TWI536017B - Detection of hemolytic uremia by using serum fetuin A as a biomarker to detect streptococcus pneumoniae infection - Google Patents

Description

使用血清胎球蛋白A作為生物標誌物以檢測肺炎鏈球菌感染時引發溶血性尿毒症的檢測方法

本發明是有關於一種方法，特別是有關於一種使用血清胎球蛋白A作為生物標誌物以檢測肺炎鏈球菌感染時引發溶血性尿毒症的檢測方法。

肺炎鏈球菌是一種革蘭氏陽性雙球菌，其感染對2歲以下的兒童和60歲以上的老人較易導致高死亡率和高發病率。

就全球而言肺炎鏈球菌的感染估計每年造成數以萬計死亡的案例，儘管已有某些疫苗應用於預防肺炎鏈球菌感染，但因肺炎鏈球菌的高變異性，其導致的感染死亡率仍是最高的，這些相關的疾病包括侵襲性肺炎鏈球菌疾病(IPD)，如敗血症、腦膜炎和溶血尿毒綜合症(HUS)；下呼吸道感染，如細菌性肺炎、壞死性肺炎；和上呼吸道感染，如急性中耳炎(AOM)等綜合症，其中溶血性尿毒綜合症和壞死性肺炎是最嚴重的疾病之一，主要發生於兒童。

肺炎鏈球菌可以定殖在人類呼吸道粘膜上，隨後可能引起上呼吸道粘膜的感染，如鼻竇炎、中耳炎、肺炎、和IPD(包括肺炎併發症之積膿症和壞死性肺炎、菌血症、以及腦膜炎)。最嚴重的IPD併發症之一是溶 血性尿毒綜合症，主要發生在兒童，症狀有溶血性貧血、血小板減少症和急性腎功能衰竭(HUS triad)。肺炎鏈球菌的神經氨酸酶在溶血性尿毒綜合症患者，因切掉在紅血球細胞(RBC)上的唾液酸(N-acetylneuraminic)，導致Thomsen-Friedenrich抗原(T-antigen，簡稱TA抗原)的暴露，並可與anti-TA抗體反應形成免疫複合物，而此複合物進而造成細胞溶解。

在最近的一項研究中，我們調查了來自溶血性尿毒綜合症患者和那些沒有溶血性尿毒綜合症患者體內所分離的肺炎鏈球菌，分析其中三個神經氨酸酶基因的分佈(nanA、nanB和nanC)。本質上，肺炎鏈球菌皆帶有nanA和nanB基因，相當於89%引起溶血性尿毒綜合症的肺炎鏈球菌中存在nanC基因，但只有42%引起IPD的肺炎鏈球菌攜帶nanC基因。因此我們推測NanC可能導致罹患溶血性尿毒綜合症的風險增加，同樣可以通過增加肺炎鏈球菌神經氨酸酶NanA和NanB的整體活性方式，而導致溶血性尿毒綜合症的發生。

產生神經氨酸酶的生物如肺炎鏈球菌，能將唾液酸醣蛋白上的唾液酸基質切下(sialyl)，並且用它作為營養之碳源和氮源。在肺炎鏈球菌感染時，NanA、NanB、NanC或累加效應的這三個神經氨酸酶有著更高的活性表達，而將唾液酸基質切下以致暴露宿主細胞的T抗原。

先前研究顯示，肺炎鏈球菌血清型2(品系R6)和血清型4(品系TIGR4)因未能生產NanB和NanC，所以可以被用來證實對α 2-3類型之唾液酸基質具有特異性的切割。

最近研究顯示，肺炎鏈球菌之NanA和NanB突變株對上皮細胞(如初生鼻咽細胞)的附著能力顯著下降。在呼吸道細胞之表面有兩種不同 的α 2-3和α 2-6類型唾液酸基質的分佈，其多寡取決於年齡、組織和細胞類型；其中α 2-3類型的唾液酸基質是有選擇性地出現在杯狀細胞及分泌黏蛋白中居多；然而α 2-6類型的唾液酸基質則存在呼吸道上皮纖毛細胞上居多。額外的肺炎鏈球菌NanC可能因此幫助此種呼吸道病原體，獲得更多的唾液酸，以助於細菌在宿主細胞的殖民化和感染作用。

