MX2012010406A - Anticuerpos monoclonales humanos, derivados de celulas b humanas, y que tienen actividad neutralizante contra el virus de la influenza a. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales humanos, derivados de celulas b humanas, y que tienen actividad neutralizante contra el virus de la influenza a.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanos, derivados de células B humanas, presentes en la sangre de pacientes que se han recuperado de infección con los virus de la influenza A; donde los anticuerpos monoclonales tienen actividad neutralizadora contra los virus de la influenza A. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la presente invención, tiene actividades de unión y neutralización contra al menos un virus de la influenza A, seleccionado del grupo que consiste de los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A; y por lo tanto, es útil para la prevención y el tratamiento de una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, y también es útil para diagnosticar una infección por virus de la influenza A.
Description
ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS, DERIVADOS DE
CÉLULAS B HUMANAS, Y QUE TIENEN ACTIVIDAD NEUTRALIZANTE CONTRA EL VIRUS DE LA INFLUENZA A
Campo técnico
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanos, derivados de células B humanas, presentes en la sangre de pacientes que se han recuperado de infección con el virus de la influenza A; donde los anticuerpos monoclonales tienen actividad neutralizante contra el virus de la influenza A.
La técnica de antecedentes
La influenza, un mal provocado por infección respiratoria con virus de influenza, ocurre con frecuencia en invierno. Se sabe que tiene infectividad muy alta y que afecta a todos los grupos de edad, en particular a las personas de edad (Treanor, J., 2004, N Engl. J. Med., 350(3):218-20). El virus de la influenza es un virus de cepa negativa y ARN (ácido ribonucleico) encapsulado, que pertenece a la familia Orthomyxoviridae. Tienen ocho segmentos de ARN de un solo filamento y están clasificados como A, B y C. Los virus de influenza A están divididos adicionalmente en dos subtipos, con base en sus principales proteínas de superficie, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). Hasta la fecha se han identificado 16 HA y 9 NA (Cheung TK y Poon LL, 2007, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1102:1-25). Los virus de influenza tienen un rango amplio, que incluye aves, cerdos y humanos, dependiendo de sus tipos, y tienen un genoma
compuesto de ARN segmentados. Por esta razón, los virus de influenza pueden mutar y recombinarse continuamente, lo que da por resultado nuevas variaciones genéticas (Treanor, J., 2004. N. Engl. J. Med., 350(3):218-20). Por esta razón, es difícil obtener inmunidad permanente contra los virus de la influenza. El método de prevención más efectivo, usado en la actualidad, es una vacuna contra cada uno de los virus de influenza particulares que se espera que sean prevalentes.
Las vacunas contra la influenza son producidas generalmente usando huevos; pero este es un método ineficiente que requiere mucho tiempo. Consecuentemente, este método tiene el problema de que es difícil producir suficientes cantidades de vacunas cada año, dentro de un marco de tiempo limitado. Para solucionar este problema, se han estado efectuando activamente estudios sobre métodos para producir vacunas mediante cultivos de células, en varias compañías farmacéuticas (GSK, Baxter, etc.). Además, es muy difícil desarrollar rápidamente una vacuna contra el virus de influenza pandémico cuando ya ocurrió la infección pandémica. También los fármacos antivirales no son completamente confiables debido a un problema asociado con la aparición de virus mutantes que tienen resistencia.
Para solucionar este problema, recientemente se han estado desarrollando activamente anticuerpos contra virus de la influenza para un propósito terapéutico (Throsby y coautores, 2008, PloS One 3 (e3942); Sui y coautores, 2009, Nature Structural & Molecular Biology, 16 (265-273); Simmons y coautores, 2007, PloS Medicine 4 (e178)).
Se ha estado usando productos de sangre de pacientes recuperados para tratar pacientes infectados con varios virus, así como para tratar infecciones pandémicas de gripe. Por ejemplo, cuando los pacientes infectados con el virus de la influenza española tuvieron síntomas de neumonía, se usaron productos de la sangre recogida de pacientes que se recuperaron de la infección con la gripe, para tratar la influenza (Luke y coautores, 2006, Annals of internal medicine, 145:599). De esa manera, se purifica globulina hiperinmune (Iglv) de plasma humano y se usa para tratar pacientes infectados con varios virus; pero el producto obtenido como se describe arriba puede no ser seguro con respecto a potenciales agentes infecciosos presentes en la sangre, y es ineficiente para la producción en masa.
Se usan células B humanas para seleccionar o discriminar anticuerpos monoclonales humanos específicos. Sin embargo, la inmortalización de las células B humanas por el virus de Epstein-Barr (EBV) es ineficiente para inmortalizar las células B y es tardada. Para solucionar esta ineficiencia se han desarrollado y usado nuevas técnicas. Una de estas técnicas es usar un método RT-PRC para obtener la información genética para un anticuerpo, directamente a partir de las células B. Por ejemplo, hay un método que comprende teñir las células B que expresan un anticuerpo contra un antígeno específico; aislar las células B usando un clasificador FACS; obtener la información genética para el anticuerpo a partir de las células B individuales, mediante un método RT-PCR; insertar la información genética en un vector de expresión; transfectar el vector de expresión a células animales, produciendo de esa manera una cantidad grande del anticuerpo. Para efectuar dicha producción de una manera más fácil y rápida, se puede usar la siguiente técnica. La nueva técnica "análisis de disposición de punto inmunológico en un chip" (ISAAC, por su nombre en inglés: ImmunoSpot Array Assay on a Chip) permite que se obtenga un gen de anticuerpo seleccionando células B individuales que secreten un anticuerpo monoclonal específico, en el término de varias semanas (Jin y coautores, 2009, Nat. Med., 15, 1088-1092). El anticuerpo así obtenido es un anticuerpo humano natural que puede ser más efectivo en términos de cuestiones inmunógenas.
Documentos que no son patentes
1. Reed L. J. y Muench H (1938). A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene, 27 (493-497).
Descripción de la invención
El problema técnico
Es un objetivo de la presente invención proveer un anticuerpo monoclonal humano, que se deriva de células B humanas y que tiene actividad neutralizante contra el virus de la influenza A.
Es otro objetivo de la presente invención proveer una molécula de ácido nucleico aislada, que codifique dicho anticuerpo
monoclonal.
Otro objetivo de la presente invención es proveer un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico insertada en él
Es otro objetivo de la presente invención proveer una línea de células productoras de anticuerpo, transfectadas con dicho vector de expresión.
Otro objetivo más de la presente invención es proveer un método para seleccionar un anticuerpo monoclonal humano.
También es un objetivo de la presente invención proveer una composición que comprende el anticuerpo monoclonal humano.
Otro objetivo de la presente invención es proveer un método para tratar una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, usando dicho anticuerpo monoclonal humano.
Un objetivo adicional de la presente invención es proveer un método para prevenir una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, usando dicho anticuerpo monoclonal humano.
Es otro objetivo de la presente invención proveer un método para diagnosticar una infección por el virus de la influenza A, usando dicho anticuerpo monoclonal humano.
Otro objetivo adicional de la presente invención es proveer un equipo para diagnosticar el virus de la influenza A, que comprende dicho anticuerpo monoclonal humano.
La solución al problema
Para alcanzar los objetivos anteriores, la presente invención provee un anticuerpo monoclonal anti-virus de influenza A, que tiene actividad neutralizante contra por lo menos uno de los subtipos seleccionado del grupo que consiste de H1, H2 y H5 del virus de influenza A.
La presente invención provee también una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica dicho anticuerpo monoclonal.
La presente invención provee además un vector de expresión que contiene la molécula aislada de ácido nucleico insertada en él.
La presente invención provee también una línea de células productoras de anticuerpo, transfectadas con el vector de expresión.
La presente invención provee adicionalmente un método para seleccionar un anticuerpo monoclonal humano.
La presente invención provee también una composición que comprende el anticuerpo monoclonal humano.
La presente invención provee también una composición para prevenir y tratar una enfermedad provocada por el virus de la influenza A; comprendiendo la composición el anticuerpo monoclonal humano.
La presente invención provee además una composición para diagnosticar una infección por virus de influenza A; comprendiendo la composición el anticuerpo monoclonal humano.
La presente invención provee también un método para tratar una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, usando el anticuerpo monoclonal humano.
La presente invención provee además un método para prevenir una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, usando el anticuerpo monoclonal humano.
La presente invención provee adicionalmente un método para diagnosticar una infección por el virus de la influenza A, usando el anticuerpo monoclonal humano.
La presente invención también provee un equipo para el diagnóstico del virus de influenza A, que comprende el anticuerpo monoclonal humano.
Efectos ventajosos de la invención
El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, de la presente invención, tiene actividades de unión y neutralización contra al menos un virus de influenza A, seleccionado del grupo que consiste de los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A; y por lo tanto, es útil para la prevención y el tratamiento de una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, y es útil también para diagnosticar una infección por el virus de la influenza
A.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una serie de gráficas que muestran las afinidades de unión de los anticuerpos CT109, CT111-1 y CT14-2 a la hemaglutinina monomérica (en lo sucesivo denominada "HA") y la HA trimérica.
