CN112300254B - 一种布鲁氏菌病诊断用多肽及其应用 - Google Patents

一种布鲁氏菌病诊断用多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种布鲁氏菌病诊断用多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；本发明所提供的多肽用于制备用于检测布鲁氏菌病的制品。本发明所提供的多肽与人及牛、羊的布鲁氏菌感染血清发生反应，不与感染了其他细菌的血清发生交叉反应，从而保证了检测的特异性。重复试验显示，无论检测人还是动物，该抗原的批内和批间变异系数均小于10％，表明所建立的ELISA试剂盒重复性良好。与传统的布鲁氏菌病血清学诊断方法相比，使用本发明所述的多肽建立的布鲁菌病抗体ELISA试剂盒也具有相似的准确度。

Description

一种布鲁氏菌病诊断用多肽及其应用
技术领域
本发明属于人和动物疫病检测技术领域，具体涉及一种布鲁氏菌诊断用多肽抗原。
背景技术
布鲁氏菌病(以下简称布病)是一种由布鲁氏菌引起的重要的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，《中华人民共和国传染病防治法》规定其为乙类传染病，该病对我国养殖业、食品安全与人类健康构成重大威胁。上世纪60年代布病在我国人畜中有较重流行，自70年代疫情逐年下降，至90年代初人间感染率仅为0.3％，发病率只有0.02/10万。但自上世纪90年代开始，我国布病疫情出现了反弹，布病的发病率呈现逐年增高趋势，并波及到31个省市、自治区和直辖市，其中以北方地区最为严重。
目前布鲁氏菌属主要包括6个种，即羊种、牛种、猪种、绵羊附睾种、沙林鼠种和犬种布鲁氏杆菌。在我国主要流行羊种、牛种、猪种和犬种布鲁氏菌，均对人致病。人可通过接触病畜的流产物、排泄物、乳、肉等经消化道和呼吸道感染。人布病的主要临床表现为波浪热、乏力、关节痛、神经痛、肝脾肿大、睾丸炎、流产等，还可引起脑膜炎、心内膜炎、脊柱炎等慢性病症，严重损伤身体，甚至丧失工作能力。如果经有效治疗，多数患者可康复，但如果诊断和治疗不及时，经常会产生严重的后果。因此，对人布病进行早期、快速、准确诊断，是控制病程发展、改善患者预后的重要任务。同时，加强动物布病检测，剔除感染动物，可切断传染源，有效降低人间布病发病率。
目前布鲁氏菌病的血清学检测仍是目前最广泛使用的方法，它是通过检测人和动物血清中的抗布鲁氏菌特异性抗体来诊断布鲁氏菌病，主要方法包括：虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金检测技术以及荧光偏振技术(FPA)等。布鲁氏菌病血清学检测使用的抗原主要是两种：一种是以布鲁氏菌全菌作为抗原，主要用于虎红平板凝集试验和试管凝集试验；另一种是以布鲁氏菌表面的脂多糖(LPS)作为抗原，主要用于酶联免疫吸附试验、胶体金检测技术和荧光偏振检测技术。但是，无论使用全菌还是脂多糖作为抗原，都存在以下弊端：布鲁氏菌脂多糖与某些其他属细菌(如：O157大肠杆菌和小肠耶尔森大肠杆菌)存在交叉抗原表位，降低了检测的特异性；无论是全菌抗原还是脂多糖抗原，在制备过程中都涉及活菌培养，人员感染的风险很大，从而极大限制了抗原的制备和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种布鲁氏菌病诊断用多肽，用于检测人以及牛、羊的布鲁氏菌病，从而弥补现有技术的不足。
本发所所提供的布鲁氏菌病诊断用多肽，其氨基酸序列为AAAPDNSVPIAAGENSYNVSVNVVFE(SEQ ID NO:1)，
本发明所提供的多肽用于制备用于检测布鲁氏菌病的制品；
所述的制品，为ELISA检测制品或胶体金检测制品；
本发明一个方面提供一种用于酶联免疫吸附检测(ELISA)的抗原多肽，是将上述的多肽与载体蛋白进行偶联制备的；
所述的载体蛋白，为血蓝蛋白(KLH)、鸡卵白蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)。
本发明还提供一种用于检测布鲁氏菌病的ELISA检测试剂盒，其中使用的检测多肽为上述的抗原多肽。
