JP2023179403A - 免疫グロブリンa抗体、並びに産生及び使用の方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】長い半減期を有するIgA抗体、並びに発現レベル及びポリマーIgA生成を改善するための産生方法を提供する。【解決手段】単離されたIgA抗体又はその断片であって、IgA抗体は、アミノ酸V458、N459及び/又はS461に置換を含む、単離されたIgA抗体又はその断片である。【選択図】なし
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本出願は、2019年1月22日に出願された米国仮出願第62/795,367号、及び2019年4月24日に出願された米国仮出願第62/838,071号の優先権を主張し、これらの内容全体が参照により組み込まれ、優先権が主張される。
本出願は、2019年1月22日に出願された米国仮出願第62/795,367号、及び2019年4月24日に出願された米国仮出願第62/838,071号の優先権を主張し、これらの内容全体が参照により組み込まれ、優先権が主張される。
本開示は、抗体、例えば、IgA抗体及びIgG-IgA融合分子、並びにそのような抗体を含む組成物と、そのような抗体及び組成物を作製及び使用する方法に関する。
免疫グロブリンA(IgA)は、ほとんどの哺乳動物の粘膜分泌物に存在する主要なクラスの抗体であり、脆弱な粘膜表面での吸入及び摂取された病原体による侵入に対する防御の第一線となる。ヒトでは、IgA2分子には存在しないIgA1重鎖(HC)のヒンジ領域の13残基の伸長によって区別される2つのIgAアイソタイプ、IgA1及びIgA2が存在する(Leusen,Mol.Immunol.68:35-9(2015))。両方のアイソタイプは、IgA2が優勢である腸及びIgA1単量体がほぼ排他的に見出される血清を除いて、全ての器官及び組織に豊富である(Kerr,Biochem.J.271:285-96(1990))。IgA2には、m1(Tsuzukida et al.,Proc Natl Acad Sci USA76:1104-8(1979))、m2(Toranno et al.,Proc Natl Acad Sci USA75:966-9(1978))、及びmn(Chintalacharuvu et al.,J Immunol152:5299-304(1994))の3つのアロタイプがある。m2及びmnのアロタイプはカノニカル軽鎖(LC)-HCジスルフィドを形成するが、IgA2m1中のHCの位置221にプロリンが存在するとLC-LCジスルフィド結合が形成される(Chintalacharuvu et al.,J Immunol 157:3443-9(1996))。IgA2m1アロタイプにおけるプロリン221のアルギニン(P221R)への変異は、m2アロタイプ及びmnアロタイプにおいて見出され、標準的なLC-HC結合を回復させる(Lohse et al.,Cancer Res76:403-17(2016)及びChintalacharuvu et al.(1996))。IgA1アイソタイプとIgA2アイソタイプとの間の配列同一性は、約90%と非常に高く、IgA2アロタイプの間では更に高く、m1とm2との間にわずか6残基の差があり、mnとm1又はm2のいずれかとの間に2残基の差がある(Chintalacharuvu et al.(1994))。
他のヒト免疫グロブリンクラスとは対照的に、IgAは、単量体可溶性種及びポリマー可溶性種の両方として天然に存在する固有の能力を有するが、その後のトランスサイトーシスのためにポリマーIgA(pIgA)のみがpIgRに結合することができる(Yoo et al.,Clin.Immunol.116:3-10(2005))。IgAのオリゴマー化は、テールピース及び137アミノ酸連結鎖(JC)と呼ばれるHCの18残基のC末端伸長によって促進される。第1のIgA単量体のIgAテールピースの最後から2番目の残基Cys471は、JCのCys15とのジスルフィド結合形成を媒介し、第2のIgA単量体のCys471は、JCのCys69とのジスルフィド結合形成を媒介して、単一のJCによって一緒に保持される共有結合IgA二量体を形成する(Zikan et al.,Mol Immunol23:541-4(1986)及びHalpern et al.,J Immunol 111:1653-60(1973))。各IgA単量体は、各々がテールピースを有する2つのHCから構成されることから、IgA二量体は、追加のIgA単量体を連結することができる2つの不対のCys471残基を有する。三量体、四量体及び五量体等のより高次のIgAオリゴマーが報告されている(Suzuki et al.,Proc Natl Acad Sci USA112:7809-14(2015))。血清IgAは主に単量体であるが、ポリマーIgAは粘膜固有層内の形質細胞によって産生される。ポリマーIgA中のJCの存在は、上皮の基底外側でのpIgRの結合及び粘膜組織の頂端側への能動輸送に必要である(Wu et al.,Clin Dev Immunol11:205-13(2004))。トランスサイトーシスの際に、pIgRの細胞外ドメインはタンパク質分解的に切断されて分泌成分(SC)として知られるものを生成し、これはpIgR中のCys467と1つのHC中のCys311との間のジスルフィド結合を介してポリマーIgA重鎖に共有結合したままである(Fallgreen-Gebauer et al.,Biol Chem Hoppe-Seyler374:1023-8(1993)及びBastian et al.,Adv Exp Med Biol371A:581-3(1995))。この複合体は、粘膜免疫の主な決定因子である分泌型IgA(sIgA)と考えられている(Mantis et al.,Mucosal Immunol4:603-11(2011)及びJohansen et al.Mucosal Immunol4:598-602(2011))。
免疫グロブリンA(IgA)研究は、従来のIgGベースの治療薬と比較して、単量体及びポリマー免疫グロブリンA(IgA)抗体の両方について、複数の潜在的な治療用途及び独特の作用機序を強調している(Yoo et al.(2005)、Bakema et al.,MAbs 3:352-61(2011)及びLeusen(2015))。腫瘍学において、単量体及びポリマーの抗EGFR及び抗CD20 IgAは、FcαRI媒介性細胞傷害又はより効果的な受容体結合及びダウンモジュレーションによって駆動され、IgGと比較して優れた腫瘍細胞殺傷を実証した(Pascal et al.,Haematologica97:1686-94(2012)、Boross et al.,EMBO Molecular Medicine 5:1213-26(2013)及びLohse et al.(2016))。IgAの細胞傷害活性は、IgG/A融合分子又はハイブリッド分子によるFcγR及びFcαRIの両方の二重結合を介して更に増加させることができた(Li et al.,Oncotarget(2017)及びKelton et al.,Chem Biol21:1603-9(2015))。感染症については、IgA多価標的関与は、インフルエンザ感染モデルにおいて優れた抗原結合及び中和を可能にした(Suzuki et al.(2015))。更に、ヒトIgA二量体(dIgA)は、多発性嚢胞腎疾患マウスモデルにおいて、ポリマー免疫グロブリン受容体(pIgR)への結合を介して腎管腔に効果的に送達することができたが、IgG分子は送達することができなかった(Olsan et al.,Journal of Biological Chemistry 290:15679-86(2015))。IgAの特異的トランスサイトーシス活性を利用することにより、現在のIgG治療薬によって非効率的に標的化される粘膜組織の管腔側内の治療標的へのアクセスが潜在的に可能になり得る(Bakema et al.(2011)、Olsan et al.(2015)及びBorrok et al.,JCI Insight 3(2018))。
組換え単量体IgAの産生は、十分に確立されたIgG分子の産生よりも困難である。IgA抗体は、典型的には発現不良及び不均一なグリコシル化を被る。ヒトIgG1は、典型的には、各CH2ドメインに1つずつ、2つのN結合型グリコシル化部位のみを有するのに対して、ヒトIgAは、グリカン不均一性に感受性であり得る複数のグリコシル化部位を含む(Leusen(2015))。IgA1は、ヒンジ領域に複数のO結合型グリコシル化部位を有し、HC定常ドメインにも2つのN結合型グリコシル化部位を有する。IgA2分子はO結合型グリカンによって改変されていないが、4つ(IgA2m1)又は5つ(IgA2m2及びIgA2mn)のN結合型グリコシル化部位(Yoo et al.(2005)及びBakema et al.(2011))を含む。JCはまた、1つのN結合型グリコシル化部位を含む。3つのポリペプチド鎖(LC、HC及びJC)のアセンブリは、複数のオリゴマー状態をもたらし、組換えポリマーIgA(Rouwendal et al.,MAbs 8:74-86(2016)及びBrunke et al.,MAbs5:936-45(2013))の全体的な複雑さに更に寄与する。IgAオリゴマーのサイズが増加すると、グリコシル化部位の数が増加するだけでなく、より多くのグリカン不均一性の可能性も生じる。
IgAは、複数の種において短い循環半減期(1日未満~約4日)を有することが以前に示されている(Challacombe et al.,Immunology36:331-8(1979)及びLeusen(2015))。IgGとは異なり、IgAは新生児型受容体FcRnに結合せず、したがってエンドソームリサイクルを受けず、リソソーム分解から逃れることができない(Roopenian et al.,Nat Rev Immunol7:715-25(2007))。FcRn結合の欠如に加えて、未成熟N結合型グリカンはまた、それらを炭水化物特異的エンドサイトーシス受容体、例えばアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)(Boross et al.(2013)及びRifai et al.,J Exp Med191:2171-82(2000))並びにマンノース受容体(Lee et al.,Science 295:1898-901(2002)及びHeystek et al.,J Immunol 168:102-7(2002))の感受性標的にすることによって、組換えIgAのより短い血清半減期に寄与し得る。肝臓に高度に濃縮されているこれらのスカベンジング受容体は、不完全にシアリル化されたN結合型グリカンを有する糖タンパク質を認識し、それらを循環から除去する(Tomana et al.,Gastroenterology94:762-70(1988)及びDaniels et al.,Hepatology 9:229-34(1989))。
したがって、当該技術分野では、より長い半減期を有するIgA抗体、並びに発現レベル及びポリマーIgA生成を改善するための産生方法が必要とされている。
本開示は、IgA抗体及びそのような抗体を含む組成物、並びにそのような抗体及び組成物を作製及び使用する方法に関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、単離されたIgA抗体に関する。例えば、限定するものではないが、本開示の単離されたIgA抗体又はその断片は、アミノ酸V458に置換を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸V458は、イソロイシンで置換されている(すなわち、V458I)。ある特定の実施形態では、単離されたIgA抗体は、IgA1抗体、IgA2mn抗体、又はIgA2m1抗体である。
ある特定の実施形態では、本開示の単離されたIgA抗体又はその断片は、アミノ酸I458に置換を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸I458は、バリンで置換されている(すなわち、I458V)。ある特定の実施形態では、単離されたIgA抗体はIgA2m2抗体である。
本開示は更に、アミノ酸N459及び/又はS461に置換を含む単離されたIgA抗体を提供する。ある特定の実施形態では、アミノ酸N459は、グルタミンで置換されている(すなわち、N459Q)。ある特定の実施形態では、アミノ酸S461は、アラニンで置換されている(すなわち、S461A)。ある特定の実施形態では、IgA抗体は、IgA1抗体又はIgA2m1抗体である。
本開示は、N166、T168、N211、S212、S213、N263、T265、N337、I338、T339、N459、S461及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に1種以上の置換を含む単離されたIgA抗体を更に提供する。ある特定の実施形態では、IgA抗体がアミノ酸N459に置換を有し、IgA1、IgA2m1又はIgA2m2抗体である。ある特定の実施形態では、IgA抗体がアミノ酸N166に置換を有し、IgA2m1又はIgA2m2抗体である。ある特定の実施形態では、IgA抗体がアミノ酸S212に置換を有し、IgA2m2抗体である。ある特定の実施形態では、IgA抗体がアミノ酸N263に置換を有し、IgA1、IgA2m1又はIgA2m2の抗体である。ある特定の実施形態では、IgA抗体が、アミノ酸N337、I338、T339に置換を有し、IgA2m1抗体又はIgA2m2抗体である。ある特定の実施形態では、IgA抗体は、アミノ酸N337、I338、T339における置換、並びにT168、N211、S212、S213、N263、T265、N459、S461及びそれらの組合せにおける1種以上の置換を有する。ある特定の実施形態では、IgA抗体はIgA2m2抗体であり、アミノ酸N166、S212、N263、N337、I338、T339及びN459に置換を含む。例えば、限定するものではないが、アミノ酸N166、S212、N263、N337、I338、T339及びN459における置換は、N166A、S212P、N263Q、N337T、I338L、T339S及びN459Qであり得る。
本開示は、単離されたIgG-IgA融合分子を更に提供する。ある特定の実施形態では、単離されたIgG-IgA融合分子は、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含むことができ、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してP221又はR221を含む配列を含み、IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を更に含む。本発明の開示は、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含む単離されたIgG-IgA融合分子であって、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してC242を含む配列を含む、単離されたIgG-IgA融合分子を提供する。ある特定の実施形態では、IgG抗体が、アミノ酸K447の欠失を含む。ある特定の実施形態では、IgG抗体は、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体及びIgG4抗体からなる群より選択される。例えば、限定するものではないが、IgG抗体はIgG1抗体であり得る。ある特定の実施形態では、IgA抗体は、IgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体及びIgA2mn抗体からなる群より選択される。例えば、限定するものではないが、IgA抗体はIgA2m1抗体である。
本開示は更に、本明細書に開示されるIgA抗体又はIgG-IgA融合分子をコードする単離された核酸、及びそのような核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示は、IgA抗体又はIgG-IgA融合分子が産生されるように本明細書に開示される宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法を更に提供する。該方法は、宿主細胞からIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を回収することを更に含む。
本開示は、本明細書に開示されるIgA抗体又はIgG-IgA融合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、追加の治療剤を更に含み得る。
本開示は更に、疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の本明細書に開示されるIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を個体に投与する工程を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患は炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである。
本開示は、IgA二量体の発現を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、該方法は、軽鎖(LC)及び重鎖(HC)をコードするDNAの量に対して、第1の細胞に導入される連結鎖(JC)をコードするDNAの量を増加させることを含み、発現の増加は、等量のJC、LC及びHCのDNAが導入された第2の細胞で産生されるIgA二量体の量に対するものである。例えば、限定するものではないが、第1の細胞に導入される、HCをコードするDNAの量対LCをコードするDNAの量対JCをコードするDNAの量の比(HC:LC:JC)は約1:1:2~約1:1:5である。
ある特定の実施形態では、本開示は、IgA二量体、三量体又は四量体の発現を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、該方法は、軽鎖(LC)及び重鎖(HC)をコードするDNAの量に対して、第1の細胞に導入される連結鎖(JC)をコードするDNAの量を減少させることを含み、発現の増加は、JC DNAの量に対してより多くのHC及びLC DNAを導入した第2の細胞で産生されるIgAの三量体又は四量体の量に対するものである。ある特定の実施形態では、第1の細胞に導入される、HCをコードするDNAの量対LCをコードするDNAの量対JCをコードするDNAの量の比(HC:LC:JC)は、約1:1:0.25~約1:1:0.5である。
本開示は、IgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの産生を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、該方法は、第1の細胞において、アミノ酸V458に置換(例えば、V458I)を有するIgA1抗体又はIgA2m1抗体を発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸V458に置換を有さないIgA1抗体又はIgA2m1抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの量に対するものである。本開示は、アミノ酸I458に置換(例えば、I458V)を有するIgA2m2抗体を第1の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸I458に置換を有さないIgA2m2抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA2m2二量体の量に対するものである、IgA2m2二量体の産生を増加させる方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、IgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの産生を増加させる方法は、アミノ酸N459及び/又はS461に置換(例えば、N459Q及び/又はS461A)を有するIgA1抗体又はIgA2m1抗体を第1の細胞において発現させることを含み、産生の増加は、アミノ酸N459又はS461に置換を有さないIgA1抗体又はIgA2m1抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの量に対するものである。ある特定の実施形態では、IgA2m2ポリマーの産生を減少させる方法は、第1の細胞において、アミノ酸C471に置換(例えば、C471S)を有するIgA2m2抗体を発現させることを含み、産生の減少は、アミノ酸C471に置換を有さないIgA2m2抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA2m2ポリマーの量に対するものである。ある特定の実施形態では、アミノ酸C471における置換(例えば、C471S)を含むIgA抗体は、P221における置換(例えば、P221R)を更に含むことができる。
本開示は、IgA2m2抗体の一過性発現を増加させる方法であって、第1の細胞において、N166、S212、N263、N337、I338、T339、N459及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を含むIgA2m2抗体を発現させることを含み、一過性発現の増加が、N166、S212、N263、N337、I338、T339、N459及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を有さないIgA2m2抗体を発現させる第2の細胞において産生される一過性発現の量に対するものである、方法を提供する。
本開示は更に、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含むIgG-IgA融合分子を発現させることを含む、IgG-IgA融合分子の二量体を発現させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してP221又はR221を含む配列を含み、IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、IgG-IgA融合分子の二量体、三量体、又は四量体を発現させる方法であって、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含むIgG-IgA融合分子を発現させることを含み、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してC242を含む配列を含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、IgG抗体が、アミノ酸K447の欠失を含む。
本開示は、本明細書に開示されるIgA及びIgG-IgA融合分子を精製する方法、及び/又は本明細書に開示されるIgA及びIgG-IgA融合分子の特定のオリゴマー状態、例えば二量体、三量体又は四量体を精製する方法を提供する。ある特定の実施形態では、IgA抗体と少なくとも1つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からIgA抗体を精製する方法は、プロテインLを含むカラムに混合物を適用してIgA抗体を結合させること、PBSを含む洗浄緩衝液でプロテインLカラムを洗浄すること、及びリン酸を含む溶出緩衝液によってプロテインLカラムからIgA抗体を溶出すること、を含む。ある特定の実施形態では、IgA抗体又はIgG-IgA融合分子及び少なくとも1つの宿主細胞タンパク質を含む混合物からオリゴマー状態のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を精製する方法は、プロテインL又はプロテインAを含む親和性精製カラムに混合物を適用してIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を結合すること、洗浄緩衝液で親和性精製カラムを洗浄すること、溶出緩衝液によって親和性精製カラムからIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を溶出して第1の溶出液を形成すること、及び第1の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィカラムに適用して異なるIgAオリゴマー状態を分離し、オリゴマー状態のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を含むフロースルーを得ること、を含み得る。
限定を行うものではなく、明確化のために、本明細書にて開示する主題の詳細の説明を、以下の小節に分ける:
I.定義;
II.抗体:
III.抗体の産生方法及び精製方法;
IV.処置方法;
V.医薬組成物;
VI.製造品;及び
VII.例示的な実施形態。
I.定義;
II.抗体:
III.抗体の産生方法及び精製方法;
IV.処置方法;
V.医薬組成物;
VI.製造品;及び
VII.例示的な実施形態。
I.定義
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容できる誤差範囲を意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での1実施当たり3つ又は3つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、更により好ましくは1%までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の1桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味することができる。
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容できる誤差範囲を意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での1実施当たり3つ又は3つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、更により好ましくは1%までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の1桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味することができる。
「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」という用語は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。「1つ(a)」(又は「an」)と並んで、「1つ以上」及び「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。更に、本明細書で使用される場合、「及び/又は」は、他のものの有無にかかわらず、2つの指定された特徴又は構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書で「A及び/又はB」等の句で使用される「及び/又は」という用語は、「A及びB」、「A又はB」、「A」(単独)及び「B」(単独)を含むことを意図している。同様に、「A、B及び/又はC」等の語句で使用される「及び/又は」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することが意図されている:A、B及びC;A、B又はC;A又はC;A又はB;B又はC;A及びC;A及びB;B及びC;A(単独);B(単独);並びにC(単独)。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、抗体断片、及び抗体融合分子が挙げられるが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2;ダイアボディ;線状抗体;一本鎖抗体分子(e.g、scFv);及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Holliger and Hudson、Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)を参照。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の源又は種に由来し、重鎖及び/又は軽鎖の残りが異なる源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の5種類の主要なクラスがあり、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMであり、これらのうちのいくつかは、下位クラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
「IgA抗体」という用語は、抗体のIgAクラスの抗体を指し、IgAアイソタイプ、IgA1及びIgA2、並びにIgA2、m1、m2及びmnの3つのアロタイプを含む。
本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞機能を阻害若しくは防止し、及び/又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性薬としては、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、及びLuの放射性同位体);化学療法剤又は化学療法薬(例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、若しくは他の挿入剤);増殖阻害剤;核酸分解酵素等の酵素及びそれらの断片;抗生物質;細菌、真菌、植物、又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素(それらの断片及び/若しくは変異体を含む)等の毒素;及びに下に記載される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤が挙げられるが、これらに限定されない。
「エフェクタ機能」は、抗体のアイソタイプにより異なる抗体のFc領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクタ機能の例としては、以下のものが挙げられる。C1q結合及び補体依存性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity:CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方制御;並びにB細胞活性化が挙げられる。
薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。例えであって、限定するものではなく、「有効量」とは、疾患及び/又は障害の症状を軽減し、最小限に抑え、かつ/又は予防し、生存を長引かせ、かつ/又は疾患及び/又は障害が再発するまでの期間を長引かせることができる本明細書に開示される抗体の量を指し得る。
「Fc領域」という用語は、本明細書では定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。本用語は、ネイティブ配列Fc領域と変異体Fc領域とを含む。ある特定の実施形態では、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226又はPro230から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リシン(Lys447)、又はC末端グリシン(Gly446)は存在してもよく、又は存在していなくてもよい。特定の実施形態では、ヒトIgA重鎖Fc領域は、Pro221(P221)、Arg221(R221)、Val222(V222)、Pro223(P223)又はCys242(C242)から重鎖のカルボキシル末端まで延在する(図1A及び図1Cを参照)。本明細書で特に明記されない限り、Fc領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991に記載されるような、EUナンバリングシステム(EUインデックスとも呼ばれる)に従う。
「Fc受容体」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を表す。Fc受容体には、FcαRI(IgA抗体のFc領域を認識する)及びFcγRII(IgG抗体のFc領域を認識する)が含まれるが、これらに限定されない。FcγRII受容体としては、FcγRIIA(「活性化受容体」)及びFcγRIIB(「阻害受容体」)が挙げられ、これらは、主にそれらの細胞質ドメインの点で異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質側ドメイン内に免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含有する。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ(ITIM)を含有する(例えば、Daeoron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)を参照)FcRは、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991);Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994);及びde Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)に総説がある。今後特定されるものを含む他のFcRは、本明細書において「FcR」という用語により包含されている。
「Fc受容体」又は「FcR」という用語はまた、胎児(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及びKim et al.,J.Immunol.24:249(1994))への母体IgG抗体の移入及び免疫グロブリンの恒常性の調節を担う新生児受容体FcRnを含む。FcRnへの結合を測定する方法は公知である(例えば、Ghetie and Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997);Ghetie et al.,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997);Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004);国際公開第2004/92219号(Hinton et al.)を参照)。インビボでのヒトFcRnへの結合及びヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトヒト細胞株で、又は変異体Fc領域を有するポリペプチドが投与される霊長類でアッセイされ得る。国際公開第2000/042072糖(Presta)は、FcRへの結合が改善又は低減された抗体変異体について記載している。例えば、Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)も参照されたい。