La figura 2 es una serie de gráficas que muestran las afinidades de unión de los anticuerpos CT104, CT120 y CT123 a la HA monomérica y la HA trimérica.
La figura 3 es una serie de gráficas que muestran las
afinidades de unión de los anticuerpos CT137, CT151 y CT165 a la HA monomérica y la HA trimérica.
La figura 4 muestra mapas de vector de pCT145(A) y pCT147(B).
A: un vector pCT145;
B: un vector pCT147;
pac: un gen que codifica una N-acetil-transferasa de puromicina (PAC); y
DS: simetría diádica (EBNA1 se une al elemento de la simetría diádica (DS) en oriP de EBV).
La figura 5 es un mapa de un vector de expresión, que expresa el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, de la presente invención.
La figura 6 muestra los resultados de experimentos de sobrevivencia en animal (ratones) efectuados usando el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la presente invención.
A: un grupo inyectado con los anticuerpos 24 horas antes de desafiar con el virus subtipo H5N1 (A/Vietnam/1203/04);
B: un grupo inyectado con el anticuerpo 48 horas antes de desafiar con el virus del subtipo H5N1 (A/Vietnam/1203/04);
C: Un grupo inyectado con el anticuerpo 24 horas antes de desafiar con el virus pandémico del subtipo H1N1 (A/California/07/2009); y
D: Un grupo inyectado con el anticuerpo 24 horas antes de desafiar con el virus estacional del subtipo H1N1 (A/Puerto
Rico/8/1934).
La figura 7 muestra los resultados del cambio de título de virus en el lavado nasal de experimentos en animales (hurón) efectuados usando el CT120 de la presente invención, 24 horas después del desafío con el subtipo H1N1 (A/California/04/09).
La figura 8 muestra los resultados del cambio de título de virus en el tejido pulmonar de experimentos en animales (hurón), efectuados usando el CT120 de la presente invención, después de desafiar con el subtipo H1N1 (A/California/04/09).
Mejor manera de poner en práctica la invención
En lo que sigue, los términos usados aquí se definirán de la siguiente manera:
El término "virus de la influenza A" se refiere al virus de cepa negativa y ARN (ácido ribonucleico) encapsulado, que pertenece a la familia Orthomyxoviridae. Tienen ocho segmentos de ARN de un solo filamento, y están clasificados como tipos A, B y C. Adicionalmente están divididos en subtipos, sobre la base de sus principales proteínas de superficie HA (hemaglutinina) y NA (neuraminidasa). Se conocen hasta ahora 16 Ha y 9 NA.
El término "subtipo H1", cuando se usa aquí, se pretende que incluya: H1N1, N1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 y H1N9 del virus de la influenza A.
El término "subtipo H2", usado aquí, está destinado a incluir: H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 y H2N9 del virus de la influenza A.
El término "subtipo H2" usado aquí está destinado a incluir: H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 y H2N9 del virus de la influenza A.
El término "subtipo H5" usado aquí está destinado a incluir: H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 y H5N9 del virus de la influenza A.
El término "hemaglutinina" (en lo sucesivo denominado "HA") indica la glicoproteína de cápsula del virus de la influenza. HA media la adsorción y la penetración del virus de la influenza en una célula huésped. Hay 16 subtipos conocidos de HA.
El término "pacientes recuperados o completamente recuperados" usado aquí se refiere a pacientes que fueron positivos para el virus de la influenza A debido a infección por el virus de la influenza A; pero que son negativos para el virus de la influenza A en la sangre, después de un periodo de tiempo dado, lo que indica que los pacientes se habían recuperado de la infección por el virus de la influenza A.
En lo que sigue se describirá detalladamente la presente invención.
Los inventores de la presente aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recolectada de pacientes que se habían recuperado de infección con el virus de la influenza A. Se seleccionaron células B, productoras de anticuerpo monoclonal, de las PBMC. Se obtuvo la información genética para producir los anticuerpos monoclonales en las células B seleccionadas, mediante un método de RT-PCR, y se insertaron en un vector pcADN. Se transfectó el vector en una línea de células CHO para confirmar la producción preliminar de anticuerpo, y su actividad de unión a HA. Se seleccionó un total de 82 anticuerpos. Para medir con mayor precisión la afinidad de unión a HA, se transfectaron todos los anticuerpos insertados en el vector pcADN a células humanas F2N; y se analizaron comparativamente los anticuerpos generados de las células transfectadas por medio de HA-ELISA, usando HA monomérica y HA trimérica como antígenos; con lo que se seleccionaron 35 anticuerpos, que fueron hechos reaccionar con la HA trimérica a un grado mayor que con la HA monomérica. Se insertaron los 35 genes de anticuerpo seleccionados en los vectores pcADN en vectores de expresión MarEx, y luego se transfectaron a células F2N para producir mayores cantidades de anticuerpos. Se usaron estos anticuerpos para una prueba de microneutralización (en lo sucesivo denominada "prueba MN") y una prueba de inhibición de hemaglutinación (en lo sucesivo denominada "prueba Hl") para determinar las actividades neutralizadoras contra varios virus de influenza. Varios de los anticuerpos exhibieron elevadas o bajas actividades neutralizadoras contra varios virus de influenza; pero todos los anticuerpos mostraron una reacción negativa en la prueba Hl. Por medio de la prueba MN se seleccionaron finalmente tres anticuerpos monoclonales (los anticuerpos CT104, CT120 Y CT123) que muestran actividad neutralizadora contra varios virus. Se encontró que, entre los tres anticuerpos monoclonales
seleccionados, CT104 tuvo actividad neutralizadora contra los subtipos H1 y H5; CT120 tuvo actividad neutralizadora contra los subtipos H1, H2 y H5; y CT123 tuvo actividad neutralizadora contra el subtipo H1 (ver la tabla 1). También en los experimentos de sobrevivencia en animales (ratón) efectuados usando el subtipo H1 y el subtipo H5, CT104 y CT120 exhibieron excelentes efectos preventivos y terapéuticos contra la infección por H5N1, y los tres anticuerpos exhibieron excelentes efectos preventivos contra infecciones pandémicas y estacionales con H1N1 (ver la figura 6). En otros experimentos en animales (hurón) efectuados usando el subtipo H1, CT120 exhibió efectos terapéuticos contra infección H1N1 (A/California/04/09) (ver la figura 7 y la figura 8). Con base en los resultados anteriores, los inventores de la presente han completado una invención que neutraliza los anticuerpos monoclonales que protegen contra la infección por el virus A de la influenza.
Consecuentemente, la presente invención provee un anticuerpo monoclonal que tiene actividad neutralizante contra los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal de preferencia se une a HA en la superficie del virus de influenza A. Además, el anticuerpo monoclonal de preferencia se deriva de las células B que están presentes en la sangre de pacientes que se habían recuperado de infección con el subtipo H1N1 del virus de la influenza A.
En la presente invención, el virus de la influenza A de preferencia es del subtipo H1N1, y el subtipo H1N1 del virus de la influencia A es por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de A/Texas/05/2009-RG15, A/Nueva York/18/2009-RG15, A/Islas Salomón/2006 y A/Ohio/83. También el virus de la influenza A de preferencia es del subtipo H2N2 y el subtipo H2N2 del virus de la influenza A es A/Ann Arbor/6/60ca. Además, el virus de la influenza A de preferencia es del subtipo H5N1 y el subtipo H5N1 del virus de la influenza A es uno seleccionado de A/Vietnam/1203/04 y A/Anhui/1/05.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal no tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H3N2 del virus de la influenza A.
La presente invención provee también un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, que comprende las siguientes secuencias de polipéptidos de cadena liviana y de cadena pesada, y un fragmento y una variante funcional de ellas:
una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 7 Y SEQ ID NO. 12; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 2 y una región CDR3 que comprende una o más secuencias, seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 8 Y SEQ ID NO. 13; y
una cadena pesada que comprende una región CDR1 que
comprende una o más secuencias, seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 14; una región CDR2 que comprende una o más secuencias, seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 15; y una región CDR3 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 11 y SEQ ID. NO. 16.
La presente invención provee también un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, seleccionado del grupo que consiste de los siguientes anticuerpos monoclonales, y un fragmento y una variante funcional de ellos:
un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 2 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 3; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 4, una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 5 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 6;
un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 7; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 2 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 8, y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 9, una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 10 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 11; y
un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 12; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 2 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 13; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 14, una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 15 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 16.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal de preferencia comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO. 36 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO. 37. De preferencia el anticuerpo monoclonal tiene actividad neutralizante contra los subtipos H1 y H5 del virus de la influenza A, y no tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H3 del virus de la influenza A. El subtipo H1 incluye: H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 y H1N9; y el subtipo H5 incluye H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 y H5N9.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal de preferencia comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO. 40 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO. 41. El anticuerpo monoclonal de preferencia tiene actividad neutralizadora contra los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A, y no tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H3 del virus de la influenza A. El subtipo H1 incluye: H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 y H1N9; y el subtipo H2 incluye H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 y H2N9. También el subtipo H5 incluye H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 y H5N9.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal de preferencia comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO. 44 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO. 45. De preferencia, el anticuerpo monoclonal tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H1 del virus de la influenza A y no tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H3 del virus de la influenza A. El subtipo H1 incluye H1 N1 , H1 N2, H1 N3, H1 N4, H1 N5, H1 N6, H1 N7, H1 N8 y H1 N9.
