KR20210134452A - Covid-19 바이러스에 대한 면역글로불린 g 신속검출기술 - Google Patents

Covid-19 바이러스에 대한 면역글로불린 g 신속검출기술 Download PDF

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Abstract

본 발명은 COVID-19 바이러스에 대한 항체 보유 여부 조사나 COVID-19 바이러스에 대한 노출 동향을 모니터링하는 목적으로 활용할 수 있는, 재조합 COVID-19 바이러스 항원과 항-인간 면역글로불린 G 항체를 이용한 면역크로마토그래피법에 기반한 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 검출하는 신속검출기술 및 신속검출 진단키트에 관한 것이다.

Description

COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출기술{Rapid Detection Method of COVID-19 Immunoglobulin G}
본 발명은 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 검출하는 신속검출기술에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 재조합 COVID-19 바이러스 항원과 항-인간 면역글로불린 G 항체를 이용한 면역크로마토그래피법에 기반한 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 기술 및 이에 활용될 수 있는 신속검출 진단키트에 관한 것이다.
최근 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2; 이하 ‘COVID-19 바이러스’라 함)에 의한 감염질환 (코로나바이러스감염증-19; 이하 ‘COVID-19’라 함)이 전세계적으로 큰 문제가 되고 있다.
COVID-19는 2019년 11월 중국 후베이성 우한시에서 시작된 이래 전세계적으로 확산되면서 보건사회적 뿐만 아니라 경제적으로도 큰 문제를 초래하고 있다. COVID-19는 Coronaviridae에 속하는 RNA 바이러스인 SARS-CoV-2, 즉 COVID-19 바이러스 감염에 의한 호흡기 감염증을 의미한다. 전파경로로는 비말 (침방울) 및 접촉을 통해 전파된다고 알려져 있으며, 상세하게는 기침이나 재채기를 할 때 생긴 비말을 통해 전파되거나 COVID-19 바이러스에 오염된 물건을 만진 뒤 눈, 코, 입을 만져서 전파된다고 알려져 있다.
COVID-19 바이러스의 잠복기는 1~14일 (평균 4~7일)이며, 검체에서 COVID-19 바이러스가 분리되거나 검체에서 COVID-19 바이러스의 특이 유전자가 검출될 때 감염이 되었다고 진단한다. COVID-19에 의해 나타나는 일반적인 증상으로는 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증까지 다양한 호흡기 감염증이 있으며, 그 외에 가래, 인후통, 두통, 객혈과 오심, 설사 등도 나타난다.
현재까지 알려진 치료법으로는 수액 보충, 해열제 등의 대증 치료가 보조수단으로 사용되고 있으나, COVID-19 바이러스에 대응 가능한 백신이나 항바이러스제는 개발되지 않은 상황이다. 세계보건기구 (World Health Organization; WHO)에 의하면 COVID-19로 인한 전세계 치명률은 약 3.4%이며, 고령, 면역기능이 저하된 환자, 기저질환을 가진 환자들이 주로 중증에 걸리거나 사망에 이르게 된다.
아직도 COVID-19가 확산 일로에 있지만 우리는 다시 일상을 준비할 필요가 있다. 이러한 측면에서 COVID-19에 노출된 이력이 있어 COVID-19 바이러스에 대한 항체를 가지고 있는 사람들을 신속하고 정확하며 용이하게 판별 및 구분할 수 있는 기술이 필요하다. 이는 COVID-19 바이러스에 대한 방어력을 가진 사람들을 선별하기 위해서도 필요하며, 방역 측면에서 COVID-19 바이러스에 노출된 사람의 분포 정도를 모니터링하여 적절한 정책을 수립하기 위해서도 필요하다.
한편, 방어면역 측면을 개략적으로 파악하거나 방역 정책 수립을 위해서는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 (Immunoglobulin)을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술이 필요하다. 면역글로불린 중에서도 면역글로불린 M (Immunoglobulin M; IgM)은 감염 초기에만 검출될 수 있는 면역글로불린이므로 그 활용성이 제한적이다. 반면, 면역글로불린 G (Immunoglobulin G; IgG)는 항체 중 큰 비율을 차지하며, 감염 초기부터 생성되기 시작하여 감염 후기까지 지속적으로 증가하므로 면역글로불린 G를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 진단기술 및 진단키트의 개발은 매우 중요하다.