「フレームワーク」又は「FR」は、相補性決定領域(CDR)以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般的に、FR1、FR2、FR3及びFR4からなる。したがって、CDR及びFR配列は、一般に、VH(又はVL)において次の配列で現れる:FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では相互に交換可能に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書に定義されるFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は、本明細書で同義に使用され、かかる細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞には、初代形質転換細胞、及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する変異体の子孫は、本発明に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生された抗体、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVL又はVHフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンVL又はVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),Vols.1-3にあるようなサブグループである。ある特定の実施形態では、VLの場合、サブグループは、Kabatら(上記参照)に見られるようなサブグループカッパIである。ある特定の実施形態では、VHの場合、サブグループは、Kabatら(上記参照)に見られるようなサブグループIIIである。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトCDRからのアミノ酸残基及びヒトFRからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様において、ヒト化抗体は、非ヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのCDR、及びヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのFRにおける、ほぼ全ての少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「超可変領域」又は「HVR」という用語は、本明細書で使用される場合、配列が超可変であり(「相補性決定領域」又は「complementarity determining region:CDR」)、かつ/又は構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成し、かつ/又は抗原接触残基(「抗原接触体」)を含有する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。別途示されない限り、可変ドメイン中のHVR残基及び他の残基(例えば、FR残基)は、Kabatら(上記参照)に従って本明細書ではナンバリングされる。一般的に、抗体は、6個のHVRを含み、VHに3個(H1、H2、H3)、VLに3個(L1、L2、L3)含む。
「免疫複合体」とは、細胞毒性薬を含むが、これに限定されない1つ以上の異種分子(複数可)にコンジュゲートされる抗体を指す。
本明細書で同義に使用される「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類)、ウサギ、及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。
「単離」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリ電気泳動)、又はクロマトグラフ(例えば、イオン交換又は逆相HPLC)によって決定される、95%超又は99%超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)を参照されたい。
「単離された」核酸とは、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
「抗体をコードする単離核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖(又はその断片)をコードする1つ又は複数の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内の核酸分子(複数可)を含み、そのような核酸分子(複数可)は、宿主細胞内の1つ又は複数の場所に存在する。
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び/又は物質を含む。それぞれのヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基(すなわち、シトシン(C)、グアニン(G)、アデニン(A)、チミン(T)又はウラシル(U))、糖(すなわち、デオキシリボース又はリボース)、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、当該塩基は、核酸分子の一次構造(線形構造)を表す。塩基の配列は、典型的には、5’から3’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、例えば、相補性DNA(cDNA)及びゲノムDNA、リボ核酸(RNA)、特に、メッセンジャーRNA(mRNA)、DNA又はRNAの合成形態、及びこれらの分子の2つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。更に、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学改変された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例としては、改変されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子はまた、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び/又はインビボで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして好適なDNA分子及びRNA分子も包含する。このようなDNAベクター(例えば、cDNA)又はRNAベクター(例えば、mRNA)は、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、mRNAは、インビボで抗体を産生するために対象にmRNAを注入することができるように、RNAベクターの安定性及び/又はコードされた分子の発現を高めるように化学改変されてもよい(例えば、Stadler et al.,Nature Medicine 2017,published online 12 June 2017,doi:10.1038/nm.4356又は欧州特許第2101823号公報B1を参照)。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び/又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能な変異体抗体は除く。このような変異体は、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、改変詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本願で開示された主題に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができ、かかる方法及び他の例示のモノクローナル抗体の作製方法は、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種性部分(例えば、細胞傷害性部分)又は放射標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、医薬組成物中に存在していてもよい。
「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然IgG抗体は、ジスルフィド結合されている2つの同一の軽鎖及び2つの同一の重鎖で構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)を有し、続いて3つの定常ドメイン(CH1、CH2、及びCH3)を有する。同様に、N末端からC末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)を有し、これに定常軽(CL)ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2種類の1つに分けられてもよい。
本明細書で使用される「添付文書」という用語は、かかる治療剤製品の使用に関する指示、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、及び/又は警告についての情報を含む、治療剤製品の商用包装に通例含まれている取扱説明書を指す。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性率(%)」は、アラインメントの目的で、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)ソフトウェア又はFASTAプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントさせるのに適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性率の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用して生成することができる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech,Inc.によって作成されており、ソースコードは、U.S.Copyright Office(Washington D.C.,20559)のユーザドキュメンテーションにファイルされており、U.S.Copyright Registration No.TXU510087の下に登録されており、かつ、国際公開第2001/007611号に記載されている。
しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性パーセントの値は、FASTAパッケージバージョン36.3.8cのggsearchプログラムを使用するか、又はその後にBLOSUM50比較マトリックスを用いて生成される。FASTAプログラムパッケージは、W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988),’’Improved Tools for Biological Sequence Analysis’’,PNAS 85:2444-2448;W.R.Pearson(1996)’’Effective protein sequence comparison’’ Meth.Enzymol.266:227-258;及びPearson et.al.(1997)Genomics 46:24-36にって認定され、www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml or www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fastaから公的に利用可能である。これに代えて、ggsearch(global protein:protein)プログラム及びデフォルトオプション(BLOSUM50;open:-10;ext:-2;Ktup=2)を用いて、fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgiでアクセス可能な公開サーバを使用して配列を比較し、ローカルではなくグローバルなアライメントを確実に実行することができる。アミノ酸同一性率は、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。
「医薬組成物」との用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、組成物が投与される被験体に対して受け入れられないほど毒性である追加の構成要素を含まないような形態での製剤を指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」とは、活性成分以外の対象に無毒である医薬組成物中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「処置」(及びその文法的な変形語、例えば、「処置する」又は「処置すること」)は、処置される個体の本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体を使用して、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を減速させることができる。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と、3つの相補性決定領域(CDR)とを含む。(例えば、Kindt et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)を参照。)抗原結合特異性を与えるために、単一のVHドメイン又はVLドメインで十分な場合がある。更に、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のVHドメイン又はVLドメインを使用し、それぞれ、相補的なVLドメイン又はVHドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)を参照されたい。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と呼ばれる。
II.抗体
ある特定の実施形態では、本開示は、改善された血清保持を示し、ポリマー抗体産生を増加させるために、抗体、例えばIgA抗体及びIgG-IgA融合分子を操作する方法に部分的に基づく。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、FcRnに対する結合を示す。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、増大したIgR媒介性トランスサイトーシスを示す。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、FcαRIに対する結合が低下している、及び/又は、FcαRIに対する結合を何ら示さない。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、投与後の炎症誘発性応答を最小限に抑えることによって、治療状況において優れた安全性を提供することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、改善された血清保持を示し、ポリマー抗体産生を増加させるために、抗体、例えばIgA抗体及びIgG-IgA融合分子を操作する方法に部分的に基づく。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、FcRnに対する結合を示す。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、増大したIgR媒介性トランスサイトーシスを示す。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、FcαRIに対する結合が低下している、及び/又は、FcαRIに対する結合を何ら示さない。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、投与後の炎症誘発性応答を最小限に抑えることによって、治療状況において優れた安全性を提供することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、改善された血清保持を示す抗体、例えばIgA抗体及びIgG-IgA融合分子を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体、例えばIgA抗体及びIgG-IgA Fc融合分子は、約1日まで、約2日まで、約3日まで、約4日まで又は約5日まで血漿中で安定である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体、例えばIgA抗体及びIgG-IgA融合分子は、血漿中で最大約4日間安定である。
ある特定の実施形態では、本開示は、グリコシル化が減少しているか又はグリコシル化がない抗体、例えばIgA抗体及びIgG-IgA融合分子を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、未改変IgA又は未改変IgG-IgA融合分子と比較して、グリコシル化の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%又は少なくとも約95%の減少を示す。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、約0.5%未満、約1%未満、約2%未満、約5%未満グリコシル化、約10%未満グリコシル化、約20%未満のグリコシル化、約30%未満グリコシル化又は約40%未満グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、0%グリコシル化を有する、すなわち、アグリコシル化されている。
A.例示的な抗体
1.IgA抗体変異体
本開示は、抗体がグリコシル化される程度を減少させるように改変されたIgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体及びIgA2mn抗体を提供する。抗体のグリコシル化部位の欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が除去されるように抗体のアミノ酸配列を変更することによって達成することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、又は6つ以上のグリコシル化部位、例えば、N結合型グリコシル化部位及び/又はO結合型グリコシル化部位を除去するように改変され得る。
1.IgA抗体変異体
本開示は、抗体がグリコシル化される程度を減少させるように改変されたIgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体及びIgA2mn抗体を提供する。抗体のグリコシル化部位の欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が除去されるように抗体のアミノ酸配列を変更することによって達成することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、又は6つ以上のグリコシル化部位、例えば、N結合型グリコシル化部位及び/又はO結合型グリコシル化部位を除去するように改変され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体を、N-X-S/T(式中、Xは任意のアミノ酸である)の1つ以上のN結合型グリコシル化モチーフを除去するように改変することができる。特定の実施形態では、N結合型グリコシル化部位の除去は、グリコシル化部位のモチーフに存在する1つ以上のアミノ酸の改変、例えば変異を含み得る。例えば、限定するものではないが、N、X及び/又はS/Tアミノ酸は、グリコシル化部位のモチーフにおいて改変、例えば変異され得る。ある特定の実施形態では、モチーフの3つ全てのアミノ酸を変異させることができる。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体を、重鎖定常ドメインから1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上又は5つ以上のグリコシル化部位を除去するように改変することができる。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、重鎖定常ドメインのアミノ酸166、211、263及び/又は337における1つ以上、2つ以上、3つ以上又は4つ全てのN結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、重鎖のテールピースにおける1つ以上のグリコシル化部位を除去するように改変され得る(図1Aを参照)。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、重鎖のテールピースのアミノ酸459のN結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示のIgA1抗体を、アミノ酸263及び/又は449の1つ以上のN結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示のIgA2m1抗体を、アミノ酸166、263、337及び/又は449の1つ以上のN結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示のIgA2m2抗体又はIgA2mn抗体を、アミノ酸166、211、263、337及び/又は449の1つ以上のN結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常ドメイン及びテールピースを含む抗体の重鎖から全てのN結合型グリコシル化部位を除去するように改変することができる。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体はアグリコシル化され得る。例えば、限定するものではないが、本開示のアグリコシル化抗体は、重鎖定常領域及びテールピースを含む抗体の重鎖にグリコシル化を有さない抗体である。ある特定の実施形態では、本開示のアグリコシル化抗体は、重鎖定常領域及びテールピースを含む重鎖上にグリコシル化を有さず、J鎖上にグリコシル化を有さない抗体である。
ある特定の実施形態では、本開示は、IgA抗体のグリコシル化を減少させるためのアミノ酸166、168、211、212、213、263、265、337、338、339、459及び/又は461における1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10つ以上、11つ以上又は12個の改変、例えば置換を有するIgA抗体を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示は、IgA抗体のグリコシル化を減少させるためのアミノ酸N166、T168、N211、S212、S213、N263、T265、N337、I338、T339、N459及び/又はS461における1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10つ以上、11つ以上又は12個の改変、例えば置換を有するIgA抗体を提供する。
特定の実施形態では、本開示のIgA1抗体は、アミノ酸263、265、459及び/又は461、例えばアミノ酸N263、T265、N459及び/又はS461に1つ以上、2つ以上、3つ以上又は4つの改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA2m1抗体は、アミノ酸166、168、263、265、337、338、339、459及び/又は461において、例えば、アミノ酸N166、T168、N263、T265、N337、I338、T339、N459及び/又はS461において、1つ以上の改変、2つ以上の改変、3つ以上の改変、4つ以上の改変、5つ以上の改変、6つ以上の改変、7つ以上の改変又は8つの改変を有する。ある特定の実施形態において、本開示のIgA2m2又はIgA2mn抗体は、アミノ酸166、168、211、212、213、263、265、337、338、339、459及び/又は461において、例えば、アミノ酸N166、T168、N211、S212、S213、N263、T265、N337、I338、T339、N459及び/又はS461において、1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上又は12個の改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA2m1、IgA2m2又はIgA2mn抗体は、3つ全てのアミノ酸337、338及び339において、例えば、アミノ酸N337、I338及びT339において改変される。
ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、アミノ酸N166に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、アミノ酸N168に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、アミノ酸S211に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、アミノ酸S212に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、アミノ酸S213に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、アミノ酸N263に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、アミノ酸N265に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、3つのアミノ酸N337、I338及びT339に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、アミノ酸N459に改変を有する。ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、アミノ酸S461に改変を有する。
ある特定の実施形態では、アミノ酸Nを、A、G又はQアミノ酸に変異させることができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸SをAアミノ酸に変異させることができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸TをAアミノ酸に変異させることができる。特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えば本開示のIgA2m2又はIgA2mn抗体は、以下の変異N166A、S212P、N263Q、N337T、I338L、T339S及びN459Qのうちの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上又は7つ全てを含むように改変することができる。例えば、限定するものではないが、本開示のIgA1抗体は、以下の変異N263Q及びN459Qの1つ以上又は2つ全てを含むように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示のIgA2m1抗体は、以下の変異、N166A、N263Q、N337T、I338L、T339S及びN459Qのうちの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上又は6つ全てを含むように改変することができる。特定の実施形態では、本開示のIgA2m2又はIgA2mn抗体は、以下の変異N166A、S212P、N263Q、N337T、I338L、T339S及びN459Qのうちの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上又は7つ全てを含むように改変することができる。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体のJ鎖は、1つ以上のグリコシル化部位を除去するように改変され得る。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、例えば、アミノ酸49、50及び51を包含するグリコシル化部位モチーフの1つ以上のアミノ酸を改変することによって、J鎖のアミノ酸49におけるN結合型グリコシル化部位を除去するように改変され得る。例えば、限定するものではないが、J鎖のアミノ酸N49及び/又はアミノ酸S51を改変することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸NをA、G又はQアミノ酸に変異させることができ、及び/又はアミノ酸SをAアミノ酸に変異させることができる。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体のJ鎖は、N49A/G/Q変異及び/又はS51A変異を含み得る。ある特定の実施形態では、本開示の抗体のJ鎖は、N49Q変異を含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体を、重鎖から1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上又は5つ以上のグリコシル化部位を除去するように改変し、J鎖から1つのグリコシル化部位を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、重鎖のアミノ酸N166、T168、N211、S212、S213、N263、T265、N337、I338、T339、N459及び/又はS461における1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上又は12個の改変、例えば、置換、並びにJ鎖のアミノ酸N49及び/又はS51における1つ又は2つの改変、例えば、置換を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、重鎖のアミノ酸N166、S212、N263、N337、I338、T339及び/又はN459における1つ以上の改変、2つ以上の改変、3つ以上の改変、4つ以上の改変、5つ以上の改変、6つ以上の改変又は7つ全ての改変、例えば置換、並びにJ鎖のアミノ酸N49及び/又はS51における1つ又は2つの改変、例えば置換を有する。
ある特定の実施形態では、本開示のIgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体は、IgA抗体のグリコシル化を減少させるためにアミノ酸N459又はS461に1つ以上の改変を有することができる。特定の実施形態では、アミノ酸N459及び/又はS461の改変は、ポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び五量体を生成する能力が増加した抗体をもたらす。
特定の実施形態では、本開示の抗体、例えばIgA抗体は、アミノ酸458に改変、例えば置換を有することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、アミノ酸V458に置換を有するIgA1抗体、IgA2m1抗体、及びIgA2mn抗体を提供する。ある特定の実施形態では、アミノ酸V458をイソロイシン(すなわち、V458I)に変異させることができる。ある特定の実施形態では、本開示は、アミノ酸I458に置換を有するIgA2m2抗体を提供する。ある特定の実施形態では、アミノ酸I458をバリン(すなわち、I458V)に変異させることができる。ある特定の実施形態では、1つ以上のこれらの改変は、本明細書中に記載されるように、グリコシル化が低減された又はグリコシル化されていない抗体中に存在し得る。
特定の実施形態では、本開示の抗体、例えばIgA抗体は、アミノ酸C471及び/又はC311に改変、例えば置換を有することができる。ある特定の実施形態では、IgA抗体は、アミノ酸C471、例えばC471Sに変異を有し得る。特定の実施形態では、IgA抗体は、アミノ酸C311、例えばC311Sに変異を有することができる。
ある特定の実施形態では、ある特定の特性が改善された抗体変異体を作製するために、本開示の抗体の改変が行われ得る。例えば、限定するものではないが、グリコシル化が低下した本開示の抗体は、改善された血清保持を示すことができる。ある特定の実施形態では、グリコシル化が減少した本開示の抗体は、ポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び五量体を生成する能力が増加し得る。ある特定の実施形態では、グリコシル化が減少した本開示の抗体は、IgA特異的hFc受容体FcαRIへの結合の減少、例えばFcαRIへの結合を示さないことができる。特定の実施形態では、アミノ酸458、459及び/又はS461に改変を有する本開示の抗体は、改変の一方を有さない抗体と比較して、ポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び五量体を生成する能力が増加している。特定の実施形態では、アミノ酸C471での改変を有する本明細書に開示される抗体は、ポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び五量体を生成する能力が低下している。
2.IgG-IgA融合分子
本開示は更に、本明細書においてIgG-IgA融合分子と呼ばれる、IgG抗体の少なくとも一部及びIgA抗体の少なくとも一部を含む抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、プロテアーゼ、例えばフリンに対する抵抗性の増加、活性及び/又は血清半減期の増加を有する(表9を参照)。ある特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子はFcRnに結合する。
本開示は更に、本明細書においてIgG-IgA融合分子と呼ばれる、IgG抗体の少なくとも一部及びIgA抗体の少なくとも一部を含む抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、プロテアーゼ、例えばフリンに対する抵抗性の増加、活性及び/又は血清半減期の増加を有する(表9を参照)。ある特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子はFcRnに結合する。
ある特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子のIgG抗体は、全長IgG抗体であり得る。特定の実施形態では、IgG抗体は、新生児型Fc受容体(FcRn)に結合する任意のIgG抗体であり得る。例えば、限定するものではないが、IgG抗体は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり得る。ある特定の実施形態では、IgG抗体はIgG1抗体である。ある特定の実施形態では、IgG抗体はIgG2抗体である。ある特定の実施形態では、IgG抗体はIgG3抗体である。ある特定の実施形態では、IgG抗体はIgG4抗体である。
