilação, enquanto o anti-mIL-13 IgG1∆ K-P221 IgA2m1 Fc e as fusões IgG1 K-C242∆ IgA2m1 Fc continham apenas ~20% de complexo de glicanos sialilados (Figura 13 e Tabela 8). Verificou-se que o polímero anti- HER2 IgA2m2 aglicosilado tinha afinidade de ligação semelhante ao humano (h)HER2, murino (m)pIgR e hpIgR como o tetrâmero IgA2m2 glicosilado, embora não se ligasse ao receptor de hFc específico de IgA, hFcαRI, como determinado pelo ensaio Wasatch SPR (Tabela 7; ver também Figura 33B-C).

Curiosamente, um tetrâmero IgA2m2 sem glicosilação no IgA2m2 de HC, mas retendo a glicosilação na cadeia J, também foi incapaz de se ligar a hFcαRI (Figura 35A-B) conforme determinado pelo ensaio Wasatch SPR, sugerindo que a glicosilação do IgA de HC é necessária para ligação ao receptor. No entanto, como mostrado usando o sistema Biacore SPR, que é o sistema SPR comumente usado na indústria farmacêutica, o estado de glicosilação dos polímeros de IgA não afetou a ligação a hFcαRI (Figura 52A-B). Como mostrado na Figura 52A-B, polímero anti-HER2 IgA2m2 aglicosilado (referido como "xHER2 4D5.IgA2m2 Tetrâmero N168A.S214P.N252Q.N326T.I327L.T328S.N461Q, J-N71Q") e anti-IL-13 oligômeros IgA2m2 retiveram a ligação de hFcαRI conforme determinado pelo ensaio Biacore SPR. Sem estar vinculado a uma teoria particular, as diferenças nos resultados obtidos nos dois sistemas SPR, ou seja, os sistemas Wasatch e Biacore, podem ser devidas, em parte, às diferentes estratégias utilizadas para imobilizar os anticorpos aos chips usados no SPR sistemas conforme divulgado nos métodos.

[000332] Além disso, tanto o anti-mIL-13 IgG1∆ K-P221 IgA2m1 Fc quanto os dímeros IgG1K-C242 IgA2m1 Fc tinham afinidades de ligação semelhantes a mIL-13, mFcRn e hFcRn como o anti-mIL-13 IgG1 (Tabela 7), bem como afinidades de ligação semelhantes a mpIgR, hpIgR e hFcα como um dímero IgA2m1 (Tabelas 3 e 7) conforme determinado pelo ensaio Wasatch SPR. Assim, as fusões IgG1-Ig2m1A Fc retêm os atributos desejados de IgG e IgA poliméricas.

TABELA 7. AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE DÍMEROS DE FUSÃO IGG1-IGA2M1 FC E TETRÂMERO IGA2M2 AGLICOSILADO PARA ANTÍGENOS E RECEPTORES USANDO O ENSAIO DE LIGAÇÃO WASATCH. KD (nM) Camundongo HER2 PIgR PIgR FcRn de FcRn FcαRI IL-13 humano camundongo humanocamundongo* humano* humano pH de 6,0 pH de 6,0 Tetrâmero 0,21 ± 0,50 ± 1.590 ± anti-HER2 NB 0,35 ± 0,01 NB NB 0,08 0,06 200 IgA2m2 Aglicosilado com 0,27 ± 0,72 ± tetrâmero NB 0,55 ± 0,10 NB NB NB 0,07 0,06 anti-HER2 IgA2m2 anti-IL-13 IgG1ΔK- 7,67 ± 8.400 ± 1.070 ± 1,46 ± 0,33 NB 3,32 ± 1,07 6.800 ± 556 Dímero P221 0,42 294 69,8 IgA2m1 Fc anti-IL-13 IgG1ΔK- 4,41 ± 9.900 ± 938 ± 1,38 ± 0,15 NB 3,32 ± 1,62 7.400 ± 830 Dímero C242 1,72 838 93,9 IgA2m1 Fc anti-IL-13 9,800 ± 1,15 ± 0,17 NB NB NB 7.800 ± 499 NB IgG1 1.081 Monômero

1.750 ± IgA de Soro NB NB NB NB NB NB 92,9 Humano

[000333] NB: Nenhuma Ligação. * KD foi calculado usando a cinética de estado estacionário. Todos os experimentos foram realizados pelo menos n=3.

TABELA 8. ANÁLISE GLOBAL DE GLICANO LIGADO A N DE OLIGÔMEROS DE FUSÃO IGG1-IGA2M1 FC E TETRÂMERO IGA2M2 AGLICOSILADO. Anti-IL-13 IgG1∆K- P221 Anti-IL-13 IgG1∆K- C242 Anti-HER2 IgA2m2 Dímero Fc IgA2m1 Dímero Fc IgA2m1 Tetrâmero Aglicosilado Manose Alta 2,7% 2,2% 0% 1,4% 2,2% 0%

Anti-IL-13 IgG1∆K- P221 Anti-IL-13 IgG1∆K- C242 Anti-HER2 IgA2m2 Dímero Fc IgA2m1 Dímero Fc IgA2m1 Tetrâmero Aglicosilado