한편, 면역글로불린 G는 폴리클로날 항체 (Polyclonal antibody)이므로 위양성 (False-positive)과 위음성 (False-negative)의 문제 발생 가능성이 높아 검출 정확도가 높은 진단기술 및 진단키트의 개발이 필요하다. 이에 더하여 바이러스 변종에 대한 대비도 가능하다면 더욱 바람직하다 할 것이다.
이에, COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 신속검출하는 기술로서, 본 발명자들은 재조합 COVID-19 바이러스 항원과 항-인간 면역글로불린 G 항체를 이용한 면역크로마토그래피법 (Immunochromatography)에 기반한 항원 처리된 2개의 검사선 (Test line)을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 검출하는 신속검출기술을 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 검출하는 신속검출기술을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 검출하는 신속검출기술을 구현하는 데에 활용될 수 있는, 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출용 진단키트를 제공하는 것이다.
상기 목적들을 달성하고자, 본 발명의 발명자들은 공지의 정보를 활용하여 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 검출하는 목적으로 활용될 수 있는 COVID-19 바이러스 특이 항원 (Antigen)들을 확보하고, COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 검출하는 목적으로 활용될 수 있는 항-인간 면역글로불린 G 항체를 확보하고, 상기 확보한 COVID-19 바이러스 특이 항원들과 항-인간 면역글로불린 G 항체를 이용하여 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 목적의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 검출용 진단키트를 개발하였고, 상기 검출용 진단키트가 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 신속하게 검출하는 데에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G를 검출하는 데에 활용될 수 있는 COVID-19 바이러스 특이 항원으로 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 COVID-19 바이러스 특이 항원 단백질을 제공한다. 상기 COVID-19 바이러스 특이 항원 단백질들은 통상의 재조합 단백질 제조기술을 이용하여 자체적으로 제조하여 이용할 수도 있고 또한 상업적으로 구입하여 활용할 수도 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1내지 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 특징지어지는 COVID-19 바이러스 특이 항원을 활용하여 제작되어진, 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트를 제공한다.
본 발명의 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트에 포함되는 항-인간 면역글로불린 G 항체는 자체적으로 제조하여 이용할 수도 있고 또한 상업적으로 구입하여 활용할 수도 있다.
본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트는 면역크로마토그래피법에 기반하여 작동하는 검출용 진단키트이다.
본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드 (Sample pad), 면역글로불린 G 감지용 접합체 패드 (Conjugate pad), COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 캡쳐용 항원이 고정된 멤브레인 (Membrane) 및 액체 시료를 흡수할 수 있는 흡수 패드 (Adsorbent pad; absorption pad)가 순차적으로 연결된 구조를 포함한다.
본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트에서 상기 “샘플 패드”는 분석을 행할 생물학적 시료를 수용하여 확산 흐름이 가능한 패드를 의미하며, 분석을 행할 생물학적 시료를 수용하여 함유하기에 충분한 다공성을 갖는 물질로 구성된다. 이러한 다공성 물질로는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세 가공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 천연발생의 면 (Cotton), 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트에서 상기 “접합체 패드”는 샘플 패드로부터 확산되어 이동되는 시료를 수용하며, 동시에 나노입자와 항체가 연결된 “나노입자-항체 콘쥬게이트”가 포함되어 있는 패드이다. 접합체 패드는 샘플 패드와 마찬가지로 확산 흐름이 가능한 물질로 구성된다. 이러한 물질로는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세 가공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 천연발생의 면, 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트에서 상기 “멤브레인”은 시료 물질이 통과할 수 있는 어떠한 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드 (예: 셀룰로오스 물질, 종이, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO4, 또는 다른 무기 미분 물질; 자연 발생 (예: 면) 및 합성 (예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드; 등의 물질로부터 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 멤브레인은 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 및 폴리프로필렌을 포함한다.
