KR20170076611A

KR20170076611A - 뇨 대사체에서 발굴된 폐렴연쇄상구균 유래 ABC-NBD, pstS, csrR 단백질을 이용한 진단방법

Info

Publication number: KR20170076611A
Application number: KR1020160178999A
Authority: KR
Inventors: 김승일; 최치원; 김건화
Original assignee: 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2015-12-24
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2017-07-04

Abstract

본 발명은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 감염 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 폐렴환자의 소변에서 분리한 폐렴연쇄상구균 유래 단백질을 이용하여 폐렴연쇄상구균 감염 여부 진단에 이용할 수 있다.

Description

뇨 대사체에서 발굴된 폐렴연쇄상구균 유래 ABC-NBD, pstS, csrR 단백질을 이용한 진단방법{Diagnostic method for Pneumonia using ABC-NBD, pstS and csrR discovered in urine proteomics from Streptococcus pneumoniae}

본 발명은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 감염 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것이다.

연쇄구균(Streptococcus)은 사람의 구강과 호흡기도에 존재하는 이질적인 그람양성세균 군으로, 주요 병원성균인 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 파이오젠스(S. pyogenes) 및 화농성연쇄상구균(S. agalactiae)를 포함한 48종으로 구성된다(Facklam et al., Clin Microbiol Rev, 15:613-630, 2002).

일반적으로 연쇄구균은 16S rDNA 염기서열에 의하여 'pyogenic', 'mitis', 'salivarius', 'bovis', 'mutans' 및 'anginosus' 군 균 등 6개의 분류군으로 구성되며(Kawamura et al., Int J Syst Bacteriol, 45:406-408, 1995), 혈청학적 특성에 기준하여 A-H, K-M 및 O-V(Lancefield et al., J Exp Med, 145:490-499, 1977)로 분류되며, 적혈구에 대한 용혈성(alpha, beta 및 gamma) 및 생화학적 성상에 의해서 서로 감별된다(Coykendall, Clin Microbiol Rev, 2:315-328, 1989; Whiley et al., Oral Microbiol Immunol, 13:195-216, 1998).

상기 'mitis' 군 균에 속하는 균들은 스트렙토코커스 미티스(S. mitis), 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis), 스트렙토코커스 고도니(S. gordonii), 스트렙토코커스 상기우스(S. sangius) 및 스트렙토코커스 파라상기우스(S. parasangius)등이 있다. 이 중 폐렴구균은 사람의 구강에 존재하는 상주균으로 건강한 사람의 40~60%가 보균자인데, 보균자의 대다수는 병독성이 약한 종류의 균을 지니고 있고 보균상태도 영구적이 아니라 산발적이며 간헐적인 것이 특징이다. 이러한 폐렴구균은 호흡기를 통하거나 맥관 계통에 의해서 확산되며, 신체의 다른 부위로 이동하여 폐렴, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염, 심내막염 및 패혈증 등을 일으키며(Suzuki et al., J Clin Microbiol, 43: 4528-4534, 2005), 미국에서는 연간 500,000건의 폐렴감염 환자의 원인체로, 40,000명의 사망을 초래한다(Williams et al., Ann Intern Med, 108: 616-625, 1988).

시료로서 소변이 갖는 특징은 다른 생체 시료에 비해 쉽게 채취 가능하고, 다양한 특성을 갖으며 신장 유래 단백질과(약 70%) 혈장 유래 단백질(약 30%)을 모두 포함하고 있고 다른 생체 시료보다 장기간 저장이 가능한 장점을 가지고 있다. 그러나 소변 시료는 염(salt)의 존재, 다른 방해 요인 및 특정 질병에서 알부민 같은 혈청 단백질이 우세한 경우가 있어 분석에 어려움을 갖는다. 그로 인해 적은 양으로 존재할 수 있는 바이오 마커로 가능성이 있는 단백질들을 동정해 내기 어렵다. 따라서 소변시료의 분석에 있어 단백질 및 펩티드의 손실을 최소화할 수 있는 탈염방법을 개발하고, 바이오 마커를 발굴하기 위한 단백질 및 펩티드의 동정 효율을 높이는 방법이 요구된다.