特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、IgA抗体の断片に融合したIgG抗体を含むことができる。ある特定の実施形態では、IgA抗体は、IgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2mn抗体又はIgA2m2抗体であり得る。特定の実施形態では、IgA断片は、約300アミノ酸長、約250アミノ酸長、約200アミノ酸長、約150アミノ酸長、約100アミノ酸長、約80アミノ酸長、約60アミノ酸長、約40アミノ酸長又は約20アミノ酸長であり得る。ある特定の実施形態では、IgA断片は約250アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、IgA断片は約20アミノ酸、例えば約18アミノ酸長である。例えば、限定するものではないが、IgA断片はIgA抗体のFc領域を含むことができる。特定の実施形態では、IgA断片は、IgA抗体のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含むことができる。特定の実施形態では、IgA断片は、IgA抗体のヒンジ領域を更に含むことができる。特定の実施形態では、IgA断片は、IgA抗体のテールピースを更に含むことができる。
特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、IgG抗体及びIgA抗体のFc領域を含むことができる。特定の実施形態では、IgG-IgA融合分子は、本明細書に開示されるIgA抗体のFc領域にそのC末端で融合したIgG抗体を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgG-IgA融合分子は、IgA重鎖のFc領域にC末端で融合した完全長IgG重鎖配列を含むことができる(図7B、図12及び図34Aを参照)。
特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してP221の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体のアミノ酸P221~Y472を含むことができる。ある特定の実施形態では、IgA抗体、例えばIgA1抗体又はIgA2m1抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してP221の配列を含み得る。一定の実施形態では、P221アミノ酸をアルギニン(R)、すなわちP221Rに変異させることができる。ある特定の実施形態では、IgA抗体、例えばIgA2m2抗体又はIgA2mn抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してR221の配列を含むことができ、例えば、IgA抗体のアミノ酸R221~Y472を含むことができる。あるいは、IgA抗体のFc領域は、IgA抗体のヒンジ領域を欠失させる重鎖のC末端を介してC242の配列を含み得る。例えば、限定するものではないが、融合分子のIgA部分は、IgA抗体のアミノ酸C242~Y472を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してV222の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2mn抗体、又はIgA2m2抗体のアミノ酸V222~Y472を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してP223の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2mn抗体、又はIgA2m2抗体のアミノ酸P223~Y472を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してC241の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体、又はIgA2mn抗体のアミノ酸C241~Y472を含むことができる。
特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してP237の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2mn抗体、又はIgA2m2抗体のアミノ酸P237~Y472を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してP238の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体、例えばIgA2m1抗体、IgA2m2抗体、又はIgA2mn抗体のアミノ酸P238~Y472を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してS238の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体、例えばIgA1抗体のアミノ酸S238~Y472を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してP239の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体、例えばIgA1、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体のアミノ酸P239~Y472を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してP240の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体、例えばIgA2m1抗体、IgA2m2抗体、又はIgA2mn抗体のアミノ酸P240~Y472を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のIgA部分、例えばIgA抗体のFc領域は、重鎖のC末端を介してS240の配列を含むことができる。例えば、限定するものではないが、IgA抗体部分は、IgA抗体、例えばIgA1抗体のアミノ酸S240を含むことができる。特定の実施形態では、融合分子のIgA部分は、IgA抗体のテールピース、例えばアミノ酸454~472を含まない。
ある特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、1つのIgAアイソタイプ由来のFc領域及び第2のアイソタイプ由来のヒンジ領域を含み得る。例えば、限定するものではないが、本開示のIgG-IgA融合分子は、IgA2、例えばIgA2m1、IgA2m2又はIgA2mn抗体由来のヒンジ領域を含むことができ、IgA1抗体由来のFc領域を含むことができる。
特定の実施形態では、IgG抗体の重鎖は、C末端リジンアミノ酸、例えばIgG抗体のアミノ酸K447(例えば、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4)を除去するように改変されている。例えば、限定するものではないが、本開示は、アミノ酸K447を欠くIgG抗体と、IgA抗体のアミノ酸P221~Y472又はR221~Y472を含むIgA部分とを含むIgG-IgA融合分子を提供する。
ある特定の実施形態では、IgG抗体とIgA抗体のFc領域との間の接合部は、アミノ酸配列TQKSLSLSPGPVPPPPPCC(配列番号1)若しくはその断片、又はその保存的置換を含み得る。ある特定の実施形態では、IgG抗体とIgA抗体のFc領域との間の接合部は、アミノ酸配列TQKSLSLSPGC(配列番号2)若しくはその断片、又はその保存的置換を含み得る。保存的置換の非限定的な例を表1に示す。ある特定の実施形態では、IgG抗体とIgA抗体のFc領域との間の接合部は、図34Aに開示されるアミノ酸配列を含むことができる。
ある特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA Fc融合物は、約1日まで、約2日まで、約3日まで、約4日まで、又は約5日まで血漿中で安定である。例えば、限定するものではないが、本開示のIgG1-IgA Fc融合物は、血漿中で最大約4日間安定である。
特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、グリコシル化を減少させるために、上記の1つ以上のアミノ酸置換を更に含むことができる。例えば、限定するものではないが、本開示のIgG-IgA融合分子は、IgA抗体の重鎖及び/又はIgG-IgA融合分子のJ鎖のグリコシル化を除去するように改変することができる。ある特定の実施形態では、IgG-IgA融合分子のIgA抗体がアグリコシル化される。ある特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、FcRnに結合するが、FcαRIには結合しない。
特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、1つ以上のFc領域残基238、265、269、270、297、327及び329における置換を更に含むことができる。例えば、限定するものではないが、本開示のIgG-IgA融合分子は、アミノ酸297、例えばN297Gにおける置換を更に含むことができる。
特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、アミノ酸C471及び/又はC311に置換を更に含むことができる。特定の実施形態では、本開示のIgG-IgA融合分子は、アミノ酸C471、例えばC471Sに変異を有することができる。一定の実施形態では、本開示のIgG-IgA Fc融合分子が、アミノ酸C311、例えばC311Sに変異を有し得る。
B.キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号明細書;及びMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))に記載されている。ある特定の実施形態では、本開示のキメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域)、及びヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体であり得る。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号明細書;及びMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))に記載されている。ある特定の実施形態では、本開示のキメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域)、及びヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体であり得る。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のキメラ抗体は、ヒト化抗体であり得る。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減する一方で、親非ヒト抗体の特異性及び親和性は保持するようにヒト化される。通常、ヒト化抗体は、HVR、例えばCDR(又はその一部)が非ヒト抗体に由来する1つ以上の可変ドメインを含み、FR(又はその一部)はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体におけるいくつかのFR残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を復元又は改善するように、非ヒト抗体(例えば、HVR残基が由来する抗体)由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びこれを製造する方法は、例えば、Almagro and Fransson、「Front.Biosci.」、第13巻:第1619~1633頁(2008年)に記載され、更に、例えば、Riechmannら、「Nature」、第332巻:第323~329頁(1988年);Queenら、「Proc.Nat’l Acad.Sci.USA」、第86巻:第10029~10033頁(1989年);米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及び第7,087,409号;Kashmiriら、「Methods」、第36巻:第25~34頁(2005年)(特異性決定領域(SDR)のグラフト接合を記載する);Padlan、「Mol.Immunol.」、第28巻:第489~498頁(1991年)(「リサーフェシング」を記載する);Dall’Acquaら、「Methods」、第36巻:第43~60頁(2005年)(「FRシャッフリング」を記載する);並びに、Osbournら、「Methods」、第36巻:第61~68頁(2005年)、及びKlimkaら、「Br.J.Cancer」、第83巻:第252~260頁(2000年)(FRシャッフリングに対する「ガイド付き選択」手法を記載する)に更に記載される。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:「ベストフィット」法を用いて選択されたフレームワーク領域(例えば、Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993)を参照)、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及びPresta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993)を参照)、ヒト成熟(体細胞変異)フレームワーク領域又はヒト生殖細胞フレームワーク領域(例えば、Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)を参照)、及びFRライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域(例えば、Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及びRosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996)を参照)。
C.ヒト抗体
ある特定の実施形態では、本開示の抗体はヒト抗体であり得る。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して作製され得る。ヒト抗体は、全体的に、van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及びLonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)に記載されている。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体はヒト抗体であり得る。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して作製され得る。ヒト抗体は、全体的に、van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及びLonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)に記載されている。
ヒト抗体は、抗原投与に応答してヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、又は染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説については、Lonberg、Nat.Biotech.、23:1117~1125(2005)を参照されたい。また、例えば、XENOMOUSETM技術を記載する米国特許第6,075,181号及び同第6,150,584号;HUMAB(登録商標)技術を記載する米国特許第5,770,429号;K-M MOUSE(登録商標)技術を記載する米国特許第7,041,870号;及び、VELOCIMOUSE(登録商標)技術を記載する米国特許出願公開第2007/0061900号も参照されたい。かかる動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組合せることによって更に改変され得る。
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている(例えば、Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);及びBoerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991)を参照)。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)にも記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第7,189,826号明細書(ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトIgM抗体の作製を記載する)、及びNi、Xiandai Mianyixue、26(4):265~268(2006)(ヒト-ヒトハイブリドーマを記載している)を含む。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)はまた、Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及びVollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)にも記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによっても作製され得る。その後、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組合せられ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択する技術は以下に記載される。
D.抗体変異体
本願で開示された主題は更に、開示された抗体のアミノ酸配列変異体を提供する。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に組み込むことで、又はペプチド合成により調製することができる。かかる改変としては、本抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/又はそれへの挿入、及び/又はその置換が挙げられるが、これらに限定されない。最終コンストラクトに到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組合せることができるが、但し、その最終抗体改変、すなわち改変された抗体が、所望の特性、例えば抗原結合を保有することを条件とする。
本願で開示された主題は更に、開示された抗体のアミノ酸配列変異体を提供する。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に組み込むことで、又はペプチド合成により調製することができる。かかる改変としては、本抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/又はそれへの挿入、及び/又はその置換が挙げられるが、これらに限定されない。最終コンストラクトに到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組合せることができるが、但し、その最終抗体改変、すなわち改変された抗体が、所望の特性、例えば抗原結合を保有することを条件とする。
1.置換、挿入及び欠失変異体
ある特定の実施形態では、抗体変異体は、1つ以上のアミノ酸置換を有することができる。置換による変異誘発に関して目的の部位には、HVR及びFRが含まれる。保存的置換の非限定的な例は、表1において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化の非限定的な例を表1で「例示的置換」の見出しの下に示し、またアミノ酸側鎖クラスに関して下に更に記載する。アミノ酸置換は、目的の抗体中に導入され得、その産物は、所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善された補体依存性細胞毒性(CDC)若しくは抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)についてスクリーニングされ得る。
ある特定の実施形態では、抗体変異体は、1つ以上のアミノ酸置換を有することができる。置換による変異誘発に関して目的の部位には、HVR及びFRが含まれる。保存的置換の非限定的な例は、表1において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化の非限定的な例を表1で「例示的置換」の見出しの下に示し、またアミノ酸側鎖クラスに関して下に更に記載する。アミノ酸置換は、目的の抗体中に導入され得、その産物は、所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善された補体依存性細胞毒性(CDC)若しくは抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)についてスクリーニングされ得る。
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けされてもよい。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性:Asp、Glu、
(4)塩基性:His、Lys、Arg、
(5)鎖の配向に影響を与える残基:Gly、Pro、
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性:Asp、Glu、
(4)塩基性:His、Lys、Arg、
(5)鎖の配向に影響を与える残基:Gly、Pro、
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
ある特定の実施形態では、非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバを別のクラスと交換することを伴うことになる。
ある特定の実施形態では、一種の置換変異体は、親抗体、例えばヒト化抗体又はヒト抗体の超可変領域残基の1つ以上の置換を伴う。一般に、更なる試験のために選択される結果として生じる変異体(複数可)は、親抗体と比較した、親和性の増加、免疫原性の低減等のこれらに限定されないある特定の生物学的特性の修正、例えば、改善を有し、かつ/又は実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有する。置換型変異体の非限定的な例は、例えば、本明細書に記載の技法等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔には、1つ以上のHVR残基が変異され、変異体抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
ある特定の実施形態では、改変(例えば、置換)がHVRに行われて、例えば、抗体親和性を改善することができる。そのような改変は、HVR「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基(例えば、Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)を参照)、及び/又は抗原と接触する残基内で行われ得、結果として得られる変異体VH又はVLが結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))に記載されている。親和性成熟のある特定の実施形態では、多様性が、様々な方法(例えば、エラー-プローンPCR、鎖シャフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発)のうちのいずれかによって、成熟させるために選択された可変遺伝子に導入され得る。その後、二次ライブラリが作製される。その後、このライブラリがスクリーニングされて、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのHVR残基(例えば、一度に4~6個の残基)をランダム化する、HVR指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に特定され得る。特にCDR-H3及びCDR-L3が標的とされることが多い。
ある特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような改変が、抗体が抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、1つ又は複数のHVR内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変(例えば、本明細書に提供されるような保存的置換)が、HVR中で行われてもよい。そのような変化は、例えば、HVR内の抗原接触残基の外側であり得る。上に提供される変異体VH及びVL配列のある特定の実施形態では、各HVRは、変化していないか、又は1つ、2つ若しくは3つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085によって記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、残基又は標的残基群(例えば、arg、asp、his、lys、及びglu等の荷電残基)が特定され、中性又は負荷電アミノ酸(例えば、アラニン又はポリアラニン)によって置き換えられて、抗体と抗原との相互作用に影響が及ぼされたかを決定する。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。あるいは、又は加えて、抗体と抗原との間の接点を特定するための抗原-抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。変異体は、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入には、1個の残基から100個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び/又はカルボキシル末端融合、並びに1個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入型変異体としては、抗体の血清半減期を増加させる、酵素(例えば、抗体指向性酵素プロドラッグ療法(Antibody-directed enzyme prodrug therapy:ADEPT)のため)又はポリペプチドへの抗体のN末端又はC末端の融合が挙げられる。
2.Fc領域変異体
ある特定の実施形態では、1つ以上のアミノ酸改変が本明細書に提供される抗体のFc領域に導入され、それにより、Fc領域変異体が生成され得る。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば、置換)を含む、ヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgA Fc領域、又はヒトIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4 Fc領域)を含み得る。
ある特定の実施形態では、1つ以上のアミノ酸改変が本明細書に提供される抗体のFc領域に導入され、それにより、Fc領域変異体が生成され得る。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば、置換)を含む、ヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgA Fc領域、又はヒトIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4 Fc領域)を含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、全てではないが一部のエフェクタ機能を有し、それによりインビボでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクタ機能(例えば、補体及びADCC等)が不要又は有害である用途にとって望ましい候補となる、抗体変異体を提供する。インビトロ及び/又はインビボ細胞傷害性アッセイを行って、CDC及び/又はADCC活性の低減/欠乏を確認することができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを行って、抗体がIgA特異的hFc受容体、すなわち、FcαRI結合を欠くが、FcRn結合能を保持することを確実にすることができる。造血細胞でのFcR発現は、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)の464頁、表3に要約されている。例えば、ADCC、NK細胞を媒介するための初代細胞はFcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号(例えば、Hellstrom,I.et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986)を参照)、及びHellstrom,I et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);米国特許第5,821,337号(Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987)を参照)に記載される。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい(例えば、フローサイトメトリー(Cell Technology、Inc.、カリフォルニア州マウンテンビュー)のためのACTITM非放射性細胞毒性アッセイ;及びCYTOTOX 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイ(Promega、ウィスコンシン州マディソン)を参照)。そのようなアッセイに有用なエフェクタ細胞には、末梢血単核球(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。あるいは、又は加えて、目的とする分子のADCC活性は、例えばClynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)に開示されるような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。C1q結合アッセイを実行して、抗体がC1qに結合することができず、それ故にCDC活性を欠くことを確認することができる。例えば、国際公開第2006/029879号及び国際公開第2005/100402号のC1q及びC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを実施してもよい(例えば、Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003);及びCragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004)を参照,)。FcRn結合及びインビボクリアランス/半減期決定もまた、当該技術分野で既知の方法を使用して行われ得る(例えば、Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))を参照)。ある特定の実施形態では、例えば、米国特許第6,194,551号、国際公開第99/51642号、及びIdusogie et al.J.Immunol.164:4178-4184(2000)に記載されるように、変化した(すなわち、改善されたか又は減少したかのいずれか)C1q結合及び/又は補体依存性細胞毒性(CDC)をもたらす改変が、Fc領域において行われる。
エフェクタ機能が低下した抗体としては、Fc領域の残基238、265、269、270、297、327及び329において1つ以上の置換を含むものが挙げられる(米国特許第6,737,056号)。そのようなFc変異体には、アミノ酸位置265、269、270、297及び327のうちの2つ以上に置換を有するFc変異体が挙げられ、残基265及び297がアラニンに置換されている、いわゆる「DANA」Fc変異体が含まれる(米国特許第7,332,581号)。
FcRに対する結合が改善又は減少したある特定の抗体変異体が記載される。例えば、米国特許第6,737,056号、国際公開第2004/056312号、及びShields et al.J.Biol.Chem.9(2):6591~6604(2001)を参照されたい。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体変異体は、ADCCを改善する1つ以上のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の298、333、及び/又は334位(残基のEUナンバリング)での置換を有するFc領域を含む。
ある特定の実施形態では、抗体のFc領域で起こる改変、例えば本明細書に開示される二重特異性抗体は、増加した半減期及び新生児型Fc受容体(FcRn)への改善された結合を有する、変異体抗体を作成することができ、これは母体IgGの胎児への移入の原因であり(Guyerら、「J.Immunol.」、第117巻:第587頁(1976年)及びKimら、「J.Immunol.」、第24巻:第249頁(1994年))、米国特許出願公開第2005/0014934A1号(Hintonら)に記載される。それらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合を改善する1つ以上の置換を有するFc領域をそこに含む。かかるFc変異体は、1つ以上のFc領域残基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424又は434における置換、例えばFc領域残基434の置換を伴うものを含む(米国特許第7,371,826号)。
Fc領域変異体のその他の例に関係するDuncan&Winter,Nature 322:738-40(1988);米国特許第5,648,260号;同第5,624,821号;及び国際公開第94/29351号もまた参照されたい。
3.システイン操作抗体変異体
ある特定の実施形態では、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作された抗体、例えば、「thioMAb」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、それを使用して、薬物部分又はリンカー-薬物部分等の他の部分に抗体を複合体化して、本明細書に更に記載されるように、免疫複合体を作製することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基のうちの任意の1つ以上がシステインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabatナンバリング)、重鎖のA118(EUナンバリング)、及び重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるように生成され得る。