본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트에서 상기 “흡수패드”는 상기 멤브레인의 말단에 또는 그 가까이에 인접해서 위치할 수 있다. 흡수 패드는 일반적으로 전체 멤브레인을 통해 이동하는 유체 시료를 받아들인다. 흡수 패드는 멤브레인을 통한 모세관 작용 및 유체의 확산 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트는 상기한 샘플 패드, 접합체 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 동일한 지지체상에 순차적으로 연결되어 구성된다.
상기 지지체는 상기한 샘플 패드, 접합체 패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 지지 및 운반할 수 있다면 어떠한 물질로도 형성될 수 있으나, 일반적으로 상기 멤브레인을 통해 확산하는 시료의 유체가 지지체를 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성인 것이 바람직하다. 예컨대, 유리; 중합체 물질, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트에서 상기 멤브레인 상에는 상기 접합체 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 항원이 처리된 2개의 검사선 및 시료가 전개되었다는 것을 확인하기 위한 대조선이 순차적으로 형성되어 있다.
본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 유무 판정, COVID-19 바이러스에 노출된 이력이 있는 사람들에 대한 모니터링 목적으로 활용될 수 있다.
본 명세서에서 COVID-19 바이러스는 2019년 11월 중국 후베이성 우한시에서 시작된 바이러스 감염의 원인 바이러스를 지칭하나, 이에 국한되지 않고 이로부터 변형된 변종 바이러스까지를 포함한다.
본 발명에 따른 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트를 활용하면 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 보유 여부를 신속하게 그리고 높은 정확도로 판정할 수 있다. 본 발명에 따른 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트는 항원 처리된 2개의 검사선을 가지고 있어 위양성 (False-positive) 발생을 낮출 수 있고, 특히 2개의 검사선에 코팅하는 항원의 종류를 달리할 경우에는 다양한 에피토프 (Epitope)를 제공해 줄 수 있어 폴리클로날 (Polyclonal) 면역글로불린 G 검출에 있어 검출 성공 확률을 높여줄 수 있으면서 추가적으로 위양성 발생 가능성을 획기적으로 낮추어 줄 수 있다. 즉, 폴리클로날 항체 검출에 있어 특히 장점을 제공해 줄 수 있다. 또한, 서로 다른 종류의 항원으로 처리된 2개의 검사선은 COVID-19 바이러스 변종에 대한 항체 검사에서도 위음성 (False-negative) 발생을 낮출 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 진단키트에서는 검사선에는 항원을 처리하고 골드 콘쥬게이트 (Conjugate)에는 항체를 처리하는 방식으로 구현된다. 통상적으로 검사선 처리에 사용되는 성분이 골드 콘쥬게이트에 결합하는 성분보다 진단키트 제작에 있어 재료적으로 많은 양이 사용된다. 본 발명은 항체와 비교하여 제조에 있어 상대적으로 적은 비용이 소요되는 항원을 검사선 처리용 성분으로 채택함으로써 진단키트의 제조비용을 낮출 수 있다는 이점을 가진다. 이는 산업적 활용에 있어 매우 중요한 요소라 할 수 있다. 또, 골드 콘쥬게이트에 결합하는 성분을 항원으로 하지 않고 항체로 함으로써 본 발명의 진단키트에서는 시그널 (Signal)의 강도 (Intensity)를 보다 높일 수 있다. 골드 콘쥬게이트에 결합하는 성분을 항원으로 하게 되면 항원 처리된 골드 콘쥬게이트가 면역글로불린 G 외에도 면역글로불린 M 등에도 결합하게 되어 결과적으로 골드 콘쥬게이트 (발색체)의 낭비를 초래하게 되어 시그널의 약화가 초래될 수 있다.