Wigger等人報導，在一個健康人的血清中，其胎球蛋白A(fetuin-A)(460±240毫克/公升)的濃度並不隨年齡和性別而有所改變；然而其濃度的改變會發生在感染、發炎和腫瘤之後。

最近報導顯示，感染胃幽門螺旋桿菌的病人中其胎球蛋白A的血清濃度水平對比尚未被感染者則降低了43%。其它類似報導也顯示在動物模型試驗下，其血液循環系統中胎球蛋白A的血清濃度水平會因致命的內毒素血症和敗血症的發生而下降。

近來，Copelovitch等人對溶血尿毒綜合症的病例有了新的修正，除了對IPD引起的相關病癥、積極的抗球蛋白試驗(Coombs test)和彌散性血管內凝血作用(disseminated intravascular coagulation,DIC)之外，還包括一個三元組(即指紅血球細胞、血小板和腎小球內皮細胞上T抗原的呈現)溶血尿毒綜合症明確可能的定義。

使用花生凝集素(peanut lectin,PNA)來檢測TA抗原，被認為是適合測試肺炎鏈球菌所引起之溶血性尿毒綜合症的方法。雖然對肺炎鏈球菌相關的溶血性尿毒綜合症已有很好的病理特性之認知，但仍需持續開發和改善其針對溶血性尿毒綜合症專一性的檢測，尤其是目前專一性檢測方法的不足和在疾病發展後期的檢測上。

肺炎鏈球菌之感染會導致高死亡率和高發病率，儘管已有某些疫苗應用於預防肺炎鏈球菌感染，但由肺炎鏈球菌感染所導致的死亡率仍是最高的。雖然目前已有一些檢測肺炎鏈球菌引發疾病的方法，但主要仍依賴於傳統的細菌培養方法和特定疾病發展的檢測，繁瑣又費時。且如果細菌增殖不夠和疾病發展的前期，則會導致檢測的敏感度不足，或是利用肺炎鏈球菌檢測試劑測試尿液中的肺炎鏈球菌夾膜C-polysaccharide之成份，則會發生偽陽性過高的現象。因此肺炎鏈球菌感染的問題一直是全球公共衛生的一大挑戰，開發新的檢測方法，實為公眾所盼，為相關研究開發人員所努力突破之目標及方向。

有鑑於上述問題，本發明提供了一種使用血清胎球蛋白A作為生物標誌物以檢測肺炎鏈球菌感染時引發溶血性尿毒症的檢測方法。

該方法針對肺炎鏈球菌感染引起的嚴重侵襲性肺炎鏈球菌疾病，包括壞死性肺炎和溶血性尿毒綜合症，因而導致兒童血清胎球蛋白A的濃度水平下降。相對於大葉性肺炎患者(610±190mg/L)和健康對照組(630±250mg/L)，溶血性尿毒綜合症患者的平均胎球蛋白A濃度水平顯著降低為207±80mg/L(P<0.001)。因此血清胎球蛋白A濃度水平可當作生物標誌物，作為對兒童肺炎鏈球菌感染的嚴重程度的分類判斷。

藉由酶聯免疫吸附測定和西方墨點雜交法，可以輕易準確地監控和評估生物標誌物胎球蛋白A在血清中的濃度水平的變化，進而評估對溶血性尿毒綜合症及壞死性肺炎發病的風險。因為壞死性肺炎的部位在肺臟表皮細胞附近，與溶血性尿毒症則有所不同。然而溶血性尿毒症是 一種與血液的成分有關的疾病，所以比較能直接影響血液中原本高含量的胎球蛋白濃度(630±250mg/L)。如果我們能將事後發生壞死性肺炎又無菌血症的樣品排除，則應可減少在健康對照組及大葉性肺炎的樣品中與壞死性肺炎重疊個數。

接下來列舉一較佳實施例，並配合圖式及圖號，對本發明做進一步的說明，期能使 貴審查委員對本發明有更詳細的了解，並使熟悉該項技術領域者能據以實施。以下僅在於解釋較佳實施例，而非在於限制本發明之發明範圍，故凡有以本發明精神為基礎，而為本發明之任何形式的變更或修飾，皆屬於本發明意圖保護之範疇。