Un fragmento del anticuerpo monoclonal de virus de la influenza A de la presente invención no es todo el anticuerpo, sino una porción del anticuerpo. Tiene la capacidad de unirse a la HA del virus de la influenza A, y se quiere que incluya todos los fragmentos que se unan competitivamente a la HA con el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la presente invención.
Además, la presente invención incluye variantes funcionales del anticuerpo monoclonal de la presente invención. Si las variantes del anticuerpo monoclonal pueden competir con el anticuerpo
monoclonal de la presente invención para unirse específicamente a los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A y sus fragmentos, se consideran como variantes funcionales el anticuerpo monoclonal de la presente invención. Específicamente, si las variantes funcionales se pueden unir a los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A o sus fragmentos y tienen actividad neutralizadora contra esos subtipos o fragmentos, se consideran como variantes funcionales de la presente invención. Las variantes funcionales incluyen, pero sin limitación a ellos: los derivados que son sustancialmente similares en la secuencia estructural primaria, pero que contienen modificaciones, por ejemplo in vitro o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en el anticuerpo monoclonal primitivo de la presente invención. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, la acetilación, la acilación, la unión covalente de un nucleótido o un derivado de nucleótido, la unión covalente de un lípido o un derivado de lípido, la reticulación, la formación de unión disulfuro, la glicosilación, la hidroxilación, la metilación, la oxidación, la pegilación, el procesamiento proteolítico, la fosforilación, y otros similares. Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser anticuerpos monoclonales que comprendan una secuencia de aminoácidos que contenga sustituciones, inserciones, omisiones o sus combinaciones, de uno o más aminoácidos, comparados con las secuencias de aminoácido de los anticuerpo monoclonales primitivos. Adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de
aminoácido en ambos extremos amino y carboxilo, o en cualquiera de ellos. Las variantes funcionales, de acuerdo con la presente invención, pueden tener las mismas o diferentes afinidades de unión, mayores o menores, en comparación con el anticuerpo monoclonal primitivo; pero todavía ser capaces de unirse a los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A o sus fragmentos. Por ejemplo, las variantes funcionales de acuerdo con la invención pueden tener afinidades de unión incrementadas o disminuidas para los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A, o sus fragmentos, en comparación con las moléculas de unión primitivas. De preferencia, se modifican las secuencias de aminoácido de las regiones variables, incluyendo, pero sin limitación a ellas, las regiones de estructura, las regiones hipervariables, en particular las regiones CDR3. Generalmente las regiones de cadena liviana o de cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR y regiones más conservadas, las llamadas regiones de estructura (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácido de CDR y residuos de aminoácido de secuencias repetitivas hipervariables. Las variantes funcionales destinadas a quedar dentro del alcance de la presente invención tienen por lo menos alrededor de 50 a 99 por ciento, de preferencia por lo menos alrededor de 60 a 99 por ciento, más preferible, por lo menos alrededor de 80 a 99 por ciento; todavía más preferible, por lo menos alrededor de 90 a 99 por ciento, en particular, por lo menos alrededor de 95 a 99 por ciento, y en particular, por lo menos
alrededor de 97-99 por ciento de homología en la secuencia de aminoácidos, con el anticuerpo primitivo, como se define aquí. Se pueden usar algoritmos de computadora, tales como Gap o Bestfit, conocidos por las personas con experiencia en la materia, para alinear de manera óptima las secuencias de aminoácido que se van a comparar y para definir residuos de aminoácido similares o idénticos. Se pueden obtener variantes funcionales, ya sea alterando los anticuerpos monoclonales primitivos o sus partes, mediante métodos generales de biología molecular, conocidos en la técnica, incluyendo PCR, mutagénesis dirigida al oligonucleótido y mutagénesis dirigida al sitio, o mediante métodos de síntesis orgánica.
La presente invención provee también un anticuerpo monoclonal contra el virus de influenza A, que comprende las siguientes secuencias de polinucleótido de cadena liviana y de cadena pesada, y un fragmento y una variante funcional de ellas: una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 23 y SEQ ID NO. 28; y una región CDR3 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 24 y SEQ ID NO.30; y
una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 25 y SEQ ID NO. 31; una región CDR2 que comprende una o más secuencias seleccionadas
del grupo que consiste de SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 32; una región CDR3 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO.27 y SEQ ID NO.33.
La presente invención provee también un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, seleccionado del grupo que consiste de los siguientes anticuerpos monoclonales, y un fragmento y una variante funcional de ellos:
un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 17; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 18 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 19; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 20; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 21 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 22;
un anticuerpo monOclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 23; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 18 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 24 y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 25, una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 26 y una región de CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 27; y
un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 28; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO.29 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 30; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 31, una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 32 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 33.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal de preferencia comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO. 34 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO. 35. El anticuerpo monoclonal de preferencia tiene actividad neutralizadora contra los subtipos H1 y H5 del virus de la influenza A y no tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H3N2 del virus de la influenza A. El subtipo H1 incluye H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 y H1N9, y el subtipo H5 incluye H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, N5N8 y H5N9.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal de preferencia comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO. 38 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO. 39. El anticuerpo monoclonal de preferencia tiene actividad neutralizadora contra los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A y no tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H3N2 del virus de la influenza A. El subtipo H 1 incluye H 1 N 1 , H 1 N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 y H1N9; y el subtipo H2 incluye H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 y H2N9. Además, el subtipo H5 incluye H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 y H5N9.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal de preferencia comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO. 42 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO. 43. De preferencia el anticuerpo monoclonal tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H1 del virus de la influenza A y no tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H3 del virus de la influenza A. El subtipo H1 incluye H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 y H1N9.
La presente invención provee también una molécula aislada de ácido nucleico que codifica el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A.
La molécula de ácido nucleico de la presente invención incluye todas las moléculas de ácido nucleico obtenidas trasladando las secuencias de aminoácido de los anticuerpos de la presente invención a secuencias de polinucleótido de acuerdo con métodos conocidos por las personas con experiencia en la materia. Consecuentemente, se pueden preparar varias secuencias de polinucleótidos con marcos de lectura abiertos (ORF) y también están incluidos en el alcance de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.
La presente invención provee también un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico insertada en él. El vector de expresión de preferencia se puede derivar de uno seleccionado del grupo que consiste de los siguientes, pero sin limitación a ellos: un vector de expresión MarEx, producido por Celltrion Inc. (Corea); un vector pCDNA ampliamente obtenible comercialmente, vectores F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti; cósmidos, fagos, tales como lambda, lambdoide, M13, Mu, P1, P22, ?µ, T-even, virus de planta 12, T4, T7, etc. Se puede usar en la presente invención cualquiera de entre una variedad de vectores de expresión, conocidos por quienes tienen experiencia en la materia; y la selección del vector de expresión depende de la naturaleza de la célula huésped que se seleccione. La introducción del vector en las células huésped puede efectuarse por medio de lo siguiente, pero sin limitación a ellos: transfección de fosfato de calcio, infección con el virus, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección don lipofectamina o electroporación; y cualquier persona con experiencia en la material puede seleccionar y usar un método de introducción adecuado para el vector de expresión y para la célula huésped usada. De preferencia, el vector contiene uno o más marcadores de selección, pero sin limitación a ello; y también se puede usar un vector que no contenga marcador de selección. La escogencia de los marcadores de selección puede depender de las células huéspedes escogidas, si bien esto no es crítico para la presente invención, como lo saben bien las personas expertas en la materia.
Para facilitar la purificación de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, se puede insertar una secuencia de etiqueta en el vector de expresión Los ejemplos de etiquetas incluyen, pero sin limitación a ellas: etiqueta de hexa-histidina, etiqueta de hemaglutinina, una etiqueta myc o una etiqueta FLAG. Se puede usar en la presente invención cualquier etiqueta que facilite la purificación, conocidas por quienes tienen experiencia en la materia.
La presente invención provee también una línea de células productoras de anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, transformada con dicho vector de expresión.
En la presente invención las células incluyen, pero sin limitación a ellas: células de mamífero, células vegetales, células de insectos, células fúngales o la célula bacteriana de origen. Como células de mamífero, se puede seleccionar una del grupo que consiste de las siguientes, pero sin limitación a ellas: células CHO, células F2N, células CSO, células BHK, células de melanoma de Bowes, células HeLa, células 911, células AT1080, células A549, células HEK293 y células HEK293T, preferentemente, como célula huésped. Se puede usar en la presente invención cualquiera de las células utilizables como célula huésped de mamífero, conocidas por quienes tienen experiencia en la materia.