本发明所提供的多肽与人及牛、羊的布鲁氏菌感染血清发生反应，不与感染了其他细菌(如O157大肠杆菌和小肠耶尔森大肠杆菌)的血清发生交叉反应，从而保证了检测的特异性。重复试验显示，无论检测人还是动物，该抗原的批内和批间变异系数均小于10％，表明所建立的ELISA试剂盒重复性良好。与传统的布鲁氏菌病血清学诊断方法相比，使用本发明所述的多肽建立的布鲁菌病抗体ELISA试剂盒也具有相似的准确度。
附图说明
图1：人布鲁氏菌病多肽P6/ELISA试剂盒的ROC曲线图
图2：人布鲁氏菌病多肽P6/ELISA检测方法和试管凝集试验的比较图；
图3：牛布鲁氏菌病多肽P6/ELISA试剂盒的ROC曲线图；
图4：牛布鲁氏菌病多肽P6/ELISA检测和RBT/SAT方法比较图；
图5：羊布鲁氏菌病多肽P6/ELISA试剂盒的ROC曲线图；
图6：羊布鲁氏菌病多肽P6/ELISA检测和RBT/SAT方法比较图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：布鲁氏菌外膜蛋白B细胞抗原多肽的预测和合成
从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获取布鲁氏菌主要外膜蛋白BP26、OMP2b、OMP16、OMP25和OMP31的氨基酸序列，采用Bepipred Linear EpitopePrediction、ABCpred prediction Server软件对外膜蛋白的B细胞抗原表位进行预测，选择α螺旋、β折叠少、亲水性和抗原性好的序列作为优势抗原表位(见表1)进行筛选。
以固相合成方法化学合成预测的多肽，采用EDC介导的方式将多肽与KLH、OVA或BSA载体偶联，然后用10kD透析袋在PBS(pH7.2)溶液中透析，除去过多试剂。最后用高效液相色谱仪(HPLC)进行纯化，纯度需达到98％以上，浓缩至2mg/mL的浓度，冻干后于4℃保存。
表1：主要外膜蛋白预测B细胞抗原多肽预测信息表
Figure BDA0002761991930000041
将预测的抗原多肽分别偶联血蓝蛋白(KLH)作为抗原，采用间接ELISA法，用已知人布鲁氏菌病阴、阳性血清对多肽进行筛选，具体步骤如下：
(1)抗原包被酶标反应板：抗原多肽和KLH偶联抗原以100μL/孔(5μg/mL)包被于酶标板中，4℃过夜；PBST洗板3次，每次3min，拍干。以羊种布鲁氏菌LPS(中国动物卫生与流行病学中心提供)作为阳性抗原对照，以KLH作为空白对照。每个抗原包被三个孔。
(2)加入1％脱脂奶粉封闭液，300μL/孔进行封闭，同上洗板；
(3)加入人标准阳性和阴性血清(1:400稀释)，100μL/孔，同上洗板；
(4)加入工作浓度的HRP标记的HRP标记重组链球菌蛋白G(HRP-rSPG)，100μL/孔，同上洗板；
(5)加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光反应；
(6)加入终止液(2mol/L H2SO4)，50μL/孔；
(7)酶标仪读取OD450值，选择P/N值最大者作为最佳反应条件。
结果显示：多肽P5、P6、P12、P13和P15具有较好的鉴别人布鲁氏菌阳性和阴性血清的能力(见表2)。
表2预测抗原多肽对人布鲁氏菌阳性和阴性血清鉴别能力对比
Figure BDA0002761991930000051
Figure BDA0002761991930000061
实施例2：牛布鲁氏菌病诊断用抗原多肽的筛选
将预测的B细胞抗原多肽分别偶联牛血清白蛋白(BSA)作为抗原，采用间接ELISA法，用牛布鲁氏菌病阳性和阴性标准血清(中国动物卫生与流行病学中心保存)对多肽进行筛选，具体步骤如下：
(1)抗原包被酶标反应板：B细胞抗原多肽-BSA偶联抗原以100μL/孔(5μg/mL)包被于酶标板中，4℃过夜；PBST洗板3次，每次3min，拍干。以羊种布鲁氏菌LPS(中国动物卫生与流行病学中心提供)作为阳性抗原对照，以BSA作为空白对照。每个抗原包被三个孔。
(2)加入1％脱脂奶粉封闭液，300μL/孔进行封闭，同上洗板；
(3)加入牛阳性和阴性标准血清(1:100稀释)，100μL/孔，同上洗板；
(4)加入工作浓度的HRP-rSPG，100μL/孔，同上洗板；
(5)加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光反应；
(6)加入终止液(2mol/L H2SO4)，50μL/孔；
(7)酶标仪读取OD450值，选择P/N值最大者作为最佳反应条件。