第1A圖：神經氨酸酶NanA、NanB和NanC的受質特異性分析。以α2-6型唾液酸受質(α2-6 sialyllactose)作為神經氨酸酶專一性活性的檢測。測試的神經氨酸酶包括NanA,NanB和NanC。C-Neu是產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)之一種神經氨酸酶，被用作對照組。

第1B圖：神經氨酸酶NanA、NanB和NanC的受質特異性分析。以α2-3型唾液酸受質(α2-3 sialyllactose)作為神經氨酸酶專一性活性的檢測。分別測試的神經氨酸酶包括NanA,NanB和NanC。C-Neu是產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)之一種神經氨酸酶，被用作對照組。

第2A圖：檢測血清唾液酸醣蛋白。分別經NanA、NanB和NanC處理後的 血清，其中帶有TA抗原暴露之唾液酸醣蛋白在西方墨點雜交法和含辣根過氧化物酶嵌合鏈黴菌親和素(streptavidin-HRP)的作用，驗證這些事先皆經生物素化(biotinylation)處理之唾液酸醣蛋白。利用鏈黴菌親和素結合和辣根過氧化物酶作用，標示(顯影)出所有經花生凝集素共軛洋菜膠樹脂純化過的唾液酸醣蛋白的位置。

第2B圖：卞氏圖表(Venn diagram)。經液相層析儀(LC)和質譜儀(MS)串聯法(LC-MS/MS)分析，比較未經處理和神經氨酸酶處理過的血清樣品組中含T抗原醣蛋白之差異。在括弧中的數字15、48和28分別顯示未經神經氨酸酶處理之對照組、以及經神經氨酸酶NanA和NanC處理的樣品組中所檢測到的蛋白質總數。數字20、0和7分別代表單獨在NanA、NanC和未經神經氨酸酶處理之對照組所測得的蛋白質數，而這些蛋白質是其它兩組所未測到的蛋白質，屬於個別神經氨酸酶處理組所獨特作用的蛋白質。數字28、8和8分別在兩處理組重疊的部分，代表在兩處理組中共同測得的蛋白質。在經NanA、NanC和未經神經氨酸酶處理之三組重疊的部分，可測得共同蛋白質數有8種。

第3A圖：神經氨酸酶NanA、NanB和NanC對血清唾液酸醣蛋白作用之差異。經NanA、NanB和NanC處理後，使用西方墨點雜交法和對胎球蛋白A專一結合之抗體，檢測全血清蛋白中所含有的胎球蛋白A。

第3B圖：神經氨酸酶NanA、NanB和NanC對血清唾液酸醣蛋白作用之差 異。經NanA、NanB和NanC處理後，再以花生凝集素收集不帶有唾液酸之醣蛋白，最後使用西方墨點雜交法和對胎球蛋白A專一結合之抗體，檢測已去除掉唾液酸醣基之醣蛋白(asialo-glycoproteins)中所含有的胎球蛋白A。

第4圖：胎球蛋白A對神經氨酸酶NanA、NanB、和NanC之抑制作用。以不同濃度的胎球蛋白A分別與神經氨酸酶NanA、NanB、和NanC作用，之後再作用於紅血球細胞上，最後檢測紅血球細胞呈現T抗原的量。MFI(mean fluorescence intensity)值代表平均螢光強度值。以經螢光素標記的花生凝集素(Fluorescein-PNA)檢測在紅血細胞上的T抗原暴露的數量。

第5圖：檢測胎球蛋白A之含量。以ELISA檢測在正常人、以及溶血性尿毒綜合症、壞死性肺炎之積膿症、和大葉性肺炎之患者血清中胎球蛋白A含量的差別。* * *表示具顯著性差異P值小於0.001(P<0.001)。

第6A圖：以受試者操作特性曲線(receiver operating characteristic curve,ROC curve；簡稱ROC曲線)分級胎球蛋白A之濃度水平。溶血性尿毒綜合症對上壞死性和大葉性肺炎之比較。曲線下面積(area under the curve或簡稱AUC)為0.842；截斷值為298毫克/公升，敏感性為92.9%，特異性為71.9%。

第6B圖：以受試者操作特性曲線(receiver operating characteristic curve,ROC curve；簡稱ROC曲線)分級胎球蛋白A之濃度水平。溶血性尿毒綜合症和壞死性肺炎對上大葉性肺炎的比較。AUC為0.873，截斷值為340毫克/公升，敏 感性為73.5%，特異性為100%。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵和優點更能明顯易懂，下文特舉出較佳實施例，並配合所附圖式，做詳細說明如下：