ある特定の実施形態では、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作された抗体、例えば、「thioMAb」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、それを使用して、薬物部分又はリンカー-薬物部分等の他の部分に抗体を複合体化して、本明細書に更に記載されるように、免疫複合体を作製することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基のうちの任意の1つ以上がシステインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabatナンバリング)、重鎖のA118(EUナンバリング)、及び重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるように生成され得る。
4.抗体誘導体
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するように、更に改変され得る。抗体の誘導体化に好適な部分としては、限定するものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol:PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。このポリマーは、任意の分子量を有していてもよい、分岐していてもよい、又は分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は変化し得て、1つを超えるポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、改善される抗体の具体的な特性又は機能、抗体の誘導体が規定の状態下である療法で使用されるか等を含むが、これらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するように、更に改変され得る。抗体の誘導体化に好適な部分としては、限定するものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol:PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。このポリマーは、任意の分子量を有していてもよい、分岐していてもよい、又は分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は変化し得て、1つを超えるポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、改善される抗体の具体的な特性又は機能、抗体の誘導体が規定の状態下である療法で使用されるか等を含むが、これらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
ある特定の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。ある特定の実施形態では、放射線は、いずれの波長のものであってもよく、これには、限定するものではないが、通常の細胞を傷つけないが、抗体-非タンパク質性部分に近接する細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長が挙げられる。
5.免疫複合体
本開示の主題はまた、化学療法剤若しくは薬物、増殖阻害剤、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位体等の1つ以上の細胞毒性物質にコンジュゲートされた、本明細書に記載される、抗体を含む免疫複合体を提供する。例えば、開示された主題の抗体は、別の抗体、抗体断片、ペプチド、又は結合模倣物等の1つ以上の他の結合分子に機能的に結合され得る(例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合、又は他の方法による)。
本開示の主題はまた、化学療法剤若しくは薬物、増殖阻害剤、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位体等の1つ以上の細胞毒性物質にコンジュゲートされた、本明細書に記載される、抗体を含む免疫複合体を提供する。例えば、開示された主題の抗体は、別の抗体、抗体断片、ペプチド、又は結合模倣物等の1つ以上の他の結合分子に機能的に結合され得る(例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合、又は他の方法による)。
ある特定の実施形態では、免疫複合体は抗体薬剤複合体(ADC)であり、本開示の抗体が、これらに限定されるわけではないが、マイタンシノイド(米国特許第5,208,020号、同第5,416,064、及び欧州特許第0 425 235号を参照);モノメチルオーリスタチン薬剤部分DE及びDF(MMAE及びMMAF)等のオーリスタチン(米国特許第5,635,483号、及び同第5,780,588号、及び同第7,498,298号を参照);ドラスタチン;カリケアマイシン又はその誘導体(米国特許第5,712,374号、同第5,714,586号、同第5,739,116号、同第5,767,285号、同第5,770,701号、同第5,770,710号、同第5,773,001号、及び同第5,877,296号;Hinman et al.,Cancer Res.53:3336-3342(1993);and Lode et al.,Cancer Res.58:2925-2928(1998)を参照);ダウノマイシン又はドキソルビシン等のアントラサイクリン(Kratz et al.,Current Med.Chem.13:477-523(2006);Jeffrey et al.,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006);Torgov et al.,Bioconj.Chem.16:717-721(2005);Nagy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000);Dubowchik et al.,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002);King et al.,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及び米国特許第6,630,579号を参照);メトトレキサート;ビンデシン;ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル等のタキサン;トリコテセン;並びにCC1065を含む1つ以上の薬剤に複合化されている。
ある特定の実施形態では、免疫複合体は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンシン(dianthin)タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、並びにトリコテセン(tricothecene)を含むがこれらに限定されない酵素活性毒素又はその断片に複合された本明細書に記載される抗体を含む。
ある特定の実施形態では、免疫複合体は、放射性原子に複合体化されて放射性複合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。放射性複合体の産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。非限定的な例としては、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、及びLuの放射性同位体が挙げられる。放射性複合体が検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィ研究のための放射性原子、例えば、tc99m若しくはI123、又は核磁気共鳴(NMR)画像法(別名、磁気共鳴画像法、mri)のためのスピン標識、例えば、ヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄を含むことができる。
抗体断片及び細胞傷害性剤の抱合体は、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート)、及びビス-活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)等の多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)に記載されているように調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合化するための例示的なキレート剤である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは、細胞内での細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー(Chari et al.,Cancer Res.52:127-131(1992);米国特許第5,208,020号)を使用することができる。リンカーの非限定的な例を上に開示する。
本明細書に開示される免疫複合体は、市販されている(例えば、Pierce Biotechnology,Inc.製、米国イリノイ州ロックフォード)、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、並びにSVSB(サクシニミジル-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)を含むが、これらに限定されない架橋剤試薬で調製されるかかる複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
III.抗体産生及び精製の方法
A.抗体産生の方法
本明細書に開示される抗体は、当技術分野で利用可能な技術又は既知の技術を用いて作製することができる。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば米国特許第4,816,567号に記載されているように、組換え方法及び組成物を用いて産生することができる。本開示の抗体、例えばIgA抗体及びIgG-IgA融合分子を作製するための詳細な手順を以下の実施例に記載する。
A.抗体産生の方法
本明細書に開示される抗体は、当技術分野で利用可能な技術又は既知の技術を用いて作製することができる。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば米国特許第4,816,567号に記載されているように、組換え方法及び組成物を用いて産生することができる。本開示の抗体、例えばIgA抗体及びIgG-IgA融合分子を作製するための詳細な手順を以下の実施例に記載する。
本願で開示された主題は、本明細書に開示される抗体をコードする単離された核酸を更に提供する。例えば、単離された核酸は、本開示のアグリコシル化抗体をコードするアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、本開示の単離された核酸は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上又は6つ以上のグリコシル化部位、例えばN結合型グリコシル化部位及び/又はO結合型グリコシル化部位を除去するように改変されたIgA抗体をコードするアミノ酸配列をコードすることができる。特定の実施形態では、本開示の単離された核酸は、アミノ酸N166、T168、N211、S212、S213、N263、T265、N337、I338、T339、N459及び/又はS461に1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上又は12個の改変、例えば置換を有するIgA抗体をコードするアミノ酸配列をコードすることができる。特定の実施形態では、本開示の単離された核酸は、本明細書に開示されるIgG-IgA融合分子、例えばIgG-IgA Fc融合分子をコードするアミノ酸配列をコードすることができる。
ある特定の実施形態では、核酸は、1つ以上のベクター、例えば発現ベクター中に存在し得る。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの1種は「プラスミド」であり、これは、追加のDNAセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することができる(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクター、発現ベクターは、それらが作動可能に連結する遺伝子の発現を誘導することができる。一般に、組換えDNA技法において利用される発現ベクターは、プラスミド(ベクター)の形態である場合が多い。しかしながら、開示された主題は、同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)のような他の形態の発現ベクター等を含むことを意図している。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体をコードする核酸、及び/又は核酸を含む1つ以上のベクターを、宿主細胞に導入することができる。ある特定の実施形態では、細胞への核酸の導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスベクター又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、微小細胞媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば(1)抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列、抗体の重鎖を含むアミノ酸配列、及び抗体のJ鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター;(2)(a)抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列及び抗体の重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、並びに(b)抗体のJ鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター;又は(3)(a)抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、(b)抗体の重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター、及び(c)抗体のJ鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第3のベクターで形質転換されたものを含み得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば、(a)抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、(b)抗体の重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター、(c)抗体のJ鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第3のベクター、及び(d)抗体の分泌成分を含むアミノ酸をコードする核酸を含む第4のベクターで形質転換されたものを含み得る。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、293細胞、例えば、Expi293細胞である。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体を作製する方法は、抗体をコードする1つ以上の核酸が導入された宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、及び必要に応じて、宿主細胞及び/又は宿主細胞培養培地から抗体を回収することを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、クロマトグラフィ技術によって宿主細胞から回収される。
本開示の抗体の組換え産生のために、例えば上記のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び/又は発現のために1つ以上のベクターに挿入され得る。そのような核酸は、従来の手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、容易に単離し、配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核生物細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びFcエフェクタ機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5,648,237号、同第5,789,199号、及び同第5,840,523号を参照されたい。(大腸菌における抗原断片の発現を記載するCharlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254も参照されたい)発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、抗体をコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する。Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)、及びLi et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)を参照されたい。グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Spodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組合せて使用してもよい。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Spodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組合せて使用してもよい。
ある特定の実施形態では、植物細胞培養物を宿主細胞として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、及び同第6,417,429号(トランスジェニック植物で抗体を産生するためのPLANTIBODIES(商標)技術を記載している)を参照されたい。
ある特定の実施形態では、脊椎動物細胞を宿主として使用することもできる。例えば、限定するものではなく、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の非限定的な例は、SV40(COS-7)によって形質転換されたサル腎臓CV1株;ヒト胎児性腎株(例えば、Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)に記載される293又は293細胞);ベビーハムスター腎細胞(baby hamster kidney cell:BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)に記載されるTM4細胞;サル腎細胞(CV1);アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76);ヒト子宮頸癌細胞(HELA);イヌ腎細胞(MDCK);バッファロラット肝細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝細胞(Hep G2);マウス乳癌(MMT 060562);例えばMather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)に記載されるTRI細胞;MRC 5細胞;並びにFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、DHFR-CHO細胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、並びにY0、NS0、及びSp2/0等の骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)を参照されたい。
ある特定の実施形態では、動物系を用いて、本開示の抗体を産生することができる。ハイブリドーマを調製するための1つの動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立された手法である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコル及び技術は、当技術分野において公知である。融合パートナ(例えば、マウス骨髄腫細胞)及び融合手順もまた公知である(例えば、Harlow and Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor New Yorkを参照されたい)。
1.ポリマーIgAの産生方法
本開示は、ポリマーIgAを産生する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の方法を使用して、2種以上のIgA単量体、例えば約2~約5種のIgA単量体を含有するIgAポリマーを産生することができる。例えば、限定するものではないが、本開示の方法を使用して、IgA二量体、三量体、四量体及び/又は五量体を産生することができる。特定の実施形態では、そのような方法は、細胞に導入される、例えばトランスフェクトされる軽鎖(LC)及び/又は重鎖(HC)をコードするDNAの量に対するJ鎖をコードするDNAの量の比を変更することを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、細胞に導入される、例えばトランスフェクトされるLC、HC及び分泌成分(SC)をコードするDNAの量に対するJ鎖をコードするDNAの量の比を変更することを含む。
本開示は、ポリマーIgAを産生する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の方法を使用して、2種以上のIgA単量体、例えば約2~約5種のIgA単量体を含有するIgAポリマーを産生することができる。例えば、限定するものではないが、本開示の方法を使用して、IgA二量体、三量体、四量体及び/又は五量体を産生することができる。特定の実施形態では、そのような方法は、細胞に導入される、例えばトランスフェクトされる軽鎖(LC)及び/又は重鎖(HC)をコードするDNAの量に対するJ鎖をコードするDNAの量の比を変更することを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、細胞に導入される、例えばトランスフェクトされるLC、HC及び分泌成分(SC)をコードするDNAの量に対するJ鎖をコードするDNAの量の比を変更することを含む。
本開示は、IgA二量体の産生を増加させる方法を提供する。特定の実施形態では、IgA二量体の産生を増加させる方法は、軽鎖及び重鎖をコードするDNAの量と比較して、細胞に導入される、例えばトランスフェクトされるJ鎖をコードするDNAの量を増加させることを含む。ある特定の実施形態では、発現の増加は、等量のJ鎖、重鎖及び軽鎖DNAが導入された、例えばトランスフェクトされた細胞で産生されたIgA二量体の量に対するものである。例えば、限定するものではないが、方法は、IgA1、IgA2m1、IgA2m1.P221R二量体、IgA2m2及びIgA2mn二量体を産生するために使用することができる。特定の実施形態では、本方法は、IgA二量体の産生を増加させるために、約1:1:2、約1:1:3、約1:1:4又は約1:1:5である、J鎖をコードするDNAの量に対する重鎖をコードするDNAの量と軽鎖をコードするDNAの量との比(HC:LC:JC)、例えば約1:1:2~約1:1:5の比で宿主細胞に導入する、例えばトランスフェクトすることを含み得る。ある特定の実施形態では、この方法は、軽鎖をコードするDNAの量及び/又は重鎖をコードするDNAの量よりも約2倍多い、約3倍多い、約4倍多い、又は約5倍多い量のJ鎖をコードするDNAで細胞をトランスフェクトすることを含み得る。
本開示は、IgAポリマーの産生を増加させる方法を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示は、IgA二量体、三量体、四量体及び/又は五量体の産生を増加させる方法を提供する。特定の実施形態では、IgAポリマー、例えば、二量体、三量体、四量体及び/又は五量体の産生を増加させる方法は、軽鎖及び重鎖をコードするDNAの量と比較して、細胞に導入されるJ鎖をコードするDNAの量を減少させることを含む。特定の実施形態では、産生の増加は、J鎖DNAの量に対して等量の重鎖及び軽鎖DNAを導入、例えばトランスフェクトした細胞で産生されるIgAポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び/又は五量体の量に対してである。例えば、限定するものではないが、方法は、IgA1、IgA2m1、IgA2m1P221R、IgA2m2又はIgA2mnポリマー、例えば二量体、三量体、四量体及び/又は五量体を産生するために使用することができる。ある特定の実施形態では、該方法は、約1:1:0.25又は約1:1:0.5、例えば、約1:1:0.25~約1:1:0.5の比である、重鎖をコードするDNAの量対軽鎖をコードするDNAの量対J鎖をコードするDNAの量の比(HC:LC:JC)で宿主細胞をトランスフェクトして、IgA三量体、四量体及び/又は五量体の産生を増加させることを含み得る。ある特定の実施形態では、J鎖をコードするDNAの量は、軽鎖をコードするDNAの量及び/又は重鎖をコードするDNAの量よりも約3倍未満、約2倍未満又は約1倍未満大きくすることができる。ある特定の実施形態では、J鎖をコードするDNAの量は、軽鎖をコードするDNAの量及び/又は重鎖をコードするDNAの量の約0.5倍未満又は約0.25倍未満であり得る。
ある特定の実施形態では、IgA1、IgA2m1及び/又はIgA2mn三量体、四量体及び五量体の産生を増加させる方法が、細胞内で、アミノ酸V458に置換を有するIgA1抗体、IgA2m1抗体及び/又はIgA2mn抗体を発現させることを含み得る。ある特定の実施形態では、アミノ酸V458をイソロイシン(すなわち、V458I)に変異させることができる。ある特定の実施形態では、IgA1、IgA2m1及び/又はIgA2mn三量体、四量体及び五量体の産生の増加は、アミノ酸V458に置換を有さない細胞における、IgA1抗体、IgA2m1抗体及び/又はIgA2mn抗体の発現から生じるIgA1、IgA2m1及び/又はIgA2mn三量体、四量体及び五量体の産生に対するものである。
ある特定の実施形態では、IgA2m2二量体の産生を増加させる方法は、アミノ酸I458に置換を有するIgA2m2抗体を発現させることを含み得る。ある特定の実施形態では、アミノ酸I458をバリン(すなわち、I458V)に変異させることができる。ある特定の実施形態では、IgA2m2二量体の産生の増加は、アミノ酸I458に置換を有さないIgA2m2抗体の発現から生じるIgA2m2二量体の産生に対するものである。
特定の実施形態では、IgAポリマーの産生を増加させる方法は、例えば、グリコシル化部位を除去するように改変されていないIgA抗体によるIgAポリマーの産生に対して、例えばアミノ酸置換(上記のように)によって、IgA抗体から1つ以上のグリコシル化部位を除去することを含み得る。ある特定の実施形態では、IgAポリマーの産生を増加させる方法が、アミノ酸N459及び/又はS461において1つ以上の置換を含み得る。例えば、限定するものではないが、IgA抗体はアミノ酸N459に置換を有することができる。一定の実施形態では、IgA抗体はアミノ酸S461に置換を有し得る。特定の実施形態では、IgA抗体は、アミノ酸N459及び/又はS461に置換を有することができる。そのような置換の非限定的な例としては、N459のA、G又はQへの変異が挙げられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸S461をAに変異させることができる。一定の実施形態では、IgA1ポリマーの産生を増加させる方法が、アミノ酸N459及び/又はS461での置換、例えばアミノ酸N459及びS461での置換を有するIgA1抗体を発現させることを含み、例えば、発現の増加は、アミノ酸N459及び/又はS461での置換を有しないIgA1抗体の発現によって産生されるIgA1ポリマーの量に対するものである。ある特定の実施形態では、IgA2ポリマー、例えばIgA2m1、IgA2m2及びIgA2mnポリマーの産生を増加させる方法が、アミノ酸N459及び/又はS461における置換、例えばアミノ酸N459及びS461における置換を有するIgA2抗体を発現させることを含む。ある特定の実施形態では、IgA2ポリマーの産生の増加は、アミノ酸N459及び/又はS461に置換を有さないIgA2抗体の発現から生じるIgA2ポリマーの産生に対するものである。
ある特定の実施形態では、IgAポリマー(例えば、IgA単量体の産生の増加)の産生を減少させる方法が、アミノ酸C471、例えばC471S変異での置換を有するIgA抗体、例えばIgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体又はIgA2mn抗体を発現させることを含む。例えば、限定するものではないが、IgA2m2ポリマーの産生を減少させる方法は、アミノ酸C471における置換、例えばC471S変異を有するIgA2m2抗体を発現させることを含む。ある特定の実施形態では、IgAポリマー、例えばIgA2m2ポリマーの産生の減少は、アミノ酸C471に置換を有さないIgA抗体、例えばIgA2m2抗体の発現から生じるIgAポリマー、例えばIgA2m2ポリマーの産生に対するものである。
2.ポリマーIgG-IgA融合分子の産生方法
本開示は更に、本開示のIgG-IgA融合分子を産生する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるIgG-IgA融合分子の二量体を生成する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるIgG-IgA融合分子のポリマー、例えば二量体、三量体及び/又は四量体を産生する方法を提供する。
本開示は更に、本開示のIgG-IgA融合分子を産生する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるIgG-IgA融合分子の二量体を生成する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるIgG-IgA融合分子のポリマー、例えば二量体、三量体及び/又は四量体を産生する方法を提供する。
特定の実施形態では、該方法は、IgG-IgA融合分子の二量体の産生に関する。例えば、限定するものではないが、IgG-IgA融合分子の二量体を発現させる方法は、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含むIgG-IgA融合分子を発現させることを含み得、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してP221又はR221を含む配列を含み、IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を含む。
特定の実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるIgG-IgA融合分子のポリマーの産生に関する。例えば、限定するものではないが、IgG-IgA融合分子の二量体、三量体、又は四量体を発現させる方法は、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含むIgG-IgA融合分子を発現させることを含み、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してC242を含む配列を含む。ある特定の実施形態では、IgG抗体が、アミノ酸K447の欠失を含む。ある特定の実施形態では、上記方法によって産生されるIgG-IgA融合分子のポリマーは、IgG-IgA融合分子の二量体、三量体及び/又は四量体を含む。
B.抗体産生の方法
本開示は更に、本明細書中に開示される抗体を精製する方法を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示は、本明細書中に開示される抗体のオリゴマー状態を分離するための方法、例えば、抗体の四量体状態から二量体状態を分離するための方法を提供する。
本開示は更に、本明細書中に開示される抗体を精製する方法を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示は、本明細書中に開示される抗体のオリゴマー状態を分離するための方法、例えば、抗体の四量体状態から二量体状態を分離するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体を精製するための方法は、タンパク質親和性カラムを使用して抗体を精製することを含み得る。ある特定の実施形態では、本方法は、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を行うことを更に含み得る。例えば、限定するものではないが、SECは、本明細書に開示される抗体、例えばIgA抗体及び/又はIgG-IgA融合分子の特定のオリゴマー状態を精製及び/又は単離するために実施することができる。ある特定の実施形態では、SECを実施して、本明細書に開示される抗体の1つのオリゴマー状態、例えば二量体状態、三量体状態、四量体状態及び/又は五量体状態を精製及び/又は単離することができる。
特定の実施形態では、タンパク質親和性カラムは、MabSelect Sure(GE Healthcare)カラムであり得る。ある特定の実施形態では、本開示の抗体、例えば主に1つのオリゴマー状態を含むIgA試料を、MabSelect Sure(GE Healthcare)、続いてHiLoad Superdexカラム(GE Healthcare)を用いてSECを用いて親和性精製することができる。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体、例えば本明細書に開示されるIgA抗体を、プロテインL(GE Healthcare)、続いてSECで精製することができる。ある特定の実施形態では、プロテインLカラムは、トリス緩衝液(25mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、5mM EDTA、2mM NaN3)を含む第1洗浄緩衝液で洗浄することができる。ある特定の実施形態では、プロテインLカラムを、Triton X-114緩衝液(25mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、5mM EDTA、0.1% Triton X-114、2mM NaN3)を含む第2の洗浄緩衝液で更に洗浄して、エンドトキシンを除去することができる。ある特定の実施形態では、プロテインLカラムを、Tris緩衝液を含む第3の洗浄緩衝液で洗浄し、KP緩衝液(0.4Mリン酸カリウム、pH7.0、5mM EDTA、0.02% Tween20、2mM NaN3)を含む第4の洗浄緩衝液で洗浄し、及び/又はTris緩衝液を含む第5の洗浄緩衝液で洗浄することができる。代替的又は追加的に、プロテインLカラムは、PBSを含む洗浄緩衝液で1回以上洗浄することができる。