结果显示：多肽P2、P4、P5、P6、P13和P22具有较好的鉴别牛布鲁氏菌阳性和阴性血清的能力(表3)。
表3预测抗原多肽对牛布鲁氏菌病阳性和阴性血清鉴别能力对比表
Figure BDA0002761991930000062
Figure BDA0002761991930000071
实施例3：羊布鲁氏菌病诊断用抗原多肽的筛选
将预测的B细胞抗原多肽分别偶联牛血清白蛋白(BSA)作为抗原，采用间接ELISA法检测羊布鲁氏菌病阳性和阴性标准血清(中国动物卫生与流行病学中心保存)，对多肽进行对比筛选。具体步骤如下：
(1)抗原包被酶标反应板：B细胞抗原多肽-BSA偶联抗原以100μL/孔(5μg/mL)包被于酶标板中，4℃过夜；PBST洗板3次，每次3min，拍干。以羊种布鲁氏菌LPS(中国动物卫生与流行病学中心提供)作为阳性抗原对照，以BSA作为空白对照。每个抗原包被三个孔。
(2)加入1％脱脂奶粉封闭液，300μL/孔进行封闭，同上洗板；
(3)加入待检羊阳性和阴性标准血清(1:100稀释)，100μL/孔，同上洗板；
(4)加入工作浓度的HRP-rSPG,，100μL/孔，同上洗板；
(5)加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光反应；
(6)加入终止液(2mol/L H2SO4)，50μL/孔；
(7)酶标仪读取OD450值，选择P/N值最大者作为最佳反应条件。
结果显示：多肽P4、P6、P13和P15具有较好的鉴别羊布鲁氏菌阴、阳血清的能力，其中以多肽P4和P6的区分能力强(见表4)。
表4：抗原多肽对羊布鲁氏菌病阳性和阴性血清鉴别能力对比表
Figure BDA0002761991930000081
Figure BDA0002761991930000091
以上结果显示，多肽P6(SEQ ID NO:1)对人、牛、羊布鲁氏菌病阳性和阴性血清均表现出较好的鉴别能力，可作为人、牛、羊布鲁氏菌病诊断用抗原。
实施例4:人布鲁氏菌病多肽P6/ELISA抗体检测试剂盒的制备
(1)最佳抗原包被浓度：多肽P6-KLH抗原分别作20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL稀释，包被于酶标反应板中，4℃过夜；人布鲁氏菌病阴阳性血清分别作1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，每个浓度设3个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。
表5：最佳抗原包被浓度和血清稀释度表
Figure BDA0002761991930000092
由表5可知，P/N的最大值为3.705，多肽P6的最佳包被浓度为5μg/mL，血清的最佳稀释度为1:100。
(2)最佳抗原包被条件
分别在4℃过夜、37℃孵育2h和37℃孵育1h三种条件下包被多肽P6-KLH抗原，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清对照，各3复孔，酶标仪读取OD450值后取平均值。选择P/N值最大者作为最佳抗原包被条件。
表6：最佳抗原包被条件的确定表
Figure BDA0002761991930000101
由表6可知，P/N值最大为2.997，因此4℃孵育过夜是最佳的抗原包被条件。
(3)最佳封闭液、封闭时间选择
分别选择0.5％BSA、1％BSA、1％脱脂奶粉和1％胎牛血清作为封闭液，选择37℃孵育1h和2h作为封闭时间，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清对照，各3复孔，酶标仪读取OD450值后取平均值。选择P/N值最大者作为最佳封闭液和封闭时间。
表7：最佳封闭液和封闭时间的确定表
Figure BDA0002761991930000102
由表7可知，P/N值最大为2.928，因此1％脱脂奶粉为最佳封闭液，37℃孵育1h为最佳封闭条件。
(4)最佳血清反应时间
分别选择30min、60min、90min和120min作为待测血清的反应时间，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清对照，每个血清反应时间均设置3个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值。选择P/N值最大者作为最佳封闭液和封闭时间。