請參考第1至6B圖關於本發明之使用血清胎球蛋白A作為生物標誌物以檢測肺炎鏈球菌感染時引發溶血性尿毒症的檢測方法，其步驟依序為：甲、源自肺炎鏈球菌感染之兒童患者的血清樣本；乙、檢測血清樣本中唾液酸醣蛋白類之胎球蛋白A的濃度水平；丙、比較在健康兒童對照組血清胎球蛋白A的濃度水平，比對上感染溶血性尿毒症之兒童患者血清樣本的變化，以定義血清胎球蛋白A濃度水平的改變與侵襲性肺炎鏈球菌感染嚴重程度的關聯性；因此，健康兒童的水平為630±250mg/L，當兒童患者血清胎球蛋白A濃度水平為207±80毫克/公升時，可做為溶血性尿毒綜合症的指標。

上述中，檢測血清胎球蛋白A濃度水平的方法為酶聯免疫吸附測定(ELISA)、西方墨點雜交法、免疫螢光標記法，免疫放射檢定法以及包括上述之各種組合。

上述中，所檢測的血清胎球蛋白A還包括胎球蛋白A中所涵蓋之任何重組片段區域的檢測。

上述中，透過測量血清胎球蛋白-A的濃度變化，可作為侵襲性肺炎鏈球菌疾病之兒童患者治療反應和健康恢復狀況的指標。

上述中，生物標誌物胎球蛋白A的濃度水平可做為區別溶血性尿毒症和彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，簡稱 DIC)之不同。

更優選的是，使用血清胎球蛋白A的濃度水平作為生物標誌物可用以決定是否為侵襲性肺炎鏈球菌感染所引起的相關疾病，這些疾病包括肺炎、積膿症、壞死性肺炎、菌血症、溶血性尿毒症、腦膜炎、和複雜的肺炎，以及包括上述之各種組合。

另一實施方式為提供一種檢測肺炎鏈球菌神經氨酸酶之試劑，其以胎球蛋白A 0~10毫克/毫升當作神經氨酸酶所作用之基質，可得知神經氨酸酶NanA、NanB、和NanC的活性。

上述中，抑制每一微克(μg)神經氨酸酶NanA、NanB、和NanC的活性所需的胎球蛋白A濃度分別為2.59毫克/毫升，2毫克/毫升和1.2毫克/毫升，於37℃下作用一小時，再加入紅細胞以量化分析紅細胞唾液酸醣基能有多少量被去除，以顯現TA抗原。

上述中，TA抗原可利用螢光素標記的花生凝集素和細胞流速儀來量化分析所呈現TA抗原的變化量。

上述中，紅血球數目為10,000-20,000顆，約3 x 10⁷細胞數/毫升。

上述中，TA抗原可利用螢光素標記的花生凝集素和細胞流速儀來量化分析所呈現TA抗原的變化量。

如第1A、1B圖所示，在神經氨酸酶NanA、NanB和NanC對α 2-3和α 2-6鍵結型唾液酸基質的特異活性這項研究中，可以證實純化的重組蛋白質NanA、NanB和NanC對唾液酸醣蛋白表面的α 2-6鍵結型唾液酸基質具有不同的特異活性(第1A圖)，但對α 2-3鍵結型唾液酸則都具有活性 (第1B圖)。NanA對α 2-6鍵結型唾液酸具有剪切活性之外，而且對α 2-3鍵結型唾液酸基質的作用，相對於NanB和NanC，具有更高活性。然而NanB和NanC對α 2-6鍵結型唾液酸不具有活性，而只對α 2-3鍵結型唾液酸基質作用(第1B圖)。C-Neu是一種梭狀芽胞桿菌(Clostridium perfringens)的神經氨酸酶，對α 2-3和α 2-6鍵結型唾液酸基質都具有活性，所以當作神經氨酸酶生化活性實驗用之對照組。