5,0% 4,0% 0%

0,5% 0,9% 0%

2,9% 3,4% 0%

1,2% 1,8% 0%

0% 0,8% 0%

4,4% 5,3% 0%

2,3% 3,2% 0%

1,4% 2,8% 0%

4,1% 3,2% 0% Complexo, asialilado e híbrido

46,1% 41,3% 0%

1,5% 1,6% 0%

2,5% 2,5% 0%

3,5% 1,2% 0%

0,9% 1,2% 0%

0,5% 0,5% 0%

1,9% 2,4% 0%

0,6% 1,1% 0%

0,7% 0,8% 0%

3,0% 4,4% 0% Complexo, Sialilado

4,9% 4,0% 0%

8,0% 8,2% 0%

0% 0,5% 0%

Anti-IL-13 IgG1∆K- P221 Anti-IL-13 IgG1∆K- C242 Anti-HER2 IgA2m2 Dímero Fc IgA2m1 Dímero Fc IgA2m1 Tetrâmero Aglicosilado 0% 0,5% 0%

[000334] Os perfis de tempo de transcitose mediada por pIgR in vitro e concentração de soro foram medidos em camundongos de ambos os formatos recém-gerados. As fusões IgG1-IgA2m1 Fc mostraram as melhorias mais marcantes nas exposições gerais de soro de IgA em camundongos (Figura 7D, Figura 34C e Tabela 9), ainda os níveis mais baixos de transcitose in vitro em comparação com o polímero IgA2m2 aglicosilado, que apresentou os mais elevados nível de transcitose in vitro (Figura 7E).

TABELA 9. ESTIMATIVAS DE PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS (MÉDIA) APÓS UM BOLUS IV DE 30 MG/KG DE OLIGÔMEROS IGA PARA CAMUNDONGOS BALB/C. Cmáx ÚltimaAUC CL Meia- (µg/mL) (dia*µg/mL) (mL/dia/kg) vida (dias) Tetrâmero anti-HER2 IgA2m2 48,9 617,8 612,8 0,87 Aglicosilado com tetrâmero anti-HER2 159 1063,7 320,7 0,68 IgA2m2 Dímero Fc anti-IL-13 IgG1∆K-P221 IgA2m1 176 962,5 236,8 3,42 Dímero Fc anti-IL-13 IgG1∆K-C242 IgA2m1 177 739,9 192,3 1,94 Dímero Anti-IL-13 IgA2m1 115 1371,8 430,9 0,41

[000335] ÚltimoAUC= área sob a concentração− curva de tempo, última concentração mensurável; CL= liberação; Cmax= concentração máxima observada; 4= intravenosa. Nota: Como a análise de PK esparsa foi realizada para todos os dados de PK de camundongos, os dados de camundongos individuais por grupo foram agrupados e SD não foi relatado.

DISCUSSÃO:

[000336] O IgA tem o potencial de estender o alcance terapêutico dos anticorpos monoclonais além das funcionalidades atuais fornecidas pelo IgG. Em parte, isso é possibilitado pela versatilidade da IgA para formar espécies monoméricas e poliméricas. Nos últimos anos, um progresso significativo foi feito na produção recombinante de IgA monomérica

(Leusen (2015), Dicker et al., Bioengineered (2016), Vasilev et al., Biotechnol Adv (2015) e Virdi et al., Cell Mol Life Sci (2015)), fornecendo um caminho robusto para isolar material bem caracterizado com teor de sialilação aumentado dos glicanos ligados a N que resultou em depuração de soro melhorada (Rouwendal et al. (2016)). Embora as fortes propriedades citotóxicas da IgA monomérica sejam uma característica atraente para indicações oncológicas, a IgA polimérica é necessária para atingir alvos além das barreiras epiteliais por meio de transcitose mediada por pIgR. Antes do trabalho descrito neste documento, apenas misturas de monômero e oligômeros feitos de forma recombinante foram usadas para experimentos in vivo estudando transcitose (Olsan et al. (2015) e Rifai et al. (2000)). Os experimentos descritos neste exemplo estabelecem uma expressão robusta e via de purificação permitindo o enriquecimento de IgA dimérico e tetramérico.

Em particular, a modulação da quantidade de DNA de JC usado na transfecção ou o estado de glicosilação da região da arremate de IgA foi capaz de influenciar a distribuição de espécies oligoméricas. Curiosamente, o local de glicosilação ligado a N no arremate de IgA é o único local extremamente conservado entre as espécies (Figura 14), oferecendo uma maneira de controlar a formação de oligômero de IgA de ordem superior in vivo. Para purificação de IgA recombinante, cromatografia de afinidade de Proteína L foi usada seguida por HPLC-SEC e foram prontamente capazes de separar dímero de tetrâmero.

[000337] Foi demonstrado anteriormente que o aumento do nível de sialilação no monômero de IgA expresso de forma recombinante reduz a depuração do soro ao superar o catabolismo mediado pelo receptor de glicano (Rouwendal et al. (2016)). Como estratégia alternativa, a contribuição do glicano para a depuração sérica de IgA oligomérica foi eliminada e o polímero IgA2m2 totalmente aglicosilado foi produzido. A falta de glicanos ligados a N não afetou a ligação a pIgR, conforme avaliado por ressonância plasmônica de superfície. Surpreendentemente, no ensaio de transcitose de MDCK in vitro, as espécies aglicosiladas melhoraram significativamente a transcitose em comparação com o tetrâmero ou dímero glicosilado. Esta melhoria não foi observada em um estudo anterior com dímero de IgA1 humano que tinha glicanos ligados a N removidos da região Fc do anticorpo, mas ainda tinha o carboidrato presente na cadeia J de murino (Chuang et al., (1997)). Sem estar vinculado a uma teoria particular, uma explicação é que a falta de glicano elimina a ligação aos receptores de glicano, proporcionando transcitose imperturbada e mais eficiente por meio da ligação de pIgR.

