CN117715931A - 针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供能够简便且迅速、高灵敏度地检测作为COVID‑19的致病病毒的SARS‑COV‑2、能够抑制非特异性反应的抗体，还提供包含上述抗体的免疫学检测方法及试剂盒。提供使用能与SARS‑COV‑2的核衣壳蛋白结合的抗体或其片段、特别是识别该蛋白质的特定区域的抗体或其片段而特异性且高灵敏度的免疫学检测法及试剂盒，特别提供基于免疫层析法或ELISA法等夹心法的检测方法、以及包含该抗体的免疫层析试纸条及包含该试纸条的试剂盒。

Description

针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及针对SARS(严重急性呼吸系统综合征)冠状病毒2的核衣壳蛋白的抗体及其用途，例如，使用该抗体的SARS-CoV-2的免疫学检测方法以及使用该抗体的免疫层析试纸条及包含其的试剂盒。
背景技术
人源冠状病毒已鉴定出NL63、229E、OC43、HKU1这4种，占感冒原因的10％～15％。此外，还已知感染动物的冠状病毒，关于可从动物感染人类的冠状病毒，已知SARS(严重急性呼吸系统综合征)冠状病毒和2012年阿拉伯半岛所报告的MARS(中东呼吸系统综合征)冠状病毒。
近些年发生了新型冠状病毒导致的肺炎。已明确了该新型冠状病毒与SARS冠状病毒、MARS冠状病毒同样为源自动物的β冠状病毒。2020年2月，该新型冠状病毒被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2，该病毒所引起的疾病被WHO(世界卫生组织)命名为COVID-19(冠状病毒病2019)。
COVID-19的初期症状与流感、感冒相似，表现为发热、咳嗽、咽喉痛、头痛、乏力、呼吸困难等症状。另外，作为初期症状，还报告了味觉障碍、嗅觉障碍之类的临床表现。多数患者在发病起1周左右回复，但与无基础疾病的病例相比，老年人和患有恶性肿瘤、慢性阻塞性肺病、慢性肾病、肝病、肥胖、血脂异常、高血压、糖尿病的患者存在重症化比例高的倾向。另外，患有心脏病、慢性肺病、脑血管障碍、慢性肾病的病例存在死亡比例高的倾向。
据报道，作为后遗症，一部分患者在COVID-19发病起经过60天后也存在嗅觉异常、味觉异常、呼吸困难、乏力、咳嗽的症状，上述症状即使经过120天仍持续。
SARS-CoV-2所致感染仍然在继续，仍处于针对SARS-CoV-2的抗病毒药供给困难的状况。通过快速检测早期发现SARS-CoV-2感染者对于抑制合并症所致重症化也变得极为重要。另外，准确检测SARS-CoV-2感染对于区分COVID-19与其它呈感冒样症状的疾病而言也非常重要。
作为SARS-CoV-2的检测方法，主流是使用实时逆转录PCR法等的核酸检测法。但是，核酸检测法虽然检测灵敏度高，但是也存在检测时间长且使用专门设备、需要熟练操作者、成本高等问题。因此，为了早期发现感染者，期望简便且迅速、高灵敏度的检测方法。在此，作为比核酸检测法简便和迅速的检测方法，可列举使用免疫层析法的抗原检测法。
非专利文献1公开了：制作由SARS-CoV-2的核衣壳蛋白中第121位至第419位的氨基酸形成的C末端区域的核衣壳蛋白并免疫小鼠，由此获得针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的抗体。得到的3种抗体中，2种的表位被确定为SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的第210位至第231位的氨基酸及第382位至第397位的氨基酸。而剩余1种抗体的表位未确定，根据与SARS冠状病毒无交差反应性这一点，推测识别第335位至第348位的氨基酸。记载了：使用该获得的抗体制作免疫层析试纸条并进行评价，结果是，在rNP情况下至100pg/mL为止可反应，在SARS-CoV-2的情况下至5.5×105拷贝/mL为止可反应，PCR的Ct值则至27.1为止可反应。
非专利文献2公开了在售的检测SARS-CoV-2且使用免疫层析法的制品的非特异性反应。以包括通过抗原检测法确认为阳性的3人在内的57位住院患者和12位机构人员为对象，实施核酸检测法，结果所有人均被判定为阴性。另外，确认为阳性的3人的检测结果在第二天及以后均是抗原检测法为阳性、核酸检测法为阴性，因此报告为通过抗原检测法的非特异性反应造成的假阳性。据此，认为抗原检测法作为筛选是有用的，但是鉴于其假阳性的发生频率，在SARS-CoV-2的检测中更期望实施核酸检测法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：A.Ryo,et al.,Highly specific monoclonal antibodiesagainst SARS-CoV-2nucleocapsid antigen for accurate diagnosis of COVID-19,Cell Reports Medicine,29Oct.2020,p.33
非专利文献2：K.Itoh,H.Tsutani,et ai.,False positive results in severeacute respiratory coronavirus 2(SARS-CoV-2)rapid antigen tests forinpatients,Journal of Infection and Chemotherapy,22Mar.2021
发明内容
发明要解决的问题
但是，也考虑到筛查等，需要更高灵敏度、可靠性高、简便的抗原检测。
本发明的目的在于提供：使用能够简便、迅速且高灵敏度地检测作为COVID-19的致病病毒的SARS-CoV-2且充分地特异性地反应的抗体的免疫学检测方法；以及，包含该抗体的免疫层析试纸条及包含该试纸条的试剂盒。
用于解决问题的方案
本发明人鉴于上述背景进行了深入研究，结果获得了针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的抗体，从而完成了本发明。
本发明包括以下方式。
〔1〕一种SARS-CoV-2的检测方法，其为检测被检试样中所含的SARS-CoV-2的存在的方法，所述检测方法通过使用与上述SARS-CoV-2的核衣壳蛋白进行反应的抗体或其片段的免疫学测定方法来进行。
〔2〕根据〔1〕所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，上述免疫学测定方法包括使上述被检试样与上述抗体或其片段相接触的步骤。
〔3〕根据〔2〕所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，上述免疫学测定方法为使用2种不同的上述抗体或其片段的夹心法。
〔4〕根据〔3〕所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，上述夹心法为免疫层析法或ELISA法中的任意者。
〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，上述抗体或其片段选自下述(1)至(20)所述的抗体或其片段：
(1)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号2、3及4所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号5、6及7所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(2)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号8、9及10所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号11、12及13所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(3)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号14、15及16所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号17、18及19所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(4)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号20、21及22所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号23、24及25所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(5)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号26、27及28所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号29、30及31所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(6)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号32、33及34所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号35、36及37所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(7)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号38、39及40所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号41、42及43所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(8)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号44、45及46所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号47、48及49所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(9)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号50、51及52所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号53、54及55所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(10)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号56、57及58所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号59、60及61所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(11)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号62、63及64所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号65、66及67所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(12)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号68、69及70所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号71、72及73所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(13)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号74、75及76所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号77、78及79所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(14)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号80、81及82所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号83、84及85所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(15)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号86、87及88所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号89、90及91所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(16)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号92、93及94所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号95、96及97所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(17)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号98、99及100所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号101、102及103所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(18)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号104、105及106所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号107、108及109所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(19)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号110、111及112所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号113、114及115所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(20)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号116、117及118所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号119、120及121所示的氨基酸序列的抗体或其片段。
〔6〕根据〔1〕至〔4〕中任一项所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，上述被检试样为生物试样。
〔7〕一种SARS-CoV-2检测免疫层析试纸条，其具备能与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白反应的第一抗体或其片段、与上述核衣壳蛋白反应的第二抗体或其片段、和膜载体，上述第一抗体或其片段预先固定在上述膜载体的规定位置而形成捕捉部位，上述第二抗体或其片段用标记物质进行了标记且被设计成能够在与上述捕捉部位分离的位置在上述膜载体上层析展开。
〔8〕根据〔7〕所述的免疫层析试纸条，其中，上述第一抗体或其片段及第二抗体或其片段中的至少任一者为单克隆抗体或其片段。
〔9〕根据〔7〕或〔8〕所述的免疫层析试纸条，其中，上述单克隆抗体或其片段选自下述(1)至(20)所述的抗体或其片段：