도 1은 본 발명의 항원 처리된 2개의 검사선을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 목적의 검출용 진단키트의 구조도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 동일 종류의 항원 처리된 2개의 검사선을 갖는, COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 목적의 검출용 진단키트의 결과 예시이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: COVID -19 바이러스 특이 항원 제조 및 항체 확보
COVID-19 바이러스 특이 항원은 서열번호 1 [COVID-19 spike protein S1 subunit (이하 ‘S1 단백질 (S1 protein)’이라 함)], 서열번호 2 [COVID-19 spike protein S1 subunit의 receptor binding domain (이하 ‘S1’ 단백질 (S1’ protein)’이라 함)], 서열번호 3 [COVID-19 spike protein S2 subunit (이하 ‘S2 단백질 (S2 protein)’이라 함)], 또는 서열번호 4 [COVID-19 nucleocapsid protein (이하 ‘N 단백질 (N protein)’이라 함)]의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 통상의 재조합 단백질 생산법으로 제조하여 확보하든지 상업적으로 구입하여 사용하면 된다. 재조합 단백질로의 제조는 통상적으로 흔히 이용되는 대장균, 동물세포, 곤충세포 등을 사용하여 제작할 수 있는데, 본 실시예에서는 예시로 대장균을 사용한 서열번호 4의 N 단백질 제조를 제시한다. 물론 이에 국한되지 않음은 당업자에게 당연하다. 본 실시예의 N 단백질 제조에서는 용이한 분리정제를 위하여 C-말단에 His-tag이 붙은 형태로 제조했으며 서열번호 8의 유전자 서열을 이용하여 발현 플라스미드를 제작하여 사용하였다. S1 단백질의 발현에서는 서열번호 5의 유전자 서열을, S1’ 단백질의 발현에서는 서열번호 6의 유전자 서열을, S2 단백질의 발현에서는 서열번호 7의 유전자 서열을 이용하면 된다.
COVID-19 바이러스의 N 단백질을 발현시키기 위해, 서열번호 8의 유전자 서열을 이용하여 발현 플라스미드를 제작하였다. 이때 C-말단에 히스티딘 표지 (Histidine tag)가 도입되게 유전자를 합성하여 이용하였다. 합성된 유전자는 pIBA-3KN vector로 클로닝 하였고, 이렇게 제작한 발현 플라스미드를 이용하여 통상의 방법대로 대장균 Top10 (DH10B competent cell, Thermo Fisher Scientific)을 형질전환시켜 생산균주 TOP10-pIBA3KN-NP를 제작하였다. 이러한 과정은 당업자에게 자명하므로 상세한 설명은 생략한다. 이렇게 제작한 균주를 생산균주로 하여 N 단백질 제조를 다음과 같이 실시하였다.
50 μg/ml 카나마이신이 포함된 LB배지 (트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L) 20 ml에 TOP10-pIBA3KN-NP를 20 μl 첨가하여 접종한 다음 37℃에서 한밤 동안 진탕 배양하였다. 다음날, 50 μg/ml 카나마이신이 포함된 LB배지 0.2 L에 한밤 배양한 배양액을 1/100 부피비로 첨가하였다. 220 rpm의 교반속도로, 37℃ 온도 조건에서 배양을 실시하였다. 세포 농도가 600 nm에서의 흡광도 기준으로 0.5가 되었을 때, 최종 농도가 0.2 μg/mL이 되도록 언하이드로테트라사이클린 (Anhydrotetracycline)을 첨가하여 COVID-19 바이러스의 N 단백질의 발현을 유도한 후에 3시간 배양을 추가 실시하였다.
배양 종료 후, 세포 배양액을 취하여 7,000 rpm에서 15분간 4℃에서 원심분리하여 세포 침전물을 회수하였고, 회수한 세포 침전물은 20 ml의 buffer A (20 mM Tris-Cl, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, pH 7.9)에 부유시켰다. 이렇게 준비된 세포 부유액을 초음파 분쇄법을 이용하여 세포를 파쇄하였고, 상기 초음파 분쇄법은 3초간 초음파를 가하여 세포를 깨고, 3초간 멈추는 조건을 총 15분간 반복하여 실시하며, 이는 얼음조 (Ice bath)에서 실시하였다.