Curiosamente, a ligação de IgA2m2 tetramérica a FcαRI era dependente da glicosilação, o que está em contraste com a falta de efeito na ligação observada para IgA2m1 monomérico projetado para conter um número reduzido de locais de glicosilação. Embora os efeitos citotóxicos da IgA polimérica não tenham sido analisados, uma IgA terapêutica que pode transcitose sem ativar o FcαRI é desejável para doenças inflamatórias, pois isso impediria as respostas pró-inflamatórias da migração de neutrófilos (Aleyd et al., Immunol Rev 268:123-38 (2015)).

[000338] Os oligômeros e monômeros de IgA glicosilados produzidos de forma recombinante nos experimentos divulgados no presente documento foram eliminados rapidamente do soro de forma semelhante ao que foi observado anteriormente para IgA monomérica e polimérica (Rouwendal et al. (2016) e Chuang et al., (1997)). A eliminação rápida foi atribuída à ligação potencial aos receptores de glicano e degradação subsequente no lisossoma.

O estudo de biodistribuição com IgA glicosilada apoiou esta conclusão, indicando o maior catabolismo no fígado e intestino delgado. Para entender melhor a contribuição de ter glicanos, um polímero IgA sem glicanos (aglicosilado) foi gerado e seu perfil de PK in vivo foi comparado diretamente com a versão glicosilada. O polímero IgA2m2 aglicosilado não apresentou nenhuma diferença apreciável na exposição geral ao soro de camundongo em comparação com o polímero glicosilado (<2 vezes). Isso sugere que ter glicanos ligados a N desempenham um papel mínimo na contribuição para a depuração de polímeros de IgA em camundongos. Embora mais estudos sejam necessários para entender por que o oligômero IgA aglicosilado não melhora a depuração do soro, parece que a transcitose e/ou depuração mediada por pIgR pode desempenhar um papel significativo na determinação das concentrações séricas globais e o destino da IgA polimérica em camundongos. Na verdade, a afinidade de ligação de equilíbrio de IgA tetramérica a pIgR está pelo menos na faixa picomolar, permitindo a ligação eficiente ao receptor pIgR abundante, seguida por transcitose. No entanto, um estudo de biodistribuição detalhado olhando para o perfil de distribuição do tecido será necessário para melhor interpretar os perfis de tempo de concentração sérica das moléculas e a disposição de IgA polimérica aglicosilada. Uma advertência importante para estudar as propriedades farmacocinéticas e a biodistribuição de uma molécula de IgA polimérica em roedores é que os padrões de expressão de pIgR diferem entre roedores e humanos, potencialmente confundindo a tradução clínica eventual. Em particular, a alta expressão de pIgR nos hepatócitos de roedores e coelhos foi associada a mecanismos de depuração biliar de IgA polimérica (Daniels et al. (1989)), que não ocorre em humanos, onde a expressão de pIgR é encontrada em células do ducto biliar (Tomana et al. (1988)). Portanto, o papel exato que o pIgR desempenha na biodistribuição e depuração de uma molécula de IgA polimérica em camundongos precisa ser avaliado separadamente.

[000339] Uma estratégia alternativa que foi adotada para evitar a depuração sérica acelerada e melhorar a exposição foi através da engenharia de fusões IgG1-IgA2m1 Fc. A capacidade de ligar FcRn permite a reciclagem no endossomo, evitando assim a classificação para degradação lisossomal. Relatórios anteriores com fusões monoméricas de IgG-IgA Fc relataram depuração sérica comparável à IgG (Li et al. Oncotarget (2017) e Borrok et al. (2015)). Além disso, uma melhoria na farmacocinética também foi observada para IgA monomérica que foi fundida a peptídeos de ligação de albumina (Meyer et al., MAbs 8: 87-98 (2016)). Uma vez que uma grande contribuição não foi observada pela remoção de glicanos dos polímeros de IgA, proteínas de fusão glicosiladas foram produzidas. Embora as fusões IgG1-IgA2 Fc diméricas mostraram exposições séricas globais melhoradas, não foram comparáveis a IgG conforme observado para as fusões IgG-IgA Fc monoméricas (Li et al. Oncotarget (2017) e Borrok et al. (2015)). Por ressonância plasmônica de superfície, foi demonstrado que as fusões IgG1- IgA2m1 Fc diméricas podem se ligar a FcRn e pIgR, embora tendo uma transcitose in vitro reduzida em um modelo MDCK. Enquanto a ligação a FcRn estendeu a meia-vida terminal, a interação de dímero Fc de IgG1-IgA2m1 com pIgR pode ter fornecido um mecanismo de depuração, particularmente na fase inicial, que resultou em transcitose e/ou depuração mediada por pIgR, contribuindo para o soro reduzido concentrações em comparação com IgG.

[000340] IgA no soro é constituído predominantemente de monômero IgA1 secretado de células da medula óssea, enquanto IgA2 polimérico é secretado de células plasmáticas na lâmina própria no local da transcitose (Yoo et al. 116:3-10 (2005)). A alta afinidade entre IgA polimérica e pIgR pode levar naturalmente à eliminação rápida de IgA polimérica da circulação, proporcionando eliminação eficaz de antígenos prejudiciais da circulação como complexos de antígeno IgA (Shroff et al., Infect Immun 63:3904-13 (1995)) e em um ambiente terapêutico pode ser explorado para restringir a atividade da droga a um tecido definido e de curta duração, algo que pode ser de benefício particular ao agonizar os receptores de citocinas. A eliminação rápida de IgA polimérica via pIgR do soro em camundongos é ainda suportada pelas concentrações de IgA aumentadas de aproximadamente 20 vezes no soro de camundongos NOD deficientes em pIgR (Simpfendorfer et al., PLoS ONE 10:e0121979 (2015)).