表8：最佳血清反应时间的确定表
Figure BDA0002761991930000111
由表8可知，P/N值最大为2.893，此时待测血清的最佳反应时间为90min。
(5)最佳酶标抗体稀释度和反应时间
将酶标抗体HRP-rSPG(购自北京博尔西生物技术有限公司，浓度为1mg/mL)分别作1:5000、1:10000、1:15000和1:20000浓度稀释，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清，每个浓度每种血清均设置3个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值。设置酶标抗体的反应时间为30min、60min、90min和120min，各3个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳酶标抗体稀释度和反应时间。
表9：最佳酶标抗体稀释度的确定表
Figure BDA0002761991930000112
表10最佳酶标抗体反应时间的确定
Figure BDA0002761991930000121
由表9、表10可知，酶标抗体的最佳稀释度为1:5000，最佳反应时间为30min。
(6)最佳底物显色时间
分别选择5min、10min、15min和20min作为底物显色时间，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清，每个底物显色时间每种血清均设置3个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳底物显色时间。
表11：最佳底物显色时间的确定表
Figure BDA0002761991930000122
由表11可知，最佳底物显色时间为20min。
根据上述优化条件，对人布鲁氏菌病多肽P6/ELISA抗体检测试剂盒进行评估：
(7)人布鲁氏菌病多肽P6/ELISA试剂盒的ROC曲线及临界值确定
从疾病预防控制中心收集了61份人布鲁氏菌阳性血清和91份阴性血清，用上述条件优化的多肽P6/ELISA试剂盒进行检测，获得各血清的OD值，然后运用SPSS软件，经ROC曲线分析，获得该ELISA方法的敏感性、特异性、曲线下面积(AUC)、约登指数(Yoden)等数据。结果显示(图1、表12)，95％置信区间，AUC为0.881，P＝0.000，说明该检测方法的灵敏度较高。
表12：曲线下面积结果表
Figure BDA0002761991930000131
临界值的确定：为了获得较好的特异性，选取约登指数(敏感性+特异性-1)最大值(0.759)所对应的OD值作为临界值,此时敏感性为83.6.7％，特异性为92.3％(见表13)
表13：不同临界值P6/ELISA检测方法性能比较表
Cut-off值 敏感性 特异性 约登指数
0.364 0.885 0.736 0.622
0.402 0.869 0.824 0.693
0.448 0.836 0.923 0.759
0.580 0.770 0.978 0.749
0.713 0.639 0.989 0.628
(8)多肽P6/ELISA与传统试管凝集方法的对比
收集人临床血清共122份(徐州医学院保存)，经传统试管凝集方法检测为布鲁氏菌阳性的血清65份，阴性血清57份。用多肽P6/ELISA方法对这些血清进行检测，并按照上述(7)确定的cut-off值进行判定。结果：65份阳性血清中，经P6多肽ELISA诊断为阳性的血清为59份，符合率为90.77％。57份阴性血清中，有53份诊断为阴性，符合率为92.98％，总符合率为91.80％(见图2)，由此可见这两种检测方法的符合率较高。
(9)多肽P6/ELISA特异性交叉实验
从天津生物芯片技术有限责任公司购买人源大肠杆菌O157血清(IM-EH003-44)、大肠杆菌H7血清(IM-EH001-7)、沙门氏菌O抗原多价血清(IM-SA004-8)、小肠耶尔森氏菌血清(IM-YE016-6)和单增李斯特菌血清(IM-LM012-1)，用多肽P6-KLH抗原制备的间接ELISA方法进行检测。结果显示：大肠杆菌O157血清、大肠杆菌H7血清、沙门氏菌O抗原多价血清、小肠耶尔森氏菌血清O9、单增李斯特菌血清OⅠ/Ⅱ和副溶血弧菌K抗原多价血清与阴性血清的OD450比值均小于1.5(0.980～1.297)，人布鲁菌阳性血清与阴性血清的OD450比值大于3，表明本发明所提供的多肽不与感染了其他细菌的血清发生交叉反应，检测的特异性较高，保证了检测的准确性(表14)。