如第2A~3B圖所示，在討論被NanA、NanB、NanC作用的唾液酸類醣蛋白和人類血清胎球蛋白A的這項實驗中，花生凝集素(peanut lectin,PNA)所偏好常見的鍵結結構是β-1,3 N半乳糖基-乙醯半乳糖胺(galactoyl(β-1,3)N-acetylgalactosamine，即是TA抗原本身)。為了識別那些被肺炎鏈球菌神經氨酸酶作用後的血清唾液酸醣蛋白是否含有胎球蛋白A，首先以花生凝集素共軛洋菜膠樹脂(peanut lectin conjugated agarose column)捕獲唾液酸醣蛋白，再以乳糖溶液沖洗出唾液酸醣蛋白，以及利用西方墨點雜交法，分析這些沖洗出的唾液酸醣蛋白質圖譜(第2A圖)，進而以液相色層質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，簡稱LC-MS/MS)分析這些沖洗出的唾液酸醣蛋白(第2B圖)。另一方面再利用西方墨點雜交法及專一結合胎球蛋白A的抗體，分析這些沖洗出的唾液酸醣蛋白中是否含有胎球蛋白A(第3A及3B圖)。

上述中，首先以生物素化(biotinylation)處理人類血清中所有的蛋白質，以利於後續實驗的辨識和純化。再經NanA、NanB和NanC處理，以使唾液酸醣蛋白之TA抗原暴露。如此便於以花生凝集素共軛洋菜膠樹脂捕獲那些具有TA抗原呈現的唾液酸醣蛋白，並且再以200mM的乳糖溶液將 唾液酸醣蛋白沖洗出。

上述中，首先利用西方墨點雜交法和含辣根過氧化物酶嵌合的鏈黴菌親和素(streptavidin-HRP)，在聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS Poly-acrylamide-gel-electrophoresis,SDS-PAGE)中分析這些被沖洗出的唾液酸醣蛋白的蛋白質圖譜，即在西方墨點法中顯示出這些先前已生物素化唾液酸醣蛋白SDS-PAGE的相對位置。

如第2A、2B圖所示，實驗結果顯示經NanA、NanB和NanC處理後，有許多的TA抗原暴露之唾液酸醣蛋白可被檢測到。其中在NanB和NanC所處理過的蛋白質圖譜相似，但與NanA所處理的不同(第2A圖)。另一方面利用LC-MS/MS液相色層質譜法分析這些沖洗出的唾液酸醣蛋白質之分子種類。由於NanB和NanC顯示相類似的唾液酸醣蛋白質圖譜(第2A圖)，所以只選擇經NanC處理過的樣品做進一步的液相色層質譜分析。同時分別將經NanA或NanC處理過的樣品，與未經任何神經胺酸酶處理可做為負對照組之樣品做比較。

上述中，我們發現這些最主要被測試分析得的唾液酸醣蛋白質類為免疫球蛋白(Immunoglobulins)、阿樸脂蛋白(apolipoproteins)、纖維蛋白原(fibrinogens)、角蛋白(keratins)、和補體系統蛋白質類(complement system proteins)。卞氏圖表(Venn diagram)顯示結果，定義出48、28、及15種唾液酸醣蛋白質分別來自NanA、NanC、及無任何處理之對照組。如以NanA處理為例，其中有28種是NanA與NanC同樣都會作用的唾液酸醣蛋白質，以及有20種是NanA所獨特作用的唾液酸醣蛋白質，而那是NanC所不會作用的(第2B圖)。

如第3A、3B圖所示，進一步以西方墨點雜交法，分析這些經花生凝集素嵌合的洋菜膠質層析柱(agarose column)沖洗出的唾液酸醣蛋白質中，是否含有胎球蛋白A。經NanA，NanB和NanC處裡的血清樣本中，不管有無以花生凝集素共軛洋菜膠樹脂(peanut lectin conjugated agarose column)捕獲唾液酸醣蛋白的樣品，均存在一種可讓對抗胎球蛋白A抗體所辨識的55 kDa蛋白質分子。然而在未經任何神經氨酸酶處理的血清，再經花生凝集素共軛洋菜膠樹脂(peanut lectin conjugated agarose column)捕獲唾液酸醣蛋白質後，是檢測不出來這個胎球蛋白A的(第3B圖)。