EXEMPLO 2: PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IGA RECOMBINANTES

[000341] IgAs recombinantes contendo uma cadeia leve kappa foram expressos em células CHO como proteínas secretadas e afinidade capturada do sobrenadante da cultura celular usando uma coluna Capto L (GE Healthcare). Após a captura, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna (CVs) de tampão Tris (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, NaN3 2 mM), 20 CVs de tampão Triton X-114 (Tris 25 mM, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-114, 2 mM NaN3) para remover endotoxina, 5 CVs de tampão Tris, 5 CVs de tampão KP (0,4 M fosfato de potássio, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,02% Tween20, 2 mM NaN3), e 10 CVs de tampão Tris. As IgAs foram eluídas com ácido acético 150 mM, pH 2,7 e imediatamente neutralizadas com 1/5 do volume de arginina 1 M, succinato 0,4 M, pH 9,0.

[000342] Após a purificação por afinidade, IgAs recombinantes foram purificados usando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Para amostras de IgA recombinante em que havia principalmente um estado oligomérico presente (> 90% de um único tipo de oligômero), uma coluna HiLoad Superdex 200 pg (GE Healthcare) foi usada para SEC seguida por corte de pico para evitar contaminantes de estados oligoméricos indesejados. Para amostras de IgA contendo misturas complexas de oligômeros em quantidades quase equivalentes (por exemplo, ~40% dímero e ~60% polímeros de ordem superior), várias abordagens de purificação foram testadas. Uma mistura de oligômeros anti-mIL-13 IgA2m2 humana como mostrado na Figura 39 foi usada para testar os diferentes tipos de purificações descritos a seguir.

[000343] SEC usando uma coluna HiLoad Superose 6 16/600 pg (GE Healthcare) deu resolução insuficiente na faixa de peso molecular mais alto para separar dímeros de IgA de oligômeros de ordem superior, como mostrado na Figura 40. No perfil de eluição Superose 6, o pico 1 elui perto de ~35-39 mL, o que corresponde ao volume vazio da coluna e, portanto, é provavelmente a proteína agregada. Os picos 2 e 3 se sobrepõem significativamente de modo que o pico 3 apareça como um ombro na borda posterior do pico 2. A análise das frações perto da borda dianteira do pico 2 e da borda posterior do pico 3 por SEC-MALS como descrito acima deu massas molares de 735.000 g/mol e 375.300 g/mol, respectivamente. O peso molecular esperado do monômero humano anti-mIL-13 IgA2m2 é ~148 kDa, dímero ~312 kDa, trímero ~460 kDa, tetrâmero ~608 kDa e pentâmero ~756 kDa. Isso sugere que os picos 2 e 3 provavelmente contêm uma mistura de pentâmero, tetrâmero, trímero e dímero. O pico 4 eluindo mais tarde em torno de ~60 mL provavelmente corresponde a IgA monomérica.

[000344] SEC usando uma coluna HiLoad Superdex 200 pg (GE Healthcare) ou uma coluna HiLoad Sephacryl 400 pg (GE Healthcare) também deu resolução insuficiente de dímeros de IgA de oligômeros de ordem superior. Tentativas de separar oligômeros por cromatografia de troca catiônica usando uma coluna SP HP (GE Healthcare), cromatografia de troca aniônica usando uma coluna Q FF (GE Healthcare) e cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando um ProPac de 5 μm, 7,8 x 75 mm A coluna HIC-10 (Dionex) também não teve sucesso.

[000345] Em contraste, a realização de purificações em pequena escala usando uma coluna XBridge Protein BEH 450 Å SEC de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm (Waters) deu a melhor separação de dímeros de IgA de oligômeros de ordem superior, como mostrado na Figura 41 para um anti-mIL-

13 IgA2m2 humano. Para maximizar a resolução, menos de 1 mg de proteína total em um volume de injeção não superior a 100 μL foi executado na coluna a 1 mL/min usando um HPLC Agilent 1260 Infinity com 0,2 M de arginina, 0,137 M de succinato, pH 5,0 como o dispositivo móvel fase e frações de 200 μL foram coletadas. As frações foram então seletivamente agrupadas para isolar predominantemente um estado oligomérico. Várias execuções foram realizadas e as frações reunidas de um determinado oligômero de cada execução foram combinadas.

[000346] A identidade de IgA, pureza e estado oligomérico encontrados em frações agrupadas foram caracterizados por SEC-MALS usando uma coluna de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm XBridge Protein BEH 200 Å SEC (Waters) conforme descrito abaixo (Figura 42), SDS-PAGE como descrito abaixo (Figura 42), microscopia eletrônica de coloração negativa conforme descrito abaixo (Figuras 43 e 44) e espectrometria de massa conforme descrito abaixo (Figura 45). SEC-MALS foi realizada por injeção de IgAs recombinantes em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) Waters XBridge Protein BEH 200 Å de 3,5 μm, 7,8 mm x 300 mm a 1 mL/min usando um Agilent 1260 Infinity HPLC com 0,2 M de arginina, 0,137 Succinato M, pH 5,0 como a fase móvel. Um exemplo de perfil analítico de SEC de IgA2m2 anti- mIL-13 recombinante de uma purificação de afinidade Capto L é mostrado na Figura 39. As proteínas eluídas da coluna SEC analítica foram injetadas diretamente em um detector de dispersão de luz multi-ângulo (MALS) Wyatt DAWN HELEOS II/Optilab T-rEX para medir a massa molar e polidispersidade dos vários estados oligoméricos IgA presentes em uma determinada amostra.