(1)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号2、3及4所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号5、6及7所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(2)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号8、9及10所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号11、12及13所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(3)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号14、15及16所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号17、18及19所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(4)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号20、21及22所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号23、24及25所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(5)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号26、27及28所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号29、30及31所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(6)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号32、33及34所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号35、36及37所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(7)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号38、39及40所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号41、42及43所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(8)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号44、45及46所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号47、48及49所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(9)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号50、51及52所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号53、54及55所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(10)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号56、57及58所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号59、60及61所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(11)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号62、63及64所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号65、66及67所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(12)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号68、69及70所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号71、72及73所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(13)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号74、75及76所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号77、78及79所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(14)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号80、81及82所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号83、84及85所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(15)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号86、87及88所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号89、90及91所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(16)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号92、93及94所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号95、96及97所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(17)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号98、99及100所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号101、102及103所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(18)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号104、105及106所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号107、108及109所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(19)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号110、111及112所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号113、114及115所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(20)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号116、117及118所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号119、120及121所示的氨基酸序列的抗体或其片段。
〔10〕一种SARS-CoV-2检测用试剂盒，其至少包含〔7〕所述的SARS-CoV-2检测免疫层析试纸条和用于将被检体展开的展开溶剂。
〔11〕一种可与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合的抗体或其片段，其为用于检测被检试样中所含的SARS-CoV-2的存在的抗体或其片段。
〔12〕根据〔11〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体为单克隆抗体。
〔13〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号2、3及4所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号5、6及7所示的氨基酸序列。
〔14〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号8、9及10所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号11、12及13所示的氨基酸序列。
〔15〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号14、15及16所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号17、18及19所示的氨基酸序列。
〔16〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号20、21及22所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号23、24及25所示的氨基酸序列。
〔17〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号26、27及28所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号29、30及31所示的氨基酸序列。
〔18〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号32、33及34所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号35、36及37所示的氨基酸序列。
〔19〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号38、39及40所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号41、42及43所示的氨基酸序列。
〔20〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号44、45及46所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号47、48及49所示的氨基酸序列。
〔21〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号50、51及52所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号53、54及55所示的氨基酸序列。
〔22〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号56、57及58所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号59、60及61所示的氨基酸序列。
〔23〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号62、63及64所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号65、66及67所示的氨基酸序列。
〔24〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号68、69及70所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号71、72及73所示的氨基酸序列。
〔25〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号74、75及76所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号77、78及79所示的氨基酸序列。
〔26〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号80、81及82所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号83、84及85所示的氨基酸序列。
〔27〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号86、87及88所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号89、90及91所示的氨基酸序列。
〔28〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号92、93及94所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号95、96及97所示的氨基酸序列。
〔29〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号98、99及100所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号101、102及103所示的氨基酸序列。
〔30〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号104、105及106所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号107、108及109所示的氨基酸序列。
〔31〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号110、111及112所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号113、114及115所示的氨基酸序列。
〔32〕根据〔12〕所述的抗体或其片段，其中，上述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号116、117及118所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号119、120及121所示的氨基酸序列。
发明的效果
根据本发明，可以使用针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的抗体检测上述SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。另外，在免疫学检测中，可以抑制非特异性反应且高灵敏度地检测SARS-CoV-2。进而，可以提供能够特异地且高灵敏度地检测SARS-CoV-2的免疫层析试纸条及包含其的试剂盒。
附图说明
图1的a为免疫层析试纸条的俯视图、b为a所示的免疫层析试纸条的长边方向剖视图。
具体实施方式
本发明中，抗体的制造及使用该抗体的检测方法中的各步骤分别基于其本身、公知的免疫学方法来进行。
(抗体)
本发明的抗体可与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白特异性地结合，可以为多克隆抗体及单克隆抗体中任意者。
对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白特异性的多克隆抗体例如可以如下得到：将从SARS-CoV-2提取纯化而得的核衣壳蛋白、或在大肠杆菌中导入核衣壳蛋白的基因等并利用基因工程手段表达、提取纯化而得的核衣壳蛋白、或构成核衣壳蛋白的一部分的多肽作为免疫用抗原对动物进行免疫，从其抗血清中得到。
对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白特异性的单克隆抗体例如可以通过下述方法得到。首先，与上述同样地使用从SARS-CoV-2提取纯化而得的核衣壳蛋白、或利用基因工程手段表达、提取纯化而得的核衣壳蛋白、或构成核衣壳蛋白的一部分的多肽作为免疫用抗原，对小鼠、大鼠、兔子及鸡等动物进行免疫。对小鼠进行免疫的情况下，将经过免疫的动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，将得到的融合细胞用含有HAT的培养基进行选择后使其生长。使生长出的细胞的培养上清通过例如酶标记免疫法等与通过上述方法得到的核衣壳蛋白进行反应，由此筛选抗SARS-CoV-2抗体产生株。对小鼠以外的动物进行免疫的情况下，从用上述免疫用抗原进行了免疫的动物中摘出淋巴组织，对抗体基因进行扩增而制作抗体文库。然后，导入大肠杆菌，筛选阳性克隆。
另外，从融合细胞、B细胞提取RNA，基于提取出的RNA合成抗体基因的重链及轻链的cDNA。此时，合成的cDNA可以表达CDR区等免疫球蛋白分子的一部分。然后，将重链表达克隆及轻链表达克隆共导入哺乳动物细胞而在细胞中共表达重链及轻链，回收培养上清，由此也可以制作抗体。
本发明的抗体可以抗体本身、以及性能与该抗体实质上同等的针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的抗体片段及改变抗体中的任意者。上述抗体片段只要与本发明的抗体同样或同等地特异性识别SARS-CoV-2核衣壳蛋白，则可以为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv片段等或者V区、VH区或CDR区等免疫球蛋白分子的一部分。另外，上述改变抗体只要与本发明的抗体同等地特异性识别SARS-CoV-2核衣壳蛋白即可，作为其具体例，可列举：嵌合抗体或人源化抗体之类的动物种属改变的抗体、亚型改变的抗体、同种型改变的抗体、通过基因工程手段重组或合成的抗体、及以能够与2种抗原或不同的2种抗原决定簇中的任一者结合的方式通过基因工程手段重组而成的抗体等。