如第3A、3B圖所示，西方墨點雜交法分析還顯示了在經NanA處理的血清，以及再經花生凝集素共軛洋菜膠樹脂捕獲唾液酸醣蛋白的樣品中，相對於經NanB和NanC處裡的血清，含有較多量胎球蛋白A。這可能是由於NanA對α 2-3和α 2-6唾液酸基質具有更廣泛且活躍的酵素活性，然而NanB及NanC則只具有α 2-3唾液酸基質的酵素活性，因此胎球蛋白A被NanA作用後所呈現的TA抗原量則比NanB及NanC作用為多。這也可反映了在胎球蛋白A在多重複性的Galβ1-3GalNAca(即TA抗原)在表面上，如同其它唾液酸醣蛋白，這些蛋白質表面均含有很多TA抗原的殘基之修飾，顯示有些來自α 2-3去唾液酸醣基化作用(desialylation)，而且也有些來自α 2-6去唾液酸醣基化作用的結果(第3B圖)。

上述中，經神經氨酸酶NanA處理過樣品和未經處理的比較時，發現NanA處理過樣品其胎球蛋白A在西方墨點雜交法分析的位置較低，代表胎球蛋白A被NanA的α 2-3和α 2-6去唾液酸醣基化作用(desialylation)，同時也比NanB及NanC只有α 2-3去唾液酸醣基化作用來得 多，因此其分子最小(第3A及3B圖)。

如第4圖所示，接下來以牛胎球蛋白A競爭性地抑制肺炎鏈球菌神經氨酸酶之測試，神經氨酸酶NanA去唾液酸醣基化的活性一般是高於NanB及NanC。當以牛胎球蛋白A當作神經氨酸酶所作用之基質，即可利用來測試其中和50%神經氨酸酶活性所需的濃度。使用不同濃度(劑量依賴方式)的牛胎球蛋白A(0~10毫克/毫升)預先分別與一微克(1μg)NanA、NanB、和NanC於37℃作用一小時，再加入10,000-20,000顆紅細胞(3 x 10⁷細胞數/毫升)，來量化分析紅細胞之唾液酸醣基能有多少量會被去除，進而呈現TA抗原。如此即可利用螢光素標記的花生凝集素(Fluorescein-PNA)和細胞流速儀(flow cytometric analysis,FACScan,Becton Dickinson,USA)來量化分析所呈現TA抗原的變化量。結果顯示要抑制每一微克(μg)NanA、NanB、和NanC的活性所需的胎球蛋白A濃度分別為2.59毫克/毫升，2毫克/毫升和1.2毫克/毫升。

如第5圖所示，實驗檢測胎球蛋白A的濃度水平作為預測溶血性尿毒綜合症和複雜的IPD肺炎患者之生物標誌物。利用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)檢測人類血清中fetuin-A的含量。所使用的夾心酶聯免疫試劑盒之有效濃度範圍介於0.16到1.74ng/ml之間，因此所測試的血清樣品皆因濃度過高而需稀釋處理，以達到有效之濃度測試範圍。

上述中，我們發現溶血性尿毒綜合症患者平均胎球蛋白A的濃度水平(207±80毫克/公升)較低，而與大葉性肺炎患者(610±190毫克/公升)和健康對照組(630±250毫克/公升)相比，則有顯著降低的趨勢(p<0.001) (第5圖)。結果也顯示，雖然壞死性肺炎和積膿症患者胎球蛋白A濃度水平也較低(390±220毫克/公升)，但與大葉性肺炎患者胎球蛋白A濃度水平相比，卻沒有顯著的差異(p<0.73)。連續三次收集來自肺炎鏈球菌腦膜炎和腦膿腫之5歲患者血液樣本，我們發現在急性感染階段，胎球蛋白A濃度水平為236毫克/公升，4周後增加到609毫克/公升，六周後到742毫克/公升。

上述中，這表明可以透過測量血清胎球蛋白A的濃度變化，來監控對IPD病患治療反應和健康恢復狀況的評估。在溶血性尿毒綜合症患者的平均年齡為4.05±4.8歲，而在正常控制組則是5.3±0.6歲，顯示這些被測試者的年齡是相近的。

上述中，當比較被測試者感染肺炎鏈球菌的情況時發現，被測試者尿液中肺炎鏈球菌抗原呈現陽性反應分別是在93%溶血性尿毒綜合症患者、80%複雜的肺炎患者、和42%大葉性肺炎患者中被檢測為陽性。然而，如針對以肺炎鏈球菌的細菌培養方法來檢測時，則發現分別只有64%溶血性尿毒綜合症患者和55%的複雜的肺炎患者樣品(包括血液、腦脊液或胸膜液)中能培養出細菌來，但在所有測試的大葉性肺炎患者樣品中，卻都沒有細菌被培養出來。