[000347] Para o anticorpo anti-mIL-13 IgA2m2, havia três picos principais identificados na SEC analítica usando a coluna Waters XBridge Protein BEH 200 Å SEC (Figura 42A). O peso molecular esperado do monômero humano anti-mIL-13 IgA2m2 é ~148 kDa, dímero ~312 kDa, trímero

~460 kDa, tetrâmero ~608 kDa e pentâmero ~756 kDa. Todos os pesos moleculares esperados são baseados na composição da sequência de aminoácidos e não levam em consideração os potenciais glicanos ligados a N ou O, pois a composição de açúcar é frequentemente heterogênea e variável.

Após a separação na coluna Waters XBridge Protein BEH 450 Å SEC, a massa molar do pico 1 foi determinada por MALS como 658.000 g/mol +/- 0,510% (Figura 42B). Isto sugere que o pico 1 é predominantemente IgA2m2 tetramérica. A massa molar do pico 2 foi determinada por MALS como 343.700 g/mol +/- 0,646% (Figura 42C). Isso sugere que o pico 2 é predominantemente IgA2m2 dimérica. O pico 3 que elui mais tarde do que o dímero é provavelmente IgA monomérica (Figura 42A).

[000348] A análise SDS-PAGE dos picos 1 e 2 purificados não reduzidos das Figuras 42B e 42C, respectivamente, mostraram uma banda predominante migrando perto dos pesos moleculares esperados para o tetrâmero e dímero de IgA, respectivamente (Figura 42D). Isso é consistente com as massas molares identificadas por MALS (Figuras 42B e 42C). Após a redução com DTT, três bandas são observadas no gel (Figura 42D). O peso molecular esperado da cadeia pesada (HC) é 50,2 kDa, a cadeia leve (LC) é 23,8 kDa e a cadeia de união (JC) é 15,6 kDa. Todos os pesos moleculares esperados são baseados na composição da sequência de aminoácidos e não levam em consideração os potenciais glicanos ligados a N ou O, pois a composição de açúcar é frequentemente heterogênea e variável. As três bandas funcionam com aproximadamente os pesos moleculares previstos de todas as três cadeias, com a HC e a JC sendo ligeiramente maiores. A HC tem cinco locais de glicosilação ligados a N previstos e a JC tem um local de glicosilação ligado a N previsto que, se ocupado, aumentaria o peso molecular e diminuiria a migração no gel. SDS-PAGE foi realizado misturando proteínas IgA recombinantes com tampão de amostra LDS (Thermo Fisher Scientific)

com ou sem ditiotreitol 10 mM (DTT) e aquecido a 70C por 10 minutos. As amostras foram então corridas em géis Bolt Bis-Tris Plus a 4-12% (Thermo Fisher Scientific) em tampão MES (Thermo Fisher Scientific) e coradas com coloração ClearPAGE Instant Blue (Expedeon).

[000349] Os picos 1 e 2 purificados de IgA2m2 anti-mIL-13 humana das Figuras 42B e 42C, respectivamente, foram analisados por microscopia eletrônica de coloração negativa (EM). Amostras de IgA2m2 purificadas foram primeiro reticuladas por incubação em glutaraldeído a 0,015% (Polysciences, Inc.) por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de fixadas, as amostras foram diluídas usando tampão TBS para atingir uma concentração de 10 ng/µL. Em seguida, 4 µl de cada amostra foram incubados por 40s em grades de cobre de malha 400 descarregadas recentemente com brilho, cobertas com uma camada fina de carbono contínuo antes de serem tratadas com 2% (p/v) de coloração negativa de acetato de uranila (Ciências de Microscopia Eletrônica). IgAs foram então fotografadas usando um Tecnai Spirit T12 (Thermo Fisher) operando a 120 keV, com uma ampliação de

25.000x (2,2 Å/pixel). As imagens foram gravadas usando uma câmera CCD Gatan de 4096 x 4096 pixels em condições de baixa dosagem. Cerca de 5000 partículas para cada amostra de IgA foram então selecionadas e extraídas usando o software e2boxer.py dentro do pacote EMAN2 usando um tamanho de caixa de partículas de 128 pixels. A classificação 2D gratuita de referência, dentro do pacote de software de imagem RELION, foi usada para gerar imagens médias de ambas as amostras. Um arquivo de imagem bruta junto com classes 2D livres de referência são mostrados para os IgAs dos picos 1 e 2 purificados (Figuras 43 e 44). O pico 1 é predominantemente IgA2m2 tetramérica, com algum pentâmero, trímero e dímero também presentes (Figura 43). O pico 2 é IgA2m2 dimérica (Figura 44).