本发明的抗体可以识别由SARS-CoV-2的全长419个氨基酸(序列号1)形成的核衣壳蛋白。另外，本发明的抗体只要能够识别SARS-CoV-2的核衣壳蛋白即可，可以是识别由核衣壳蛋白的第41位的氨基酸至第186位的氨基酸形成的N末端结构域(NTD)者。另外，本发明的抗体可以是识别作为C末端结构域(CTD)的由第247位的氨基酸至第419位的氨基酸形成的区域者。
本发明中的识别N末端结构域(NTD)的抗体为：(1)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号2、3及4所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号5、6及7所示的氨基酸序列的抗体、(2)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号8、9及10所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号11、12及13所示的氨基酸序列的抗体、(3)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号14、15及16所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号17、18及19所示的氨基酸序列的抗体、(4)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号20、21及22所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号23、24及25所示的氨基酸序列的抗体、(5)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号26、27及28所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号29、30及31所示的氨基酸序列的抗体、(6)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号32、33及34所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号35、36及37所示的氨基酸序列的抗体、(7)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号38、39及40所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号41、42及43所示的氨基酸序列的抗体、(8)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号44、45及46所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号47、48及49所示的氨基酸序列的抗体、(9)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号50、51及52所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号53、54及55所示的氨基酸序列的抗体、(10)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号56、57及58所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号59、60及61所示的氨基酸序列的抗体、(11)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号62、63及64所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号65、66及67所示的氨基酸序列的抗体、(13)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号74、75及76所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号77、78及79所示的氨基酸序列的抗体、(17)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号98、99及100所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号101、102及103所示的氨基酸序列的抗体、(18)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号104、105及106所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号107、108及109所示的氨基酸序列的抗体、(20)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号116、117及118所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号119、120及121所示的氨基酸序列的抗体。
本发明中的识别C末端结构域(CTD)的抗体为：(12)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号68、69及70所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号71、72及73所示的氨基酸序列的抗体、(14)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号80、81及82所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号83、84及85所示的氨基酸序列的抗体、(16)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号92、93及94所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号95、96及97所示的氨基酸序列的抗体、(19)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号110、111及112所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号113、114及115所示的氨基酸序列的抗体。
本发明中的识别位于N末端结构域与C末端结构域之间的区域的抗体为：(15)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号86、87及88所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号89、90及91所示的氨基酸序列的抗体。
第一抗体为识别N末端结构域的抗体时，第二抗体可以为识别N末端结构域的抗体、识别C末端结构域的抗体、识别位于N末端结构域及C末端结构域之间的区域的抗体中的任意者。
第一抗体为识别C末端结构域的抗体时，第二抗体可以为识别N末端结构域的抗体、识别C末端结构域的抗体、识别位于N末端结构域及C末端结构域之间的区域的抗体中的任意者。
第一抗体为识别位于N末端结构域及C末端结构域之间的区域的抗体时，第二抗体可以为识别N末端结构域的抗体、识别C末端结构域的抗体、识别位于N末端结构域及C末端结构域之间的区域的抗体中的任意者。
(检测方法)
本发明另外还提供通过使用与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白特异性反应的抗体或其片段的免疫学测定方法来检测被检试样中所含的SARS-CoV-2的存在的方法。上述免疫学测定方法优选包括使被检试样与上述本发明的抗体或其片段相接触的步骤。根据本发明的检测方法，当被检试样包含SARS-CoV-2时，在上述接触工序中会形成上述抗体或其片段与SARS-CoV-2的复合体，因此例如通过定量或定性测定该复合体可以检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白、进而检测SARS-CoV-2。
本发明的检测方法中的上述复合体的检测只要为通常的免疫学测定方法，则可以采用任意种来进行。作为免疫学测定方法的具体例，可列举酶免疫测定法(ELISA法或EIA法)、荧光免疫测定法(FIA)、放射免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法(LIA)、酶抗体法、荧光抗体法、免疫层析法(immunochromatography method)、流穿法(flow-through method)、免疫比浊法、胶乳比浊法、胶乳凝集反应测定法、红细胞凝集反应法、或粒子凝集反应法等。特别地，作为本发明中的SARS-CoV-2核衣壳蛋白的免疫学测定方法，优选作为使用2种抗体或其片段的夹心法的ELISA法、免疫层析法及流穿法。ELISA法需要判定时间，但是灵敏度和定量性优异，且能够同时处理多个被检体。免疫层析法的灵敏度和定量性比ELISA法差，但是能够迅速且简便地进行检测。流穿法与免疫层析法相比操作繁杂，但是灵敏度和定量性可媲美ELISA法且能够迅速进行检测。
关于夹心法中使用的2种抗体或其片段，为了避免抗体之间的竞争反应且具有高反应性，优选2种抗体分别识别不同的表位。
本发明的免疫层析法典型情况下为如下免疫层析法：准备具备捕捉部位的膜载体，所述捕捉部位为将能够在抗原的第一抗原决定簇处进行抗原抗体反应的第一抗体预先固定在规定位置而形成的，使能够在上述抗原的第二抗原决定簇处进行抗原抗体反应且经过标记的第二抗体与规定量的被检试样的混合液向着上述捕捉部位在上述膜载体上层析展开，当上述被检试样中包含上述抗原时，将上述抗原与上述第二抗体的复合体捕捉到上述捕捉部位，本发明的免疫层析法可以通过使用本发明的抗体或其片段作为上述第一抗体及上述第二抗体而实施。
本发明中的被检试样没有特别限制，可列举鼻腔抽吸液、鼻腔擦拭液、鼻咽擦拭液、咽部擦拭液、喀痰、唾液、支气管肺泡灌洗液等可能存在SARS-CoV-2的生物试样。这些被检体的采集方法没有特别限定，可以通过公知的方法采集。例如，鼻腔擦拭液、鼻咽擦拭液、咽部头擦拭液的情况下，通常采用使用棉棒的方法。采集的被检试样在例如免疫层析法时可以直接添加到膜载体上，也可以用展开溶剂等适当的稀释液稀释后添加到膜载体上。进而，采集的被检试样也可以在使用过滤器进行过滤而除去被检试样中所含的源自生物成分的粘着物、固形物后添加到膜载体上。
在使用混有血液的被检试样时、特别是使用金胶体等显色标记物质作为标记抗体的标记物质时，优选预先在试样添加用构件中配置血细胞捕捉构件。由此可阻止红细胞在膜载体上展开，因此更容易确认膜载体的捕捉部位的显色标记的聚集。作为血细胞捕捉膜构件，可使用羧甲基纤维素膜，具体而言可以使用ADVANTEC TOYO KAISHA,LTD.销售的离子交换滤纸CM(商品名)、Whatman Japan销售的离子交换纤维素纸等。
(检测试剂盒)
本发明的检测方法可以通过依据免疫学测定方法的方式来实施，优选通过依据能够迅速且简便地实施的免疫层析法的方式来实施。免疫层析法可以依据公知的免疫层析试纸条的构成而容易地实施。
通常，免疫层析试纸条具备能够在作为抗原的SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的第一抗原决定簇处进行抗原抗体反应的第一抗体、能够在上述抗原的第二抗原决定簇处进行抗原抗体反应且经过标记的第二抗体、和膜载体，上述第一抗体预先固定在上述膜载体的规定位置而形成捕捉部位，上述第二抗体以能够在与上述捕捉部位分离的位置在上述膜载体上层析展开的方式配置而构成。第一抗体及第二抗体如上所述分别可以为多克隆抗体或单克隆抗体，优选任一者为单克隆抗体，更优选均为单克隆抗体。通常，第一抗原决定簇及第二抗原决定簇在抗原上的位置及结构均不同，第一抗体及第二抗体以“杂合”的组合来使用。
另外，核衣壳蛋白虽然与病毒内的RNA一起大量存在，但是为了避免抗体彼此的竞争反应、实现高反应性，优选第一抗体和第二抗体为识别存在于SARS-CoV-2核衣壳蛋白中的不同抗原决定簇的抗体。
作为免疫层析试纸条的例子，可列举图1所示者。图1为例示，条的形状、构成、使用构件的种类、结构不限于这些。图1中，数字1表示粘合片、2表示浸渗构件、3表示膜载体、4表示吸收用构件、5表示试样添加用构件、31表示捕捉部位、32表示对照捕捉部位。
例如，膜载体3使用宽5mm、长36mm的细长的条状硝酸纤维素制滤膜，在距离其层析展开开始点侧末端7.5mm的位置处固定有第一抗体，形成被检体的捕捉部位31。进而，在距离膜载体3的层析展开开始点侧的末端15mm的位置设置有照捕捉部位32，从而不论被检体是否存在均能够确认被检试样的层析展开正常进行。通常，可以通过将可与上述第二抗体以免疫学方式特异性结合的物质(被检体除外)固相化于膜载体3来形成对照捕捉部位32。例如，使用源自小鼠的抗体作为第二抗体时，可以通过使用针对小鼠抗体的抗体来形成对照捕捉部位32。
使用了硝酸纤维素制滤膜作为膜载体3，但是膜载体3只要能够对被检试样进行层析展开且能够固定第一抗体而形成上述捕捉部位31及上述对照捕捉部位32即可，也可以使用其它纤维素制膜、尼龙制膜、玻璃纤维膜等。
浸渗构件2由浸渗有第二抗体的构件构成，所述第二抗体在位于与上述第一抗体所结合的第一抗原决定簇不同的部位的第二抗原决定簇处与上述抗原进行抗原抗体反应，该第二抗体预先用适当的标记物质进行标记。
例如，在图示的例子中，作为浸渗构件2，使用了宽5mm、长15mm的玻璃纤维无纺布，但是不限于此，浸渗构件2也可以使用纤维素类布(滤纸、硝酸纤维素膜等)、聚乙烯或聚丙烯等多孔塑料类布等。
作为第二抗体的标记物质，可以为能使用的任意物质，可列举显色标记物质、酶标记物质、荧光标记物质、放射线标记物质等。其中，从能够通过肉眼来观察捕捉部位31处的颜色变化、从而迅速且简便地进行判定的角度出发，优选使用显色标记物质。
作为显色标记物质，可列举金胶体及铂胶体等金属胶体以及它们的复合金属胶体、用红色及蓝色等的颜料着色的聚苯乙烯胶乳等合成胶乳、天然橡胶胶乳等胶乳。这些中，特别优选金胶体等金属胶体。
该浸渗构件2可以通过使被上述标记物质标记的第二抗体的悬浮液浸渗于玻璃纤维无纺布等构件、并进行干燥等来制作。
图1中，将层析展开开始点侧设为“上游”、将展开溶剂的流动方向(吸收构件4侧)设为下游。将膜载体3贴合于粘合片1的中部，在该膜载体3的上游末端之上重叠并连接浸渗构件2的下游末端，并且将浸渗构件2的上游部分与粘合片1贴合，由此可以制作本发明的免疫层析试纸条。
另外，在膜载体3的下游部分的上表面上重叠并连接有吸收用构件4的上游末端，并且将该吸收用构件4的下游侧部分贴合于粘合片1。再按照浸渗构件2的上表面被试样添加用构件5的下游部分覆盖的方式进行配置，并且将该试样添加用构件5的上游部贴合于粘合片1。
吸收用构件4只要是能够快速吸收液体并保持的构件即可，可列举由棉布、滤纸及聚乙烯或聚丙烯等构成的多孔塑料无纺布等，滤纸最为适合。
试样添加用构件5可以使用多孔聚乙烯及多孔聚丙烯等多孔合成树脂的片或膜、以及滤纸及棉布等纤维素制纸或织造布或无纺布。
进而，图1的免疫层析试纸条可以收纳于适当的塑料制壳体内而提供，所述塑料制壳体在试样添加用构件5和捕捉部位31的上方分别形成被检试样注入部和判定部的开口。需要说明的是，从防止使用者的二次感染的目的出发，免疫层析试纸条优选收纳于塑料制壳体内而提供。
本发明的免疫层析试剂盒优选除了包含上述免疫层析试纸条以外还包含用于将被检体展开的展开溶剂。
展开溶剂也可以用作被检体稀释液，通常包含水作为溶剂，可以在该溶剂中添加选自缓冲液、无机盐、有机盐、表面活性剂、蛋白质、高分子化合物、聚阴离子、抗菌剂、螯合剂等中的1种或2种以上。
另外，也可以为了促进抗原抗体反应或抑制非特异性反应而添加表面活性剂、蛋白质、高分子化合物及聚阴离子。
特别地，在实施本发明时，为了有助于溶解构成SARS-CoV-2颗粒的由脂质双层膜构成的包膜、释放内包的核衣壳蛋白、使抗SARS-CoV-2抗体的抗原识别部位露出，优选在展开溶剂中含有非离子性表面活性剂。作为非离子性表面活性剂，可列举例如聚乙二醇单-对异辛基苯基醚、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、Brij(商标)35(商品名)等，可以添加1种或2种以上。
从而，在将包含生物试样等的被检试样根据需要与展开溶剂混合而得到可层析展开的混合液后，将该混合液添加到图1所示的免疫层析试纸条的试样添加用构件5处，则该混合液通过该试样添加用构件5并在浸渗构件2中与经过标记的第二抗体混合。此时，如果该混合液中存在被检体，则通过抗原抗体反应而形成被检体与第二抗体的复合体。
该复合体在膜载体3上层析展开并到达捕捉部位31，与此处固定的第一抗体发生抗原抗体反应，从而进行捕捉。使用金胶体等显色标记物质作为标记物质时，通过该显色标记物质的聚集而捕捉部位31显色，因此能够立即对被检体进行定性测定。进而，通过利用免疫层析酶标仪以光学方法读取聚集在免疫层析试纸条的捕捉部位31的该显色物质的显色强度，可以将显色强度数值化而进行定量测定。
另外，正常进行了层析展开时，未与被检体进行抗原抗体反应的第二抗体被固定化于对照捕捉部位32的针对第二抗体的抗体捕捉，与上述捕捉部位31同样地显色，因此可确认正常地进行了层析展开。另一方面，对照捕捉部位32未显色时，则可确认发生了第二抗体未能展开等问题。