세포 파쇄 후에 세포 파쇄액을 7,000 rpm에서 15분간 4℃에서 원심분리하여 얻어진 상등액을 통상의 히스티딘-친화 크로마토그래피 (Histidine affinity chromatography) 정제 공정을 통하여 정제하였다.
정제 공정을 간단히 설명하면 다음과 같다. 히스티딘-친화 수지로 5 ml의 HisTrapTM HP (GE Healthcare사)를 사용하였다. 크로마토그래피는 칼럼을 Buffer A (20 mM Tris-Cl, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, pH 7.9)로 미리 평형화시킨 후에 실시하였고, 시료를 칼럼에 적하한 다음에는 5 ml/분의 유량 (Flow rate)으로 상기 buffer A를 10 CV (Column Volume) 흘려주어 세척을 실시하였다. 세척 후에는 5 ml/분의 유량으로 buffer B (20 mM Tris-Cl, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, pH 7.9)의 농도가 4%가 되게 하여 10 CV를 흘려준 후, 농도 기울기 (Gradient)가 100%가 되게 하는 조건으로 크로마토그래피를 수행하였다. 이 과정에서 목적하는 COVID-19 바이러스의 N 단백질의 용출이 달성되었다. 용출액은 투석 완충액 (10 mM PBS, pH 7.2)에 대하여 4℃에서 24시간 동안 투석을 실시하여 항원 단백질 용액을 준비하였다.
면역크로마토그래피법에 기반한 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트를 제작하기 위해서는 항-인간 면역글로불린 G 항체와 이 항-인간 면역글로불린 G 항체에 대한 항체의 조합이 필요하다. 이러한 조합의 선택은 당업자에게는 일반적이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명의 실시예에서는 염소 (Goat) 항-인간 면역글로불린 G 항체와 토끼 (Rabbit) 항-염소 항체 (Anti-goat antibody)를 사용하였다. 그러나 이에 국한되지 않음은 자명하다.
실시예 2: 40 nm 콜로이드 골드용액의 제조
Sigma사의 gold(Ⅲ) chloride trihydrate (제품번호: 520918)를 사용하여 콜로이드 골드 (Colloidal gold) 용액을 제조하였다. Gold(Ⅲ) chloride trihydrate를 증류수에 1% (w/v)가 되게 녹인 후, 3구 플라스크에 증류수 1 L를 넣고 30분간 끓여 주었다. 1% gold 20 ml을 넣은 후 5분간 끓여준 후, 1% sodium citrate 20 ml을 넣고 30분간 끓여 주었다. 이렇게 제조된 콜로이드 골드 용액을 식힌 후 분광광도계 (spectrophotometer)를 이용하여 콜로이드 골드의 크기가 40 nm임을 확인하였다.
실시예 3: 항-인간 면역글로불린 G 항체 콘쥬게이트 제작
2 mM sodium tetraborate (pH 9.0-9.2)에 항-인간 면역글로불린 G 항체를 투석하여 버퍼를 교환했다. 투석한 항체를 정량한 후 1 mg/ml로 희석한 후 K2CO3를 이용하여 콜로이드 골드 용액의 pH를 4, 5, 6, 7, 8, 9로 제조하였다. pH별로 제조된 콜로이드 골드 용액을 1.5 ml tube에 1 ml씩 분주하였다. 각각의 콜로이드 골드 용액에 투석한 항체를 1, 5, 10, 20 μl을 넣어 상온에서 30분간 반응시켰다. Blocking을 위해 BSA를 최종농도로 1%가 되게 첨가한 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 한 다음에 상층액을 덜어내고 저장 완충액 (storage buffer; 1× PBS, 0.1% Tween 20, 0.1% BSA, 0.1% NaN3)으로 펠렛을 완전히 부유시켜 냉장보관하면서 접합체 패드 전처리에 사용하였다.