如第6A、6B圖所示，是利用受試者操作特徵(ROC)曲線來評估胎球蛋白A的濃度水平，藉由比較溶血性尿毒綜合症患者(HUS)和那些帶有複雜的肺炎和大葉性肺炎之患者(CP/LP)，同時也比較溶血性尿毒綜合症患者和帶有複雜的肺炎患者(HUS/CP)對上那些帶有大葉性肺炎患者(LP)。

上述中，這些曲線是依據其不同的敏感性和特異性，來鑑別 各種不同的截斷值。比較HUS和CP/LP的ROC曲線下面積(area under curve，簡稱AUC)是0.842；當截斷值為298毫克/公升，則其敏感性為92.9%[95%信賴區間(confidence interval，簡稱CI)為68.5%~98.7%]，特異性為71.9%[95% CI為54.6%~84.4%]，消極預測值(negative predictive value，簡稱NPV)為95.8%[95% CI為79.8%~99.2%]，和陰性相似比為0.36[95% CI為0.04~0.36]。當截斷值為298毫克/公升，則有五位是陰性的肺炎鏈球菌感染的溶血性尿毒綜合症患者，和一位是陰性的尿抗原試驗之溶血性尿毒綜合症患者，他們卻可能已被劃分為陽性肺炎鏈球菌感染者(第6A圖)。

上述中，在比較溶血性尿毒綜合症和複雜的肺炎(HUS/CP)與那些大葉性肺炎(LP)之差異時，ROC曲線的AUC為0.873。為了便於分析，截斷值為340毫克/公升，則其敏感性為73.5%(95% CI為56.9%~85.4%)，特異性為100%(95% CI為75.8%~100%)，NPV 57.1%(95% CI為36.5%~75.5%)，和陰性相似比為0.27(95%置信區間：0.10~0.68)(第6B圖)。結果建議當溶血性尿毒綜合症患者血清胎球蛋白A濃度水平低於298毫克/公升時，醫生應該警覺地觀察IPD患者的可能性發展。而當患者血清胎球蛋白A濃度水平低於340毫克/公升時，則可做為複雜性肺炎的指標，包括那些有疑似肺炎鏈球菌感染，而且不管有或沒有溶血尿毒綜合症發生的患者。

綜合上述實施例之說明，當可充分了解本發明之操作、使用及本發明產生之功效，惟以上所述實施例僅係為本發明之較佳實施例，當不能以此限定本發明實施之範圍，即依本發明申請專利範圍及發明說明內容所做簡單的等效變化與修飾，皆屬本發明涵蓋之範圍內。

Claims (3)

1. 一種使用血清胎球蛋白A作為生物標誌物以檢測肺炎鏈球菌感染時引發溶血性尿毒症的檢測方法，其步驟依序為：甲、源自肺炎鏈球菌感染之兒童患者的血清樣本；乙、檢測血清樣本中唾液酸醣蛋白類之胎球蛋白A的濃度水平；丙、比較在健康兒童對照組血清胎球蛋白A的濃度水平，比對上感染溶血性尿毒症之兒童患者血清樣本的變化，以定義血清胎球蛋白A濃度水平的改變與侵襲性肺炎鏈球菌感染嚴重程度的關聯性；因此，健康兒童的水平為630±250mg/L，當兒童患者血清胎球蛋白A濃度水平為207±80毫克/公升時，可做為血溶性尿毒綜合症的指標。
2. 如申請專利範圍1所述使用血清胎球蛋白A作為生物標誌物以檢測肺炎鏈球菌感染時引發溶血性尿毒症的檢測方法，其檢測血清胎球蛋白A濃度水平的方法為酶聯免疫吸附測定(ELISA)、西方墨點雜交法、免疫螢光標記法，免疫放射檢定法以及包括上述之各種組合。
3. 如申請專利範圍1所述之使用血清胎球蛋白A作為生物標誌物以檢測肺炎鏈球菌感染時引發溶血性尿毒症的檢測方法，其中，透過測量血清胎球蛋白-A的濃度變化，可作為侵襲性肺炎鏈球菌疾病之兒童患者治療反應和健康恢復狀況的指標。