La presente invención provee también un método para seleccionar un anticuerpo que tenga una actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A en pacientes recuperados de
infección con el virus de la influenza A; comprendiendo el método los pasos de: 1) examinar si el paciente infectado con el virus de la influenza A está completamente recuperado, y seleccionar los pacientes que sean negativos para el virus de la influenza A en la sangre, de entre los pacientes examinados; 2) recoger sangre de los pacientes completamente recuperados, seleccionados en el paso 1); 3) aislar las células B de la sangre de paciente recolectada en el paso 2); 4) seleccionar las células B que produzcan un anticuerpo que se una a HA, de las células B aisladas en el paso 3); 5) extraer los ARN de las células B seleccionadas en el paso 4); 6) amplificar los genes de anticuerpo de los ARN extraídos en el paso 5); 7) clonar los genes amplificados en el paso 6), en vectores de expresión; 8) transfectar los vectores de expresión del paso 7) en células huésped; 9) examinar si las células huésped transfectadas del paso 8) producen el anticuerpo que se une a HA; 10) cultivar la célula transfectada, seleccionada, del paso 9); 11) purificar los anticuerpos que se unen a la HA del virus de la influenza A, de los cultivos de células transfectadas del paso 10); 12) reconfirmar si los anticuerpos purificados en el paso 11) tienen actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A; y 13) volver a seleccionar un anticuerpo confirmado que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A del paso 12).
La presente invención provee también una composición que comprende el anticuerpo monoclonal contra el virus de influenza A.
La composición de la presente invención puede contener,
además del anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, un excipiente aceptable para uso farmacéutico. Los excipientes aceptables para uso farmacéutico son bien conocidos por quienes tienen experiencia en la materia.
La presente invención provee también una composición para prevenir y tratar una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, que comprende el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A.
La composición de la presente invención, además del anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, puede contener un excipiente aceptable para uso farmacéutico. Los excipientes aceptables para uso farmacéutico son bien conocidos por quienes tienen experiencia en la materia.
Además, la composición preventiva y terapéutica de la presente invención puede comprender por lo menos otros cinco agentes terapéuticos para la influenza A. La composición preventiva y terapéutica de la presente invención puede comprender varios anticuerpos monoclonales que se unan a los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A, o sus fragmentos; donde los anticuerpos monoclonales pueden exhibir un efecto sinergístico sobre la actividad neutralizadora.
También la composición preventiva y terapéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente uno o más de otros agentes terapéuticos o agentes de diagnóstico. Los agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación a ellos, los fármacos antivirales. Estos fármacos pueden incluir anticuerpos, moléculas pequeñas, compuestos orgánicos o inorgánicos, enzimas, secuencias de polinucleótido, péptidos antivirales, etc.
La composición preventiva y terapéutica de la presente invención debe ser estéril y estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. También puede estar en forma de polvo para reconstitución en el excipiente apropiado, aceptable para uso farmacéutico, antes del suministro o en el momento de suministrarla. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos de preparación preferidos son: secado al vacío y secado por congelación, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, desde una solución de ellos previamente filtrada de manera estéril. Alternativamente, la composición de la presente invención puede estar en solución y se le puede añadir el excipiente apropiado, aceptable para uso farmacéutico y/o se lo puede mezclar antes del suministro o en el momento del suministro, para dar una forma de dosis unitaria inyectable. De preferencia el excipiente aceptable para uso farmacéutico usado en la presente invención es adecuado para alta concentración de fármaco, puede mantener la fluidez apropiada y, de ser necesario, puede retardar la absorción.
La selección de la ruta óptima de administración de la composición preventiva y terapéutica estará influenciada por varios factores, incluyendo las propiedades fisicoquímicas de las moléculas activas dentro de la composición, la urgencia de la situación clínica y la relación de las concentraciones en el plasma de las moléculas activas, para el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, se pueden preparar los anticuerpos monoclonales de la presente invención con portadores que los protejan contra la liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar en la presente invención polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno, acetato de vinilo, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Además, el anticuerpo monoclonal puede ser revestido o coadministrado con un material o un compuesto que prevenga la inactivación del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal puede ser administrado junto con un portador apropiado, por ejemplo, un liposoma un diluyente.
Las rutas de administración de la composición preventiva y terapéutica de la presente invención se pueden dividir en administración oral y parenteral. La ruta de administración preferida es la ruta intravenosa, pero no está limitada a ella.
Se pueden formular formas de dosis oral, tales como tabletas, trociscos, caramelos, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras, cápsulas de gelatina blanda, jarabes o elixires, pildoras, grageas, líquidos, geles o suspensiones acuosas espesas. Estas formulaciones pueden contener excipientes farmacéuticos incluyendo, pero sin limitación a ellos: agentes de granulación y desintegración, agentes
aglutinadores, agentes lubricantes, conservadores, agentes colorantes, saborizantes o edulcorantes; aceites vegetales o minerales, agentes humectantes y agentes espesadores.
Las formulaciones para administración parenteral pueden estar en la forma de soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles, no tóxicas, para inyección o infusión. Las soluciones o suspensiones pueden comprender agentes que no sean tóxicos para quienes los reciben, a las dosis y las concentraciones empleadas, tales como 1 ,3-butanodiol, solución de Ringer, solución de Hank, solución isotónica de cloruro de sodio, ácidos grasos, agentes anestésicos locales, conservadores, reguladores de pH, agentes incrementadores de viscosidad o solubilidad, antioxidantes solubles en agua, antioxidantes solubles en aceite y agentes quelatadores de metales.
La presente invención provee una composición para diagnóstico del virus de la influenza A, que comprende un conjugado que comprende una etiqueta conjugada a dicho anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A.
La composición de diagnóstico de la presente invención comprende por lo menos una etiqueta detectable, tal como una porción/agente detectable. Se puede conjugar la etiqueta, de manera no covalente, al anticuerpo monoclonal de la presente invención. Se puede conjugar la etiqueta directamente al anticuerpo monoclonal, por medio de una unión covalente. Alternativamente, se puede conjugar la etiqueta al anticuerpo monoclonal por medio de uno o más compuestos de enlace. Las técnicas para conjugar la etiqueta al anticuerpo monoclonal son bien conocidas por quienes son expertos en la materia. La porción / el agente detectables como etiqueta de preferencia es uno seleccionado del grupo que consiste de los siguientes, pero sin limitación a ellos: enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
La presente invención provee también un método para tratar una enfermedad provocada por el virus de la influenza A; comprendiendo el método un paso de: administrar un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, de la presente invención, a un sujeto que tenga una enfermedad provocada por el virus de la influenza A.
En el método terapéutico de la presente invención, el virus de la influenza A de preferencia es uno seleccionado del grupo que consiste de los subtipos H1, H2 y H5. El subtipo H1 incluye H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 y H1N9; y el subtipo H2 incluye H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 y H2N9. Por su parte, el subtipo H5 incluye H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 y H5N9.
En el método terapéutico de la presente invención, se puede administrar cualquier agente terapéutico para la enfermedad provocada por el virus de la influenza A, conocido por quienes son expertos en la materia, junto con el anticuerpo monoclonal de la presente invención.
En el método terapéutico de la presente invención, la enfermedad provocada por el virus de la influenza A puede ser uno seleccionado del grupo que consiste de los siguientes, pero sin limitación a ellos: una nueva cepa de gripe, gripe pandémica y gripe estacional.
En el método terapéutico de la presente invención la dosis del anticuerpo monoclonal del virus de la influenza A se puede ajustar a la respuesta óptima. Por ejemplo, la dosis es de 0.01 a 200 mg/kg, de preferencia de 0.1 a 10 mg/kg y, más preferible, de 1 a 100 mg/kg, pero no está limitada a éstas. Se pueden administrar diariamente varias dosis divididas, o se puede reducir proporcionalmente la dosis, según lo indiquen las exigencias de una situación individual. Se puede administrar la composición de la presente invención en una sola porción o en múltiples porciones, espaciadas durante el día. El modo de administración no está limitado en la presente invención, y puede ser decidido por el médico que atiende.
En el método terapéutico de la presente invención, las rutas de administración del anticuerpo monoclonal del virus de la influenza A se pueden dividir en administración oral y administración parenteral. La ruta preferida de administración es la intravenosa, pero no está limitada a ella.
La presente invención provee también un método para prevenir una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, comprendiendo el método un paso de administrar un anticuerpo monoclonal del virus de la influenza A, de la presente invención, a un sujeto.
En el método preventivo de la presente invención, se puede administrar el anticuerpo monoclonal del virus de la influenza A, junto con cualquier agente preventivo para la enfermedad provocada por el virus de la influenza A, conocido por quienes son expertos en la materia.
En el método preventivo de la presente invención se puede ajustar la dosis del anticuerpo monoclonal del virus de la influenza A, a la respuesta óptima. Por ejemplo, la dosis es de 0.01 a 200 mg/kg, de preferencia de 0.1 a 150 mg/kg y, más preferible, de 1 a 100 mg/kg; pero no está limitada a éstas. Se puede administrar diariamente varias dosis divididas, o se puede reducir proporcionalmente la dosis, según lo indiquen las exigencias de una situación individual. La composición de la presente invención puede ser administrada en una sola porción o en múltiples porciones espaciadas durante todo el día. El modo de administración no está limitado en la presente invención y puede ser decidida por el médico que atiende.