실시예 4: 검출키트의 각 부분별 전처리 및 조립
샘플 패드 (밀리포어사)(10)는 PBS에 0.5％ BSA와 0.5％ Tween 20을 혼합하여 전처리하였다. 접합체 패드 (밀리포어사)(20)는 항-인간 면역글로불린 G 항체 콘쥬게이트가 4 OD가 되도록 조정하였고, 5％ 트레할로스 (Trehalose)를 첨가하였다. DCI-400 (ZETA, KOREA)을 이용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Nitrocellulose membrane) (30)에 검사선(40)과 대조선 (Control line) (50)을 전처리하였다. 즉, 검사선(40)은 실시예 1에서 제작된 항원 단백질 용액 1 ㎕가 니트로셀룰로오스 멤브레인(30) 1 cm에 분사되도록 농도를 조정하였으며, 분사속도는 초당 5 cm의 속도로 하였다. 대조선(50)도 검사선과 동일한 조건으로 토끼 (Rabbit) 항-염소 항체 (Anti-goat antibody)를 분사하였다. 검사선과 대조선이 분사 완료된 니트로셀룰로오스 멤브레인은 37℃에서 2시간 건조시켜 항원 단백질 용액과 항-염소 항체 용액이 충분히 니트로셀룰로오스 멤브레인에 부착되도록 처리하였다. 전처리가 완료된 샘플 패드 (Sample pad) (10), 접합체 패드 (Conjugate pad) (20), 니트로셀룰로오스 멤브레인(30), 흡수 패드 (Adsorbent pad) (60)들을 도 1에 나타난 것처럼 백킹 카드 (Backing card) (70) 위에서 2 mm씩 서로 중첩되도록 순차적으로 부착시킨 후 폭 4 mm로 절단하여 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트(100)를 제작하였다.
실시예 5: COVID -19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트의 성능 평가
환자 혈청 20건을 대상으로 표준측정법인 효소결합면역흡착검사 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)법과 본 발명의 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트를 동시에 적용하여 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 검출양상을 비교하고 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다. 대조 진단키트로는 상용 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 검출 진단키트 2종을 사용하였다.
그 결과를 표 1에 제시하였다.
검출법
구분 ELISA 본 발명의 진단키트
(검사선 1: S1’ 단백질; 검사선 2: N 단백질)		 본 발명의 진단키트
(검사선 1: N 단백질; 검사선 2: S1’ 단백질)		 본 발명의 진단키트
(검사선 1: N 단백질; 검사선 2: N 단백질)		 상용제품 A 상용제품 B
양성시료 10 10 10 10 8 7
음성시료 10 10 10 10 12 13
표 1에 제시된 결과가 본 발명에 따라 제조된 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트의 장점을 모두 보여주기에는 시험대상 시료수가 작았지만 최소한 표준측정법인 효소결합면역흡착검사에 상응하는 성능 수준을 제공함을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
10: 샘플 패드 (Sample pad)
20: 접합체 패드 (Conjugate pad)
30: 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Nitrocellulose membrane)
40: 검사선 (Test line)
50: 대조선 (Control line)
60: 흡수 패드 (Adsorbent pad)
70: 백킹 카드 (Backing card)
100: COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트
SEQUENCE LISTING <110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Rapid Detection Method of COVID-19 Immunoglobulin G <130> KP090693 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 674 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 spike protein S1 subunit <400> 1 Ser Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala 1 5 10 15 Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe 20 25 30 Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe 35 40 45 Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly 50 55 60 Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr 65 70 75 80 Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly 85 90 95 Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala 100 105 110 Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro 115 120 125 Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser 130 135 140 Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val 145 150 155 160 Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys 165 170 175 Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile 180 185 190 Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly 195 200 205 Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile 210 215 220 Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro 225 230 235 240 Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val 245 250 255 Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly 260 265 270 Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr 275 280 285 Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr 290 295 300 Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn 305 310 315 320 Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe 325 330 335 Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala 340 345 350 Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys 355 360 365 Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu 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Lys Val Glu Ala 290 295 300 Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln 305 310 315 320 Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser 325 330 