在图示的免疫层析试纸条中，第二抗体浸渗于浸渗构件2而配置于膜载体3上，但是只要被设计成能够在与捕捉部位31分离的位置在膜载体3上展开的方式即可，不限于图示的方式。例如，也可以将第二抗体预先内包在为了将被检试样和展开溶剂混合而准备的管等容器内，并且与预定固定有第一抗体的膜载体3所构成的试纸条一起捆包。
实施例
通过下述实施例进一步具体地说明本发明，但是本发明不受该实施例限定。
(实施例1：重组核衣壳蛋白的表达及纯化)
将装配有SARS-CoV-2的核衣壳蛋白基因的质粒pcMV3-2019-nCov-NP-His(Sinobio)导入E.coli DH5α感受态细胞(宝生物)，在添加了卡那霉素的TB培养基培养一晚，由此扩增该质粒。将该扩增而得的质粒转化于293T细胞，7天后实施细胞的回收及裂解。对细胞溶解液进行超声波处理后，使用亲和柱进行纯化。将该纯化蛋白质相对于磷酸缓冲生理盐水(以下称为PBS)进行透析，作为目标重组核衣壳蛋白。
(实施例2：针对重组核衣壳蛋白的单克隆抗体的制作)
作为SARS-CoV-2的核蛋白，使用SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白NP(CUSABIO公司制)(以下称为SARS-CoV-2重组NP)及上述实施例1中制作的重组核衣壳蛋白。将各重组蛋白作为免疫用抗原而制作针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的单克隆抗体。对小鼠进行免疫的抗原通过事先将重组蛋白与等量的佐剂(日本BD)混合而制备。以达到100μg抗原量的方式将重组蛋白与佐剂的混合物多次免疫于小鼠(BALB/c、6周龄、日本SLC)，将其脾细胞用于细胞融合中。细胞融合中，使用作为小鼠骨髓瘤细胞的Sp2/0-Ag14细胞(Shulman等、1987)。细胞融合通过将小鼠的脾细胞与Sp2/0-Ag14细胞混合并添加聚乙二醇溶液(Sigma)来进行。融合细胞在HAT-RPMI[包含0.1mM次黄嘌呤钠、0.4μM氨基蝶呤及0.1mM胸苷的含血清RPMI]中培养，通过酶结合抗体法(ELISA)确认培养上清中的抗体产生。将抗体产生阳性细胞在HT-RPMI[包含0.1mM次黄嘌呤钠及0.1mM胸苷的含血清RPMI]中培养，再在含血清培养基中接着培养。
(实施例3：单克隆抗体的制备)
将实施例2中克隆的细胞接种于事先接种了2,6,10,14-四甲基十五烷(KISHIDACHEMICAL)的小鼠(BALB/c、RETIRE、Charles River Laboratories Japan)的腹腔内。然后从小鼠采集腹水，供于蛋白G柱而纯化单克隆抗体。
最终，获得了产生针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的单克隆抗体的活细胞83个克隆。
(实施例4：抗SARS-CoV-2抗体的氨基酸分析)
对于实施例3中得到的抗SARS-CoV-2抗体中的10个克隆进行了互补决定区(CDR)分析。培养实施例2中制作的产生单克隆抗体的活细胞，从规定数量的细胞中纯化RNA。以纯化而得的RNA为模板，使用低聚dT引物及SuperScript(商标)III逆转录酶(ThermoFisherSCIENTIFIC)而合成cDNA。然后使用抗体恒定区特异性序列3’反向引物而扩增可变区序列后，实施序列分析。将轻链的序列插入T载体后进行转化，纯化T质粒，由此实施序列分析。将通过序列分析而解读出的DNA序列用IMGT/V-QUEST、VBASE2、IGBLAST这3个程序进行分析，确认CDR的鉴定结果一致。将CDR序列的分析结果示于表1。需要说明的是，本领域技术人员知晓，本发明中，表1所示的各抗体的CDR序列只要同样或同等地识别SARS-CoV-2核衣壳蛋白则可以缺失、置换或添加1个或多个氨基酸。
[表1]
获得的抗SARS冠状病毒2抗体的重链和轻链的cDR序列
(实施例5：抗SARS-CoV-2抗体的反应性试验)
进行了实施例3中得到的抗SARS-CoV-2抗体的反应性试验。为了评价抗体的反应性，制作以规定浓度将作为重组蛋白的SARS-CoV-2重组NP、人冠状病毒229E(由ATCC获得的VR-740株)、人冠状病毒OC43(由ATCC获得的VR-1558株)固相化而成的微型板。向各固相化的微型板中添加实施例3中制作的各抗体，在室温下反应1小时。反应结束后，将孔内的溶液抽吸除去后，添加辣根过氧化物酶标记抗小鼠抗体，反应1小时。然后添加作为显色底物的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺溶液进行反应，通过2当量硫酸使反应停止。使用酶标仪测定反应停止后的微型板的各孔中的450nm吸光度。将其结果示于表2。
[表2]
抗SARS冠状病毒2抗体的反应性试验
由表2可确认，实施例3中制作的抗SARS-CoV-2抗体对作为重组蛋白的SARS-CoV-2重组NP显示高反应性，与作为阴性对照的人冠状病毒229E及OC43不发生交叉反应。因此表明，获得的抗SARS-CoV-2抗体与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白特异性结合。
进一步，使用由位于序列号1所示的SARS-CoV-2核衣壳蛋白的N末端的第41位至第186位的氨基酸构成的重组核衣壳蛋白(CUSABIO)及由位于C末端的第220位至第419位的氨基酸构成的重组核衣壳蛋白(CUSABIO)通过上述方法进行反应性试验。将其结果示于表3。
[表3]
由表3可确认，实施例3中制作的抗体与位于N末端的第41位至第186位的氨基酸所构成的重组核衣壳蛋白反应。该结果表明，获得的抗SARS-CoV-2抗体识别SARS-CoV-2核衣壳蛋白的N末端区域、特别是位于N末端起第41位至第186位的氨基酸所构成的区域的表位。
(实施例6：针对抗SARS-CoV-2的抗体的解离速率常数的计算)
实施了实施例3中制作的抗体各自的针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的解离常数(Kd)的计算。Kd值使用Fortebio公司生产的BLItz System(商品名)，通过生物层干涉法来计算。作为生物传感器芯片，使用固相化有抗小鼠IgG Fv抗体者。
作为测定准备，将上述生物传感器芯片在200μL的缓冲液中浸渍10分钟，由此实施传感器芯片的水合。
为了测定抗体的解离常数，将该生物传感器芯片用缓冲液清洗30秒，校正为初期值。然后将实施例3中获得的抗体溶液调整为100nM，使该抗体溶液4μL与生物传感器芯片反应，用120秒将抗SARS-CoV-2抗体固相化在生物传感器芯片的表面。然后，为了除去未结合的抗体，用缓冲液清洗30秒。接着，使调整为100nM的SARS-CoV-2重组NP4μL对固相化于生物传感器芯片表面的抗SARS-CoV-2抗体进行120秒相互作用而实施抗原抗体反应后，用缓冲液清洗120秒，测定抗体的结合能力。测定结束后计算解离常数。将计算出的各抗体的结合速率常数、解离速率常数及解离常数示于表4。
[表4]
表4表明，此次得到的抗体中结合力最弱的抗体的解离常数为2.0nM，结合力最强的抗体的解离常数为38pM。该结果表明，此次获得的抗体对SARS-CoV-2重组NP具有2.0nM以下的解离常数。
(实施例7：源自兔子的针对SARS-CoV-2的免疫细胞试样的制备)
使用作为SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的SARS-CoV-2重组NP来作为免疫用抗原，从兔子进行采血，由此获得免疫细胞。对兔子进行免疫的抗原通过事先将重组蛋白与等量的佐剂(日本BD)混合而制备。以达到500μg的抗原量的方式将SARS-CoV-2重组NP与佐剂的混合物多次免疫于兔子，进行采血及脾的摘出。从采集的全血中，通过离心分离仅分离回收外周血单核细胞(PBMC)，由此制作PBMC试样。另外，摘出的脾通过过滤而进行细胞化，作为兔子脾试样。
(实施例8：源自兔子的的抗SARS-CoV-2抗体基因的获得)
为了从实施例7中制备的兔子脾试样中分离针对SARS-CoV-2的淋巴细胞，使用作为分离溶液的淋巴细胞分离液1077(PromoCell公司)进行密度离心法，从兔子脾试样中进行淋巴细胞级分的分取，由此制备淋巴细胞试样。为了从PBMC试样及淋巴细胞试样中分取与SARS-CoV-2重组NP反应的B细胞，使各试样与荧光标记SARS-CoV-2核衣壳蛋白反应。使用细胞分选仪(索尼公司)测定与经荧光标记的核衣壳蛋白反应的B细胞，将确认了反应性的细胞通过单细胞分选而一个细胞一个细胞地分取到微型板中。对于分取而得的细胞，进行单细胞RT-PCR，进行单克隆抗体的基因获取。由此获得合计200个克隆的抗体基因。
(实施例9：Fab抗体基因的序列分析)
对实施例8中获得的抗体基因中的10个克隆进行了抗体基因的重链及轻链的DNA序列分析。将各自的编码可变区的cDNA导入pRSET载体，通过桑格法分析其DNA序列。然后以得到的DNA序列为基础进行氨基酸序列及Fab抗体的CDR的分析。从经分析的DNA序列中，使用IMGT/V-QUEST、VBASE2、IGBLAST这3个程序进行CDR分析，确认所鉴定的CDR是一致的。将CDR序列的分析结果示于表5。需要说明的是，本领域技术人员知晓，本发明中，表5所示的各抗体的CDR序列只要同样或同等地识别SARS-CoV-2核衣壳蛋白则可以缺失、置换或添加1个或多个氨基酸。
[表5]
源自兔子的抗SARS-CoV-2 Fab抗体的重链和轻链的CDR序列
根据表5，TN02、TN06、TN09的CDR序列仅1至2个氨基酸不同，重链及轻链CDR是类似的，因此可判断这些抗体在抗原上识别的表位相同。
(实施例10：通过无细胞表达系统制作Fab抗体及反应性试验)
在实施例8中获得的10个克隆的抗体基因中添加无细胞表达用的启动子序列及核糖体结合序列而制作模板。使用各模板通过PUREfrex(商标)2.0(GENEFRONTIER公司)进行无细胞转录翻译偶联反应，由此进行抗SARS-CoV-2Fab抗体的蛋白质表达。此时，为了设定为最适合形成二硫键的条件而添加DsbC Set(GENEFRONTIER公司)。由此获得抗SARS-CoV-2Fab抗体。然后，对得到的抗SARS-CoV-2Fab抗体进行反应性评价。此时，抗体使用了即将H链用HA标签标记者。为了评价抗体的反应性，制作了以规定浓度将获得的SARS-CoV-2重组NP固相化而成的微型板。在该微型板中，使经HA标签标记的规定浓度的抗SARS-CoV-2Fab抗体进行反应后，使标记有针对抗体的HA标签的辣根过氧化物酶的抗HA标签抗体进行反应。然后，添加作为显色底物的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液并使其反应，通过2当量的硫酸使反应停止。使用酶标仪测定反应停止后的微型板的各孔的450nm吸光度。
另外，评价了抗SARS-CoV-2Fab抗体的表达量。具体而言，将得到的标记有HA标签的抗SARS-CoV-2Fab抗体以反应性评价中使用的规定浓度的5倍浓度固相化于微型板。使标记有针对固相化的抗体的H链上所添加的HA标签的辣根过氧化物酶的抗HA标签抗体进行反应。然后，添加作为显色底物的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液而进行反应，通过2当量的硫酸使反应停止。使用酶标仪测定反应停止后的微型板的各孔的450nm吸光度。然后，以百分率来计算单位表达量的反应性，作为反应率。由于反应性评价和表达量评价中所使用的抗体浓度不同，因此将测定结果用抗体浓度进行校正而计算反应率。将其结果示于表6。
[表6]
兔子来源抗SARS-CoV-2Fab抗体的反应性评价
根据表6，在对SARS-CoV-2重组NP的吸光度高的抗体中，也确认到抗体的表达量多、反应率低的抗体。另一方面，在针对核衣壳蛋白的吸光度低的抗体中，也确认到抗体表达量少、具有高反应率的抗体。实际上，即使是反应率低的抗体，在抗体的表达量多时表观上反应性也变高。
另外，在表5中被判断为类似的TN02、TN06、TN09中，反应率最高的抗体是TN09，因此选择了3种抗体中的TN09来实施此后的试验。
进而，使用由位于序列号1所示的SARS-CoV-2核衣壳蛋白的N末端的第41位至第186位的氨基酸构成的重组核衣壳蛋白(CUSABIO)及由位于C末端的第220位至第419位的氨基酸构成的重组核衣壳蛋白(CUSABIO)进行反应性试验。向固相化有重组核衣壳蛋白的微型板中添加表达的各Fab抗体，在室温下反应1小时。反应结束后，将孔内的溶液抽吸除去后，添加标记有辣根过氧化物酶的抗兔子抗体，反应1小时。然后，添加作为显色底物的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺溶液而进行反应，通过2当量的硫酸使反应停止。使用酶标仪测定反应停止后的微型板的各孔的450nm吸光度。如实施例9的表5所示，TN02及TN06的CDR序列与TN09的CDR序列类似，表明这3种抗体与相同的表位结合。因此，本试验中仅对反应率最高的TN09的反应区域进行评价。将其结果示于表7。
[表7]
源自兔子的抗SARS-CoV-2 Fab抗体的反应区域的评价
根据表7，使用源自兔子的的基因而表达的抗体中，TN01、TN03、TN07、TN08及TN10与位于N末端的第41位至第186位的氨基酸所构成的重组核衣壳蛋白反应，因此表明其识别位于序列号1的第41位至第186位的氨基酸序列区域的表位。另一方面，TN04及TN09与位于C末端的第220位至第419位的氨基酸所构成的重组核衣壳蛋白反应，因此表明其识别位于序列号1的第220位至第419位的氨基酸序列区域的表位。TN05与任意重组核衣壳蛋白均不反应。因此，表明其识别不属于上述氨基酸序列的位置的表位、即识别第187位至第219位的氨基酸序列。
(实施例11：使用抗SARS-CoV-2抗体的免疫层析试纸条的制作)
将实施例3中纯化出的抗SARS-CoV-2抗体及实施例10中制作的抗SARS-CoV-2Fab抗体用于免疫层析试纸条的制作。
(1)铂-金胶体颗粒溶液的制备
将使用的玻璃器具全部用王水清洗。将390mL超纯水添加到烧瓶中使其沸腾，向该沸腾的水中加入氯金酸水溶液(每1升水溶液以金计为1g、片山化学工业株式会社制)30mL，然后添加1重量％柠檬酸钠水溶液60mL。在添加柠檬酸钠水溶液起6分45秒后，加入氯铂酸水溶液(每1升水溶液以铂计为1g、和光纯药工业株式会社制)30mL。进而在该操作5分钟后，添加1重量％柠檬酸钠水溶液60mL，进行4小时回流，得到铂-金胶体悬浮液。
(2)铂-金胶体标记抗SARS-CoV-2抗体溶液的制备
对于实施例3中得到的各抗SARS-CoV-2抗体，通过以下步骤进行铂-金胶体标记。
将抗SARS-CoV-2抗体的蛋白质换算重量1μg(以下在表示蛋白换算重量时，以基于该纯化蛋白质的重量分析的重量数值来示出)和上述(1)中制备的铂-金胶体悬浮液1mL混合，在室温下静置4分钟而使抗SARS-CoV-2抗体结合到铂-金胶体颗粒的表面。然后以相对于整体液量而言最终浓度为0.5％的方式加入5％BSA水溶液，将铂-金胶体颗粒的残余表面用BSA封闭，由此制备铂-金胶体标记抗SARS-CoV-2抗体溶液。然后对该溶液进行离心分离(5600×g、25分钟)，使铂-金胶体标记抗体沉淀，除去上清，由此获得铂-金胶体标记抗体。将获得的铂-金胶体标记抗体悬浮于含有10％蔗糖、1％BSA、0.5％Triton-X100的50mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)，作为铂-金胶体标记抗体溶液。
(3)SARS-CoV-2检测免疫层析试纸条的制作
在制作免疫层析试纸条时，准备作为层析展开用膜载体的硝酸纤维素膜、作为铂-金胶体标记抗体浸渗构件的玻璃纤维无纺布、作为试样添加用构件的棉布、作为吸收用构件的滤纸。免疫层析用滤膜如下制作：在距离层析展开用膜载体的层析展开开始点侧的末端7.5mm的位置处，通过抗体涂布装置(武藏工程)以线状涂布含有抗SARS-CoV-2抗体1.0mg/mL的溶液0.5μL，在室温下干燥，从而制作。
然后，使铂-金胶体标记抗体溶液37.5μL浸渗于玻璃纤维无纺布，冷冻干燥，由此制作铂-金胶体标记抗体浸渗构件。
使用上述所制作的层析展开用膜载体及标记抗体浸渗构件、试样添加用构件、吸收用构件制作与图1相同的免疫层析试纸条。
(实施例12：使用免疫层析试纸条的、对重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白的反应性试验)
以各种组合将实施例3中得到的抗SARS-CoV-2抗体作为固相化于膜载体的第一抗体(固相化抗体)及作为铂-金胶体标记抗体的第二抗体(标记抗体)，通过实施例11中记载的方法制作免疫层析试纸条，实施反应性试验。通过15分钟后判定部有无显色来进行试纸条的评价。显色的结果以无显色(-)、微弱显色(±)、充分显色(+)、显著显色(++)这4个阶段来示出。通常得到微弱显色时，为可以通过目视来确认显色的水平。
(1)第二抗体(标记抗体)使用TAU002、第一抗体(固相化抗体)使用TAU001或TAU004的免疫层析试纸条的反应性试验
通过实施例11中记载的方法对抗SARS-CoV-2抗体TAU002进行铂-金胶体标记，将TAU001或TAU004固相化于膜载体。使用这些制作免疫层析试纸条，向制作的试纸条滴加作为抗原的4ng/mL的SARS-CoV-2重组NP 901μL，由此评价反应性。将其结果示于表8。
[表8]
使用TAU002作为标记抗体的反应性评价