表14多肽P6与其他细菌病的血清学交叉反应检测结果
Figure BDA0002761991930000141
(8)重复性实验
用同一批次的P6-KLH蛋白包被同一块酶标反应板，检测8份布鲁菌病阳性血清的OD450值，每份血清设置4个重复，检测其板内变异系数。用不同批次的P6-KLH蛋白包被酶标反应板，检测8份布鲁菌病阳性血清的OD450值，每份血清设置4个重复，检测其批次变异系数。
表15人布鲁菌病P6/ELISA试剂盒重复性实验结果
Figure BDA0002761991930000142
Figure BDA0002761991930000151
结果如表15所示，批内变异系数在1.71％～8.42％之间，批间变异系数在3.86％～8.16％之间，均小于10％，表明建立的人布鲁菌多肽P6/ELISA试剂盒重复性良好。
实施例5、牛布鲁氏菌病多肽P6/ELISA抗体检测试剂盒的制备
(1)最佳抗原包被浓度：
多肽P6-BSA偶联抗原分别作20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL稀释，包被于酶标反应板中，4℃过夜；牛布鲁氏菌病阳性血清(英国PAHA中等阳性标准血清，中国动物卫生与流行病学中心保存)分别作1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320稀释，每个抗原浓度和抗体稀释度设3个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳抗原包被浓度及血清稀释度。
表16：最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定表
Figure BDA0002761991930000152
Figure BDA0002761991930000161
由表16可知，当多肽P6-BSA的包被浓度为5μg/mL，血清的稀释度为1:40时检测效果最佳。
(2)最佳抗原包被条件
分别在4℃过夜、37℃孵育2h和37℃孵育1h三种条件下包被多肽P6-BSA抗原，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清，各3复孔，酶标仪读取OD450值后取平均值。选择P/N值最大者作为最佳抗原包被条件。
表17：最佳抗原包被条件的确定表
Figure BDA0002761991930000162
由表17可知，P/N最大值为2.720，因此4℃孵育过夜是最佳抗原包被条件。
(3)最佳封闭液、封闭时间选择、最佳血清反应时间、最佳酶标抗体稀释度和反应时间、最佳底物显色时间同实施例5中条件。
根据上述优化条件对牛布鲁氏菌病多肽P6/ELISA抗体检测试剂盒进行评估：
(4)ROC曲线和临界值确定
取确诊的牛布鲁氏菌病阳性血清85份、阴性血清70份(中国动物卫生与流行病学中心保存)，用牛布鲁氏菌病多肽P6/ELISA抗体试剂盒进行检测。运用SPSS软件，经ROC曲线分析，对该方法的敏感性、特异性、阳性阈值进行测算。结果显示，95％置信区间，AUC为0.920，P＝0.000，说明该检测方法的灵敏度较高(图3、表18)。
表18：曲线下面积结果表
Figure BDA0002761991930000171
临界值的确定：为了提高检测试剂盒特异性，选取约登指数(敏感性+特异性-1)最大值(0.729)所对应的OD值作为临界值,此时敏感性为85.0％，特异性为92.9％(见表19)
表19：不同临界值P6/ELISA检测方法的性能
cut-off 敏感性 特异性 约登指数
0.292 0.941 0.643 0.584
0.371 0.835 0.786 0.621
0.409 0.850 0.929 0.729
0.356 0.882 0.771 0.654
0.394 0.812 0.886 0.697
(5)多肽P6/ELISA与虎红平板凝集试验初筛、试管凝集试验确诊的布病诊断方法之间的对比