La presente invención provee también un método para diagnosticar la infección por el virus de la influenza A en un paciente; comprendiendo el método los pasos de: 1) poner en contacto una muestra con el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la presente invención; y 2) detectar una reacción entre el anticuerpo monoclonal y la muestra. Alternativamente, el método de diagnóstico puede comprender los pasos de: 1) poner en contacto una muestra con una composición de diagnóstico de la presente invención; y 2) detectar una reacción entre la composición de diagnóstico y la muestra.
En el método de diagnóstico de la presente invención, el virus de la influenza A tiene uno o más subtipos, seleccionados del grupo que consiste de H1, H2 y H5. El subtipo H1 incluye H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 y H1N9; y el subtipo H2 incluye H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 y H2N9. Por su parte, el subtipo H5 incluye H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 y H5N9.
En el método de diagnóstico de la presente invención, el anticuerpo monoclonal de la presente invención, de ser necesario, puede ser conjugado con una etiqueta para diagnóstico y detección, de acuerdo con cualquier método conocido por una persona experta en la materia.
En el método de diagnóstico de la presente invención, de preferencia se selecciona la muestra del grupo que consiste de los siguientes, pero sin limitación a ellos: flema, escupitajo, sangre, célula de pulmón, mucosidad de tejido pulmonar, tejido respiratorio y saliva. Se puede preparar la muestra de acuerdo con cualquier método convencional, conocido por las personas expertas en la materia.
En el método de diagnóstico de la presente invención, se puede seleccionar el método para detectar la reacción del grupo que consiste de los siguientes, pero sin limitación a ellos: inmunoanálisis de unión homogéneos y heterogéneos, tales como radio-inmuno-análisis (RIA), ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, FACS, BIACORE y análisis de mancha Western. Se puede usar en la presente invención cualquier método de detección conocido por las personas expertas en la materia.
La presente invención provee también un equipo para diagnóstico del virus de la influenza A, que comprende: 1) un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la presente invención; y 2) un contenedor.
Además, la presente invención provee un equipo para el diagnóstico de una infección por el virus de la influenza A, que comprende: 1) una composición para diagnóstico de la infección por el virus de la influenza A, de acuerdo con la presente invención; y 2) un contenedor.
En el equipo de diagnóstico de la presente invención, el virus de la influenza A de preferencia tiene uno o más subtipos, seleccionados del grupo que consiste de H1, H2 y H5. El subtipo H1 incluye H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 y H1N9; y el subtipo H2 incluye H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 y H2N9. Por su parte, el subtipo H5 incluye H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 y H5N9.
En el equipo de diagnóstico de la presente invención está
incluido un soporte sólido en el contenedor 2). El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede estar fijado a un soporte sólido, y este soporte sólido puede ser poroso o no poroso, plano o no plano.
Ejem píos
Ejemplo 1: Aislamiento de PBMC de la sangre de pacientes recuperados de la gripe.
Un grupo de pacientes recuperados consistió de voluntarios pacientes quienes tenían de 2 a 4 semanas después de la confirmación de nuevas infecciones de gripe. Se confirmó que los voluntarios no tenían el virus de la influenza (H1N1) en la sangre, y que tenían un anticuerpo contra el nuevo virus de influenza. Se llevó a cabo este estudio bajo la aprobación del Institutional Review Board (IRB). Este grupo de pacientes tuvo las siguientes características: (1) Los pacientes no estaban vacunados contra la gripe estacional; (2) los pacientes fueron negativos para otros virus infecciosos, es decir, HBsAg, y fueron negativos para el anticuerpo anti-VCH y el anticuerpo anti-VIH; (3) los pacientes fueron negativos para RT-PCR para el subtipo H1N1 del virus de la influenza en el plasma, (4) los pacientes mostraron un título de 1:160 o más alto en el suero, en análisis ELISA para la HA(H1N1) (monomérica) del subtipo H1N1 del virus de la influenza A. Se recogió aproximadamente 10 mL de sangre entera de los voluntarios, y se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre recolectada, usando Lymphoprep™ (Axis-Shield, Noruega, 1114545).
Se lavaron tres veces las PBMC aisladas con solución salina regulada con fosfato, se suspendieron a 2 x 107 células / ml_ en medio de congelación KM Banker II (Cosmobio, Japón, KOJ-16092010) y se guardaron en un tanque de nitrógeno líquido.
Ejemplo 2: Selección primaria de anticuerpos monoclonales
Se seleccionaron células B que secretan anticuerpos específicos al antígeno, usando el método descrito por Jin y coautores (Jin, A. y coautores, 2009, Nat. Med. 15, 1088-1092). Brevemente, se añadieron las PBMC a cada concavidad del chip de microarreglo preparado, a una densidad de una célula por concavidad. Se confirmaron los anticuerpos secretados de las células individuales mediante el anticuerpo anti IgG humano previamente aplicado. Se examinó si las células que secretan anticuerpo seleccionadas secretaban anticuerpos que se unen a HA, usando el antígeno de HA etiquetado mediante un análisis de inmunopunto enlazado con enzima (ELISPOT; Sedgwick, J. D., 2005, Methods Mol. Biol., Vol. 302, pp.314). Se obtuvieron las secuencias completas de los genes de cadena pesada y de cadena liviana de los anticuerpos, a partir de las células individuales que secretan anticuerpo, mediante una reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). Se insertaron los ADN de cadena pesada y de cadena liviana obtenidos, en vectores de expresión pcADN 3.1(+) (Invitrogen, E. U. A., V790.20) para preparar vectores de expresión que produzcan cada una de la cadena pesada y la cadena liviana de los anticuerpos. Se cotransfectaron los vectores de expresión preparados en células CHO. Después de eso, usando los anticuerpos derivados de las células CHO transfectadas, se seleccionaron primariamente 82 anticuerpos que se unen a HA, por medio del HA-ELISA descrito en el ejemplo 3 que sigue. Aquí, se seleccionaron primariamente todos los anticuerpos que mostraron una reacción con HA, sin diluir seriadamente las muestras de anticuerpo.
Ejemplo 3: Segundo paso de selección de anticuerpos monoclonales, y su producción.
A fin de seleccionar secundariamente los anticuerpos monoclonales que tienen gran afinidad de unión para la HA recombinante de los 82 anticuerpos seleccionados primariamente, se llevó a cabo un HA-ELISA usando la HA monomérica y HA trimérica. Se compró HA monomérica recombinante (11055-V08H) de virus de la influenza A (A/California/04/2009), de Sino Biological Inc. (China). La HA monomérica comprada consistió de un dominio extraceluiar (metí -gln529) de HA que comprendía 10 residuos de polihistidina en el extremo C y se derivó de células humanas transfectadas. Se proporcionó HA trimérica recombinante (FR-180) por IRR (Influenza Reagent Resource, E. U. A.). La HA trimérica de H1N1 (A/California/04/2009) incluyó un sitio de división de trombina en el extremo C, un dominio de trimerización (fondón) y seis residuos histidina, y se produjo usando un sistema de baculovirus.
Se midió la reactividad del anticuerpo con el antígeno HA mediante ELISA usando la HA y el anticuerpo. Específicamente,
primero se revistieron 50 µ?_ de cada una de HA monomérica o HA trimérica (250 ng/mL) sobre cada concavidad de una placa de microtitulación de 96 concavidades (Nunc, Dinamarca, 449824). Se bloqueó la placa con solución salina regulada con fosfato (Teknova, E. U. A., D5120) que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y luego se añadió una muestra de anticuerpo diluida seriadamente tres veces (concentración inicial 1 µg/mL) a cada concavidad de la placa. Luego se incubó la placa a la temperatura ambiente durante una hora y se trató después con anticuerpo anti gamma humana de chivo, etiquetado con peroxidasa (Zymed, E. U. A., 62.8420). Después de incubar durante una hora a la temperatura ambiente, se incubó la placa con tetrametilbencidina (TMB; Sigma-Aldrich, E. U. A., T0440) y se detuvo la incubación añadiendo HCI 1N. Se midió la absorbencia a 450/570 nm, usando un lector de placas (Spectramax plus 384, Molecular Devices) y se expresó gráficamente la reactividad de antígeno-anticuerpo, usando el programa Graphpad prism (GraphPad Software Inc., E. U. A.).
Como se muestra en la figura 1, los anticuerpos CT109, CT111-1 y CT154-2 mostraron actividades de unión muy altas contra la HA trimérica, y también mostraron actividades de unión altas contra la HA monomérica, pero menores que las actividades de unión contra la HA trimérica.
Además, los anticuerpos CT104, CT120 y CT123 mostraron altas actividades de unión contra la HA trimérica, pero mostraron pocas actividades de unión, o ninguna, contra la HA monomérica (Figura 2). Otros anticuerpos (los anticuerpos CT137, CT151 CT165) mostraron pocas actividades de unión, o ninguna, contra los dos antígenos (figura 3).