根据表8的结果，在使用TAU002作为铂-金胶体标记抗体的情况下，通过将TAU001及TAU004固相化于膜载体而得到显色，因此表明能够检测SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。还确认，根据标记抗体及固相化抗体的组合的不同，反应性也产生微弱差异。
(2)第二抗体(标记抗体)使用TAU003、第一抗体(固相化抗体)使用TAU001或TAU004的免疫层析试纸条的反应性试验
通过实施例11中记载的方法对抗SARS-CoV-2抗体TAU003进行铂-金胶体标记，将TAU001或TAU004固相化于膜载体。使用这些制作免疫层析试纸条，向制作的试纸条上滴加作为抗原的4ng/mL的SARS-CoV-2重组NP 90μL，由此评价反应性。将其结果示于表9。
[表9]
使用TAU003作为标记抗体的反应性评价
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根据表9的结果，在使用TAU003作为铂-金胶体标记抗体的情况下，通过将TAU001及TAU004固相化于膜载体而得到显色，因此表明能够检测SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。如果与通过同样的方法实施了试验的表8进行对比，表明通过使用TAU003作为标记抗体可提高检测灵敏度。
(3)第二抗体(标记抗体)使用TAU004、第一抗体(固相化抗体)使用TAU001、TAU002、TAU003、TAU005、TAU006的免疫层析试纸条的反应性试验
通过实施例11中记载的方法对抗SARS-CoV-2抗体TAU004进行铂-金胶体标记。然后将TAU001、TAU002、TAU003、TAU005或TAU006固相化于膜载体。使用这些制作免疫层析试纸条，向制作的试纸条上滴加作为抗原的4ng/mL的SARS-CoV-2重组NP 90μL，由此评价反应性。将其结果示于表10。
[表10]
使用TAU004作为标记抗体的反应性评价
根据表10的结果，在使用TAU004作为铂-金胶体标记抗体的情况下，通过将任意抗SARS-CoV-2抗体固相化于膜载体，均得到了显色，因此表明任意组合均能够检测SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。另外，表明通过将TAU004用作铂-金胶体标记抗体，可以与各种抗体组合使用。与通过同样的方法实施了试验的上述表9相比，表明通过将TAU004用作标记抗体，能够在提高检测灵敏度的状态下与各种抗体组合。
(4)第二抗体(标记抗体)使用TAU005、第一抗体(固相化抗体)使用TAU001或TAU004的免疫层析试纸条的反应性试验
通过实施例11中记载的方法对抗SARS-CoV-2抗体TAU005进行铂-金胶体标记，将TAU001或TAU004固相化于膜载体。使用这些制作免疫层析试纸条，向制作的试纸条上滴加作为抗原的4ng/mL的SARS-CoV-2重组NP 90μL，由此评价反应性。将其结果示于表11。
[表11]
使用TAU004作为标记抗体的反应性评价
根据表11的结果，在使用TAU005作为铂-金胶体标记抗体的情况下，通过将TAU001及TAU004固相化于膜载体而得到显色，因此表明能够检测SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。但是，与上述表9的使用TAU003的情况为同等程度。
(5)第二抗体(标记抗体)使用TAU006、第一抗体(固相化抗体)使用TAU001或TAU004的免疫层析试纸条的反应性试验
通过实施例11中记载的方法对抗SARS-CoV-2抗体TAU005进行铂-金胶体标记，将TAU001或TAU004固相化于膜载体。使用这些制作免疫层析试纸条，向制作的试纸条上滴加作为抗原的4ng/mL的SARS-CoV-2重组NP 90μL，由此评价反应性。将其结果示于表12。
[表12]
使用TAU006作为标记抗体的反应性评价
根据表12的结果，在使用TAU006作为铂-金胶体标记抗体的情况下，通过将TAU001及TAU004固相化于膜载体而得到显色，因此表明能够检测SARS-CoV-2的核衣壳蛋白，使用TAU006的情况下，与使用上述TAU002作为标记抗体时得到了同样的结果。
根据实施例12所示的结果可确认，从实施例3中得到的抗SARS-CoV-2抗体中选择2种抗体制作免疫层析试纸条时，在各种抗体组合情况下均确认到显色。另外表明，根据抗体的组合的不同，能够以更高的灵敏度检测SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。还表明，通过使用TAU004作为固相化抗体即第一抗体或作为标记抗体即第二抗体中的任意者，能够与各种抗体组合，能够高灵敏度地检测SARS-CoV-2。
(实施例13：使用被检体的免疫层析试纸条的反应性评价)
通过实施例11中记载的方法对实施例10中制作的抗SARS-CoV-2抗体进行铂-金胶体标记，将不同的抗SARS-CoV-2抗体固相化于膜载体，由此制作免疫层析试纸条。向制作的试纸条上，滴加作为生物试样的阳性被检体90μL，由此评价反应性。此时，作为被检体种类，使用鼻咽擦拭液被检体及唾液被检体。试纸条的评价通过15分钟后判定部有无显色来进行，显色的结果通过无显色(-)、微弱显色(±)、充分显色(+)、显著显色(++)这4个阶段来进行判定。将其结果示于表13及表14。
[表13]
使用鼻咽阳性被检体的、基于抗体组合的反应性评价
[表14]
使用唾液阳性被检体的、基于抗体组合的反应性评价
根据表13及表14，在使用任一被检体种类时，在多种组合情况下均确认到显色。通常认为，使用唾液被检体时，相较于鼻咽被检体而言更难检测。但是，在使用唾液被检体情况下，通过将本发明的抗体组合，也能够检测被检体中所含的SARS-CoV-2核衣壳蛋白。该结果表明，通过使用实施例10中得到的抗SARS-CoV-2抗体的免疫层析试纸条，在使用唾液被检体时，也与鼻咽被检体同样地具有检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白的性能。
通过与上述同样的方法，以各种组合使用实施例3及实施例10中制作的SARS-CoV-2抗体，通过免疫层析法进行测定，由此评价免疫层析试纸条的性能。试纸条的评价通过15分钟后判定部有无显色来进行，显色的结果通过无显色(-)、微弱显色(±)、充分显色(+)、显著显色(++)这4个阶段来进行判定。将其结果示于表15至表23。此时，使用的被检体使用SARS-CoV-2阳性鼻咽被检体。
[表15]
使用TAU007作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表16]
使用TAU008作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表17]
使用TN01作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表18]
使用TN03作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表19]
使用TN04作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表20]
使用TN05作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表21]
使用TN08作为第二抗体(标记抗体)的
免疫层析试纸条的反应性评价
[表22]
使用TN09作为第二抗体(标记抗体)的
免疫层析试纸条的反应性评价
[表23]
使用TN10作为第二抗体(标记抗体)的
免疫层析试纸条的反应性评价
根据表15至表23的结果，即使将任意抗体用作第二抗体，在各种抗体的组合的情况下均确认到显色。将TAU007用作第二抗体时，第一抗体优选TAU008、TN03、TN05、TN07、TN08、TN09。
将TAU008用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TN01、TN03、TN04、TN05、TN07、TN08、TN09、TN10。
将TN01用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN04、TN05、TN09、TN10。
将TN03用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN04、TN05、TN09、TN10。
将TN04用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN01、TN03、TN05、TN07、TN08、TN09、TN10。
将TN05用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN01、TN03、TN04、TN07、TN08、TN10。
将TN08用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN04、TN05、TN09。
将TN09用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN01、TN03、TN04、TN07、TN08、TN10。
将TN10用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN01、TN03、TN04、TN05、TN07、TN09。
这些结果表明，通过所得到的抗体的各种组合，能够检测鼻咽被检体中所含的抗原。
进而，对SARS-CoV-2阳性唾液被检体，以各种组合使用实施例3及实施例8中制作的SARS-CoV-2抗体，通过免疫层析法进行测定，由此评价免疫层析试纸条对唾液被检体的性能。试纸条的评价通过15分钟后判定部有无显色来进行，显色的结果通过无显色(-)、微弱显色(±)、充分显色(+)、显著显色(++)这4个阶段来进行判定。将其结果示于表24至表32。
[表24]
使用TAU007作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表25]
使用TAU008作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表26]
使用TN01作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表27]
使用TN03作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表28]
使用TN04作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表29]
使用TN05作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表30]
使用TN08作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表31]
使用TN09作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
[表32]
使用TN10作为第二抗体(标记抗体)的免疫层析试纸条的反应性评价
根据表24至表32的结果，在使用唾液被检体时，即使将任意抗体用作第二抗体，在各种抗体的组合的情况下也均确认到显色。将TAU007用作第二抗体时，第一抗体优选TAU008、TN03、TN05、TN07、TN08、TN09。
将TAU008用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TN01、TN03、TN04、TN05、TN07、TN08、TN09、TN10。
将TN01用作第二抗体时，第一抗体优选TN04、TN05、TN09、TN10。
将TN03用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN04、TN05、TN09、TN10。
将TN04用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN01、TN03、TN05、TN07、TN08、TN09、TN10。
将TN05用作第二抗体时，第一抗体优选TAU008、TN01、TN03、TN04、TN07、TN08、TN10。
将TN08用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN04、TN05、TN09。
将TN09用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN01、TN03、TN04、TN07、TN08、TN10。
将TN10用作第二抗体时，第一抗体优选TAU007、TAU008、TN01、TN03、TN04、TN05、TN07、TN09。
这些结果表明，能以得到的抗体的各种组合来检测唾液被检体中所含的抗原。另外，也出现了在基于抗体组合的显色强度方面使用鼻咽被检体时与使用唾液被检体时观察到差异的组合。但是，不论被检体种类属如何，记载的全部的抗体组合均能够检测被检体中所含的SARS-CoV-2核衣壳蛋白。该结果表明，通过将本发明的抗体组合，能够高灵敏度地检测鼻咽被检体及唾液被检体中所含的SARS-CoV-2核衣壳蛋白。
(实施例14：使用阴性被检体的免疫层析试纸条的非特异性的反应性评价)
通过实施例11中记载的方法对抗SARS-CoV-2抗体TAU004进行铂-金胶体标记，作为第二抗体，将TAU005作为第一抗体而固相化于膜载体，制作免疫层析试纸条。向制作的试纸条上滴加作为生物试样的阴性被检体90μL，由此评价反应性。此时，作为被检体种类，使用鼻咽擦拭液被检体及唾液被检体，分别实施50例。试纸条的评价通过15分钟后判定部有无显色来进行。显色的结果通过无显色(-)、微弱显色(±)、充分显色(+)、显著显色(++)这4个阶段来示出，得到微弱显色时，判定为非特异性性反应。将其结果示于表33。
[表33]
鼻咽被检体和唾液被检体的非特异性反应的评价
根据表33的结果，向制作的免疫层析试纸条滴加各种被检体种类的阴性被检体时，50个被检体全部为确认到显色。该结果表明，不论被检体种类属如何，使用TAU004及TAU005的免疫层析试纸条均未确认到由与被检体成分的交叉反应导致的非特异性性反应。
对于这些被检体，实施基于日本国立感染症研究所开发出的基因检测法(SARS-CoV-2基因检测·病毒分离手册Ver.1.1)的核酸扩增法(PCR法)，结果确认50个被检体全部为阴性。
(实施例15：使用临床被检体的免疫层析试纸条的反应性评价)
以临床疑似SARS-CoV-2感染的患者为对象，利用灭菌棉棒擦拭患者的鼻咽而采集鼻咽擦拭液。将采集了鼻咽擦拭液的棉棒在被检体提取液中进行提取而制备被检试样。然后使用与实施例14同样制作的免疫层析试纸条而实施被检试样中的SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的检测。需要说明的是，作为对照，使用与本发明的抗体不同的抗体，使用作为制品销售的ImunoAce(商标)SARS-CoV-2(抗原定性检测试剂盒、TAUNS)。另外，对于采集的临床被检体，实施基于国立感染症研究所开发出的基因检测法(SARS-CoV-2基因检测·病毒分离手册Ver.1.1)的核酸扩增法(PCR法)，确认SARS-CoV-2的存在。将使用各被检试样的免疫层析的目视判定结果及被检试样的PCR法中的Ct值示于表34。试纸条的评价通过15分钟后判定部有无显色来进行，显色的结果通过无显色(-)、微弱显色(±)、充分显色(+)、显著显色(++)这4个阶段来示出。关于PCR法的结果，对于不能检测出者记作ND，将能检测出者记载Ct值。
[表34]
根据表34的结果，在ImunoAce(商标)SARS-CoV-2的情况下，10个被检体中，有3个被检体确认到显色。另一方面，使用实施例14中制作的试验板对同一被检体进行反应，结果在5个被检体中确认到显色。通过ImunoAce(商标)SARS-CoV-2未能检测的2个被检体的Ct值为33.63及24.08。该结果表明，实施例14中制作的试验板与已作为制品在销售的抗原检测试剂盒相比，检测灵敏度提高。另外，临床被检体3的显色强度也升高，因此表明检测灵敏度提高。关于用PCR未检测到的临床被检体1及9，在使用任一试验板情况下均未确认到显色，因此推测与被检体中所含的其它成分的交叉反应性低。
(实施例16：使用唾液被检体的免疫层析试纸条的反应性评价)
通过实施例12中记载的方法对抗SARS-CoV-2抗体TAU008进行铂-金胶体标记，作为第二抗体，将TAU007作为第一抗体而固相化于膜载体，由此制作免疫层析试纸条。以临床疑似SARS-CoV-2感染的患者为对象，将患者吐出的唾液吸收到灭菌棉棒中而进行采集，将采集了唾液的棉棒在被检体提取液中进行提取，作为所制作的免疫层析试纸条的被检试样。同时，用灭菌棉棒擦拭同一患者的鼻咽而采集鼻咽擦拭液。将采集了鼻咽擦拭液的棉棒在被检体提取液中进行提取，作为ImunoAce(商标)SARS-CoV-2(TAUNS)的被检试样。使用所制备的各被检试样，实施ImunoAce(商标)SARS-CoV-2(TAUNS)及制作的免疫层析试纸条对被检试样中所含的SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的性能评价。此时，作为对照，使用ImunoAce(商标)SARS-CoV-2(TAUNS)。另外，对于采集的临床被检体，实施基于国立感染症研究所开发出的基因检测法(SARS-CoV-2基因检测·病毒分离手册Ver.1.1)的核酸扩增法(PCR法)，确认SARS-CoV-2的存在。将使用各被检试样的免疫层析的目视判定结果及被检试样的PCR法中的Ct值示于表35。试纸条的评价通过15分钟后判定部有无显色来进行，显色的结果通过无显色(-)、微弱显色(±)、充分显色(+)、显著显色(++)这4个阶段来表示。关于PCR法的结果，未能检测出者记载为ND，能检测到者记载Ct值。