[000350] A análise de espectrometria de massa confirmou a presença de JC, LC e HC em menos de 5 Da dos pesos moleculares esperados com os resíduos amino-terminais de JC e HC formando um ácido piroglutâmico. A espectrometria de massa foi realizada por aquecimento de IgA a 0,5 mg/mL na presença de DTT 5 mM a 97C por 30 minutos para reduzir e desnaturar a proteína. A amostra foi então resfriada em gelo seguida por desglicosilação durante a noite a 37C com 1.000 unidades de PNGaseF (NEB). A IgA reduzida, desnaturada e desglicosilada foi então injetada em uma coluna de 3 μm, 4,6 x 50 mm de cromatografia de fase reversa PLRP-S (Agilent) a 1 mL/min usando um Agilent 1290 Infinity UHPLC. Um gradiente de tampão B de 5%-60% ao longo de 6 minutos foi realizado com ácido trifluoroacético a 0,05% (TFA) em água (tampão A) e TFA a 0,05% em acetonitrila (tampão B). As proteínas eluídas da coluna de fase reversa foram injetadas diretamente em um espectrômetro de massa de tempo de vôo de ionização por eletropulverização Agilent 6230 (ESI-TOF) para medição de massa intacta.

[000351] Além do sucesso descrito para a IgA2m2 nas Figuras 41-45, esta técnica de separação também foi aplicável a todos os outros isotipos e alotipos testados, incluindo IgA1 (Figura 46), IgA2m1 de tipo selvagem (Figura 47) e IgA2m1 contendo a mutação P221R para restaurar a ligação dissulfeto entre a cadeia leve e a cadeia pesada (Figura 48).

EXEMPLO 3: ANÁLISE IN VITRO DE ANTICORPOS IGA RECOMBINANTES E MOLÉCULAS DE FUSÃO IGG-IGA

[000352] A capacidade dos anticorpos IgA e moléculas de fusão IgG-IgA para desencadear a morte de células cancerosas foi analisada in vitro nas linhas de células de câncer de mama HER2 + KPL-4, BT474-M1 e SKBR3 usando um ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo. O ensaio foi realizado da seguinte forma. O sangue periférico de doadores saudáveis foi coletado usando EDTA como anticoagulante. Os neutrófilos humanos, que foram usados como células efetoras, foram isolados do sangue periférico usando o EasySep ™ Direct Human Neutrophil Isolation Kit (STEMCELL Technologies) seguindo as instruções do fabricante. Neutrófilos e células alvo amplificadas por HER2 (SK-BR3; a uma densidade de 10.000 células por poço) foram incubados na proporção de 20:1 na presença de reagentes de teste por 48 horas em placas de 96 poços de fundo transparente preto (Corning). A viabilidade da célula alvo foi medida por unidades de luz relativa de luminescência (RLU) usando o reagente Cell Titer-Glow Luminescent Cell Viability (Promega cat#G7570). A atividade de morte das células alvo foi calculada como: ((RLU sem tratamento - RLU com tratamento)/RLU sem tratamento) × 100%.

[000353] Conforme mostrado na Figura 49, as linhas celulares SKBR3 e BT474-M1 foram sensíveis ao monômero IgA2m1 anti-HER (referido como "monômero 4D5.IgA2m1.P221R.C471S" na Figura 49). Em particular, o monômero IgA2m1 anti-HER resultou na morte significativa de células SKBR3 em comparação com seu efeito na viabilidade das células BT474-M1. No entanto, a linha celular KPL-4 não foi sensível aos anticorpos anti-IgA. Para analisar melhor se a capacidade dos anticorpos IgA de resultar na morte de células cancerosas é específica do doador de neutrófilos, neutrófilos de dois doadores separados foram usados no ensaio de viabilidade celular. Como mostrado na Figura 50, os neutrófilos de dois doadores diferentes foram capazes de mediar a morte de células SKBR3 na presença de anticorpos monoméricos anti-HER2 IgA e moléculas de fusão IgG-IgA monoméricas indicando que a eficácia dos anticorpos e moléculas de fusão não são doadoras específico. Os anticorpos poliméricos anti-HER2 IgA resultaram em menos morte celular em comparação com os anticorpos monoméricos anti-HER2 IgA (Figura 50).

[000354] Experimentos adicionais foram realizados para determinar se o estado de glicosilação do anticorpo afeta sua capacidade de resultar na morte de células cancerosas. Os anticorpos monoméricos e tetraméricos anti-HER IgA glicosilados resultaram na morte significativa de células SKBR3 (Figura 51). No entanto, os anticorpos tetraméricos anti-HER IgA aglicosilados não resultaram na morte das células SKBR3 alvo. Sem estar vinculado a uma teoria particular, esses resultados sugerem que a glicosilação pode afetar a eficácia do anticorpo IgA.

[000355] Além das várias modalidades representadas e reivindicadas, a matéria divulgada também é direcionada a outras modalidades com outras combinações das características divulgadas e reivindicadas neste documento. Como tal, as características particulares apresentadas neste documento podem ser combinadas umas com as outras de outras maneiras dentro do escopo da matéria divulgada, de tal modo que a matéria divulgada inclua qualquer combinação adequada das características divulgadas neste documento. A descrição anterior de modalidades específicas da matéria divulgada foi apresentada para fins de ilustração e descrição. Não se destina a ser exaustivo ou a limitar a matéria divulgada às modalidades divulgadas.

[000356] Será evidente para aqueles técnicos no assunto que várias modificações e variações podem ser feitas nas composições e métodos da matéria divulgada sem se afastar do espírito ou escopo da matéria divulgada. Assim, pretende-se que a matéria divulgada inclua modificações e variações que estão dentro do escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.