335 Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser 340 345 350 Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro 355 360 365 Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro 370 375 380 Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly 385 390 395 400 Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His 405 410 415 Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr 420 425 430 Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val 435 440 445 Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys 450 455 460 Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp 465 470 475 480 Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys 485 490 495 Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu 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305 310 315 320 Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala 325 330 335 Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu 340 345 350 Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro 355 360 365 Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu 385 390 395 400 Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser 405 410 415 Thr Gln Ala <210> 5 <211> 2028 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 spike protein S1 subunit <400> 5 atgtctagtc agtgtgttaa tcttacaacc agaactcaat taccccctgc atacactaat 60 tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac aaagttttca gatcctcagt tttacattca 120 actcaggact tgttcttacc tttcttttcc aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc 180 tctgggacca atggtactaa gaggtttgat aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt 240 tattttgctt ccactgagaa gtctaacata ataagaggct ggatttttgg tactacttta 300 gattcgaaga cccagtccct acttattgtt aataacgcta ctaatgttgt 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> receptor binding domain for COVID-19 spike protein S1 subunit <400> 6 atgaatatta caaacttgtg cccttttggt gaagttttta acgccaccag atttgcatct 60 gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat 120 aattccgcat cattttccac ttttaagtgt tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat 180 ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa 240 atcgctccag ggcaaactgg aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt 300 acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat 360 aattacctgt atagattgtt taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca 420 actgaaatct atcaggccgg tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac 480 tttcctttac aatcatatgg tttccaaccc actaatggtg ttggttacca accatacaga 540 gtagtagtac tttcttttga acttctacat gcaccagcaa ctgtttaa 588 <210> 7 <211> 1770 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 spike protein S2 subunit <400> 7 atgagtgtag ctagtcaatc catcattgcc tacactatgt cacttggtgc agaaaattca 60 gttgcttact ctaataactc tattgccata cccacaaatt ttactattag tgttaccaca 120 gaaattctac cagtgtctat gaccaagaca tcagtagatt gtacaatgta catttgtggt 180 gattcaactg aatgcagcaa tcttttgttg caatatggca gtttttgtac acaattaaac 240 cgtgctttaa ctggaatagc tgttgaacaa gacaaaaaca cccaagaagt ttttgcacaa 300 gtcaaacaaa tttacaaaac accaccaatt aaagattttg gtggttttaa tttttcacaa 360 atattaccag atccatcaaa accaagcaag aggtcattta ttgaagatct acttttcaac 420 aaagtgacac ttgcagatgc tggcttcatc aaacaatatg gtgattgcct tggtgatatt 480 gctgctagag acctcatttg tgcacaaaag tttaacggcc ttactgtttt gccacctttg 540 ctcacagatg aaatgattgc tcaatacact tctgcactgt tagcgggtac aatcacttct 600 ggttggacct ttggtgcagg tgctgcatta caaataccat ttgctatgca aatggcttat 660 aggtttaatg gtattggagt tacacagaat gttctctatg agaaccaaaa attgattgcc 720 aaccaattta atagtgctat tggcaaaatt caagactcac tttcttccac agcaagtgca 780 cttggaaaac ttcaagatgt ggtcaaccaa aatgcacaag ctttaaacac gcttgttaaa 840 caacttagct ccaattttgg tgcaatttca agtgttttaa atgatatcct ttcacgtctt 900 gacaaagttg aggctgaagt gcaaattgat aggttgatca caggcagact tcaaagtttg 960 cagacatatg tgactcaaca attaattaga gctgcagaaa tcagagcttc tgctaatctt 1020 gctgctacta aaatgtcaga gtgtgtactt ggacaatcaa aaagagttga tttttgtgga 1080 aagggctatc atcttatgtc cttccctcag tcagcacctc atggtgtagt cttcttgcat 1140 gtgacttatg tccctgcaca agaaaagaac ttcacaactg ctcctgccat ttgtcatgat 1200 ggaaaagcac actttcctcg tgaaggtgtc tttgtttcaa