血清样品：收集已牛血清203份(中国动物卫生与流行病学中心保存)，用传统的虎红平板凝集试验(RBT)初筛、试管凝集方法(SAT)确诊的布病诊断方法检出阳性血清125份，阴性血清77份。然后用多肽P6/ELISA方法对这些血清进行复核，按照上述(4)的cut-off值进行判定。
结果：77份阴性血清中，经多肽P6/ELISA方法诊断为阴性的血清为76份，符合率为98.7％。105份阳性的血清中，有96份血清经P6/ELISA方法诊断为阳性，符合率为91.43％。在灵敏性和准确性上，P6/ELISA方法与传统的虎红平板凝集初筛、试管凝集确诊的方法之间的符合率较高。
(6)多肽P6/ELISA特异性交叉实验
同时检测布病标准阳性血清，以及耶尔森菌O9、大肠杆菌O157免疫兔血清，结果显示耶尔森菌和大肠杆菌阳性和阴性血清的比值(P/N值)均小于1.2，而布鲁氏菌的P/N值大于3，表明本试剂盒所提供的多肽与不与感染了其他细菌的血清发生交叉反应，保证了检测的准确性。见表20。
表20：多肽P6与其他细菌病的血清学交叉反应检测结果表
Figure BDA0002761991930000181
(7)重复性实验
用同一批次的多肽P6-BSA抗原包被同一块酶标反应板，检测8份布鲁菌病阳性血清的OD450值，每份血清设置4个重复，检测其批内变异系数。用不同批次的P6-BSA抗原包被酶标反应板，检测8份布鲁菌病阳性血清的OD450值，每份血清设置4个重复，检测其批间的变异系数。结果如表21所示：批内变异系数在1.34％～7.68％之间，批间变异系数在3.37％～7.33％之间，均小于10％；表明用多肽P6-BSA作为抗原建立的牛布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性。
表21：牛布鲁菌病多肽P6/ELISA抗体试剂盒重复性实验结果表
Figure BDA0002761991930000182
Figure BDA0002761991930000191
实施例6：羊布鲁氏菌病多肽P6/ELISA抗体检测试剂盒的制备
(1)最佳抗原包被浓度：多肽P6-BSA抗原分别作20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL稀释，包被于酶标反应板中，4℃过夜；羊布鲁氏菌病中等阳性血清分别作1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320稀释(中国动物卫生与流行病学中心保存)，每个浓度设3个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳抗原包被浓度及血清稀释度。
表22最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
Figure BDA0002761991930000192
表22所示，计算所得P/N的最大值为3.324，当多肽P6-BSA抗原的包被浓度为10μg/mL，血清的稀释度为1:20时的检测效果最佳。
(2)最佳抗原包被条件
分别在4℃过夜、37℃孵育2h和37℃孵育1h三种条件下包被多肽P6-BSA抗原，同时设置羊布鲁氏菌病阳性和阴性血清，各3复孔，酶标仪读取OD450值后取平均值。选择P/N值最大者作为最佳抗原包被条件。
表23最佳抗原包被条件的确定
Figure BDA0002761991930000201
由表23可知，4℃孵育过夜是最佳的抗原包被条件。
(3)最佳封闭液、封闭时间选择、最佳血清反应时间、最佳酶标抗体稀释度和反应时间、最佳底物显色时间同上述实施例5中的条件。
根据上述优化条件，对羊布鲁氏菌病多肽P6/ELISA抗体检测试剂盒进行评估：
(4)ROC曲线和临界值确定
取经确诊的布鲁氏菌病牛阳性血清85份，牛阴性血清70份(中国动物卫生与流行病学中心保存)，用P6/ELISA牛布鲁氏菌病抗体试剂盒进行检测。运用SPSS软件，经ROC曲线分析，对该方法的敏感性、特异性、阳性阈值进行测算。结果显示，95％置信区间，AUC为0.825，P＝0.000，说明该检测方法的灵敏度高(图5、表24)。
表24、ROC曲线和临界值确定表
Figure BDA0002761991930000202
Figure BDA0002761991930000211
临界值的确定：选取约登指数(敏感性+特异性-1)最大值(0.805)所对应的OD值作为临界值,此时敏感性为84.0％，特异性为96.5％，特异性和敏感性都较高(见表25)