[表35]
由同一患者采集的鼻咽被检体与唾液被检体的比较
根据表35，使用鼻咽被检体的ImunoAce(商标)SARS-CoV-2中，30个被检体中，18个被检体确认到显色。另一方面，使用实施例16中制作的试纸条对同一被检者的唾液被检体进行反应，结果30个被检体中，21个被检体确认到显色。该结果表明，使用唾液被检体时，也与使用鼻咽被检体时同样能够进行检测。另外，在鼻咽中所含的病毒量多、唾液中所含的病毒量少的被检者25及30中，本实施例中制作的试纸条的显色强。这些结果表明，本实施例中制作的试纸条与已作为制品销售的抗原检测试剂盒相比，检测灵敏度提高。另外，通过PCR未能检测到的被检体中，使用本实施例中制作的免疫层析试纸条时也未确认到显色，因此推测检测灵敏度提高且能够抑制非特异性显色。
产业上的可利用性
根据本发明，提供针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的抗体、使用该抗体的SARS-CoV-2的免疫学检测方法及试剂盒。由此，不需要特殊的设备及熟练的技术也能够迅速且特异性地检测SARS-CoV-2的感染。
附图标记说明
1 粘合片
2 浸渗构件
3 膜载体
31 捕捉部位
32 对照捕捉部位
4 吸收用构件
5 试样添加用构件
序列表
<110> 滋吾堂有限公司（TAUNS Laboratories, Inc.）
<120> 针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的抗体及其用途（ANTIBODY AGAINSTNUCLEOCAPSID PROTEIN OF SARS-CoV-2 AND USE OF SAME）
<130> IFP-1612
<160> 121
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2（SARS CORONAVIRUS 2）
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 2
Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Phe Ile
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 3
Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 4
Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Phe Tyr Ala Met Asp His
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 5
Gln Asn Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 6
Leu Val Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 7
Cys Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 8
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 9
Ile Asn Thr Glu Thr Asn Glu Ser
1 5
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 10
Gly Ser Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 11
Glu Asn Ile Tyr Ser Thr
1 5
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 12
Ala Ala Thr
1
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 13
Gln His Phe Trp Gly Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 14
Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr Ser
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 15
Val Asn Thr Glu Thr Ala Asp Pro
1 5
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 16
Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Asn Thr His Asp Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 17
Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
1 5
<210> 18
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 18
Leu Ala Thr
1
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 19
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 20
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 21
Ile Asn Pro Asn His Gly Gly Thr
1 5
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 22
Ala Arg Ser Gly Asn Phe Ile Thr Thr Val Gly Gly Leu Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 23
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Thr Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 24
Trp Ala Ser
1
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 25
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 26
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 27
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 28
Ala Arg Asn Tyr Ala Asn Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 29
Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
1 5
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 30
Thr Ala Thr
1
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 31
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 32
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Gly
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 33
Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 34
Ala Arg Arg Gly Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Val Tyr
1 5 10 15
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 35
Glu Asn Ile Tyr Gly Asn
1 5
<210> 36
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 36
Thr Ala Thr
1
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 37
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 38
Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 39
Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 40
Ala Arg Asp Asp Asn Phe Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 41
Gln Ser Val Ser Thr Ser Thr Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 42
Tyr Ala Ser
1
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 43
Gln His Thr Trp Asp Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 44
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 45
Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 46
Ala Ser Ser Ala Tyr Tyr Gly Asn Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 47
Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
1 5
<210> 48
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 48
Val Ala Thr
1
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 49
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 50
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Gly
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 51
Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 52
Ala Ser Ser Ala Tyr His Gly Asn Trp Phe Leu Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 53
Glu Asn Val Tyr Gly Asn
1 5
<210> 54
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 54
Val Ala Thr
1
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 55
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 56
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 57
Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 58
Ala Arg Asp Gly Asn Phe Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 59
Gln Ser Ile Ser Thr Ser Asp Tyr Ile Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 60
Tyr Ala Ser
1
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 61
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 62
Gly Phe Asp Phe Ser Ser Gln Asn Tyr
1 5
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 63
Ile Tyr Thr Val Ser Gly Glu Thr
1 5
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 64
Ala Arg Ser Pro Val Lys Arg Ile Gly Val Asp Met Thr Arg Leu Asp
1 5 10 15
Leu
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 65
Gln Ser Val Phe Ser Asp Asn Tyr
1 5
<210> 66
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 66
Tyr Ala Ser
1
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 67
Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ile Asn Val
1 5 10
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 68
Gly Phe Asp Phe Ser Ser Asp Ile
1 5
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 69
Ile Val Ile Asp Thr Thr Thr Thr
1 5
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 70
Ala Arg Ala Phe Ser Leu
1 5
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 71
Glu Ser Val Val Val Asn Tyr
1 5
<210> 72
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 72
Gln Ala Ser
1
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 73
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Phe Pro
1 5 10
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 74
Gly Phe Asp Leu Asn Asn Tyr Gln Tyr
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 75
Ile Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Thr
1 5
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 76
Ala Arg Asp Val Tyr Val Gly Tyr Ala Gly Tyr Ala Tyr Ala Leu Asn
1 5 10 15
Leu
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 77
Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Leu
1 5
<210> 78
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 78
Lys Ala Ser
1
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 79