Sobre la base de los resultados mostrados en las figuras 1 a 3, de los 82 anticuerpos seleccionados primariamente, se seleccionaron secundariamente 35 anticuerpos que mostraron actividades de unión altas contra la' HA trimérica. Para cuantificar las actividades de unión de los anticuerpos monoclonales y, por tanto, reducir el número de los anticuerpos monoclonales en la prueba MN, fue necesario incrementar los niveles de expresión de los anticuerpos seleccionados en segundo término. Por lo tanto, se volvieron a clonar los genes de anticuerpo de los vectores de cADN en vectores de expresión MarEx construidos y patentados por Celltrion, Inc., de la siguiente manera. Después de clonar de nuevo, se usaron los vectores de expresión MarEx que contenían los genes de anticuerpo para producir los anticuerpos necesarios para una prueba MN y una prueba Hl.
Se trataron los vectores originales pcADN que contenían cada uno de los genes de cadena pesada y genes de cadena liviana de los 35 anticuerpos seleccionados secundariamente, con las enzimas de restricción Nhe I y Pme I, para separar los genes de cadena pesada y los genes de cadena ligera. Se insertaron respectivamente los genes de cadena pesada obtenidos y los genes de cadena liviana obtenidos en vectores pCT145 y en vectores pCT147, que habían sido tratados con las mismas enzimas de restricción. Se
construyeron los vectores pCT145 y pCT147 por Celltrion, Inc., a fin de construir los vectores que expresan la cadena pesada y la cadena liviana, respectivamente (figura 4). A continuación, a fin de construir los vectores de expresión que contengan una unidad de transcripción (promotor de gen poli A de cadena pesada) junto con la unidad de transcripción de cadena liviana (promotor de gen poli A de cadena liviana), se trataron los vectores pCT145 que contenían los genes de cadena pesada con las enzimas de restricción Pac I y Ase I para separar las unidades de transcripción de cadena pesada, y luego se trataron los vectores pCT147 que contenían los genes de cadena liviana, con las mismas enzimas de restricción y se insertaron con las unidades de transcripción de cadena pesada separadas. Luego se seleccionaron los vectores que contenían la unidad de transcripción de cadena pesada junto con la unidad de transcripción de cadena liviana, usando enzimas de restricción (figura 5). Se extrajeron los vectores seleccionados usando un maxi equipo de plásmido Endofree (QIAGEN, Alemania, 12362), y se analizaron las secuencias de nucleótido usando la parte de las muestras de ADN extraídas, determinando de esa manera las secuencias de nucleótidos de los anticuerpos.
A continuación se transfectó el ADN de los anticuerpos extraídos en la célula de suspensión de la línea de células F2N (construida por Celltrion, Inc., Corea) para producir anticuerpos monoclonales en forma de producción transitoria. Aquí, se llevó a cabo la transfección de la siguiente manera. Se llevó a cabo la
transfección de las células con ADN plásmido usando el polímero catiónico FreeStyle™ Max (Invitrogen, E. U. A., 16447-100) de acuerdo con el instructivo del fabricante. El día antes de la transfección, se centrifugaron las células F2N cultivadas en el medio libre de suero EXCELL 293 (SAFC, LIK, 14571C; en lo sucesivo denominado "medio EXCELL 293") y se suspendieron a una concentración de células de 1 x 106 células/mL en medio EXCELL 293 modificado (SAFC, LIK, 65237, hecho a la orden) y se sembraron 80 mL de la suspensión de células en un matraz de Erienmeyer de 250 mL, o se sembraron 200 mL de la suspensión de células en un matraz de Erienmeyer de 1 litro, en una cantidad de 200 mL. El día de la transfección, en el caso en el que se sembraron 80 mL de la suspensión de células, se diluyó cada uno del ADN que codifica un anticuerpo monoclonal y 100 pL de reactivo FreeStyle™ Max, a un volumen de 1.6 mL, usando el medio OptiPRO SFM ii (Invitrogen, E. U. A. 12309) y se agitó moderadamente. En el caso en el que se sembraron 200 mL de la suspensión de células, cada uno de 250 pg de ADN y 250 pg de reactivo FreeStyle™ Max se diluyó a un volumen de 4 mL usando medio OptiPRO SFM II y se agitó moderadamente. Inmediatamente después del proceso de agitación, se mezcló la solución que contenía el reactivo FreeStyle™ Max diluido en ella, con la solución que contenía el ADN diluido en ella; y se incubó la solución mixta a la temperatura ambiente durante 19 minutos. Durante el proceso de incubación a la temperatura ambiente, durante 19 minutos, se diluyeron las células F2N sembradas a una
concentración de células de 0.8 x 10 células, usando medio EXCELL 293 nuevo, modificado. Después de incubar durante 19 minutos, se añadió la solución mixta de ADN y reactivo FreeStyle™ Max al cultivo de células F2N, preparado para la transfección. El día después de la transfección se añadió la misma cantidad de medio EXCELL 293 a las células transfectadas, que se cultivaron entonces durante 7-8 días, produciendo de esa manea anticuerpos monoclonales.
Ejemplo 4: Examen de la actividad neutralizadora in vitro contra virus
De la selección de 35 anticuerpos monoclonales, se seleccionaron 11 anticuerpos que mostraron afinidades de unión altas para la HA trimérica en HA-ELISA, y se sometieron a una prueba MN a fin de examinar su actividad neutralizadora contra varios virus de influenza.
Ejemplo 4-1: Cultivo de la línea de células MDCK y determinación de la concentración de virus
Se usó como línea de células de riñon canino Madin-Darb (MDCK), la línea London (MDCK-L). Se cultivó la linea de células MDCK en una incubadora humidificada con 5% de COs. a 37 °C usando un medio DMEM (Gibco, E. U. A., 11965) que contenía 10% de FBS (Atlas Biologicals, E. U. A., F0500A), 1 x penicilina/estreptomicina (Gibco, E. U. A., 15140), 25 mM de HEPES (Gibco, E. U. A., 15630) y 2 mM de L-glutamina (Gibco, E. U. A., 25030).
Se cuantificó la concentración de virus mediante ELISA para determinar la dosis infectiva de cultivo de tejido (TCID50). Se efectuó la determinación de la concentración de virus de la siguiente manera. Primero se diluyó seriadamente un material de virus 10 veces con un diluyente para virus [DMEM (Gibco, E. U. A.), BSA al 3 por ciento (Gibco, E. U. A. 15260), 1 x penicilina/estreptomicina (Gibco, E. U. A.) y 25 mM de HEPES (Gibco, E. U. A)], y se añadió a cada concavidad de una placa de 96 concavidades, 100 µ?_ del virus diluido. Como control negativo se usó diluyente para virus que no contenía virus. Luego se trató la línea de células MDCK que se estaba cultivando, con tripsina, se separó de la incubadora de cultivo y luego se trató con medio de cultivo MDCK para neutralizar la tripsina. A continuación se lavaron dos veces las pellas de células con salina regulada con fosfato, y luego se diluyó a una concentración de células de 5 x 105 células/mL, con un diluyente para virus. Se añadió 3-4 µg/mL de TPCK-tripsina (Sigma, E. U. A.) a la placa de 96 concavidades que contenía el virus, e inmediatamente se añadió 100 pL de la línea de células MDCK a cada concavidad de la placa, y se incubó en una incubadora humidificada, con 5% de C02 a 37 °C durante 20 horas. Se lavó una vez la placa incubada con solución salina regulada con fosfato y luego se añadió a cada concavidad de la placa 200 pL de una solución mixta de acetona fría : salina regulada con fosfato (PBS) (80:20). A continuación se fijaron las células durante 8 minutos y después se secó la placa a la temperatura ambiente durante 20
minutos. Se añadió a cada concavidad de la placa 200 µ?_ de salina regulada con fosfato para lavar dos veces cada concavidad. Se añadió a cada concavidad de la placa 100 µ?_ del anticuerpo monoclonal anti-proteína nuclear (NP) biotinilado (Milipore, E. U. A., MAB8257B), que se diluyó a 2,000 veces con salina regulada con fosfato que contenía BSA, y se incubó a la temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó tres veces la placa con 200 L/concavidad de salina regulada con fosfato y se diluyó 20,000 veces un anticuerpo conjugado con estreptavidina-HRP, con salina regulada con fosfato que contenía 1% de BSA. Luego se añadió a cada concavidad de la placa 100 µ?_ de la dilución de anticuerpo y se incubó a la presión ambiente durante 1 hora. Después de lavar cuatro veces la placa con salina regulada con fosfato, se añadió a cada concavidad 100 µ?_ de solución OPD (Sigma, E. U. A. P8287), y se desarrolló la placa a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Se trató la placa con 50 µ-Jconcavidad de HCI 3M para detener el desarrollo de color, y luego se midió la OD 90 de cada concavidad. Con base en la OD490 medida, se calculó la TCID50 usando el método de Reed & Muench (The American, 1938).