特定の実施形態では、抗体は、1Mアルギニン、0.4Mコハク酸塩、pH2.7で中和することができる150mM酢酸、pH9.0を含む緩衝液を使用してプロテインLカラムから溶出することができる。代替的又は追加的に、抗体は、pH3.0の50mMリン酸を含む緩衝液を使用してプロテインLカラムから溶出することができる。ある特定の実施形態では、溶出した抗体をpH11の20×PBSで中和することができる。
ある特定の実施形態では、複合オリゴマーを含むIgA試料では、例えば、抗体の特定のオリゴマー状態(例えば、二量体、三量体及び/又は四量体の状態)を単離するために、3.5μm、7.8mm×300mm XBridge Protein BEH 450 Å SECカラム(Waters)を使用してプロテインL溶出液を更に精製することができる。ある特定の実施形態では、100μL以下の注入体積中の1mg未満の総タンパク質を、移動相として0.2Mアルギニン、0.137Mコハク酸塩、pH5.0を用いたAgilent 1260 Infinity HPLCを使用して1mL/分でカラムに流し、200μLの画分を収集した。特定の実施形態では、SECカラムからの画分を選択的にプールして、主に1つのオリゴマー状態を単離することができる。1回以上の実行を行うことができ、各実行からの所与のオリゴマーの画分を一緒にプールすることができる。
処置方法
本開示の主題は、開示された抗体、例えばIgA及びIgG-IgA融合分子を使用する方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、本開示の抗体の治療的使用に関する。
本開示の主題は、開示された抗体、例えばIgA及びIgG-IgA融合分子を使用する方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、本開示の抗体の治療的使用に関する。
ある特定の実施形態では、本開示の主題の1つ以上の抗体は、対象における疾患及び/又は障害を処置するために使用され得る。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、炎症性疾患、自己免疫疾患及びがんを処置するために使用され得る。ある特定の実施形態において、本開示の抗体は、がんを処置するために使用され得る。ある特定の実施形態では、FcαRIへの結合を欠き、FcαRIを活性化することができない本開示の抗体を、炎症性疾患、自己免疫疾患及びがんを処置するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、治療効果のために抗体のトランスサイトーシスを必要とする疾患及び/又は障害を処置するために、及び/又は治療標的にアクセスするために使用され得る。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、粘膜を横切る抗体のトランスサイトーシスを必要とする疾患及び/又は障害を処置するために使用され得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、特定の疾患及び/又は障害を有する個体を処置する方法に使用するための抗体であって、有効量の抗体又はそれを含む組成物を個体に投与することを含む抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも1つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。ある特定の実施形態では、本開示は、特定の分子経路及び/又は機構を阻害するのに使用するための抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、個体における特定の分子経路及び/又は機構を阻害する方法であって、特定の分子経路及び/又は機構を阻害するのに有効な抗体を個体に投与することを含む方法に使用される抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、特定の分子経路及び/又は機構を不活性化するのに使用される抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、個体における特定の分子経路及び/又は機構を阻害する方法であって、特定の分子経路及び/又は機構を不活性化するのに有効な抗体を個体に投与することを含む方法に使用される抗体を提供する。
本明細書で同義に使用される「個体」、「患者」、又は「対象」は、哺乳動物を指す。哺乳動物には、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類)、ウサギ、及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。
本開示は更に、対象の疾患及び/又は障害を処置するための医薬品の製造又は調製における抗体の使用を提供する。ある特定の実施形態では、医薬は、特定の疾患及び/又は障害の処置用である。ある特定の実施形態では、医薬は、疾患を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、特定の疾患及び/又は障害を処置する方法に使用するためのものである。ある特定の実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも1つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。ある特定の実施形態では、医薬は、特定の分子経路及び/又は機構を阻害又は活性化するためのものである。ある特定の実施形態では、医薬は、個体における特定の分子経路及び/又は機構を阻害又は活性化する方法であって、特定の分子経路及び/又は機構を阻害するのに有効な量の医薬を個体に投与することを含む方法において使用するためのものである。
ある特定の実施形態では、開示される治療方法で使用するための抗体は、本明細書に記載される医薬組成物中に存在することができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の薬学的に許容可能な担体を含むことができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、1つ以上の本開示の抗体を含むことができる。
追加的又は代替的に、医薬組成物は、第2の治療剤を含むことができる。開示される抗体の1種以上が別の治療剤と共に投与される場合、1種以上の抗体及び他の治療剤は、いずれかの順序で又は同時に投与され得る。上述のかかる併用療法は、併用投与(2つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる)及び個別投与を包含し、個別投与の場合、本開示の抗体の投与が、追加の治療剤(複数可)の投与前に、投与と同時に、及び/又は投与後に起こる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約1ヶ月以内、又は約1週間、2週間若しくは3週間以内、又は約1、2、3、4、5、若しくは6日以内に生じる。
本開示の抗体(及び任意の追加の治療剤)は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含み、局所処置に所望される場合、病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短時間であるか、又は慢性的であるかに部分的に応じて、例えば、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射によるものであり得る。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
本開示の抗体は、グッドメディカルプラクティス(good medical practice)と一致した様式で製剤化、投薬、及び投与され得る。本文脈で考慮すべき因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の因子が挙げられる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている1つ以上の薬剤とともに製剤化される。有効量のそのような他の作用物質は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類、及び上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載される投薬量の約1~99%、又は適切であると経験的/臨床的に決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防又は治療について、本開示の抗体の適切な投薬量(単独で又は1つ以上の他の追加の治療剤と組合せて使用される場合)は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的のために投与されるか、以前の療法、患者の病歴、及び抗体への応答、並びに主治医の判断に依存する。ある特定の実施形態では、本開示の抗体を必要に応じて投与することができる。特定の実施形態では、抗体は、1回又は一連の治療にわたって患者に投与することができる。例えば、限定するものではないが、本明細書中に開示される抗体及び/又は医薬組成物は、対象に、1日に2回、1日に1回、2日に1回、3日に1回、4日に1回、5日に1回、6日に1回、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、1ヶ月に1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、6ヶ月に1回又は1年に1回投与され得る。
ある特定の実施形態では、疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、1回又は複数回の別個の投与によるものであれ、連続注入によるものであれ、約1μg/kg~15mg/kg(例えば、0.1mg/kg~10mg/kg)の抗体が、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。1つの典型的な1日投薬量は、上で言及した因子に応じて、約1μg/kg~100mg/kg以上の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、1日投与量は、約100mg/kgを超える場合がある。ある特定の実施形態では、投与量は、1~1000μg/ml、いくつかの方法では25~300μg/mlの血漿抗体濃度を達成するように調整され得る。
数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、治療は、概して、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられ得る。抗体の1つの例示的な投薬量は、約0.05mg/kg~約10mg/kgの範囲である。ある特定の実施形態では、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg若しくは10mg/kg(又はこれらの任意の組合せ)の1回又は複数回の用量を患者に投与してもよい。あるいは、抗体は、持続放出製剤として投与することができ、その場合、必要とされる投与頻度は少ない。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に基づいて変動し得る。ある特定の実施形態では、そのような用量は、断続的に、例えば、毎週又は3週間毎(e.g、患者が約2~約20回、又はe.g約6回の用量の抗体を受けるように)投与されてもよい。初期の多めの用量、それに続く1回又は複数回の量の少ない用量を投与してよい。
ある特定の実施形態では、方法は、対象を監視し、処置の有効性を決定することを更に含むことができる。例えば、この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視され得る。
V.医薬組成物
本開示の主題は、本開示の抗体の1つ以上、例えばIgA及びIgG-IgA Fc融合タンパク質を薬学的に許容可能な担体と共に含有する医薬組成物を更に提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本開示の主題の複数の(例えば、2つ以上)抗体及び/又はその抗原結合部分の組合せを含むことができる。
本開示の主題は、本開示の抗体の1つ以上、例えばIgA及びIgG-IgA Fc融合タンパク質を薬学的に許容可能な担体と共に含有する医薬組成物を更に提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本開示の主題の複数の(例えば、2つ以上)抗体及び/又はその抗原結合部分の組合せを含むことができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を1つ以上の任意の薬学的に許容可能な担体と凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混和することによって調製され得る(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))。例えば、限定するものではないが、凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。ある特定の実施形態では、水性抗体製剤としては、米国特許第6,171,586号及び国際公開第2006/044908号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、純度が約80%超、約90%超、約91%超、約92%超、約93%超、約94%超、約95%超、約96%超、約97%超、約98%超、約99%超、約99.1%超、約99.2%超、約99.3%超、約99.4%超、約99.5%超、約99.6%超、約99.7%超、約99.8%超又は約99.9%超であり得る。
薬学的に許容可能な担体は一般的に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質、防腐剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、及びm-クレゾール等)、低分子量(約10残基未満)のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属複合体(例えば、Zn-タンパク質複合体)、並びに/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容可能な担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)等のヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤を更に含む。rHuPH20を含む、ある特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号明細書及び同第2006/0104968号明細書に記載される。一態様では、sHASEGPを、1種以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ(例えば、コンドロイチナーゼ)と組合せる。
担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与(例えば注射又は点滴によって)に適し得る。投与経路に応じて、抗体は、化合物を不活性化し得る酸及び他の自然条件の作用から化合物を保護するために材料でコーティングすることができる。
本開示の医薬組成物は、併用療法で、すなわち他の薬剤と組合せて投与することもできる。ある特定の実施形態では、本明細書における医薬組成物は、処置される特定の適応症に必要な2種以上の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する有効成分も含み得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、第1の治療薬によって治療される同じ疾患を処置するための第2の有効成分を含むことができる。そのような有効成分は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組合せて存在する。例えば、限定するものではないが、本開示の製剤は、治療されている特定の適応症に対して必要に応じて1つを超える活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する活性成分も含有し得る。例えば、同じ疾患の処置に有用な第2の治療薬を更に提供することが望ましい場合がある。そのような有効成分は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組合せて存在する。
本開示の組成物は、当該技術分野で知られている種々の方法によって投与することができる。投与経路及び/又は投与様式は、所望の結果に応じて変化する。活性化合物を、化合物を急速放出から保護する担体、例えばインプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤をいて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法は、例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978によって記載されている。特定の実施形態では、医薬組成物は、米国食品医薬品局の医薬品適正製造基準(GMP)条件下で製造される。
開示される抗体を含有する徐放性調製物を調製することもできる。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、これらのマトリクスは、成形物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。ある特定の実施形態では、活性成分はまた、例えばコアセルベーション技法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタチレート)マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル)中に、又はマクロ乳濁液中に取り込まれても良い。かかる技法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)に開示されている。
特定の投与経路によって本開示の抗体を投与するために、化合物をその不活性化を防止するための材料で被覆するか、又は化合物をその不活性化を防止するための材料と同時投与することが必要な場合がある。例えば、化合物は、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤中で対象に投与され得る。薬学的に許容可能な希釈剤としては、生理食塩水、及び緩衝液水溶液が挙げられる。リポソームには、水中油中水型CGFエマルジョン並びに従来のリポソーム(Strejan et al.,J.Neuroimmunol.7:27(1984))が含まれる。
薬学的に許容可能な担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。いずれかの従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本開示の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性のある化合物はまた、該組成物中に組み込むことができる。
治療用組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で滅菌され、実質的に等張であり、安定でなければならない。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール等の多価アルコール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
滅菌注射用溶液は、1つ以上の開示された抗体を、必要に応じて、上に列挙した成分の1つ又は組合せを含む適切な溶媒中に必要な量で組み込み、続いて、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって滅菌精密濾過を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又はエマルションを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる、減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。
治療用組成物を、当技術分野で公知の医療機器により投与することもできる。例えば、本開示の治療用組成物は、例えば、米国特許第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号又は第4,596,556号に開示されている装置等の無針皮下注射装置を用いて投与することができる。本開示において有用なインプラント及びモジュールの例には、以下が含まれる:制御された速度で薬剤を分配するための植え込み型微小注入ポンプを開示している米国特許第4,487,603号;皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を開示している米国特許第4,486,194号;正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示している米国特許第4,447,233号;連続薬物送達のための可変流量植込み型注入装置を開示している米国特許第4,447,224号;マルチチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示している米国特許第4,439,196号;浸透圧薬物送達システムを開示している米国特許第4,475,196号。他の多くのそのようなインプラント、送達システム、及びモジュールが知られている。
治療用組成物の場合、本開示の製剤には、経口、経鼻、局所(頬側及び舌下を含む)、直腸、膣及び/又は非経口の投与に適したものが含まれる。製剤は、都合良く、単位剤形で提示されてもよく、薬学分野において公知のいずれかの方法によって調製され得る。単一剤形を製造するために担体材料と組合わせることができる抗体の量は、処置される対象及び特定の投与様式に応じて変化する。単一剤形を生成するために担体材料と組合せることができる抗体の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、100パーセントのうち、この量は、有効成分の約0.01パーセント~約99パーセント、約0.1パーセント~約70パーセント、又は約1パーセント~約30パーセントの範囲である。
本開示の組成物の局所投与又は経皮投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。活性化合物は、滅菌条件下で薬学的に許容可能な担体と、及び必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤又は噴射剤と混合され得る。
「非経口投与」及び「非経口で投与される」という句は、経腸投与及び局所投与以外の投与態様を意味し(通常は注射による)、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入が挙げられる。
これらの医薬組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤等のアジュバントを含有することができる。上記の滅菌化手順によって、及び種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含むことの両方によって、微生物の存在の予防が確保され得る。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物に含めることも望ましい場合がある。更に、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射用医薬形態の長期吸収をもたらすことができる。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体が医薬としてヒト及び動物に投与されるとき、それらは、単独で、又は、例えば、約0.01%~約99.5%(又は約0.1~約90%)の本明細書中に記載される抗体を薬学的に許容可能な担体と組合せて含有する医薬組成物として与えられ得る。
VI.製造品
本開示の主題は更に、上記の疾患及び/又は障害の治療及び/又は予防に有用な、例えば1つ以上の本開示の抗体を含有する製造品材料に関する。
本開示の主題は更に、上記の疾患及び/又は障害の治療及び/又は予防に有用な、例えば1つ以上の本開示の抗体を含有する製造品材料に関する。
ある特定の実施形態では、製造品は、容器、及び容器についての又は容器に関連するラベル又は添付文書を含んでもよい。適切な容器の非限定的な例としては、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、又は別の組成物との組合せで、状態の治療、予防、及び/又は診断に有効である組成物を保持し得、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は、静注溶液袋又は皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る)。
特定の実施形態では、組成物中の少なくとも1つの活性物質は、本開示の主題の抗体である。ラベル又はパッケージ添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す場合がある。
ある特定の実施形態では、製造品は、(a)本開示の抗体を含む組成物を内部に収容した第1の容器と、(b)更なる細胞傷害性薬剤、又はさもなければ治療剤を含む組成物を内部に収容した第2の容器とを含無ことができる。特定の実施形態では、製造品は、組成物を使用して特定の状態を治療することができることを示す添付文書を更に含むことができる。
代替的に、又は追加的に、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第2の又は第3の容器を更に含無ことができる。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料を含み得る。
VII.例示的な実施形態
A.ある特定の実施形態では、本開示の主題は、単離されたIgA抗体又はその断片であって、IgA抗体がアミノ酸V458、N459及び/又はS461に置換を含む、単離されたIgA抗体又はその断片を提供する。
A.ある特定の実施形態では、本開示の主題は、単離されたIgA抗体又はその断片であって、IgA抗体がアミノ酸V458、N459及び/又はS461に置換を含む、単離されたIgA抗体又はその断片を提供する。
A1.アミノ酸V458がイソロイシンで置換されている(V458I)、アミノ酸N459がグルタミン(N459Q)、グリシン(N459G)若しくはアラニン(N459A)で置換されている、及び/又はアミノ酸S461がアラニンで置換されている(S461A)、上述のAに記載の単離されたIgA抗体。
B.ある特定の実施形態では、本開示の主題は、単離されたIgA抗体又はその断片であって、IgA抗体がアミノ酸I458に置換を含む、単離されたIgA抗体又はその断片を提供する。
B1.アミノ酸I458がバリンで置換されている(I458V)、上述のBに記載の単離されたIgA抗体。
C.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA抗体が、N166、T168、N211、S212、S213、N263、T265、N337、I338、T339、N459、S461及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸において1つ以上の置換を含む、単離されたIgA抗体又はその断片を提供する。
C1.アミノ酸N166、S212、N263、N337、I338、T339及びN459における置換が、N166A、S212P、N263Q、N337T、I338L、T339S及びN459Qである、上述のCに記載の単離されたIgA抗体。
C2.IgA抗体がIgA1、IgA2m1、IgA2m2又はIgA2mn抗体である、上述のA~C1のいずれか1つに記載の単離されたIgA抗体。
C3.IgA抗体が、アミノ酸N337、I338及びT339における置換、並びにT168、N211、S212、S213、N263、T265、N459、S461及びそれらの組合せにおいて1つ以上の置換を含む、上述のC及びC1のいずれか1つに記載の単離されたIgA抗体。
C4.IgA抗体が、IgA2m1、IgA2m2、又はIgA2mn抗体である、上述のC3に記載の単離されたIgA抗体。
C5.IgA抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はヒト抗体である、上述のA~C4のいずれか1つに記載の単離されたIgA抗体。
D.ある特定の実施形態では、本開示の主題は、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含む単離されたIgG-IgA融合分子であって、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してP221又はR221を含む配列を含み、IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を更に含む、単離されたIgG-IgA融合分子を提供する。
E.ある特定の実施形態では、本開示の主題は、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含む単離されたIgG-IgA融合分子であって、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してC242を含む配列を含む、単離されたIgG-IgA融合分子を提供する。
E1.IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を更に含む、上述のEに記載の単離されたIgG-IgA融合分子。
E2.IgG抗体が、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体及びIgG4抗体からなる群より選択される、上述のD~E1のいずれか1つに記載の単離されたIgG-IgA融合分子。
E3.IgG抗体がIgG1抗体である、上述のD~E2のいずれか1つに記載の単離されたIgG-IgA融合分子
E4.IgA抗体が、IgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体及びIgA2mn抗体からなる群より選択される、上述のD~E3のいずれか1つに記載の単離されたIgG-IgA融合分子。
E5.IgA抗体がIgA2m1抗体である、上述のD~E4のいずれか1つに記載の単離されたIgG-IgA融合分子
F.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、A~C4のいずれか1つのIgA抗体、又はD~E5のいずれか1つのIgG-IgA融合分子をコードする単離された核酸を提供する。
G.ある特定の非限定的な実施形態では、本願で開示された主題は、Fに記載の核酸を含む宿主細胞を提供する。
H.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA抗体又はIgG-IgAを産生する方法であって、Gに記載の宿主細胞を、前記IgA抗体又はIgG-IgA融合分子が産生されるように培養することを含む、方法を提供する。
H1.宿主細胞から前記IgA抗体又はIgG-IgA融合分子を回収することを更に含む、上述のHに記載の方法。
H2.Hから産生された、又はH1から回収された上述のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子。
I.特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、A~C4及びH2のいずれか1つに記載の1種以上のIgA抗体、又はD~E5及びH2のいずれか1つに記載の1種以上のIgG-IgA融合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
I1.追加の治療剤を更に含む、上述のIに記載の医薬組成物。
J.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量のA~C4及びH2のいずれか1つに記載の1種以上のIgA抗体、又はD~E5及びH2のいずれか1つに記載の1種以上のIgG-IgA融合分子を前記個体に投与することを含む、方法を提供する。
J1.疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、前述のJに記載の方法。
K.医薬として使用するための前述のA~C4及びH2のいずれか1つに記載のIgA抗体又はD~E5及びH2のいずれか1つに記載のIgG-IgA融合分子。
L.疾患の処置に使用するための、前述のA~C4及びH2のいずれか1つに記載のIgA抗体又はD~E5及びH2のいずれか1つに記載のIgG-IgA融合分子。
M.疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、前述のLに記載のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子。
N.特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、疾患を治療するための医薬品の製造における、A~C4及びH2のいずれか1つに記載のIgA抗体又はD~E5及びH2のいずれか1つに記載のIgG-IgA融合分子の使用を提供する。
N1.疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、前述のNに記載の使用。
O.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA二量体の発現を増加させる方法であって、軽鎖(LC)及び重鎖(HC)をコードするDNAの量に対して、第1の細胞に導入される連結鎖(JC)をコードするDNAの量を増加させることを含み、発現の増加が、等量のJC、LC及びHCのDNAが導入された第2の細胞で産生されるIgA二量体の量に対するものである、方法を提供する。
O1.第1の細胞に導入される、HCをコードするDNAの量対LCをコードするDNAの量対JCをコードするDNAの量の比(HC:LC:JC)が約1:1:2~約1:1:5である、上述のOに記載の方法。
P.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA二量体、三量体又は四量体の発現を増加させる方法であって、軽鎖(LC)及び重鎖(HC)をコードするDNAの量に対して、第1の細胞に導入される連結鎖(JC)をコードするDNAの量を減少させることを含み、発現の増加が、JC DNAの量に対してより多くのHC及びLC DNAを導入した第2の細胞で産生されるIgAの三量体又は四量体の量に対するものである、方法を提供する。
P1.第1の細胞に導入される、HCをコードするDNAの量対LCをコードするDNAの量対JCをコードするDNAの量の比(HC:LC:JC)が約1:1:0.25~約1:1:0.5である、上述のPに記載の方法。
Q.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの産生を増加させる方法であって、第1の細胞において、アミノ酸V458に置換を有するIgA1抗体又はIgA2m1抗体を発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸V458に置換を有さないIgA1抗体又はIgA2m1抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの量に対するものである、方法を提供する。