表25：不同临界值P6/ELISA检测方法的性能
cut-off 敏感性 特异性 约登指数
0.251 0.940 0.614 0.554
0.277 0.920 0.737 0.657
0.328 0.840 0.965 0.805
0.475 0.700 1.000 0.700
(5)与虎红平板凝集试验初筛、试管凝集试验确诊的布病诊断方法之间对比
收集羊血清105份(中国动物卫生与流行病学中心保存)，经虎红平板凝集试验和试管凝集试验方法(RBT/SAT)确诊为阳性的血清为47份，检测为阴性的血清共63份。然后用多肽P6/ELISA方法对这些血清进行复核，按照上述(4)的cut-off值进行判定。结果：63份阴性血清中，经多肽P6/ELISA方法诊断为阴性的血清为60份，符合率为95.24％。42份阳性的血清中，有38份血清经P6/ELISA方法诊断为阳性，符合率为90.48％(见图6)。特异性和敏感性上，该试剂盒与传统的虎红平板初筛、试管凝集确诊的检测方法比较一致。
(6)多肽P6/ELISA特异性交叉实验
特异性鉴定结果表明本试剂盒所提供的多肽不与感染了耶尔森菌O9、大肠杆菌O157的血清发生交叉反应，保证了检测的准确性。
(8)重复性实验
用同一批次的P6-BSA抗原包被同一块酶标反应板，检测8份羊布鲁菌病阳性血清的OD450值，每份血清设置4个重复，检测其板内变异系数。用不同批次的P6-BSA抗原包被酶标反应板，检测8份羊布鲁菌病阳性血清的OD450值，每份血清设置4个重复，检测其批次变异系数。结果如表26所示：批内变异系数在2.40％～7.15％之间，批间变异系数在3.75％～7.10％之间，均小于10％，表明建立的羊布鲁氏菌病多肽P6/ELISA抗体检测试剂盒的重复性良好。
表26：羊布鲁菌病P6/ELISA抗体试剂盒重复性实验结果
Figure BDA0002761991930000221
综上，利用本发明制备所得的布鲁氏菌B细胞抗原肽P6与血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联后所建立的ELISA试剂盒可用来检测人和牛、羊布鲁氏菌病血清抗体，具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，与其他检测方法的符合率也很高，可以代替传统的方法用于人和动物的布鲁氏菌病诊断。
本发明对布鲁氏菌病检测是摈弃了传统的用细菌操作和基因工程技术来制备抗原的方法，使得抗原的安全性、易得性更高。因此，以化学合成多肽P6作为抗原的任何布鲁氏菌病抗体检测技术及其修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种用于布鲁氏菌病诊断用的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为SEQID NO:1。
2.权利要求1所述的多肽在制备用于检测布鲁氏菌病的制品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为ELISA检测制品或胶体金检测制品。
4.一种用于酶联免疫吸附检测的抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽是将权利要求1所述的多肽与载体蛋白进行偶联制备的。
5.如权利要求4所述的抗原多肽，其特征在于，所述的载体蛋白为血蓝蛋白、鸡卵白蛋白或牛血清白蛋白。
6.一种用于检测布鲁氏菌病的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中使用的检测多肽为权利要求4所述的抗原多肽。
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CN102432673A (zh) * 2011-12-14 2012-05-02 南方医科大学 一种布鲁氏菌bp26蛋白表位及其单克隆抗体和应用
CN103278635A (zh) * 2013-05-31 2013-09-04 中国兽医药品监察所 动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒
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