Ejemplo 4-2: Análisis MN
Se diluyó cada anticuerpo a una concentración de 10 pg/mL con un diluyente para virus. De esta concentración inicial, se diluyó seriadamente dos veces la dilución de anticuerpo con un diluyente para virus y se añadió 50 µ?. de la dilución a cada concavidad de una placa de 96 concavidades. También se añadieron a cada concavidad de la placa 50 µ?_ de virus, a una concentración que correspondía a 100 TCID50 y se incubaron en una incubadora humidificada, con 5% de C02 a 37 °C durante una hora. Luego se añadieron a cada concavidad 3-4 pg/mL de TPCK-tripsina (Sigma, E. U. A., T1426) y se añadió a cada concavidad 100 µ?_ de las células MDCK tratadas, y se incubó en una incubadora humidificada, con 5% de C02, a 37 °C durante 20 horas. Luego se llevó a cabo un análisis MN de acuerdo con el mismo método que el método de cuantificación de virus descrito en el ejemplo 4-1, determinando de esa manera el valor OD490 de cada concavidad. Se determinó que las concavidades que mostraban valores de OD490 mayores que los de la concavidad en que se introdujo únicamente células, estaban infectadas con virus. Entre los valores OD 490 para cada anticuerpo, al que no se detectó ningún antígeno de virus, se muestra en la tabla 1 la concentración más baja (µ/mL) del anticuerpo, y la concentración más baja del anticuerpo significa la máxima actividad neutralizadora contra el virus.
Tabla 1
Resultados del análisis de microneutralización (análisis MN) efectuado usando anticuerpos seleccionados y virus de diversos tipos
* Unidad: g/mL
Como se puede ver de los resultados de los análisis MN de 11 anticuerpos candidatos contra los virus de influenza del subtipo H1, H2, H3 y H5, CT104 mostró actividades neutralizadoras contra dos virus del subtipo H1N1 pandémicos (A/Texas/05/2009 y A/New York/ 18/2009), y dos virus del subtipo H1N1 estacionales (A/Islas Salomón/3/2006 y A/Ohio/83) a concentraciones bajas (0.313-0.625 µg/p^L, y también neutralizaron dos virus del subtipo H5N1 (A/Vietnam/1203/04 y A/Anhui/1/05), a concentraciones de 1.25 g/mL y 0.625 pg/mL, respectivamente. Sin embargo, el anticuerpo CT104 no mostró actividad neutralizadora contra el virus del subtipo H2N2 (A/Ann Arbor/6/60ca) y el virus de subtipo H3N2 (A/Wisconsin/67/2005). CT123 mostró actividad neutralizadora únicamente contra cuatro virus del subtipo H1N1 probados. En
particular, el anticuerpo CT120 mostró alta actividad neutralizadora contra los cuatro virus de influenza del subtipo H1N1, un subtipo de influenza H2N2 (A/Ann Arbor/6/60ca) y dos virus de influenza del subtipo H5N1. Sin embargo, los anticuerpos descritos arriba no mostraron actividad neutralizadora contra el subtipo H3N2 que pertenece a la clase H3.
Se midieron los valores de IC5o de los tres anticuerpos seleccionados, que tienen actividad neutralizadora contra los virus para comparación, y se muestran los resultados de la medición en la siguiente Tabla 2. Aquí, el valor IC50 es la concentración de anticuerpo a la que el anticuerpo muestra el 50 % de la actividad neutralizadora máxima contra los virus, y el valor menor de IC50 significa la máxima actividad neutralizadora del anticuerpo.
Tabla 2
Valores IC5Q de las actividades neutralizadoras de CT104, CT120 y CT123 contra dos tipos de virus H1N1 pandémicos
de anticuerpo neutralizadora mostrada en la tabla 1.
Como se puede ver de la tabla 2 anterior, los tres anticuerpos tuvieron valores de IC50 muy bajos y, por lo tanto, tuvieron elevada actividad neutralizadora contra los dos virus mostrados en la tabla 2.
Ejemplo 5: Examen de la capacidad del anticuerpo para inhibir una reacción de hemaglutinación provocada por los virus
Se diluyó seriadamente un anticuerpo 2 veces en una placa de 96 concavidades, con fondo en V y se añadieron virus de una unidad cuádruple de HA al anticuerpo y se mezclaron con él. A continuación se incubó la placa a la temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se añadió a cada concavidad de la placa 1% de glóbulos rojos de sangre de ave. Se determinó el punto final de inhibición de hemaglutinación, a la concentración más baja de anticuerpo en la que no se observó reacción de hemaglutinación.
Como resultado, todos los anticuerpo probados no inhibieron la hemaglutinación para dos tipos de virus del subtipo H1N1 pandémico (A/Texas/05/2009-RG15 y A/New York/18/2009-RG18), ni siguiente a concentraciones altas (> 20 Mg/mL) (Tabla 3)
Tabla 3: Resultados de la prueba de inhibición de hemaglutinación para anticuerpos seleccionados, contra dos tipos de virus pandémicos H1N1
Tabla 3 (continuación)
Ejemplo 6: Examen de efectos preventivos y terapéuticos de anticuerpos sobre la infección por virus de influenza mediante experimento en animales-Ejemplo 6-1: Experimento de sobrevivencia en ratones
A fin de examinar si los anticuerpos CT104, CT120 y CT123, seleccionados de los ejemplos anteriores tienen efectos preventivos y terapéuticos contra virus de los subtipos H1N1 y H5N1 en ratones, se llevó a cabo el siguiente experimento.
Se infectó nasalmente cada grupo que consistía de cinco ratones, con virus 10xLD50 de virus. Se administró a los ratones cada uno de los tres anticuerpos seleccionados (CT-104, CT-120 y CT123) y un anticuerpo de control negativo (CT-P6) mediante inyección intra-abdominal, en una cantidad de 10 mg/kg de ratón, 24 horas antes de la infección con el virus y 48 horas después de la infección con el virus.
Los resultados del experimentos están mostrados en la figura 6. Como se muestra en la figura 6, cuando se inyectó CT-104 o CT-120 a los ratones 24 horas antes de la infección con 10xLD50 del virus del subtipo H5N1 (A/Vietnam/1203/2004), sobrevivieron todos los ratones; pero cuando se trató los ratones con CT-123, el 20% de los ratones murió después de 12 días. En el caso del anticuerpo de control negativo (CT-P6), los ratones inyectados con el anticuerpo de control murieron todos después de 7 días (figura 6A). Cuando se inyectaron los anticuerpos 2 días después de la infección con el virus, a fin de examinar los efectos terapéuticos de los anticuerpos, los ratones inyectados con CT-104 y CT-120 sobrevivieron todos hasta el día 14, el último día del periodo de observación; pero el ratón inyectado con el anticuerpo de control negativo (CT-P6) o CT-123, murieron todos (figura 6B).
Cuando se inyectaron los anticuerpos 24 horas antes de la infección con el virus de subtipo H1N1 pandémico (A/California/07/2009), a fin de examinar los efectos de prevención de los anticuerpos, los ratones inyectados con CT-120 y los inyectados con CT-123 sobrevivieron todos hasta el día 14, el último día del periodo de observación; y el 80 por ciento de los ratones inyectados con CT-104 sobrevivió; pero los ratones inyectados con el anticuerpo de control negativo (CT-P6) murieron todos (figura 6C).
Además, los ratones a los que se administró CT-104 o CT-123
24 horas antes de la infección con el virus de subtipo H1N1 estacional (A/Puerto Rico/8/1934), todos los ratones sobrevivieron al periodo de observación, y los ratones a los que se administró CT-120 mostraron una tasa de sobrevivencia del 80%; pero los ratones inyectados con el anticuerpo de control negativo (anticuerpo CT-P6) murieron todos (figura 6D).
Ejemplo 6-2: Experimento en hurón
Para investigar las virtudes curativas, se probó el CT120 seleccionado en el modelo animal en hurón, que muestra sensibilidades y síntomas similares a los humanos contra el virus de la influenza.
Cada grupo de prueba estuvo formado por 9 hurones, excepto el grupo de control negativo que incluyó 4 hurones adicionales, para medir la concentración inicial de la infección viral. Se inocularon los hurones intranasal o intratraquealmente con 1 ml_ (1 x 106 EID50/mL) del virus de la influenza [A/California/04/09 (H1N1)] después de aclimatación. Se inyectó intravenosamente CT120 una vez a las 24 horas después de la inoculación viral: Se inyectó el grupo de prueba 1 con 15 mg/kg de CT120; se inyectó el grupo de prueba 2 con 30 mg/kg de CT120. Para el grupo de prueba 3, se inyectó 30 mg/kg de CT120 cada 24 horas durante 3 días. En el grupo de control negativo se inyectó intravenosamente 30 mg/kg de anticuerpo CT-P6 una vez a las 24 horas después de la inoculación viral.
Se recogió cada lavado nasal de los hurones de cada grupo de prueba en los días 1, 3, 5 y 8 después de la inoculación viral, y se midió la concentración viral en las muestras recogidas usando huevos fértiles. Se sacrificaron 3 hurones de cada grupo de prueba los días 1, 3, 5 y 8 después de la inoculación viral y se midió la concentración viral en los tejidos pulmonares sacados, utilizando huevos fértiles.