Q1.アミノ酸がイソロイシンで置換されている(V458I)、上述のQに記載の方法。
R.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA2m2二量体の産生を増加させる方法であって、アミノ酸I458に置換を有するIgA2m2抗体を第1の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸I458に置換を有さないIgA2m2抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA2m2二量体の量に対するものである、方法を提供する。
R1.アミノ酸がバリンで置換されている(I458V)、上述のRに記載の方法。
S.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの産生を増加させる方法であって、アミノ酸N459又はS461に置換を有するIgA1抗体又はIgA2m1抗体を第1の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸N459又はS461に置換を有さないIgA1抗体又はIgA2m1抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの量に対するものである、方法を提供する。
S1.アミノ酸N459がN459Q、N459G若しくはN459A変異で置換されており、及び/又はアミノ酸S461がS461A変異で置換されている、上述のSに記載の方法。
T.IgA2m2ポリマーの産生を減少させる方法であって、第1の細胞において、アミノ酸C471に置換を有するIgA2m2抗体を発現させることを含み、産生の減少が、アミノ酸C471に置換を有さないIgA2m2抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA2m2ポリマーの量に対するものである、方法。
T1.アミノ酸C471がC471S変異で置換されている、Tに記載の方法。
U.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA2m2抗体の一過性発現を増加させる方法であって、第1の細胞において、N166、S212、N263、N337、I338、T339、N459及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を含むIgA2m2抗体を発現させることを含み、前記一過性発現の増加が、N166、S212、N263、N337、I338、T339、N459及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を有さないIgA2m2抗体を発現させる第2の細胞において産生される一過性発現の量に対するものである、方法を提供する。
V.ある特定の実施形態では、本開示の主題は、IgG-IgA融合分子の二量体を発現する方法であって、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含む単離されたIgG-IgA融合分子を発現することを含み、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してP221又はR221を含む配列を含み、IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を含む、方法を提供する。
W.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgG-IgA融合分子の二量体、三量体、又は四量体を発現させる方法であって、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含むIgG-IgA融合分子を発現させることを含み、IgA抗体のFc領域が、IgA抗体の重鎖のC末端を介してC242を含む配列を含む、方法を提供する。
W1.IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を含む、上述のWに記載の方法。
X.ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA抗体と少なくとも1つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からIgA抗体を精製する方法であって、
(a)プロテインLを含むカラムに混合物を適用してIgA抗体を結合させること;
(b)PBSを含む洗浄緩衝液でプロテインLカラムを洗浄すること;及び
(c)リン酸を含む溶出緩衝液によってプロテインLカラムからIgA抗体を溶出させること、を含む、方法を提供する。
(a)プロテインLを含むカラムに混合物を適用してIgA抗体を結合させること;
(b)PBSを含む洗浄緩衝液でプロテインLカラムを洗浄すること;及び
(c)リン酸を含む溶出緩衝液によってプロテインLカラムからIgA抗体を溶出させること、を含む、方法を提供する。
Y.非限定的な実施形態では、本開示の主題は、IgA抗体又はIgG-IgA融合分子と少なくとも1つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からオリゴマー状態のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を精製する方法であって、
(a)プロテインL又はプロテインAを含む親和性精製カラムに混合物を適用して、IgA抗体又はIgG-IgA融合分子を結合させること;
(b)親和性精製カラムを洗浄緩衝液で洗浄すること;
(c)溶出緩衝液によって親和性精製カラムからIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を溶出して、第1の溶出液を形成すること;及び
(d)サイズ排除クロマトグラフィカラムに前記第1の溶出液を適用して、異なるオリゴマー状態のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を分離し、オリゴマー状態のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を含むフロースルーを得ること、を含む、方法を提供する。
(a)プロテインL又はプロテインAを含む親和性精製カラムに混合物を適用して、IgA抗体又はIgG-IgA融合分子を結合させること;
(b)親和性精製カラムを洗浄緩衝液で洗浄すること;
(c)溶出緩衝液によって親和性精製カラムからIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を溶出して、第1の溶出液を形成すること;及び
(d)サイズ排除クロマトグラフィカラムに前記第1の溶出液を適用して、異なるオリゴマー状態のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を分離し、オリゴマー状態のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を含むフロースルーを得ること、を含む、方法を提供する。
以下の実施例は、本開示の主題の単なる例示であり、いかなる意味においても制限とみなすべきではない。
実施例1:マウスにおけるポリマーIgAの薬物動態パラメータに対するグリコシル化及びFcRn結合の役割の評価
IgA抗体は、伝統的なIgGベースの薬物と比較して、それらの優れた受容体媒介性細胞傷害活性、病原体の強力な中和、及びポリマー免疫グロブリン受容体(pIgR)媒介性輸送を介した粘膜バリアを越えるトランスサイトーシス能に基づいて、新規な治療プラットフォームとして幅広い可能性を有する。しかしながら、IgAの臨床開発への移行は、複雑な発現及び特性評価、並びに組換え生成された不完全なシアリル化N結合型グリカンを持つIgA単量体のグリカン受容体捕捉によって媒介されると考えられる迅速な血清クリアランスによる課題があった。本実施例では、組換え生成された単量体、二量体及びポリマーのヒトIgAの包括的な生化学的、生物物理学的及び構造的な特性評価が提供される。更に、ポリマーIgAの急速な血清クリアランスを克服するための2つの戦略が特定されている:(1)アグリコシル化又は部分的にアグリコシル化されたポリマーIgAを生成するN結合型グリコシル化部位の除去、及び(2)ポリマーIgG-IgA Fc融合物の生成によるFcRn結合の操作。
IgA抗体は、伝統的なIgGベースの薬物と比較して、それらの優れた受容体媒介性細胞傷害活性、病原体の強力な中和、及びポリマー免疫グロブリン受容体(pIgR)媒介性輸送を介した粘膜バリアを越えるトランスサイトーシス能に基づいて、新規な治療プラットフォームとして幅広い可能性を有する。しかしながら、IgAの臨床開発への移行は、複雑な発現及び特性評価、並びに組換え生成された不完全なシアリル化N結合型グリカンを持つIgA単量体のグリカン受容体捕捉によって媒介されると考えられる迅速な血清クリアランスによる課題があった。本実施例では、組換え生成された単量体、二量体及びポリマーのヒトIgAの包括的な生化学的、生物物理学的及び構造的な特性評価が提供される。更に、ポリマーIgAの急速な血清クリアランスを克服するための2つの戦略が特定されている:(1)アグリコシル化又は部分的にアグリコシル化されたポリマーIgAを生成するN結合型グリコシル化部位の除去、及び(2)ポリマーIgG-IgA Fc融合物の生成によるFcRn結合の操作。
方法:
プラスミドクローニング及び配列アラインメント。使用される抗体可変ドメイン配列には、ヒト化抗ヒトHER2抗体(Carter et al.,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9(1992))及びマウス抗マウスIL-13抗体(Genentech)が含まれる。ヒトIgA定常重鎖IgA1、IgA2m1及びIgA2m2、他のIgA種及びヒトJ鎖のタンパク質配列を、Uniprot(www.uniprot.org)又はNCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)から得た。得られた他の種には、以前に報告されたように軽鎖-重鎖ジスルフィドを安定化するIgA2m1、すなわちP221Rの変異が含まれる(Chintalacharuvu et al.,J Immunol 157:3443-9(1996)))。ヒト軽鎖定常ドメイン及びヒトIgA1、IgA2m1及びIgA2m2重鎖定常ドメインへの抗体可変ドメインの融合をコードする遺伝子を合成し、哺乳動物pRKベクター(Eaton et al.,Biochemistry 25:8343-7(1986))にクローニングした。部位特異的突然変異誘発を使用して、点突然変異を導入した。全てのプラスミドを配列検証した。配列アラインメントは、GSeqWeb(Genentech)及びExcel(Microsoft)を使用して行った。
プラスミドクローニング及び配列アラインメント。使用される抗体可変ドメイン配列には、ヒト化抗ヒトHER2抗体(Carter et al.,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9(1992))及びマウス抗マウスIL-13抗体(Genentech)が含まれる。ヒトIgA定常重鎖IgA1、IgA2m1及びIgA2m2、他のIgA種及びヒトJ鎖のタンパク質配列を、Uniprot(www.uniprot.org)又はNCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)から得た。得られた他の種には、以前に報告されたように軽鎖-重鎖ジスルフィドを安定化するIgA2m1、すなわちP221Rの変異が含まれる(Chintalacharuvu et al.,J Immunol 157:3443-9(1996)))。ヒト軽鎖定常ドメイン及びヒトIgA1、IgA2m1及びIgA2m2重鎖定常ドメインへの抗体可変ドメインの融合をコードする遺伝子を合成し、哺乳動物pRKベクター(Eaton et al.,Biochemistry 25:8343-7(1986))にクローニングした。部位特異的突然変異誘発を使用して、点突然変異を導入した。全てのプラスミドを配列検証した。配列アラインメントは、GSeqWeb(Genentech)及びExcel(Microsoft)を使用して行った。
小規模抗体発現及び精製。Expi293T(商標)細胞を、IgA単量体についてはLC及びHCの両方の15μgのDNA、又はIgAオリゴマーについてはLC、HC及びJCの様々な比の合計30μgのDNAで30mLの規模で一過性にトランスフェクトした(Bos et al.,Journal of Biotechnology 180:10-6(2014)及びBos et al.,Biotechnol Bioeng 112:1832-42(2015))。全ての抗体がカッパ軽鎖を含有していたため、IgAをプロテインL(GE Healthcare)を用いてバッチで親和性精製した。プロテインL溶出液を分析SEC-HPLC(Tosoh Bioscience LLC TSKgel SuperSW3000カラム、Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLC)によって特性評価した。一定体積をカラムにロード、Chromeleon Chromatography Data Systemソフトウェア(Thermo Scientific)を使用して各曲線下面積を定量した。
大規模な抗体発現及び精製。IgA、IgG及びIgG-IgA Fc融合物を、以前に記載されたようにCHO DP12細胞において一過性に発現させた(Wong et al.,Biotechnol Bioeng 106:751-63(2010))。低発現クローンについては、TI安定細胞株を作製した。IgG及びIgG-IgA Fcの融合物を、MabSelect Sure(GE Healthcare)、続いてHiLoad Superdex 200pgカラム(GE Healthcare)を用いたサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を用いて親和性精製した。Capto L(GE Healthcare)、続いてSECを用いてIgAを親和性精製した。DNA比が主に一方のオリゴマー状態への発現の偏りに成功したIgA試料については、HiLoad Superdex 200pgカラム(GE Healthcare)をSECに使用した。オリゴマーの複雑な混合物を含有するIgA試料については、3.5μm、7.8mm×300mmのXbridge Protein BEH 450 Å SECカラム(Waters)を二量体及び四量体のピークのより良好な分離のために使用した。
SEC-MALS。ポリマーIgAを3.5μm、7.8mm×300mm Xbridge Protein BEH 200 Å SECカラム(Waters)に流し、モル質量決定及び多分散性測定のためにDAWN HELEOS/Optilab T-rEX II(Wyatt)多角度光散乱検出器に直接注入した。
示差走査蛍光測定(DSF)。DSFを以前に記載されたように行った(Lombana et al.,Sci Rep 5:17488(2015))。
インビトロトランスサイトーシスアッセイメイディン・ダービー・イヌ腎臓(MDCKII)細胞(European Collection of Authenticated Cell Cultures、英国ソールズベリー)を、ヒトpIgR遺伝子をコードするcDNAを含むレトロウイルス(Retro-X,Takara Bio;OriGene、メリーランド州ロックビル)で形質導入した。pIgR遺伝子の発現を、qRT-PCR及びウェスタンブロッティングにより確認した。pIgRを発現するMDCKII細胞を、10%FBS、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン(Thermo Fisher、カリフォルニア州カールスバッド)及び2μg/mlピューロマイシン(Takara Bio、カリフォルニア州マウンテンビュー)を補充したDMEM中で維持した。トランスサイトーシスアッセイのために、細胞を0.4μmのMillicell 24ウェル細胞培養インサート(Millipore、マサチューセッツ州バーリントン)に播種し、4日間培養した。実験当日、細胞をFluoroBrite DMEM(Thermo Fisher)で2回洗浄し、6μgのIgA分子を基底外側区画に添加した。24時間のインキュベーション後、ELISAによる分析のために、頂端側区画及び基底外側区画の両方から培地を収集した。
電子顕微鏡法。精製した抗IL-13 IgA2m2二量体及び四量体試料を、0.015%グルタルアルデヒド(Polysciences,Inc.)中、室温で10分間インキュベートすることによって最初に架橋した。固定したら、試料をTBS緩衝液を用いて希釈して、10ng/μLの濃度を達成した。次いで、4μlの各試料を、2%(w/v)酢酸ウラニル陰性染色剤(Electron Microscopy Sciences)で処理する前に、連続炭素の薄層で覆われた新たにグロー放電した400メッシュの銅グリッド上で40秒間インキュベートした。次いで、IgAの二量体及び四量体を、120keVで操作するTecnai Spirit T12(Thermo Fisher)を用いて25,000×(2.2Å/ピクセル)の倍率で撮像した。低線量条件下でGatan 4096×4096ピクセルCCDカメラを使用して画像を記録した。次いで、IgAの二量体及び四量体の両方について約5000個の粒子を選択し、128ピクセルの粒子ボックスサイズを使用して、EMAN2パッケージ(Tang et al.,J Struct Biol 157:38-46(2007))内のe2boxer.pyソフトウェアを使用して抽出した。RELION画像ソフトウェアパッケージ(Scheres J Struct Biol 180:519-30(2012))内の参照フリー2Dクラスを使用して、両方の試料の平均画像を生成した。
全体的なN結合型グリカン組成分析(LC-MS分析)。10μgの各IgA試料を8MグアニジンHClで1:1の体積比で変性させ、100mMジチオスレイトール(DTT)で95℃で10分間還元した。試料を100mM Tris HCl(pH7.5)で最終濃度の2MグアニジンHClに希釈し、続いて2μlのP0705S PNGase F(New England BioLabs)を用いて37℃で一晩N結合脱グリコシル化した。脱グリコシル化後、各試料150ngをAgilent 1260 Infinity LCシステムに注入し、2%~32%溶媒B(溶媒A:0.1%ギ酸及び0.02%トリフルオロ酢酸を含む99.88%水;溶媒B:9.88%水+0.1%ギ酸及び0.02%トリフルオロ酢酸を含有する90%アセトニトリル)の定組成勾配によって溶出した。HPLCシステムを、Agilent G4240A Cube MSシステムを介してG6520B Q-TOF質量分析計に連結した。試料をグリカン濃縮し、Chip Cube MSシステムのG4240-64025 mAb-Glycoチップ内に構築した多孔質グラファイト化炭素カラムを使用して分離した。データ取得:1.9kVスプレー電圧;325℃ガス温度;5l/分の乾燥ガス流;160Vフラグメンター電圧;65Vスキマー電圧;750V oct 1 RF Vpp電圧;400~3000m/zの走査範囲;正極性;拡張ダイナミックレンジ(2GHz)機器モードを使用したMS1重心データ取得;3スペクトル/秒;333.3ms/スペクトル;3243過渡/スペクトル;及びCE設定0。取得したマススペクトルデータを、10ppmの質量許容差を有する正確な質量とグリカン同定のための予想される保持時間との組合せを利用して、Agilent MassHunter Qualitative Analysisソフトウェアのグリカンライブラリに対して検索した。各グリカンの抽出された化合物クロマトグラムにおけるAUCに基づいて、各試料内の全ての同定されたN結合型グリカンと比較して、N結合型グリカンを標識なしで定量した。
N結合型糖ペプチド部位マッピング分析(LC-MS/MS分析)。10μgのIgAを37℃で1時間、10mMのDTTで還元し、室温で20分間、10mMのヨードアセトアミドでアルキル化し、0.2μgのトリプシン(Promega)及び0.2μgのキモトリプシン(Thermo Fisher Scientific)で別々に37℃で一晩消化し、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)でクエンチし、C18(3M Empore C18抽出ディスク)ステージ-チップ(50%アセトニトリル、49.9%水、0.1%TFA)でクリーンアップに供した。200fmolの試料をオートサンプラーを介してWaters NanoAcquity UPLCシステムに注入し、Waters Acquity M-Class BEH C18カラム(0.1mm×100mm、1.7μm樹脂)で45℃で分離した。2%~40%の溶媒Bの勾配を溶出に使用した(溶媒A:99.9%水、0.1%ギ酸;溶媒B 99.9%アセトニトリル、0.1%ギ酸)。
分離したペプチドを、データ取得のために以下のパラメータを使用してOrbitrap Elite質量分析計(Thermo Fisher Scientific)にナノスプレーイオン化によってオンラインで分析した:60000解像度;375~1600m/z走査範囲;正極性;重心モード;0.25活性化Q及び10msの活性化時間を有する1m/zの分離幅;CID活性化;並びにCE設定35。データをデータ依存モードで収集し、前駆体イオンをFTMSで分析し、上位15個の最も豊富なイオンをITMSでのフラグメンテーション及び分析のために選択した。取得した質量スペクトルデータを、Protein Metrics Byonicソフトウェアを使用してタンパク質配列に対して検索し、Protein Metrics Byologicソフトウェアで分析した。各グリコシル化部位のペプチド同定は、MS2断片化スペクトル、抽出イオンクロマトグラム(XIC)、及び保持時間の組合せに基づいて手動で検証した。N結合型糖ペプチドを、その非改変ペプチドと比較して、XICのAUCインテグレーションによって標識なしで定量した。
マウス研究。雌性Balb/Cマウス(6~8週齢)をCharles River laboratoriesによって得た。到着したら、全てのマウスを、食物及び水を自由に摂取できるようにして、標準的な12時間の明/12時間の暗サイクルの下、21℃の室温で病原体を含まない動物施設で維持した。全てのマウスは、それぞれの抗体(IgG又はIgA)の単回静脈内(IV)注射を受けた。血液試料(150~200μL)を、注射後の様々な時点でイソフルラン麻酔下で後眼-窩洞又は心臓穿刺のいずれかを介して収集した。試料を血清分離管に収集した。血液を周囲温度で少なくとも20分間凝固させた。凝固した試料を、収集時間の1時間以内に開始して遠心分離するまで室温で維持した。各試料を1500~2000×gの相対遠心力で2~8℃で5分間遠心分離した。遠心分離後20分以内に血清を血液試料から分離し、標識された2.0-mLポリプロピレン、コニカル-ボトム微量遠心管に移した。
健康であるように見え、明らかな異常がない動物のみを試験に使用した。実施された全ての動物実験は、Genentechの施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって検討及び承認された。
トランスサイトーシス及び薬物動態研究のためのIgA ELISA。IgA抗体レベルをサンドイッチELISAによって測定した。384マイクロタイタープレートのウェルを、25μlのコーティング緩衝液(0.05M炭酸ナトリウム、pH9.6)中2μg/mlのヤギ抗ヒトκ抗体(SouthernBiotech、カタログ番号2060-01)で4℃で一晩コーティングし、続いて50μlのPBS中0.5%BSAで37℃で2時間ブロッキングした。次いで、試料緩衝液(1×PBS、pH7.4、0.5%BSA、0.35M NaCl、0.05%Tween20、0.25%CHAPS、5mM EDTA)で希釈した試料(25μl)をブロックしたプレートに添加し、室温で2時間インキュベートした。インキュベーション後、25μlのホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgA(SouthernBiotech、カタログ番号2053-05)を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを25μlのTMB(Moss、カタログ番号TMBE-1000)と共に15分間インキュベートし、25μlの1M H3PO4で反応を停止させた。プレートリーダーを使用して630nmで還元しながら450nmで吸光度を測定した。工程の間に、プレートを200μlの洗浄緩衝液(PBS中0.05%Tween-20)で6回洗浄した。定量のための基準として、各IgA分子について連続希釈ストック材料(20ng/ml~0.15ng/ml)を使用して標準曲線を確立した。IgA ELISAは、最大10%のマウス血清及び10%の組織溶解物の生物学的マトリックスに耐える。
放射化学。ヨウ素-125[125I]を、Perkin Elmer製の0.1N水酸化ナトリウム中のヨウ化ナトリウムとして得た(マサチューセッツ州ボストン)。1 mCiの125I(約3μL)を使用して、間接ヨードゲン法(Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード)を使用して、約10μCi/μgの比活性でチロシン残基を介して125Iでランダムに標識した。111In標識抗体(約8μCi/μg)の放射合成を、111In及び1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)結合体化(リジンを介してランダムに)mAbを0.3M酢酸アンモニウムpH7中、37℃で1時間インキュベートすることによって達成した。全ての放射性免疫抱合体の精製は、PBS中で平衡化したNAP5カラムを使用して達成し、サイズ排除クロマトグラフィによって確認した。
抗体を、間接的なヨードゲン添加法(Chizzonite et al.,J Immunol;147:1548-56(1991))を使用して放射性ヨウ素化した。放射性標識タンパク質を、PBS中で予め平衡化したNAP5(商標)カラム(GE Healthcare Life Sciences、カタログ17-0853-01)を使用して精製した。放射性ヨウ素化後、標識抗体をSEC-HPLCによって特性評価し、非標識抗体と比較した。試料をAgilent 1100シリーズHPLC(Agilent Technology、カリフォルニア州サンタクララ)及び直列に接続したYarra SEC-3000、3μM 300mm×7.8mm(Phenomenex、カリフォルニア州トーランス、カタログ00H-4513-K0)サイズ排除カラムに注入し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS pH7.0)を用いて0.8mL/分の流速で20分間溶出した。溶出を、280nmでの吸収によって、及びインラインGabiガンマカウンター(Elysia-Raytest、ドイツ)で溶出画分の放射能を測定することによって監視した。
組織分布研究の設計及び分析。プロトコル、飼育及び麻酔は、the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careの規制に準拠し、Institutional Animal Care and Use Committees of Genentech Laboratory Animal Resourcesによって承認された。
体重20~30gの範囲及び6~7週齢の範囲の雌BALB-cマウスをJackson/West(CA)から入手した。それぞれ12匹のマウス、6群をこの試験に使用した。125Iの甲状腺分離を防止するために、100μLの30mg/mLのヨウ化ナトリウムを、投与の1時間前及び24時間前に腹腔内投与した。全てのマウスに、125I標識抗体及び111In標識抗体(それぞれ5μCi)+それぞれの未改変抗体の混合物からなる単回IV注射を総用量5mg/kgで行った。4匹のマウスのコホートを、注射の5分後、15分後、30分後、1時間後、4時間後、12時間後、1日後、2日後及び3日後にイソフルラン(効果を得るための吸入)下で後眼窩出血させた。1時間、1日、3日目;開胸によるケタミン(75~80mg/kg)/キシレン(7.5~15mg/kg)の麻酔下で4匹の動物を安楽死させた。以下の組織を収集し、冷PBSですすぎ、ブロット乾燥し、秤量し、凍結した:脳、肝臓、肺、腎臓、脾臓、心臓、胃、小腸、筋肉、皮膚、脂肪、大腸。試料放射能を、自動バックグラウンド及び減衰補正を用いて111In(245keV;減衰t1/2=2.8日)及び125I(35keV;減衰t1/2=59.4日)のエネルギーウインドウにおいて1480 WIZARD(商標)ガンマカウンターを使用して放射能についてカウントした。GraphPad Prism(Windows用のバージョン7.00、GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ、www.graphpad.com)を使用してデータを分析し、グラフ化した。
マウス血漿安定性。マウス血漿(抗凝固剤リチウムヘパリンを含む)をBioIVT(ニューヨーク州ウエストベリー)から入手し、ウシ血清アルブミン(Sigma-Aldrich;ミズーリ州セントルイス、カタログA2058)をPBS(PBS+0.5% BSA)と混合することによって緩衝液対照を作製した。放射性標識抗体をマウス血漿又は緩衝液対照に5μCiの放射性標識トレーサで混合し、次いで、5%CO2を含む37oCに設定したインキュベータ内でインキュベートした。インキュベーションの0、24、及び96時間の設定時点で、試料をインキュベータから取り出し、分析まで-80oCの冷凍庫で保存した。
試料は、PBS中の1:1試料希釈を用いて、上記のSEC-HPLC法によって分析した。時間0における親ピークからの変化をモニターするために、結果クロマトグラムを時間点間で比較した。
Wasatchによる抗体動態96×96アレイベースのSPRイメージングシステム(Carterra USA)を使用して、精製IgA、IgG-IgA Fc融合物又はIgGの25℃での動態を分析した。抗体を10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5で10μg/mlに希釈し、アミンカップリングを使用して、Continuous Flow Microspotterを使用してSPRセンサープリズムCMD 200Mチップ(XanTec Bioanalytics、ドイツ)に直接固定した。ランニングバッファー(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.05%Tween20、1mM EDTA)で希釈した抗原を様々な濃度で3分間注入し、10分間解離させ、10mMグリシンpH2.5を使用してサイクル間で再生した。抗原は、R&D Systems(mIL-13、413-ML-025/CF;mpIgR、2800-PG-050;hpIgR、2717-PG-050;hFcαRI、3939-FA-050)、Sino Biologicals(hHER2、10004-H08H)、又はGenentechからのものであり、種特異的β-2ミクログロブリン(m/hFcRn)と共発現させた。データをWasatch動的ソフトウェアツールで処理した。
Biacoreによる抗体動態。抗IL-13又は抗HER2 IgA2m2抗体の結合動態を、Biacore T200装置(GE Healthcare)での表面プラズモン共鳴を用いて測定した。全ての動態実験は、30μL/分の流速で、25℃で、10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.05%Tween20、及び1mM EDTAのランニングバッファーを用いて行った。Human Fab Capture Kit(GE Healthcare)からのFab Binderを、アミンベースのカップリングを介してCM5センサーチップに固定化した。50~100ug/mLの濃度のIgA抗体を5uL/分で210秒間捕捉した。抗体に結合する組換えヒトFcαRI抗原(R&D Systems、3939-FA-050)を、1000nM、333nM及び111nMの濃度を使用して測定した。結合のためのセンサーグラムを、90秒の注入時間、続いて120秒の解離時間、及びグリシンpH2.1の2回の60秒の注入によるサイクル間の表面の再生を用いて記録した。1:1ラングミュア結合モデルを使用して、反応速度及び結合定数を計算した。
結果:
IgAオリゴマー形成に影響を及ぼす因子。単量体IgAの組換え産生はよく理解されており、IgGの産生と同様に、軽鎖(LC)と重鎖(HC)の共発現によって達成することができる。対照的に、ポリマーIgAのアセンブリは、LC、HC及び連結鎖(JC)の共発現を必要とし、得られるIgAオリゴマー状態はあまり特性評価されていない。IgAオリゴマーの集合プロセスのより良い理解を得るために、IgA1、IgA2m1、IgA2m1.P221R(ジスルフィド安定化LC-HCペアリング)及びIgA2m2(図1A)を含む様々なヒトIgAアイソタイプ及びアロタイプの発現を特性評価した。抗マウスインターロイキン-13(mIL-13)抗体のマウス可変ドメインを、ヒトカッパLC定常ドメイン及びIgA HC定常ドメインとのキメラとしてクローニングした。次いで、キメラLC及びHCをヒトJCの存在下及び非存在下で共発現させた(図1B)。プロテインLによる親和性精製後、同時トランスフェクトJCの非存在下で産生されたIgAは、30mLのExpi293T一過性発現から比較的純粋な単量体を生じた。これらの実験では、細胞に等しい質量量のLC及びHC DNAをトランスフェクトした。対照的に、等しい質量量のLC、HC及びJC DNAのトランスフェクションは、IgA単量体、二量体、及び3~5個のIgA単量体を含有するポリマーに対応する様々なオリゴマー種を産生した(図1D及び図2A~図2C)。IgA1、IgA2m1及びIgA2m1.P221Rは主に二量体IgAを産生することが判明したが(図2A~B)、IgA2m2はほぼ等量の二量体及びポリマーを産生した(図2C)。オリゴマーの同様の分布が、リットルスケールにスケールアップしたときにCHO一過性発現において観察された。
IgAオリゴマー形成に影響を及ぼす因子。単量体IgAの組換え産生はよく理解されており、IgGの産生と同様に、軽鎖(LC)と重鎖(HC)の共発現によって達成することができる。対照的に、ポリマーIgAのアセンブリは、LC、HC及び連結鎖(JC)の共発現を必要とし、得られるIgAオリゴマー状態はあまり特性評価されていない。IgAオリゴマーの集合プロセスのより良い理解を得るために、IgA1、IgA2m1、IgA2m1.P221R(ジスルフィド安定化LC-HCペアリング)及びIgA2m2(図1A)を含む様々なヒトIgAアイソタイプ及びアロタイプの発現を特性評価した。抗マウスインターロイキン-13(mIL-13)抗体のマウス可変ドメインを、ヒトカッパLC定常ドメイン及びIgA HC定常ドメインとのキメラとしてクローニングした。次いで、キメラLC及びHCをヒトJCの存在下及び非存在下で共発現させた(図1B)。プロテインLによる親和性精製後、同時トランスフェクトJCの非存在下で産生されたIgAは、30mLのExpi293T一過性発現から比較的純粋な単量体を生じた。これらの実験では、細胞に等しい質量量のLC及びHC DNAをトランスフェクトした。対照的に、等しい質量量のLC、HC及びJC DNAのトランスフェクションは、IgA単量体、二量体、及び3~5個のIgA単量体を含有するポリマーに対応する様々なオリゴマー種を産生した(図1D及び図2A~図2C)。IgA1、IgA2m1及びIgA2m1.P221Rは主に二量体IgAを産生することが判明したが(図2A~B)、IgA2m2はほぼ等量の二量体及びポリマーを産生した(図2C)。オリゴマーの同様の分布が、リットルスケールにスケールアップしたときにCHO一過性発現において観察された。