atggcacaca ctggtttgta 1260 acacaaagga atttttatga accacaaatc attactacag acaacacatt tgtgtctggt 1320 aactgtgatg ttgtaatagg aattgtcaac aacacagttt atgatccttt gcaacctgaa 1380 ttagactcat tcaaggagga gttagataaa tattttaaga atcatacatc accagatgtt 1440 gatttaggtg acatctctgg cattaatgct tcagttgtaa acattcaaaa agaaattgac 1500 cgcctcaatg aggttgccaa gaatttaaat gaatctctca tcgatctcca agaacttgga 1560 aagtatgagc agtatataaa atggccatgg tacatttggc taggttttat agctggcttg 1620 attgccatag taatggtgac aattatgctt tgctgtatga ccagttgctg tagttgtctc 1680 aagggctgtt gttcttgtgg atcctgctgc aaatttgatg aagacgactc tgagccagtg 1740 ctcaaaggag tcaaattaca ttacacataa 1770 <210> 8 <211> 1260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 nucleocapsid protein <400> 8 atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60 tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120 cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180 aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240 gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300 atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360 cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420 acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480 cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540 caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600 agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660 ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720 caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780 aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840 caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900 tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960 ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020 gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080 aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140 gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200 gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

Claims (11)

  1. 백킹 카드 위에 COVID-19 바이러스 특이 항원이 처리된 2개의 검사선과 항-인간 면역글로불린 G에 대한 항체가 처리된 대조선을 포함하는 멤브레인이 구비되고,
    상기 멤브레인의 일측에는 상기 대조선의 항-인간 면역글로불린 G에 대한 항체와 반응하는 항체 콘쥬게이트가 처리된 접합체 패드가 형성되며, 상기 접합체 패드 위에 혈청 시료를 적하하는 샘플 패드가 중첩되어 구비되며,
    상기 멤브레인의 타측에는 백킹 카드 위에 반응이 종료된 혈청을 흡수하는 흡수 패드가 구비되는 면역크로마토그라피를 이용한 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 COVID-19 바이러스 특이 항원은 서열번호 1로 표시되는 COVID-19 spike protein S1 subunit, 서열번호 2로 표시되는 COVID-19 spike protein S1 subunit의 receptor binding domain, 서열번호 3으로 표시되는 COVID-19 spike protein S2 subunit, 또는 서열번호 4로 표시되는 COVID-19 nucleocapsid protein에서 선택되는 어느 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 2개의 검사선은 같은 종류의 항원으로 처리될 수 있는 것을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 2개의 검사선은 서로 다른 종류의 항원으로 처리될 수 있는 것을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 항-인간 면역글로불린 G에 대한 항체는 항-염소 항체 (Anti-goat antibody)인 것을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 멤브레인은 니트로셀룰로오스 멤브레인인 것을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 항체 콘쥬게이트는 염소 항체 콘쥬게이트 (Goat antibody conjugate)인 것을 특징으로 하는 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항에 의한 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트를 이용하여 생물학적 시료 내에 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G가 포함되어 있는지 여부를 평가하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피법을 이용한 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 또는 혈청인 것인, COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단방법.
  10. COVID-19 바이러스의 양성 판정 오류 배제를 위한 진단 방법으로서,
    (a) 제 3항에 의한 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트의 샘플 패드에 생물학적 시료를 적하하는 단계;
    (b) 샘플 패드 및 대조선 사이의 2개의 검사선에 표시되는 발색 여부를 확인하는 단계를 포함하되, 2개의 검사선 모두에서 발색되는 경우를 COVID-19 바이러스의 양성 판정 오류가 배제된 판정으로 결정하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
  11. COVID-19 바이러스에 대한 항체 형성의 경중도를 판단하기 위한 진단 방법으로서,
    (a) 제 3항에 의한 COVID-19 바이러스에 대한 면역글로불린 G 신속검출 진단키트의 샘플 패드에 생물학적 시료를 적하하는 단계;
    (b) 샘플 패드 및 대조선 사이의 2개의 검사선에 표시되는 발색 여부를 확인하는 단계를 포함하되, 샘플 패드에서 가까운 검사선에서만 발생되는 경우를 COVID-19 바이러스에 대한 항체 형성이 경도라고 판단하고, 2개의 검사선 모두에서 발색되는 경우를 COVID-19 바이러스에 대한 항체 형성이 중도라고 판단하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
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