Leu Gly Gly Val Asp Asp Asp Ala Asp Pro Asn Thr
1 5 10
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 80
Gly Ile Asp Phe Thr Asn Tyr Asp
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 81
Ile Leu Ala Gly Ser Ser Gly Gly Pro
1 5
<210> 82
<211> 13
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 82
Ala Gly Ser Gly Tyr Arg Asn Ser Phe Tyr Phe Gly Leu
1 5 10
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 83
Ser Val Tyr Gly Asn Asn Tyr
1 5
<210> 84
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 84
Gln Ala Ser
1
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 85
Gln Gly Thr Tyr Trp Ser Asp Asp Trp Tyr Asn Val
1 5 10
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 86
Gly Phe Asp Phe Ser Thr Ser Ala
1 5
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 87
Ile Asp Thr Gly Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 88
<211> 6
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 88
Ala Arg Asp Phe Val Leu
1 5
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 89
Ser Val Tyr Asp Ser Gln Val
1 5
<210> 90
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 90
Lys Ala Ser
1
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 91
Ala Gly Ala Tyr Ser Gly Asn Val Val Ala
1 5 10
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 92
Gly Phe Asp Phe Ser Gly Asp Ile Ala
1 5
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 93
Ile Val Val Asp Thr Thr Thr Thr
1 5
<210> 94
<211> 6
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 94
Ala Arg Ala Phe Ser Leu
1 5
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 95
Glu Ser Val Ala Val Asn Tyr
1 5
<210> 96
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 96
Glu Thr Ser
1
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 97
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Asp Phe Pro
1 5 10
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 98
Gly Phe Asp Leu Ser His Phe Phe Tyr
1 5
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 99
Ile Glu Thr Ala Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 100
<211> 18
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 100
Ala Arg Ser Ile Tyr Thr Gly Thr Tyr Ala Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu
1 5 10 15
Asn Leu
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 101
Lys Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr
1 5
<210> 102
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 102
Gly Ala Ser
1
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 103
Ala Gly Gly Tyr Ser Thr Ser Ser Asp Asn Gly
1 5 10
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 104
Gly Phe Ser Phe Asn Asn Lys His Tyr
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 105
Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Thr Thr
1 5
<210> 106
<211> 14
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 106
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Ser Tyr Gly Tyr Ala Tyr Asp Ile
1 5 10
<210> 107
<211> 6
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 107
Glu Asp Ile Tyr Ser Leu
1 5
<210> 108
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 108
Ser Ala Ser
1
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 109
Gln Cys Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala
1 5 10
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 110
Gly Phe Asp Phe Ser Ser Asp Val
1 5
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 111
Ile Val Ile Asp Thr Thr Thr Thr
1 5
<210> 112
<211> 6
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 112
Ala Arg Thr Phe Ser Leu
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 113
Glu Ser Val Val Val Lys Tyr
1 5
<210> 114
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 114
Gln Ala Ser
1
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 115
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Phe Pro
1 5 10
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 116
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 117
Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 118
Ala Gly Asp Glu Asp Tyr Trp Asp Leu
1 5
<210> 119
<211> 6
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 119
Gln Asn Ile Tyr Ser Asn
1 5
<210> 120
<211> 3
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 120
Gly Thr Ser
1
<210> 121
<211> 12
<212> PRT
<213> 兔子（Rabbit）
<400> 121
Gln Ser Ala Tyr Tyr Ser Ser Thr Ser Ser Trp Thr
1 5 10

Claims (32)

1.一种SARS-CoV-2的检测方法，其为检测被检试样中所含的SARS-CoV-2的存在的方法，所述检测方法通过使用与所述SARS-CoV-2的核衣壳蛋白进行反应的抗体或其片段的免疫学测定方法来进行。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，所述免疫学测定方法包括使所述被检试样与所述抗体或其片段相接触的步骤。
3.根据权利要求2所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，所述免疫学测定方法为使用2种不同的所述抗体或其片段的夹心法。
4.根据权利要求3所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，所述夹心法为免疫层析法或ELISA法中的任意者。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，所述抗体或其片段选自下述(1)至(20)所述的抗体或其片段：
(1)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号2、3及4所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号5、6及7所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(2)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号8、9及10所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号11、12及13所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(3)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号14、15及16所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号17、18及19所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(4)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号20、21及22所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号23、24及25所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(5)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号26、27及28所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号29、30及31所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(6)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号32、33及34所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号35、36及37所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(7)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号38、39及40所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号41、42及43所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(8)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号44、45及46所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号47、48及49所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(9)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号50、51及52所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号53、54及55所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(10)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号56、57及58所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号59、60及61所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(11)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号62、63及64所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号65、66及67所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(12)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号68、69及70所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号71、72及73所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(13)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号74、75及76所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号77、78及79所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(14)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号80、81及82所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号83、84及85所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(15)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号86、87及88所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号89、90及91所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(16)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号92、93及94所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号95、96及97所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(17)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号98、99及100所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号101、102及103所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(18)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号104、105及106所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号107、108及109所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(19)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号110、111及112所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号113、114及115所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(20)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号116、117及118所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号119、120及121所示的氨基酸序列的抗体或其片段。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的SARS-CoV-2的检测方法，其中，所述被检试样为生物试样。