二次精製によるポリマーからのIgA二量体の分離は、大規模では困難であることが判明した。二量体形成に向かってアセンブリを偏らせようと試みて、LC及びHC DNA量の両方に対するJC DNAの量を増加させて、JC発現レベルの増加を促進した。これにより、二量体種の相対的割合が増加し、ポリマー種の相対的割合が減少した(図2A~図2C;図15~図17及び図20も参照されたい。)。逆に、LC及びHC DNA量の両方と比較してJC DNAの量を減少させると、高次ポリマー(三量体/四量体/五量体)の割合が増加した(図18及び図21~図23)。JC DNA量に基づいてオリゴマー種に影響を及ぼす能力は、IgA2m2種について最も顕著であった。更に、分泌成分、連結鎖、軽鎖及び重鎖の同時トランスフェクションは、分泌成分を含まない連結鎖、軽鎖及び重鎖の同時トランスフェクションと比較して、より高次のオリゴマーを生じた(図29)。
IgA2m2がIgA1又はIgA2m1よりも大きなオリゴマーを形成する傾向が高い理由を理解するために、異なるアイソタイプ/アロタイプに対するHCテールピースのアミノ酸配列を比較した。IgA1及びIgA2m1テールピースの配列は同一であるが、IgA2m2は2つの残基が異なる。残基458及び467は両方ともIgA1及びIgA2m1中のバリンであるが、IgA2m2はそれぞれこれらの位置にイソロイシン及びアラニンを有する(図1A、アスタリスク)。したがって、これらの2つのアミノ酸の相違が、より大きなオリゴマーを形成する組換えIgA2m2の独特の素因を説明し得るかどうかを調べた。実際、イソロイシンがIgA1又はIgA2m1の位置458でバリンに置換された場合、より多くのポリマーが生成され、これは残基467でアラニン又はバリンとは無関係であった(図2D)。逆に、IgA2m2の位置458をイソロイシンからバリンに変更すると、ポリマー種の含有量は減少し、二量体含有量が増加した。
分泌成分又は連結鎖とのジスルフィド結合を防ぐために、IgA2m2抗体の重鎖中の特定のシステイン残基の変異を生成し、オリゴマー形成に対するそのような変異の効果を決定するために分析した。Cys311のセリンへの変異は分泌成分とのジスルフィド結合を妨げ、Cys471のセリンへの変異は連結鎖とのジスルフィド結合を妨げる。図28Bに示すように、連結鎖を軽鎖及び重鎖に付加する場合、IgA2m2二量体及び高次オリゴマー形成にはC311ではなくC471の変異が必要であった。
グリコシル化は、IgAオリゴマー化において役割を果たすことが知られている(Chuang et al.,J Immunol 158:724-32(1997))。したがって、IgA1及びIgA2m2の各N結合型グリコシル化部位を除去するように変異を作製した。IgA1又はIgA2m2のテールピース内のN結合型グリコシル化部位を除去した4つの別々の変異(N459A/G/Q又はS461A)も、生成されたポリマーの量を増加させたが、テールピースの外側のグリコシル化部位を除去する変異はオリゴマー形成を変化させなかった(それぞれ図2E及び図2F;図38も参照)。したがって、トランスフェクションにおけるDNA比の調節に加えて、テールピースアミノ残基458にイソロイシンを有するか、又はIgAテールピースのN結合型グリコシル化を防止することによって、IgAポリマー形成を増加させることができる。
IgA単量体及びオリゴマーの大規模精製及び生物物理学的特性評価。小規模発現によって得られたIgAオリゴマー形成への洞察を使用して、単量体、二量体及び四量体IgAをCHO一過性発現を使用してスケールアップした。IgA1、IgA2m1、IgA2m1.P221R及びIgA2m2の単量体及び二量体種、並びにIgA2m2の四量体種を単離した(図3A)。これらの試料の非還元型SDS-PAGE分析は、IgA単量体、二量体及び四量体についてそれぞれ約150kDa、約310kDa及び約610kDaの予想質量と一致する分子量の主なバンドを示した(図3B)。これらの予想質量は、グリコシル化を伴わないアミノ酸配列に基づいており、オリゴマー当たり1つのJCの組み込みを仮定した。精製オリゴマー種のモル質量もSEC-MALSによって測定し、二量体及び四量体IgAの予想質量と一致することが分かった(表2)。精製IgA試料の還元SDS-PAGE分析により、それぞれ約25kDa及び約55kDaの単量体のLC及びHCバンドの存在が確認されるが、オリゴマー試料では、25kDa直下のJCのバンドも検出することができる(図3B)。LC、HC及びJCの同一性を、還元及び酵素的脱グリコシル化後に質量分析によって更に確認した(図18E)。単離された種のオリゴマー状態を更に検証するために、陰性染色電子顕微鏡法(EM)も使用した。IgA2m2二量体(図3C)及び四量体(図3D)の陰性染色画像は、それぞれ2つ又は主に4つのIgA分子の存在を確認する。二量体では、2つのIgA分子がそれらのFcドメインによって尾部から尾部に連結されて細長い粒子になるが、四量体では、4つのFcドメイン間の相互作用により、4つのIgA分子のコンパクトな複合体が生じる。両方の試料の生画像は、良好に挙動した単分散粒子の存在を示した(図8)。
タンパク質を、モル質量及び多分散性測定のためにWyatt DAWN HELEOS II/Optilab T-rEX多角度光散乱(MALS)検出器に連結されたWaters Xbridge Protein BEH 200 Å分析サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)カラムに注入した。IgA分子の予測分子量(MW)は、アミノ酸組成のみに基づいており、二量体又は四量体あたり1つのJCの取り込みを想定しており、潜在的なN結合型グリカン又はO結合型グリカンを考慮していない。
抗mIL-13 IgA単量体、二量体及び四量体は、抗mIL-13 IgG1と同様の親和性でマウスIL-13に結合し(表3及び図19)、Fab領域が組換えIgAにおいて適切に折り畳まれ、機能的であることを示している。予想されたように、マウス及びヒトpIgR結合はIgAオリゴマーについてのみ見られたが、単量体及びオリゴマーの両方の抗mIL-13 IgAはヒトFcαRIに対して同様の親和性で結合した(表3)。更に、CHO細胞又はExpi293細胞における一過性発現から精製されたIgA2m2は、マウス及びヒトpIgRに対して同様の結合を示した(図36A)。pIgR結合能のために、全てのIgAオリゴマーは、ヒトpIgRを異所性に発現するMDCK細胞株を使用してインビトロでトランスサイトーシスすることができたが、単量体はできなかった(図4A及び図7E)。更に、IgA単量体及びオリゴマーは全て、示差走査蛍光定量法(DSF)によって測定した場合、抗mIL-13ヒトIgG1と比較して安定性の増加、及びIgG1 Fab断片と比較して安定性の類似又は増加を示した(図4B)。
組換えIgAの薬物動態プロファイル及び体内分布。開示された組換えIgAオリゴマーの血清濃度時間プロファイルを分析し、それらが組換え単量体を使用して以前に報告されたデータ(図5A及び表4)に匹敵すると判断した(Boross et al.(2013),Rouwendal et al.(2016)及びLohse et al.,Br J Haematol 112:4170(2017))。組換えIgAオリゴマーの単回投与後に非常に急速な血清クリアランス(>200mL/日/kg)が観察された。血清精製ヒトIgA単量体は、全体的なクリアランスがより遅く、血清PKプロフィールは、高度にシアリル化されたIgA単量体について以前に報告されたものと概ね一致していた(Rouwendal et al.(2016))。血清濃度時間プロファイルを特徴付けることに加えて、I-125及びIn-111の二重標識抗体を用いたマウスにおける放射性標識体内分布研究も行った。二重トレーサ手法は、以前に記載されたように(図5B~図5C)、リソソーム分解前のインタクト抗体(I-125)と内在化/異化抗体(In-111マイナスI-125)とを区別する能力を提供した(Boswell et al.,Bioconjugate Chem 21:2153-63(2010),Mandikian et al.,Mol Cancer Ther 17:776-85(2018)及びRajan et al.,MAbs 9:1379-88(2017))。簡潔には、ヨウ素は細胞から急速に拡散し、ヨウ素化抗体がリソソーム分解を受けた後に除去されるが、In-111標識抗体は、リソソーム分解後にIn-111付加物の細胞間蓄積を示す。IgA抗体はIgG1と比較して非常に迅速に除去されたため、生の組織値は間質濃度と血管濃度の両方を表すので、組織分布データの直接比較は困難である。したがって、インタクトな抗体分布データを、組織中の間質濃度のみを表すように以前に記載されたように血液補正した(Boswell et al.,Mol Pharmaceutics 11:1591-8(2014))。IgG1と比較してインタクトIgAオリゴマーのわずかな濃縮が、低いレベルであるが(図5B)、肝臓、胃、小腸、大腸及び皮膚において1時間後に観察された(Asano et al.,Scand J Immunol 60:267-72(2004)及びWang et al.,Scand J Immunol 83:235-43(2016))。高レベルのIgA分解もまた、肝臓及び小腸における1時間の投与後に研究されたフォーマットにわたって見られた(図5C)。フォーマット間で観察された総血中濃度の差を説明するために、血漿濃度に対する個々の組織の比も記載した(図9)。1日後、インタクトIgA抗体はほとんど組織に残らず(図10)、肝臓における最大の異化作用が検出された(図11)が、小腸における異化作用は、In-111が後の時点で腸細胞にあまり蓄積しないので、検出されなかった可能性がある(Boswell et al.,British Journal of Pharmacology 168:445-57(2013))。特定の理論に束縛されるものではないが、IgAの分解及び最終的なクリアランス機構を減少させると、IgGと比較して粘膜組織へのIgA分子の取り込みを更に改善できると仮定された。
単量体型IgA分子のN結合型グリカン上のシアリル化含量は、特異的グリカン受容体を介した抗体クリアランスと負に相関することが報告されている(Rouwendal et al.(2016))。したがって、開示されたIgA分子を分析して、それらの全体的なシアリル化含有量を決定した。グリカンを、複合体及びシアリル化がIgA分子にとって最も望ましいプロセシングのレベルに基づいてカテゴリーに分類した(図6A)。IgA1、IgA2m1、IgA2m1.P221R、IgA2m2、並びにIgA2m2単量体及び四量体の組換え生成された二量体は、約20~50%シアリル化されていた(図6B、図25、図26、及び表5)。これは、IgA分子が、グリカン受容体によって認識され得る不完全にプロセシングされたグリカンを含有することを示している。更に、IgA2m1二量体上の各部位におけるシアリル化含有量を調べたところ、JC上の部位を含む全ての部位が、不完全にプロセシングされたグリカンを含有していることが見出され、不完全なグリカンプロセシングがただ1つの特定の部位で起こっていることを示唆した(図6C及び表6)。開示された組換えIgA分子とは対照的に、ヒト血清から精製されたIgAは、シアリル化含有量が95%であり(図6B及び表5)、SEC-MALSによって測定すると単量体であった。血清IgAは主に単量体であることが知られているため(Kerr(1990))、シアリル化含有量は抗体の全身曝露と正に相関するので、高度にシアリル化された分子が濃縮され得る。特定の理論に束縛されるものではないが、ヒト精製IgA単量体のこの増加したシアリル化レベルは、組換えIgA単量体と比較してマウスにおける分子の血清クリアランスの減少と相関すると考えられる。実際、これは真であることが実証され、肝臓における特異的グリカン受容体への結合がIgA単量体の重要なクリアランス機構であり得ることを示唆している(図5A、図25及び図27)。
濃度-時間曲線下のAUClast=面積、最後の測定可能な濃度;CL=クリアランス;Cmax=観察された最大濃度;IV=静脈内;#Balb/cマウスに10mg/kg IVボーラスを投与した。注:全てのマウスPKデータについてまばらなPK分析を行ったので、1群あたりの個々のマウスからのデータをプールし、SDは報告しなかった。
pIgR結合が低下したIgA変異体の生成。pIgR結合に対する変異の効果を決定するために、IgA2m2の変異体を作製した。アミノ酸Y411、V413及びT414のアラニンへの変異(本明細書では「411-414AAA」と呼ぶ)、P440R変異、C311S変異又はそれらの組合せを有するIgA2m2変異体を作製した。そのような変異体の発現レベルを図30Aに示す。図30Bは、小規模精製抗IL-13 IgA2m2変異体のSEC特性評価を提供する。図30C~図30Dに示されるように、アミノ酸Y411、V413及びT414の変異を有するIgA2m2変異体はマウスpIgR又はヒトpIgRに結合しないが、P440R変異体はマウスpIgRに対する親和性の10倍の低下及びヒトpIgRに対する結合能の顕著な喪失をもたらした。更に、アミノ酸411、413及び414の変異を有するIgA2m2変異体もFcαRIに結合しない(図30E)。
IgA抗体のシアリル化含有量を増加させるための細胞培養条件の変更。IgA抗体を発現する細胞の培養条件を改変して、抗体のシアリル化含有量を増加させた。試験した細胞培養条件を図31Aに提供する。図31Bに示すように、IgA2m2抗体のシアリル化は、ガラクトース及びN-アセチルマンノサミン(ManNac)の存在下でシアリルトランスフェラーゼ(ST)及びガラクトシルトランスフェラーゼ(GT)を添加すると増加し、7日間の採取を行った。
グリコシル化部位及びFcRn操作による組換えIgAの薬物動態プロファイルの改善。マウスにおける組換えポリマーIgAのクリアランスを減少させるために、2つの並行アプローチを行った。最初に、IgA2m2中の5つ全てのN結合型グリコシル化モチーフ及びJC中の単一部位を突然変異誘発によって除去して、グリカンを含まない分子(アグリコシル化)を生成した(図7A及び図25)。アグリコシル化IgAポリマーは、グリカン受容体によって認識されず、グリカン受容体媒介クリアランス機構とは無関係の薬物動態の研究を可能にする。図36B~図36Dに示されるように、個々のIgA2m2グリコシル化変異体は、マウスpIgR及びヒトpIgRに対して同様の結合を有する。IgA2m2中のN結合型グリコシル化モチーフN-X-S/Tを除去するために、NをA/G/Qに変異させるか、S/TをAに変異させるか、モチーフをアグリコシル化IgA1配列に戻した3つの場合、これが起こる(図1A)。JC残基N49をA/G/Qに変異させるか、又はS51をAに変異させた。個々のIgA2m2の変異N166A、S212P、N263Q、N337T.I338L.T339S及びN459Q、並びにN49Q JCの変異は、最高レベルの一過性発現を与えるが、IgA2m2の5つ全てのグリコシル化部位を除去する変異の組合せは、不十分な発現をもたらし、J鎖N49Q変異の更なる付加は、それを完全に無効にしたことが見出された。図24A~図24Cも参照されたい。キメラ免疫グロブリンは、単一の種に由来するものと比較して、哺乳動物細胞においてより低い発現レベルを示すことが多い。したがって、マウス抗mIL13可変ドメインをヒト化抗HER2に切り替えてヒト化IgAを生成したが、これは一過性発現レベルを改善しなかった。したがって、オリゴマー種の混合物として精製されたアグリコシル化ヒト抗HER2 IgA2m2ポリマーの発現レベルを増加させるために、CHO標的化インテグレーション(TI)安定細胞株を作製した。
第2に、リソソーム分解を減少させる方法としてFcRn結合を利用するために、2つのIgG1-IgA Fc融合物を操作した(図7B)。以前の研究は、このアプローチがIgA単量体血清クリアランスをIgG1に匹敵するレベルまでレスキューすることを示唆した(Li et al.(2017)and Borrok et al.(2015))。最初に、以前に報告されたIgG1-IgA2m1 P221R Fc融合の二量体及び四量体バージョン(Borrok et al.(2015))を作製したが、これらは4日目にマウス血漿中で不安定性を示すことが観察された(図7C)。一次切断産物は、完全長抗HER2 IgG1(トラスツズマブ)と同様の時間に分析SECに溶出し、この不安定性は、IgG1-IgA2m1 P221R Fc接合部で切断するエンドプロテアーゼによって引き起こされたことを示唆した。接合部のアミノ酸配列を検査し、フリン様切断部位に似た正電荷を帯びた残基のストレッチを同定した(図12)。タンパク質分解的切断を軽減するために、接合部におけるこれらの正に荷電した残基を、IgG1重鎖のC末端K447の除去によって除去し、IgA2m1 Fcを、P221、天然のIgA2m1残基(P221R変異の代わり)、又はIgA2m1ヒンジを欠失させるC242のいずれかで開始させた(図12及び図34A)。C242 Fc開始もまた、それがIgA1 Fc結晶構造コンストラクトの最初の残基であるので含まれており、そのため、安定な切断型タンパク質であると推定された(Herr et al.,Nature 423:614-20(2003))。再操作されたIgG1ΔK-P221 IgA2m1 Fc及びIgG1ΔK-C242 IgA2m1 Fc融合物が二量体として産生された場合、両方ともマウス血漿中で最大4日間安定であることが見出された(図7C)。図34Bは、完全長抗IL-13 IgG1-IgA Fc融合物の一過性発現データを提供する。操作された融合分子のいくつかは、IgG1及び元のコンストラクトと比較して改善された発現を示す(図34B及び図37A)。更に、図33Aに示すように、LC及びHC DNAの量と比較してJC DNAの量を増加させると、高次オリゴマー種よりも多くの二量体種が生成された。
下部ヒンジ残基E233又はL234のIgG1をC241又はC242のIgA1のFcに融合することによって、IgG1-IgA1融合物も生成した。図37Bに示すように、IgG1-IgA1融合物は、IgA1と同様に、主に二量体として発現した。更に、IgG1-IgA1融合物は、IgA1と同様の様式でヒト及びマウスpIgR及びヒトFcαRIに結合した(図37C)。
操作されたIgA抗体及びIgG1-IgA融合分子を、示差走査蛍光定量法(DSF)によって安定性について分析し、IgA1二量体と比較して安定性の損失がないことを確認した(図32)。
操作されたIgA抗体及びIgG1-IgA融合分子を、全体的なグリカン含有量、抗原結合及び受容体結合について更に特性評価した。アグリコシル化抗HER2 IgA2m2ポリマーは実際にグリコシル化を有していなかったが、抗mIL-13 IgG1ΔK-P221 IgA2m1 Fc及びIgG1ΔK-C242 IgA2m1 Fc融合物は、約20%の複合体シアリル化グリカンしか含まなかった(図13及び表8)。アグリコシル化抗HER2 IgA2m2ポリマーは、ヒト(h)HER2、マウス(m)pIgR及びhpIgRに対して、グリコシル化IgA2m2四量体と同様の結合親和性を有するが、Wasatch SPRアッセイによって測定したところ、IgA特異的hFc受容体hFcαRIには結合しなかった(表7;図33B~図33Cも参参照)。興味深いことに、IgA2m2 HC上にグリコシル化を欠くが、J鎖上にグリコシル化を保持するIgA2m2四量体も、Wasatch SPRアッセイによって決定されるようにhFcαRIに結合することができず(図35A~図35B)、IgAHCのグリコシル化が受容体結合に必要であることを示唆した。しかしながら、製薬業界で一般的に使用されているSPRシステムであるBiacore SPRシステムを使用して示されているように、IgAポリマーのグリコシル化状態はhFcαRIへの結合に影響を及ぼさなかった(図52A~図52B)。図52A~図52Bに示されるように、アグリコシル化抗HER2 IgA2m2ポリマー(「xHER2 4D5.IgA2m2四量体N168A.S214P.N252Q.N326T.I327L.T328S.N461Q,J-N71Q」と称する)及び部分的に脱グリコシル化された抗IL-13 IgA2m2オリゴマーは、Biacore SPRアッセイによって測定されるようにhFcαRI結合を保持した。特定の理論に束縛されるものではないが、2つのSPRシステム、すなわちWasatch及びBiacoreシステムから得られた結果の違いは、一部には、方法に開示されているように、SPRシステムで使用されるチップに抗体を固定するために使用される異なる戦略に起因し得る。
更に、抗mIL-13 IgG1ΔK-P221 IgA2m1 Fc二量体及びIgG1K-C242 IgA2m1 Fc二量体の両方は、抗mIL-13 IgG1と同様のmIL-13、mFcRn及びhFcRnに対する結合親和性を有し(表7)、またWasatch SPRアッセイによって測定した場合、IgA2m1二量体と同様のmpIgR、hpIgR及びhFcαRIに対する結合親和性を有していた(表3及び表7)。したがって、IgG1-Ig2m1A Fc融合物は、IgG及びポリマーIgAの両方の所望の属性を保持する。
インビトロpIgR媒介トランスサイトーシス及び血清濃度時間プロファイルを、これらの新たに生成されたフォーマットの両方のマウスにおいて測定した。IgG1-IgA2m1 Fc融合物は、マウスにおける全体的なIgA血清曝露において最も顕著な改善を示した(図7D、図34C及び表9)が、最も高いレベルのインビトロトランスサイトーシスを示したアグリコシル化IgA2m2ポリマーと比較して、最も低いレベルのインビトロトランスサイトーシスを示した(図7E)。
濃度-時間曲線下のAUClast=面積、最後の測定可能な濃度;CL=クリアランス;Cmax=観察された最大濃度;IV=静脈内。注:全てのマウスPKデータについてまばらなPK分析を行ったので、1群あたりの個々のマウスからのデータをプールし、SDは報告しなかった。
考察
IgAは、IgGによって提供される現在の機能性を超えてモノクローナル抗体の治療範囲を拡大する可能性を有する。部分的には、これは、IgAの汎用性によって単量体種とポリマー種の両方を形成することが可能である。過去数年にわたって、単量体型IgA(Leusen(2015),Dicker et al.,Bioengineered(2016),Vasilev et al.,Biotechnol Adv(2015)及びVirdi et al.,Cell Mol Life Sci(2015))の組換え産生に著しい進歩がみられ、N結合型グリカンのシアリル化含量が増加し、血清クリアランスの改善をもたらした十分に特性評価された材料を単離するための堅固な経路が提供されている(Rouwendal et al.(2016))。単量体IgAの強力な細胞傷害特性は腫瘍学的適応症にとって魅力的な特徴であるが、ポリマーIgAは、pIgR媒介性トランスサイトーシスを介して上皮障壁を超えて標的に到達する必要がある。本明細書中に記載される研究の前に、組換え作製された単量体及びオリゴマーの混合物のみを、トランスサイトーシスを研究するインビボ実験のために使用した(Olsan et al.(2015)及びRifai et al.(2000))。この実施例に記載される実験は、二量体及び四量体IgAの濃縮を可能にする堅牢な発現及び精製経路を確立する。特に、トランスフェクションに使用されるJC DNAの量又はIgA尾部領域のグリコシル化状態を調節することにより、オリゴマー種の分布に影響を及ぼすことができた。興味深いことに、IgA尾部上のN結合型グリコシル化部位は、種間で極めて保存されている唯一の部位であり(図14)、インビボで高次IgAオリゴマー形成を制御する方法を提供する。組換えIgAの精製には、プロテインL親和性クロマトグラフィを使用した後、HPLC-SECを使用し、四量体から二量体を容易に分離することができた。
IgAは、IgGによって提供される現在の機能性を超えてモノクローナル抗体の治療範囲を拡大する可能性を有する。部分的には、これは、IgAの汎用性によって単量体種とポリマー種の両方を形成することが可能である。過去数年にわたって、単量体型IgA(Leusen(2015),Dicker et al.,Bioengineered(2016),Vasilev et al.,Biotechnol Adv(2015)及びVirdi et al.,Cell Mol Life Sci(2015))の組換え産生に著しい進歩がみられ、N結合型グリカンのシアリル化含量が増加し、血清クリアランスの改善をもたらした十分に特性評価された材料を単離するための堅固な経路が提供されている(Rouwendal et al.(2016))。単量体IgAの強力な細胞傷害特性は腫瘍学的適応症にとって魅力的な特徴であるが、ポリマーIgAは、pIgR媒介性トランスサイトーシスを介して上皮障壁を超えて標的に到達する必要がある。本明細書中に記載される研究の前に、組換え作製された単量体及びオリゴマーの混合物のみを、トランスサイトーシスを研究するインビボ実験のために使用した(Olsan et al.(2015)及びRifai et al.(2000))。この実施例に記載される実験は、二量体及び四量体IgAの濃縮を可能にする堅牢な発現及び精製経路を確立する。特に、トランスフェクションに使用されるJC DNAの量又はIgA尾部領域のグリコシル化状態を調節することにより、オリゴマー種の分布に影響を及ぼすことができた。興味深いことに、IgA尾部上のN結合型グリコシル化部位は、種間で極めて保存されている唯一の部位であり(図14)、インビボで高次IgAオリゴマー形成を制御する方法を提供する。組換えIgAの精製には、プロテインL親和性クロマトグラフィを使用した後、HPLC-SECを使用し、四量体から二量体を容易に分離することができた。
組換え発現されたIgA単量体上のシアリル化レベルを増加させると、グリカン受容体媒介異化を克服することによって血清クリアランスが減少することが以前に実証されている(Rouwendal et al.(2016))。代替戦略として、オリゴマーIgAの血清クリアランスに対するグリカンの寄与が排除され、完全にアグリコシル化IgA2m2ポリマーが産生された。N結合型グリカンの欠如は、表面プラズモン共鳴によって評価されるように、pIgRへの結合に影響を及ぼさなかった。驚くべきことに、インビトロMDCKトランスサイトーシスアッセイでは、アグリコシル化種は、グリコシル化四量体又は二量体と比較してトランスサイトーシスを有意に改善したことが観察された。この改善は、抗体Fc領域からN結合型グリカンを除去したが、それでもなおマウスJ鎖上に炭水化物が存在するヒトIgA1二量体を用いた以前の研究では観察されなかった(Chuang et al.,(1997))。特定の理論に束縛されるものではないが、1つの説明は、グリカンの欠如がグリカン受容体への結合を排除し、したがってpIgR結合を介して非摂動的でより効率的なトランスサイトーシスを提供することである。興味深いことに、FcαRIへの四量体IgA2m2の結合は、グリコシル化に依存しており、これは、少ない数のグリコシル化部位を含むように操作された単量体IgA2m1について観察された結合に対する効果の欠如とは対照的であった。ポリマーIgAの細胞傷害効果は分析されなかったが、FcαRIを活性化することなくトランスサイトーシスすることができるIgA治療薬は、好中球移動からの炎症誘発性応答を防ぐので、炎症性疾患に望ましい(Aleyd et al.,Immunol Rev 268:123-38(2015))。
本明細書に開示される実験で組換え生産されたグリコシル化IgAオリゴマー及び単量体は、単量体及びポリマーIgAについて以前に観察されたものと同様に血清から迅速に除去された(Rouwendal et al.(2016)及びChuang et al.,(1997))。速いクリアランスは、グリカン受容体への潜在的な結合及びその後のリソソームにおける分解に起因していた。グリコシル化IgAを用いた体内分布研究はこの結論を支持し、肝臓及び小腸で最も異化作用があることを示した。グリカンを有することの寄与をよりよく理解するために、グリカンを含まないIgAポリマー(アグリコシル化)を生成し、そのインビボPKプロフィールをグリコシル化バージョンと直接比較した。アグリコシル化IgA2m2ポリマーは、グリコシル化ポリマーと比較して、全体的なマウス血清曝露に顕著な差を示さなかった(2倍未満)。これは、N結合型グリカンを有することが、マウスにおけるIgAポリマーのクリアランスへの寄与において最小限の役割を果たすことを示唆している。アグリコシル化IgAオリゴマーが血清クリアランスを改善しない理由を理解するために更なる研究が必要であるが、pIgR媒介性トランスサイトーシス及び/又はクリアランスは、マウスにおける全体的な血清濃度及びポリマーIgAの運命を決定するのに重要な役割を果たし得ると考えられる。実際、pIgRに対する四量体IgAの平衡結合親和性は、少なくともピコモル濃度範囲であり、豊富なpIgR受容体への効率的な結合とそれに続くトランスサイトーシスを可能にする。しかしながら、分子の血清濃度時間プロファイル及びアグリコシル化ポリマーIgAの配置をよりよく解釈するためには、組織分布プロファイルを調べる詳細な体内分布研究が必要であろう。げっ歯類におけるポリマーIgA分子の薬物動態特性及び生体内分布を研究するための1つの重要な注意点は、pIgRの発現パターンがげっ歯類とヒトとで異なり、最終的な臨床翻訳を混乱させる可能性があることである。特に、げっ歯類及びウサギの肝細胞におけるpIgRの高発現は、ヒトでは起こらないと考えられているポリマーIgA (Daniels et al.(1989))の胆汁クリアランス機構に関連しており、pIgR発現は胆管の細胞で代わりに見られる(Tomana et al.(1988))。したがって、pIgRがマウスにおけるポリマーIgA分子の生体内分布及びクリアランスにおいて果たす正確な役割を別々に評価する必要がある。
加速された血清クリアランスを回避し、曝露を改善するためにとられた代替戦略は、IgG1-IgA2m1 Fc融合物の操作によるものであった。FcRnに結合する能力は、エンドソームにおけるリサイクルを可能にし、したがってリソソーム分解のための選別を回避する。単量体IgG-IgA Fc融合物を用いた以前の報告は、IgGに匹敵する血清クリアランスを報告した(Li et al.Oncotarget(2017)and Borrok et al.(2015))。更に、アルブミン結合ペプチドに融合した単量体IgAについても薬物動態の改善が観察された(Meyer et al.,MAbs 8:87-98(2016))。IgAポリマーからグリカンを除去することによる大きな寄与は観察されなかったため、グリコシル化融合タンパク質が産生された。二量体IgG1-IgA2 Fc融合物は全体的な血清曝露の改善を示したが、単量体IgG-IgA Fc融合物について観察されたIgGに匹敵するものではなかった(Li et al.Oncotarget(2017)and Borrok et al.(2015))。表面プラズモン共鳴により、二量体IgG1-IgA2m1 Fc融合物は、MDCKモデルにおいてインビトロでのトランスサイトーシスが減少しているにもかかわらず、FcRn及びpIgRに結合することができることが実証された。FcRnへの結合は最終半減期を延長したが、pIgRとのIgG1-IgA2m1 Fc二量体相互作用は、特に初期段階でクリアランス機構を提供し、pIgR媒介性トランスサイトーシス及び/又はクリアランスをもたらし、IgGと比較して血清濃度の低下に寄与した。
血清中のIgAは、主に骨髄細胞から分泌されるIgA1単量体で構成され、一方、ポリマーIgA2は、トランスサイトーシスの位置で粘膜固有層の形質細胞から分泌される(Yoo et al.116:3-10(2005))。ポリマーIgAとpIgRとの間の高い親和性は、循環からのポリマーIgAの迅速な捕捉を自然にもたらし、IgA抗原複合体(Shroff et al.,Infect Immun 63:3904-13(1995))としての循環からの有害抗原の効果的なクリアランスを提供し、治療状況では、薬物活性を所定の組織及び短期間に制限するために活用することができ、これはサイトカイン受容体をアゴナイズする場合に特に有益であり得る。マウスの血清からのpIgRを介したポリマーIgAの迅速なクリアランスは、pIgR欠損NODマウスの血清中のIgA濃度の約20倍の増加によって更に裏付けられる(Simpfendorfer et al.,PLoS ONE 10:e0121979(2015))。
実施例2:組換えIgA抗体の精製
カッパ軽鎖を含有する組換えIgAを、Capto L(GE Healthcare)カラムを使用して細胞培養上清から捕捉された分泌タンパク質及び親和性としてCHO細胞において発現させた。捕捉後、カラムを5カラム容量(CV)のTris緩衝液(25mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、5mM EDTA、2mM NaN3)、エンドトキシンを除去するための20 CVのTriton X-114緩衝液(25mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、5mM EDTA、0.1% Triton X-114、2mM NaN3)、5 CVのTris緩衝液、5 CVのKP緩衝液(0.4Mリン酸カリウム、pH7.0、5mM EDTA、0.02% Tween20、2mM NaN3)及び10 CVのTris緩衝液で洗浄した。IgAを150mM酢酸、pH2.7で溶出し、直ちに1/5体積の1Mアルギニン、0.4Mコハク酸塩、pH9.0で中和した。
カッパ軽鎖を含有する組換えIgAを、Capto L(GE Healthcare)カラムを使用して細胞培養上清から捕捉された分泌タンパク質及び親和性としてCHO細胞において発現させた。捕捉後、カラムを5カラム容量(CV)のTris緩衝液(25mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、5mM EDTA、2mM NaN3)、エンドトキシンを除去するための20 CVのTriton X-114緩衝液(25mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、5mM EDTA、0.1% Triton X-114、2mM NaN3)、5 CVのTris緩衝液、5 CVのKP緩衝液(0.4Mリン酸カリウム、pH7.0、5mM EDTA、0.02% Tween20、2mM NaN3)及び10 CVのTris緩衝液で洗浄した。IgAを150mM酢酸、pH2.7で溶出し、直ちに1/5体積の1Mアルギニン、0.4Mコハク酸塩、pH9.0で中和した。
親和性精製後、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を使用して組換えIgAを精製した。主に1つのオリゴマー状態(単一タイプのオリゴマーの>90%)が存在する組換えIgA試料については、HiLoad Superdex 200pgカラム(GE Healthcare)をSECに使用し、続いて望ましくないオリゴマー状態の汚染物質を回避するためにピークシェービングを行った。ほぼ等量のオリゴマーの複合混合物(例えば、約40%の二量体及び約60%の高次ポリマー)を含むIgA試料について、いくつかの精製アプローチを試験した。図39に示されるようなオリゴマーのヒト抗mIL-13 IgA2m2混合物を使用して、以下に記載される種々のタイプの精製を試験した。