Se molió cada tejido pulmonar usando un homogeneizador en PBS que incluía antibióticos (1 mL por cada gramo de tejido pulmonar) y luego se eliminó el sobrenadante después de la centrifugación.
Se recogió cada lavado nasal con 1 mL de PBS que incluía antibióticos, y luego se eliminó el sobrenadante después de la centrifugación, para medir la concentración viral. A continuación se diluyeron seriadamente los sobrenadantes del homogeneizado de tejido pulmonar o del lavado nasal, diez veces con PBS que incluía antibióticos, y luego se inocularon huevos fértiles de 10 a 13 días de puestos, con el sobrenadante diluido. Se incubaron las mezclas de 50 uL de fluido alantoico de los huevos fértiles incubados durante 48 horas y el mismo volumen de glóbulos rojos de la sangre al 0.5% (de pavo) durante 30 minutos, y luego se tituló el virus por la aglutinación de la sangre.
Aun cuando el título viral en el lavado nasal permaneció alto (>log10 4 EIDo/mL) hasta el día 5 después de la inoculación y disminuyó luego en el grupo de control, el título viral disminuyó significativamente en el grupo inyectado con CT120, y no se detectó el virus el día 8 después de la inoculación (figura 7). Así, se observó una eliminación viral más rápida en el grupo tratado con CT120 que en el grupo de control. Especialmente, se suprimió más significativamente el virus cuando se inyectó el anticuerpo diariamente durante los 3 días iniciales en el grupo de prueba 3.
El título viral en los tejidos pulmonares permaneció alto (>log 4.5 EID5o/mL) hasta el día 5 después del desafío, y luego disminuyó en el grupo de control; mientras que el título viral disminuyó notablemente en el grupo inyectado con CT120. No se detectó virus el día 8 después del desafío (figura 8). Especialmente el experimento en hurones demostró que se suprime más significativamente el virus en los grupos de prueba 2 y 3. Estos resultados demuestran que 30 mg/kg de CT120 suprimen más efectivamente la proliferación viral que la dosis de 15 mg/kg.
Claims (37)
1. Un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, que tiene actividad neutralizadora contra por lo menos un virus seleccionado del grupo que consiste de los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A.
2. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal es derivado de las células B presentes en la sangre de pacientes que se han recuperado de la infección con el virus de la influenza A.
3. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 1, en el que el virus de la influenza A tiene el subtipo H1N1.
4 Un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, que comprende las siguientes secuencias de polipéptido de cadena liviana y de cadena pesada, y un fragmento y una variante funcional de él: una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 1, SEQ. ID. NO. 7 y SEQ ID NO. 12; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 2; y una región CDR3 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 13; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una región CDR1 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO.4; SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO. 14; una región CDR2 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 15; y una región CDR3 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO.6, SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 16.
5. Un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, seleccionado del grupo que consiste de los siguientes anticuerpos monoclonales y un fragmento y una variante funcional de ellos: un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 1; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 2 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 3; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 4; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 5 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO.6; un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 7; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 2 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 8, y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 9, una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 10 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 11; y un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 12; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 2 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 13; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 14; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 15 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 16.
6. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo monoclonal comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO. 36 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO. 37.
7. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo monoclonal tiene una actividad neutralizadora contra los subtipos H1 y H5 del virus de la influenza A.
8. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo monoclonal comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 40 y una cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 41.
9. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo monoclonal tiene actividad neutralizadora contra los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A.
10. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo monoclonal comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO. 44 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO.45.
11. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 10, en el que el anticuerpo monoclonal tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H1 del virus de la influenza A.
12. Un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, que comprende las siguientes secuencias de polinucleótido de cadena liviana y de cadena pesada; y un fragmento o variante funcional de ellas: una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 23 y SEQ ID NO. 28; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 18 o SEQ ID NO. 29; y una región CDR3 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO.24 y SEQ ID NO.30; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 25 y SEQ ID NO. 31; una región CDR2 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 32; y una región CDR3 que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO.27 y SEQ ID NO 33.
13. Un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, seleccionado del grupo que consiste de los siguientes anticuerpos monoclonales y un fragmento o variante funcional de ellos: un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 17; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 18 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 19, y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 20, una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 21 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 22; un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 23; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO 18 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 24; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 25; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 26 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 27; y un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena liviana que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 28; una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 29 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 30; y una cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 31, una región CDR2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 32 y una región CDR3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 33.
14. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo monoclonal comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO. 34 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO.35.
15. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 14, en el que el anticuerpo monoclonal tiene actividad neutralizadora contra los subtipos H1 y H5 del virus de la influenza A.
16. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo monoclonal comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO. 38 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO.39.
17. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 16, en el que el anticuerpo monoclonal tiene actividad neutralizadora contra los subtipos H1, H2 y H5 del virus de la influenza A.
18. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo monoclonal comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO. 42, y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO.43.
19. El anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 18, en el que el anticuerpo monoclonal tiene actividad neutralizadora contra el subtipo H1 del virus de la influenza A.
20. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 y 5.
21. Un vector de expresión que tiene la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 20 insertada en él.
22. Una línea de células productoras del anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, que contiene el vector de expresión de la reivindicación 21, transfectado en una célula huésped.
23. La línea de células productoras del anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de la reivindicación 22, en el que la célula huésped es una seleccionada del grupo que consiste de célula CHO, células F2N y células HEK 293.
24. Un método para seleccionar un anticuerpo que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A en pacientes recuperados de la infección con el virus de la influenza A, comprendiendo el método los pasos de: 1) examinar si los pacientes infectados con el virus de la influenza A están completamente recuperados y seleccionar los pacientes que sean negativos para el virus de la influenza A en la sangre de los pacientes examinados; 2) recolectar sangre de los pacientes completamente recuperados seleccionados en el paso 1; 3) aislar las células B de la sangre de los pacientes recogida en el paso 2); 4) seleccionar las células B que produzca un anticuerpo de unión a HA (Hemaglutinina), de las células B aisladas en el paso 3); 5) extraer los ARN de las células B seleccionadas en el paso 4); 6) amplificar los genes de anticuerpo de los ARN extraídos en el paso 5); 7) clonar los genes amplificados en el paso 6), en vectores de expresión; 8) transfectar los vectores de expresión del paso 7) a células huésped; 9) examinar si las células huésped transfectadas, del paso 8) producen el anticuerpo que se une a HA; 10 cultivar la célula transfectada seleccionada del paso 9); 11) purificar los anticuerpos que se unen a la HA del virus de la influenza A, a partir de los cultivos de células transfectadas del paso 10); 12) reconfirmar si los anticuerpos purificados en el paso 11) tienen actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A; y 13) volver a seleccionar un anticuerpo que se ha confirmado que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A en el paso 12).
25. Una composición que comprende un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5, 12 y 13.
26. Una composición para prevenir y tratar una enfermedad provocada por un virus de la influenza A, que comprende un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5, 12 y 13.
27. Una composición para diagnosticar un virus de la influenza A, que comprende un conjugado que comprende una etiqueta conjugada a un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5, 12 y 13.
28. La composición de la reivindicación 27, en la que la etiqueta está seleccionada del grupo que consiste de: enzimas, luciferasas e isótopos radiactivos.
29. Un método para tratar una enfermedad provocada por un virus de la influenza A, comprendiendo el método un paso de administrar el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, de cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5, 12 y 13, a un sujeto que tenga la enfermedad.
30. El método de la reivindicación 29, en el que el virus de la influenza A tiene uno o más subtipos seleccionados del grupo que consiste de H1 , H2 y H5.
31. Un método para prevenir una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, comprendiendo el método un paso de administrar el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5, 12 y 13 a un sujeto.
32. Un método para diagnosticar una infección por virus de la influenza A en un paciente, comprendiendo el método los pasos de: 1) poner en contacto una muestra con el anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A, de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 4, 5, 12 y 13; y 2) Detectar una reacción entre el anticuerpo monoclonal y la muestra.
33. Un método para diagnosticar una infección por el virus de la influenza A en un paciente, comprendiendo el método los pasos de: 1) poner en contacto la muestra con una composición para diagnosticar el virus de la influenza A de la reivindicación 27; y 2) detectar una reacción entre el anticuerpo monoclonal y la muestra.
34. El método de la reivindicación 32 o 33, en el que el virus de la influenza A tiene uno o más subtipos, seleccionados del grupo que consiste de H1, H2 y H5.
35. Un equipo para diagnosticar un virus de la influenza A, que comprende: 1) un anticuerpo monoclonal contra el virus de la influenza A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5, 12 y 13; y 2) un contenedor.
36. Un equipo para diagnosticar un virus de la influenza A, que comprende: 1) una composición para detectar el virus de la influenza A de acuerdo con la reivindicación 27; y 2) un contenedor.
37. El equipo de la reivindicación 35 o 36, en el que el virus de la influenza A tiene uno o más subtipos seleccionados del grupo que consiste de H1, H2 y H5.
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