[000357] Várias publicações, patentes e pedidos de patentes são citados neste documento, cujos conteúdos são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO IgA ISOLADO, ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo anticorpo IgA compreender uma substituição no aminoácido V458, N459 e/ou S461.

2. ANTICORPO IgA ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo aminoácido V458 ser substituído por uma isoleucina (V458I), o aminoácido N459 ser substituído por uma glutamina (N459Q), uma glicina (N459G) ou uma alanina (N459A) e/ou o aminoácido S461 ser substituído por uma alanina (S461A).

3. ANTICORPO IgA ISOLADO, ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo anticorpo IgA compreender uma substituição no aminoácido I458.

4. ANTICORPO IgA ISOLADO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo aminoácido I458 ser substituído por uma valina (I458V).

5. ANTICORPO IgA ISOLADO, ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo anticorpo IgA compreender uma ou mais substituições em um aminoácido selecionado do grupo que consiste em N166, T168, N211, S212, S213, N263, T265, N337, I338, T339, N459, S461 e uma combinação dos mesmos.

6. ANTICORPO IgA ISOLADO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelas substituições nos aminoácidos N166, S212, N263, N337, I338, T339 e N459 serem N166A, S212P, N263Q, N337T, I338L, T339S e N459Q.

7. ANTICORPO IgA ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo anticorpo IgA ser um anticorpo IgA1, IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn.

8. ANTICORPO IgA ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado pelo anticorpo IgA ter substituições nos aminoácidos N337, I338 e T339 e uma ou mais substituições em T168, N211, S212, S213, N263, T265, N459, S461 e uma combinação dos mesmos.

9. ANTICORPO IgA ISOLADO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo anticorpo IgA ser um anticorpo IgA2m1, IgA2m2 ou IgA2mn.

10. ANTICORPO IgA ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo anticorpo IgA ser humanizado, um anticorpo quimérico ou anticorpo humano.

11. MOLÉCULA DE FUSÃO IgG-IgA ISOLADA, caracterizada por compreender um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo P221 ou R221 através do terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA, e em que o anticorpo IgG compreende ainda uma deleção do aminoácido K447.

12. MOLÉCULA DE FUSÃO IgG-IgA ISOLADA, caracterizada por compreender um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo C242 através do terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA.

13. MOLÉCULA DE FUSÃO IgG-IgA ISOLADA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo anticorpo IgG compreender ainda uma deleção do aminoácido K447.

14. MOLÉCULA DE FUSÃO IgG-IgA ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo anticorpo IgG ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4.

15. MOLÉCULA DE FUSÃO IgG-IgA ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo anticorpo IgG ser um anticorpo IgG1.

16. MOLÉCULA DE FUSÃO IgG-IgA ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizada pelo anticorpo IgA ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgA1, um anticorpo IgA2m1, um anticorpo IgA2m2 e um anticorpo IgA2mn.

17. MOLÉCULA DE FUSÃO IgG-IgA ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizada pelo anticorpo IgA ser um anticorpo IgA2m1.

18. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, caracterizado por codificar o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou a molécula de fusão IgG-IgA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 17.

19. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 18.

20. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO IgA OU IgG-IgA caracterizado por compreender a cultura da célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 19, de modo que o anticorpo IgA ou a molécula de fusão IgG-IgA seja produzido.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por compreender ainda recuperar o anticorpo IgA ou a molécula de fusão IgG-IgA da célula hospedeira.

22. ANTICORPO IGA, ou molécula de fusão igg-iga, caracterizados por serem produzidos, conforme definido na reivindicação 20, ou recuperados, conforme definido na reivindicação 21.

23. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um ou mais anticorpos IgA, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 22, ou uma ou mais moléculas de fusão IgG-IgA,

conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 11 a 17 ou 22, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

24. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por compreender ainda um agente terapêutico adicional.

25. MÉTODO PARA TRATAR UM INDIVÍDUO com uma doença caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos IgA, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 22, ou uma ou mais moléculas de fusão IgG-IgA, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 11 a 17 ou 22.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela doença ser uma doença inflamatória, uma doença autoimune ou câncer.

27. ANTICORPO IgA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 22, ou a molécula de fusão IgG-IgA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17 ou 22, caracterizados por serem para uso como um medicamento.

28. ANTICORPO IgA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 22, ou a molécula de fusão igg-iga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17 ou 22, caracterizados por serem para uso no tratamento de uma doença.

29. ANTICORPO IgA ou molécula de fusão igg-iga, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pela doença ser uma doença inflamatória, uma doença autoimune ou câncer.

30. USO DO ANTICORPO IgA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 22, ou da molécula de fusão igg- iga, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 17 ou 22, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença.

31. USO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela doença ser uma doença inflamatória, uma doença autoimune ou câncer.

32. MÉTODO PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DE DÍMEROS de IgA, caracterizado por compreender aumentar a quantidade de DNA que codifica uma cadeia de união (JC) que é introduzida em uma primeira célula em relação à quantidade de DNA que codifica a cadeia leve (LC) e a cadeia pesada (HC), em que a expressão aumentada é relativa à quantidade de dímeros de IgA produzidos em uma segunda célula introduzida com quantidades iguais de DNA de JC, LC e HC.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela proporção da quantidade de DNA que codifica a HC para a quantidade de DNA que codifica a LC para a quantidade de DNA que codifica a JC (HC:LC:JC) que é introduzido na primeira célula ser de cerca de 1:1:2 a cerca de 1:1:5.