HiLoad Superose 6 16/600pgカラム(GE Healthcare)を使用したSECでは、図40に示すように、高次オリゴマーからIgA二量体を分離するための高分子量範囲の分解能が不十分であった。Superose 6溶出プロファイルでは、ピーク1が約35~39mL付近で溶出し、これはカラムの空隙容積に対応し、したがって凝集したタンパク質である可能性が高い。ピーク2及びピーク3は、ピーク3がピーク2の後縁上の肩部として現れるように顕著に重なり合う。上記のSEC-MALSによるピーク2の前縁及びピーク3の後縁付近の画分の分析により、それぞれ735,000g/mol及び375,300g/molのモル質量が得られた。ヒト抗mIL-13 IgA2m2単量体の予想分子量は約148kDa、二量体約312kDa、三量体約460kDa、四量体約608kDa及び五量体約756kDaである。これは、ピーク2及びピーク3が五量体、四量体、三量体及び二量体の混合物を含む可能性が高いことを示唆している。後に約60mL付近で溶出するピーク4は、単量体IgAに対応している可能性が高い。
HiLoad Superdex 200pgカラム(GE Healthcare)又はHiLoad Sephacryl 400pgカラム(GE Healthcare)のいずれかを使用するSECも、高次オリゴマーからのIgA二量体の分解能が不十分であった。SP HPカラム(GE Healthcare)を使用するカチオン交換クロマトグラフィ、Q FFカラム(GE Healthcare)を使用するアニオン交換クロマトグラフィ、及び5μm、7.8×75mm ProPac HIC-10カラム(Dionex)を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)によってオリゴマーを分離する試みも成功しなかった。
対照的に、3.5μm、7.8mm×300mmのXBridge Protein BEH 450 Å SECカラム(Waters)を使用して小規模精製を行うと、ヒト抗mIL-13 IgA2m2について図41に示すように、IgA二量体が高次オリゴマーから最も良好に分離された。分解能を最大にするために、100μL以下の注入体積中の1mg未満の総タンパク質を、移動相として0.2Mアルギニン、0.137Mコハク酸塩、pH5.0を用いたAgilent 1260 Infinity HPLCを使用して1mL/分でカラムに流し、200μLの画分を収集した。次いで、画分を選択的にプールして、主に1つのオリゴマー状態を単離した。複数回の実行を行い、各実行からの所与のオリゴマーのプール画分を合わせた。
プールした画分に見られるIgA同一性、純度及びオリゴマー状態を、以下に記載される3.5μm、7.8mm×300mm XBridge Protein BEH 200 Å SECカラム(Waters)を使用するSEC-MALS(図42)、以下に記載されるSDS-PAGE(図42)、以下に記載される陰性染色電子顕微鏡法(図43及び図44)及び以下に記載される質量分析(図45)によって特性評価した。SEC-MALSは、3.5μm、7.8mm×300mmのWaters XBridge Protein BEH 200 Åサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)カラムに、移動相として0.2Mアルギニン、0.137Mコハク酸塩、pH5.0を用いるAgilent 1260 Infinity HPLCを使用して、1mL/分で組換えIgAを注入することによって行った。Capto L親和性精製からの組換え抗mIL-13 IgA2m2の例示的な分析SECプロファイルを図39に示す。分析SECカラムから溶出したタンパク質をWyatt DAWN HELEOS II/Optilab T-rEX多角度光散乱(MALS)検出器に直接注入して、所与の試料中に存在する様々なIgAオリゴマー状態のモル質量及び多分散性を測定した。
抗mIL-13 IgA2m2抗体については、Waters XBridge Protein BEH 200 Å SECカラムを用いた分析SECで3つの主要なピークが同定された(図42A)。ヒト抗mIL-13 IgA2m2単量体の予想分子量は約148kDa、二量体約312kDa、三量体約460kDa、四量体約608kDa及び五量体約756kDaである。全ての予想される分子量はアミノ酸配列組成に基づいており、糖組成はしばしば不均一で可変であるため、潜在的なN結合型又はO結合型グリカンを考慮していない。Waters XBridge Protein BEH 450 Å SECカラムで分離した後、ピーク1のモル質量は、MALSにより、658,000g/mol+/-0.510%と決定された(図42B)。これは、ピーク1が主に四量体IgA2m2であることを示唆している。ピーク2のモル質量は、343,700g/mol+/-0.646%としてMALSによって決定された(図42C)。これは、ピーク2が主に二量体IgA2m2であることを示唆している。二量体よりも遅く溶出するピーク3は、おそらく単量体IgAである(図42A)。
図42B及び図42Cからの還元されていない精製ピーク1及び2のSDS-PAGE分析は、それぞれIgA四量体及び二量体の予想分子量付近に移動する優勢なバンドを示した(図42D)。これは、MALSによって特定されるモル質量と一致する(図42B及び図42C)。DTTで還元すると、ゲル上に3つのバンドが観察される(図42D)。重鎖(HC)の予想分子量は50.2kDaであり、軽鎖(LC)は23.8kDaであり、連結鎖(JC)は15.6kDaである。全ての予想される分子量はアミノ酸配列組成に基づいており、糖組成はしばしば不均一で可変であるため、潜在的なN結合型又はO結合型グリカンを考慮していない。3つのバンドは、ほぼ3つ全ての鎖の予測された分子量で走り、HC及びJCはわずかに大きい。HCには5つの予測N結合型グリコシル化部位があり、JCには1つの予測N結合型グリコシル化部位があり、これが占有されると分子量が増加し、ゲル上の移動が減少する。SDS-PAGEは、組換えIgAタンパク質を、10mMジチオスレイトール(DTT)を含む又は含まないLDS試料緩衝液(Thermo Fisher Scientific)と混合し、70℃で10分間加熱することによって行った。次いで、試料をMES緩衝液(Thermo Fisher Scientific)中の4%~12%Bolt Bis-Tris Plusゲル(Thermo Fisher Scientific)上で泳動し、ClearPAGE Instant Blue染色(Expedeon)で染色した。
図42B及び図42Cからそれぞれ精製されたヒト抗mIL-13 IgA2m2のピーク1及び2を、陰性染色電子顕微鏡法(EM)によって分析した。精製したIgA2m2試料を、0.015%グルタルアルデヒド(Polysciences,Inc.)中、室温で10分間インキュベートすることによって最初に架橋した。固定したら、試料をTBS緩衝液を用いて希釈して、10ng/μLの濃度を達成した。次いで、4μLの各試料を、2%(w/v)酢酸ウラニル陰性染色剤(Electron Microscopy Sciences)で処理する前に、連続炭素の薄層で覆われた新たにグロー放電した400メッシュの銅グリッド上で40秒間インキュベートした。次いで、IgAを、120keVで操作するTecnai Spirit T12(Thermo Fisher)を用いて25,000×(2.2Å/ピクセル)の倍率で撮像した。低線量条件下でGatan 4096×4096ピクセルCCDカメラを使用して画像を記録した。次いで、各IgA試料について約5000個の粒子を選択し、128ピクセルの粒子ボックスサイズを使用してEMAN2パッケージ内のe2boxer.pyソフトウェアを使用して抽出した。RELION画像ソフトウェアパッケージ内の参照フリー2Dクラスを使用して、両方の試料の平均画像を生成した。精製されたピーク1及びピーク2からのIgAについて、参照フリー2Dクラスと共に生画像ファイルを示す(図43及び図44)。ピーク1は主に四量体IgA2m2であり、幾つかの五量体、三量体及び二量体も存在する(図43)。ピーク2は二量体IgA2m2である(図44)。
質量分析により、JC、LC及びHCが予想分子量の5Da未満以内に存在し、JC及びHCのアミノ末端残基がピログルタミン酸を形成していることが確認された。質量分析は、5mMのDTTの存在下、IgAを0.5mg/mL、97℃で30分間加熱してタンパク質を還元及び変性させることによって行った。次いで、試料を氷上で冷却し、続いて1,000単位のPNGaseF(NEB)で37℃で一晩脱グリコシル化した。次いで、還元され、変性し、脱グリコシル化されたIgAを、Agilent 1290 Infinity UHPLCを使用して1mL/分で3μm、4.6×50mm逆相クロマトグラフィPLRP-Sカラム(Agilent)に注入した。水中0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)(緩衝液A)及びアセトニトリル中0.05%TFA(緩衝液B)を用いて、6分間にわたる5%~60%緩衝液B勾配を行った。逆相カラムから溶出したタンパク質を、インタクト質量測定のためにAgilent 6230エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計(ESI-TOF)に直接注入した。
図41~図45のIgA2m2について記載された成功に加えて、この分離技術は、IgA1(図46)、IgA2m1野生型(図47)及び軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合を回復させるためのP221R変異を含有するIgA2m1(図48)を含む、試験した全ての他のアイソタイプ及びアロタイプにも適用可能であった。
実施例3:組換えIgA抗体及びIgG-IgA融合分子のインビトロ分析
がん細胞死を引き起こすためのIgA抗体及びIgG-IgA融合分子の能力を、CellTiter-Glo発光細胞生存度アッセイを用いてHER2+乳がん細胞株KPL-4、BT474-m1及びSKBR3においてインビトロで分析した。アッセイを以下のように行った。抗凝固剤としてEDTAを使用して、健常ドナーから末梢血を採取した。製造者の指示に従い、EasySep(商標)Direct Human Neutrophil Isolation Kit(STEMCELL Technologies)を用いて、末梢血からエフェクタ細胞としてヒト好中球を単離した。好中球及びHER2増幅標的細胞(SK-BR3;ウェルあたり10,000細胞の密度で)を、黒色透明底96ウェルプレート(Corning)中、試験試薬の存在下で20:1の比で48時間インキュベートした。標的細胞生存率を、Cell Titer-Glow Luminescent Cell Viability試薬(Promegaカタログ番号G7570)を使用して発光相対光単位(RLU)によって測定した。標的細胞死滅活性を以下のように計算した:((処置していないRLU-処置したRLU)/処置していないRLU)×100%。
がん細胞死を引き起こすためのIgA抗体及びIgG-IgA融合分子の能力を、CellTiter-Glo発光細胞生存度アッセイを用いてHER2+乳がん細胞株KPL-4、BT474-m1及びSKBR3においてインビトロで分析した。アッセイを以下のように行った。抗凝固剤としてEDTAを使用して、健常ドナーから末梢血を採取した。製造者の指示に従い、EasySep(商標)Direct Human Neutrophil Isolation Kit(STEMCELL Technologies)を用いて、末梢血からエフェクタ細胞としてヒト好中球を単離した。好中球及びHER2増幅標的細胞(SK-BR3;ウェルあたり10,000細胞の密度で)を、黒色透明底96ウェルプレート(Corning)中、試験試薬の存在下で20:1の比で48時間インキュベートした。標的細胞生存率を、Cell Titer-Glow Luminescent Cell Viability試薬(Promegaカタログ番号G7570)を使用して発光相対光単位(RLU)によって測定した。標的細胞死滅活性を以下のように計算した:((処置していないRLU-処置したRLU)/処置していないRLU)×100%。
図49に示すように、SKBR3及びBT474-m1細胞株は、抗HER IgA2m1単量体(図49で「4D5.IgA2m1.P221R.C471S単量体」と呼ばれる)に対して感受性であった。特に、抗HER IgA2m1単量体は、BT474-m1細胞の生存率に対するその効果と比較して、SKBR3細胞の有意な死滅をもたらした。しかしながら、KPL-4細胞株は抗IgA抗体に感受性ではなかった。がん細胞の死をもたらすIgA抗体の能力が好中球のドナーに特異的であるかどうかを更に分析するために、2人の別々のドナーからの好中球を細胞生存率アッセイに使用した。図50に示すように、2人の異なるドナー由来の好中球は、単量体抗HER2 IgA抗体及び単量体IgG-IgA融合分子の存在下でSKBR3細胞の死を媒介することができ、抗体及び融合分子の有効性がドナー特異的ではないことを示している。ポリマー型抗HER2 IgA抗体は、単量体型抗HER2 IgA抗体と比較して細胞死が少なかった(図50)。
抗体のグリコシル化状態が、がん細胞死をもたらすその能力に影響するかどうかを決定するために、更なる実験を行った。グリコシル化単量体及び四量体抗HER IgA抗体は、SKBR3細胞の有意な死滅をもたらした(図51)。しかしながら、アグリコシル化四量体抗HER IgA抗体は、標的SKBR3細胞の死をもたらさなかった。特定の理論に束縛されるものではないが、これらの結果は、グリコシル化がIgA抗体の有効性に影響を及ぼし得ることを示唆している。
描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組合せられても良い。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例証及び説明目的のために提示されている。包括的であるようにも本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。
本開示の主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物及び方法に様々な修正及び変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の修正及び変形を含むよう意図されている。
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
SEQUENCE LISTING
<110> GENENTECH, INC.
<120> IMMUNOGLOBULIN A ANTIBODIES AND METHODS OF PRODUCTION AND USE
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Leu Lys Glu Pro Gly Glu Gly Ala Thr Thr Tyr Leu Val Thr Ser Val
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Leu Arg Val Ser Ala Glu Thr Trp Lys Gln Gly Asp Gln Tyr Ser Cys
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Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Met Asn Phe Thr Gln Lys Thr Ile
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Ser Leu Gln Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala
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Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Gly Leu Lys Glu Pro Thr Gly Ala Val
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Val Gln Asp Ser Cys Gly Cys Tyr Thr Val Ser Ser Val Leu Pro Gly
165 170 175
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Leu Pro Ser Glu Ser Tyr Leu Val Phe Glu Pro Leu Arg Glu Pro Gly
260 265 270
Glu Gly Ala Ile Thr Tyr Leu Val Thr Ser Val Leu Arg Val Ser Ala
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Glu Thr Trp Lys Gln Gly Ala Gln Tyr Ser Cys Met Val Gly His Glu
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Ala Leu Pro Met Ser Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ser Gly
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Rabbit IgA sequence"
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Leu Asp Pro Leu Ser Val Ser Trp Asp Val Ser Gly Glu Asn Val Arg
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65 70 75 80
Asn Val Thr Cys His Val Val His Asn Asn Glu Gly Gln Asp Leu Pro
85 90 95
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100 105 110
Cys Pro Thr Thr Cys Gly Glu Pro Ser Leu Ser Leu Gln Arg Pro Asp
115 120 125
Ile Gly Asp Leu Leu Leu Glu Ser Lys Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu
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Ser Gly Leu Lys Asp Pro Glu Gly Ala Val Phe Thr Trp Glu Pro Thr
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Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Asp Glu Leu Ala Leu Asn Ala Leu
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Gln Arg Thr Ile Asn Arg Glu Ala Gly Arg Pro Thr His Val Asn Val
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Ser Glu Pro Leu Thr Val Thr Trp Ser Pro Ser Arg Glu Gly Val Ile
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50 55 60
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100 105 110
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Ala Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala
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Glu Gly Ile Cys Tyr
340
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<212> PRT
<213> Gorilla sp.
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Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val
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65 70 75 80
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Tyr
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<213> Homo sapiens
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Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly
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Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala
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<213> Homo sapiens
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Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro
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Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala
35 40 45
Claims (49)
- 単離されたIgA抗体又はその断片であって、IgA抗体は、アミノ酸V458、N459及び/又はS461に置換を含む、単離されたIgA抗体又はその断片。
- アミノ酸V458がイソロイシンで置換されている(V458I)、アミノ酸N459がグルタミン(N459Q)、グリシン(N459G)、若しくはアラニン(N459A)で置換されている、及び/又はアミノ酸S461がアラニンで置換されている(S461A)、請求項1に記載の単離されたIgA抗体。
- 単離されたIgA抗体又はその断片であって、IgA抗体は、アミノ酸I458に置換を含む、単離されたIgA抗体又はその断片。
- アミノ酸I458がバリンで置換されている(I458V)、請求項3に記載の単離されたIgA抗体。
- 単離されたIgA抗体又はその断片であって、IgA抗体は、N166、T168、N211、S212、S213、N263、T265、N337、I338、T339、N459、S461及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸において1つ以上の置換を含む、単離されたIgA抗体又はその断片。
- IgA抗体は、前記アミノ酸N166、S212、N263、N337、I338、T339及びN459における置換が、N166A、S212P、N263Q、N337T、I338L、T339S及びN459Qである、請求項5に記載の単離されたIgA抗体。
- 前記IgA抗体は、IgA1、IgA2m1、IgA2m2又はIgA2mn抗体である、請求項1~6のいずれか一項に記載の単離されたIgA抗体。
- 前記IgA抗体が、アミノ酸N337、I338及びT339における置換、並びにT168、N211、S212、S213、N263、T265、N459、S461及びそれらの組合せにおいて1つ以上の置換を含む、請求項5又は6に記載の単離されたIgA抗体。
- 前記IgA抗体が、IgA2m1、IgA2m2、又はIgA2mn抗体である、請求項8に記載の単離されたIgA抗体。
- 前記IgA抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はヒト抗体である、請求項1~9のいずれか一項に記載の単離されたIgA抗体。
- IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含む単離されたIgG-IgA融合分子であって、前記IgA抗体のFc領域が、前記IgA抗体の重鎖のC末端を介してP221又はR221を含む配列を含み、前記IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を更に含む、単離されたIgG-IgA融合分子。
- IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含む単離されたIgG-IgA融合分子であって、前記IgA抗体のFc領域が、前記IgA抗体の重鎖のC末端を介してC242を含む配列を含む、単離されたIgG-IgA融合分子。
- 前記IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を更に含む、請求項12に記載の単離されたIgG-IgA融合分子。
- 前記IgG抗体が、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体及びIgG4抗体からなる群より選択される、請求項11~13のいずれか一項に記載の単離されたIgG-IgA融合分子。
- 前記IgG抗体がIgG1抗体である、請求項11~14のいずれか一項に記載の単離されたIgG-IgA融合分子。
- 前記IgA抗体が、IgA1抗体、IgA2m1抗体、IgA2m2抗体及びIgA2mn抗体からなる群より選択される、請求項11~15のいずれか一項に記載の単離されたIgG-IgA融合分子。
- 前記IgA抗体がIgA2m1抗体である、請求項11~16のいずれか一項に記載の単離されたIgG-IgA融合分子。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体又は請求項11~17のいずれか一項に記載のIgG-IgA融合分子をコードする単離された核酸。
- 請求項18に記載の核酸を含む、宿主細胞。
- IgA抗体又はIgG-IgAを産生する方法であって、請求項19に記載の宿主細胞を、前記IgA抗体又はIgG-IgA融合分子が産生されるように培養することを含む、方法。
- 前記宿主細胞から前記IgA抗体又はIgG-IgA融合分子を回収することを更に含む、請求項20に記載の方法。
- 請求項20から産生された、又は請求項21から回収された、IgA抗体又はIgG-IgA融合分子。
- 請求項1~10若しくは22のいずれか一項に記載の1つ以上のIgA抗体、又は請求項11~17若しくは22のいずれか一項に記載の1つ以上のIgG-IgA融合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
- 追加の治療剤を更に含む、請求項23に記載の医薬組成物。
- 疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の請求項1~10若しくは22のいずれか一項に記載の1以上のIgA抗体、又は請求項11~17若しくは22のいずれか一項に記載の1以上のIgG-IgA融合分子を前記個体に投与することを含む、方法。
- 前記疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、請求項25に記載の方法。
- 医薬として使用するための、請求項1~10若しくは22のいずれか一項に記載のIgA抗体、又は請求項11~17若しくは22のいずれか一項に記載のIgG-IgA融合分子。
- 疾患の処置に使用するための、請求項1~10若しくは22のいずれか一項に記載のIgA抗体、又は請求項11~17若しくは22のいずれか一項に記載のIgG-IgA融合分子。
- 前記疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、請求項28に記載のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子。
- 疾患を処置するための医薬の製造における、請求項1~10若しくは22のいずれか一項に記載のIgA抗体、又は請求項11~17若しくは22のいずれか一項に記載のIgG-IgA融合分子の使用。
- 前記疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんである、請求項30に記載の使用。
- IgA二量体の発現を増加させる方法であって、軽鎖(LC)及び重鎖(HC)をコードするDNAの量に対して、第1の細胞に導入される連結鎖(JC)をコードするDNAの量を増加させることを含み、発現の増加が、等量のJC、LC及びHCのDNAが導入された第2の細胞で産生されるIgA二量体の量に対するものである、方法。
- 前記第1の細胞に導入される、前記HCをコードするDNAの量対前記LCをコードするDNAの量対前記JCをコードするDNAの量の比(HC:LC:JC)が約1:1:2~約1:1:5である、請求項32に記載の方法。
- IgA二量体、三量体又は四量体の発現を増加させる方法であって、軽鎖(LC)及び重鎖(HC)をコードするDNAの量に対して、第1の細胞に導入される連結鎖(JC)をコードするDNAの量を減少させることを含み、発現の増加が、JC DNAの量に対してより多くのHC及びLC DNAを導入した第2の細胞で産生されるIgAの三量体又は四量体の量に対するものである、方法。
- 前記第1の細胞に導入される、前記HCをコードするDNAの量対前記LCをコードするDNAの量対前記JCをコードするDNAの量の比(HC:LC:JC)が約1:1:0.25~約1:1:0.5である、請求項34に記載の方法。
- IgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの産生を増加させる方法であって、第1の細胞において、アミノ酸V458に置換を有するIgA1抗体又はIgA2m1抗体を発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸V458に置換を有さないIgA1抗体又はIgA2m1抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの量に対するものである、方法。
- アミノ酸がイソロイシンで置換されている(V458I)、請求項36に記載の方法。
- IgA2m2二量体の産生を増加させる方法であって、アミノ酸I458に置換を有するIgA2m2抗体を第1の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸I458に置換を有さないIgA2m2抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA2m2二量体の量に対するものである、方法。
- アミノ酸がバリンで置換されている(I458V)、請求項38に記載の方法。
- IgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの産生を増加させる方法であって、アミノ酸N459又はS461に置換を有するIgA1抗体又はIgA2m1抗体を第1の細胞において発現させることを含み、産生の増加が、アミノ酸N459又はS461に置換を有さないIgA1抗体又はIgA2m1抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA1ポリマー又はIgA2m1ポリマーの量に対するものである、方法。
- アミノ酸N459がN459Q、N459G若しくはN459A変異で置換されており、及び/又はアミノ酸S461がS461A変異で置換されている、請求項40に記載の方法。
- IgA2m2ポリマーの産生を減少させる方法であって、第1の細胞において、アミノ酸C471に置換を有するIgA2m2抗体を発現させることを含み、産生の減少が、アミノ酸C471に置換を有さないIgA2m2抗体を発現する第2の細胞において産生されるIgA2m2ポリマーの量に対するものである、方法。
- アミノ酸C471がC471S変異で置換されている、請求項42に記載の方法。
- IgA2m2抗体の一過性発現を増加させる方法であって、第1の細胞において、N166、S212、N263、N337、I338、T339、N459及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を含むIgA2m2抗体を発現させることを含み、前記一過性発現の増加が、N166、S212、N263、N337、I338、T339、N459及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸に置換を有さないIgA2m2抗体を発現させる第2の細胞において産生される一過性発現の量に対するものである、方法。
- IgG-IgA融合分子の二量体を発現させる方法であって、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含むIgG-IgA融合分子を発現させることを含み、前記IgA抗体のFc領域が、前記IgA抗体の重鎖のC末端を介してP221又はR221を含む配列を含み、前記IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を含む、方法。
- IgG-IgA融合分子の二量体、三量体、又は四量体を発現させる方法であって、IgA抗体のFc領域にそのC末端で融合した全長IgG抗体を含むIgG-IgA融合分子を発現させることを含み、前記IgA抗体のFc領域が、前記IgA抗体の重鎖のC末端を介してC242を含む配列を含む、方法。
- 前記IgG抗体がアミノ酸K447の欠失を含む、請求項46に記載の方法。
- IgA抗体と少なくとも1つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からIgA抗体を精製するための方法であって、
(a)プロテインLを含むカラムに前記混合物を適用して前記IgA抗体を結合させること;
(b)PBSを含む洗浄緩衝液で前記プロテインLカラムを洗浄すること;及び
(c)リン酸を含む溶出緩衝液によって前記プロテインLカラムから前記IgA抗体を溶出させること、を含む、方法。 - IgA抗体又はIgG-IgA融合分子と少なくとも1つの宿主細胞タンパク質とを含む混合物からオリゴマー状態のIgA抗体又はIgG-IgA融合分子を精製する方法であって、
(a)プロテインL又はプロテインAを含む親和性精製カラムに前記混合物を適用して、前記IgA抗体又はIgG-IgA融合分子を結合させること;
(b)前記親和性精製カラムを洗浄緩衝液で洗浄すること;
(c)溶出緩衝液によって前記親和性精製カラムから前記IgA抗体又はIgG-IgA融合分子を溶出して、第1の溶出液を形成すること;及び
(d)サイズ排除クロマトグラフィカラムに前記第1の溶出液を適用して、異なるオリゴマー状態の前記IgA抗体又はIgG-IgA融合分子を分離し、オリゴマー状態の前記IgA抗体又はIgG-IgA融合分子を含むフロースルーを得ることを含む、方法。
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