7.一种SARS-CoV-2检测免疫层析试纸条，其具备能与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白反应的第一抗体或其片段、与所述核衣壳蛋白反应的第二抗体或其片段、和膜载体，所述第一抗体或其片段预先固定在所述膜载体的规定位置而形成捕捉部位，所述第二抗体或其片段用标记物质进行了标记且被设计成能够在与所述捕捉部位分离的位置在所述膜载体上层析展开。
8.根据权利要求7所述的免疫层析试纸条，其中，所述第一抗体或其片段及第二抗体或其片段中的至少任一者为单克隆抗体或其片段。
9.根据权利要求7或8所述的免疫层析试纸条，其中，所述单克隆抗体或其片段选自下述(1)至(20)所述的抗体或其片段：
(1)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号2、3及4所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号5、6及7所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(2)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号8、9及10所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号11、12及13所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(3)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号14、15及16所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号17、18及19所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(4)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号20、21及22所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号23、24及25所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(5)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号26、27及28所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号29、30及31所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(6)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号32、33及34所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号35、36及37所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(7)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号38、39及40所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号41、42及43所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(8)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号44、45及46所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号47、48及49所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(9)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号50、51及52所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号53、54及55所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(10)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号56、57及58所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号59、60及61所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(11)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号62、63及64所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号65、66及67所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(12)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号68、69及70所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号71、72及73所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(13)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号74、75及76所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号77、78及79所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(14)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号80、81及82所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号83、84及85所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(15)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号86、87及88所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号89、90及91所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(16)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号92、93及94所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号95、96及97所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(17)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号98、99及100所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号101、102及103所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(18)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号104、105及106所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号107、108及109所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(19)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号110、111及112所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号113、114及115所示的氨基酸序列的抗体或其片段、
(20)重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号116、117及118所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号119、120及121所示的氨基酸序列的抗体或其片段。
10.一种SARS-CoV-2检测用试剂盒，其至少包含权利要求7所述的SARS-CoV-2检测免疫层析试纸条和用于将被检体展开的展开溶剂。
11.一种可与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合的抗体或其片段，其为用于检测被检试样中所含的SARS-CoV-2的存在的抗体或其片段。
12.根据权利要求11所述的抗体或其片段，其中，所述抗体为单克隆抗体。
13.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号2、3及4所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号5、6及7所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号8、9及10所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号11、12及13所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号14、15及16所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号17、18及19所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号20、21及22所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号23、24及25所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号26、27及28所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号29、30及31所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号32、33及34所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号35、36及37所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号38、39及40所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号41、42及43所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号44、45及46所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号47、48及49所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号50、51及52所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号53、54及55所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号56、57及58所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号59、60及61所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号62、63及64所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号65、66及67所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号68、69及70所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号71、72及73所示的氨基酸序列。
25.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号74、75及76所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号77、78及79所示的氨基酸序列。
26.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号80、81及82所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号83、84及85所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号86、87及88所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号89、90及91所示的氨基酸序列。
28.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号92、93及94所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号95、96及97所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号98、99及100所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号101、102及103所示的氨基酸序列。
30.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号104、105及106所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号107、108及109所示的氨基酸序列。
31.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号110、111及112所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号113、114及115所示的氨基酸序列。
32.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号116、117及118所示的氨基酸序列且轻链的CDR1、CDR2及CDR3分别包含序列号119、120及121所示的氨基酸序列。
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