34. MÉTODO PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DE DÍMEROS, TRÍMEROS OU TETRÂMEROS de IgA, caracterizado por compreender diminuir a quantidade de DNA que codifica uma cadeia de união (JC) introduzida em uma primeira célula em relação à quantidade de DNA que codifica a cadeia leve (LC) e a cadeia pesada (HC), em que a expressão aumentada é relativa à quantidade de trímeros ou tetrâmeros de IgA produzidos em uma segunda célula introduzida com maiores quantidades de DNA de HC e LC em relação à quantidade de DNA de JC.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pela proporção da quantidade de DNA que codifica a HC para a quantidade de DNA que codifica a LC para a quantidade de DNA que codifica a JC (HC:LC:JC), que é introduzido na primeira célula, ser de cerca de 1:1:0,25 a cerca de 1:1:0,5.

36. MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE POLÍMEROS, IgA1 ou IgA2m1, caracterizado por compreender expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 tendo uma substituição no aminoácido V458, em que o aumento da produção é relativo à quantidade de polímeros IgA1 ou IgA2m1 produzidos em uma segunda célula expressar um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 que não tem uma substituição no aminoácido V458.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo aminoácido ser substituído por uma isoleucina (V458I).

38. MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE DÍMEROS de IgA2m2, caracterizado por compreender expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA2m2 tendo uma substituição no aminoácido I458, em que a produção aumentada é relativa à quantidade de dímeros de IgA2m2 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA2m2 que não tem uma substituição no aminoácido I458.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo aminoácido ser substituído por uma valina (I458V).

40. MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE UM POLÍMERO IgA1 OU IgA2m1 caracterizado por compreender expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 tendo uma substituição no aminoácido N459 ou S461, em que a produção aumentada é relativa à quantidade de polímeros IgA1 ou IgA2m1 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA1 ou IgA2m1 que não tem uma substituição no aminoácido N459 ou S461.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo aminoácido N459 ser substituído por uma mutação N459Q, N459G ou N459A e/ou o aminoácido S461 ser substituído por uma mutação S461A.

42. MÉTODO PARA DIMINUIR A PRODUÇÃO DE

POLÍMEROS, IgA2m2, caracterizado por compreender expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA2m2 com uma substituição no aminoácido C471, em que a produção diminuída é relativa à quantidade de polímeros IgA2m2 produzidos em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA2m2 que faz não tem uma substituição no aminoácido C471.

43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo aminoácido C471 ser substituído por uma mutação C471S.

44. MÉTODO PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO TRANSITÓRIA DE UM ANTICORPO IgA2m2 caracterizado por compreender expressar, em uma primeira célula, um anticorpo IgA2m2 que compreende uma substituição em um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 e um combinação dos mesmos, em que a expressão transitória aumentada é relativa à quantidade de expressão transitória produzida em uma segunda célula que expressa um anticorpo IgA2m2 que não tem uma substituição em um aminoácido selecionado do grupo que consiste em N166, S212, N263, N337, I338, T339, N459 e uma combinação dos mesmos.

45. MÉTODO PARA EXPRESSAR DÍMEROS DE MOLÉCULAS DE FUSÃO IgG-IgA, caracterizado por compreender expressar uma molécula de fusão IgG-IgA compreendendo um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc do anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo P221 ou R221 através do terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA, e em que o anticorpo IgG compreende uma deleção do aminoácido K447.

46. MÉTODO PARA EXPRESSAR DÍMEROS, TRÍMEROS OU TETRÂMEROS de moléculas de fusão IgG-IgA caracterizado por compreender expressar uma molécula de fusão IgG-IgA compreendendo um anticorpo IgG de comprimento total fundido em seu terminal C a uma região Fc de um anticorpo IgA, em que a região Fc de o anticorpo IgA compreende uma sequência compreendendo C242 até o terminal C da cadeia pesada do anticorpo IgA.

47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo anticorpo IgG compreender uma deleção do aminoácido K447.

48. MÉTODO PARA PURIFICAR UM ANTICORPO, IgA, a partir de uma mistura, compreendendo um anticorpo IgA e pelo menos uma proteína de célula hospedeira, caracterizado por compreender: (a) aplicar a mistura a uma coluna compreendendo Proteína L para ligar ao anticorpo IgA; (b) lavar a coluna de Proteína L com um tampão de lavagem compreendendo PBS; e (c) eluir o anticorpo IgA da coluna de Proteína L por um tampão de eluição compreendendo ácido fosfórico.

49. MÉTODO PARA PURIFICAR UM ESTADO OLIGOMÉRICO DE UM ANTICORPO IgA ou uma molécula de fusão IgG-IgA a partir de uma mistura compreendendo um anticorpo IgA ou uma molécula de fusão IgG-IgA e pelo menos uma proteína de célula hospedeira, caracterizado por compreender: (a) aplicar a mistura a uma coluna de purificação por afinidade compreendendo Proteína L ou Proteína A para ligar ao anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA; (b) lavar a coluna de purificação por afinidade com um tampão de lavagem; (c) eluir o anticorpo IgA ou a molécula de fusão IgG-IgA da coluna de purificação por afinidade por um tampão de eluição para formar um primeiro eluato; e

(d) aplicar o primeiro eluato a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho para separar diferentes estados oligoméricos do anticorpo IgA ou molécula de fusão IgG-IgA e obter um fluxo que compreende um estado oligomérico do anticorpo IgA ou da molécula de fusão IgG-IgA.