LC-MS/MS를 이용한 요단백질체(urine proteomics) 분석과 생물정보학적(bioinfomatics) 분석을 통해 폐렴환자 소변에서 검출되는 폐렴 원인균의 특이적 단백질을 선별하고, 타겟 항원 단백질에 대한 항체를 생산하여 높은 특이성과 민감도를 갖는 항원과 항체를 최종 선정한 후, 면역진단 키트 개발하고 이를 상용화한다면 기존 진단 기법과 비교하여 비용적 시간적 측면에서 훨씬 저렴하고 빠르게 감염 여부와 감염균을 진단할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 폐렴연쇄상구균에 감염된 폐렴환자의 소변에서 폐렴연쇄상구균의 특정 단백질이 검출되는 것을 확인하였으며, 이로부터 폐렴환자의 소변에서 확보한 폐렴연쇄상구균의 특정 단백질을 분리하고 이를 이용하여 폐렴연쇄상구균에 의한 폐렴 진단에 활용될 수 있는 바이오 마커를 제공하고자 하였다.

본 발명의 목적은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 감염 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 pstS(phosphate ABC transporter substrate+B766-binding protein), carR(DNA-binding response regulator protein) 또는 ABC-NBD(sugar ABC transporter ATP-binding protein)에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는, 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 감염 여부 확인용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 개체로부터 분리된 시료에서 제 1항의 키트를 이용하여 pstS, carR 또는 ABC-NBD 단백질을 검출하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 검출된 수준을 정상 대조군의 검출 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐렴연쇄상구균 감염 여부 진단 방법을 제공한다.

도 1은, 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 감염에 의한 폐렴환자와 대조군인 정상인의 소변시료의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
A-E : 폐렴연쇄상구균 감염환자의 소변 시료;
1-10 : LC-MS 분석 번호; 및
C1~C3 : 건강한 사람의 소변 시료.
도 2는, LC-MS/MS를 이용한 폐렴환자 소변 분석법의 흐름도를 도식화한 것이다.
도 3은, 바이오마커 후보물질의 시퀀스 커버리지 검사 결과를 나타낸 도이다.
도 4는, 항원(pstS, ABC-NBD)의 항체를 이용한 폐렴환자 및 정상인의 소변시료의 Dot Blotting 결과를 나타낸 도이다:
C : 건강한 사람의 소변 시료;
P : BinaxNOW 진단키트에서 폐렴 양성으로 나온 소변 시료;
WP : BinaxNOW 진단키트에서 폐렴 위양성(week positive)으로 나온 소변 시료; 및
N : BinaxNOW 진단키트에서 폐렴 음성으로 나온 소변 시료.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 pstS(phosphate ABC transporter substrate+B766-binding protein), carR(DNA-binding response regulator protein) 또는 ABC-NBD(sugar ABC transporter ATP-binding protein)에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는, 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 감염 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 pstS는 서열번호 1로 기재되는 것이 바람직하며, 상기 carR는 서열번호 2로 기재되는 것이 바람직하고, 상기 ABC-NBD는 서열번호 3으로 기재되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 폐렴연쇄상구균 유래 단백질을 분리하기 위해 중환자실 및 호흡기내과를 통해 24명의 폐렴환자로부터 확보된 소변 시료로부터 염(salt) 등을 제거하고 3 kDa 이상의 단백질들만을 모아 전기영동을 실시하였다(도 1 참조). 전기영동 결과를 토대로 LC-MS/MS를 하기 위해 gel을 분리한 후 In-gel digestion을 실시하여 펩티드(peptide)화 하여 LC-MS/MS는 LTQ-Velos(Thermo, USA)를 사용하였고 여기서 얻은 시료에 대한 스펙트럼을 이용하여 단백질 동정에 사용하였다(도 2 참조). LC-MS/MS 결과로부터 폐렴연쇄상구균 유래 단백질을 동정하고 분리하기 위해 MASCOT(Ver 2.4)을 이용하였으며 프로그램에 정상인에서 동정된 단백질 및 요도 감염 세균 유래 펩타이드를 제거하여 폐렴연쇄상구균에서 유래한 단백질 중 90% 이상 일차하는 단백질 3개를 분리하였다(표 1 내지 표 4 참조).

따라서, 상기 폐렴환자의 소변에서 분리한 폐렴연쇄상구균 유래 단백질을 이용하여 폐렴연쇄상구균 감염 여부 확인에 이용할 수 있다.

본 발명에서 폐렴연쇄상구균 감염 진단에 있어서 사용되는 표현 "단백질 발현수준 측정"은 생물학적 시료에서 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA:Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 새로운 폐렴 진단용 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 폐렴 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 효소의 활성형에 결합하는 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 폐렴연쇄상구균의 감염 여부를 진단하기 위하여 상기 단백질군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 각각 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)을 포함하며, 보다 바람직하게는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭 항체이고, 보다 더 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명에서, 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것이 바람직하다.

또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)인 것이 바람직하다. 본 발명에서, 상기 항체는 상기 서술한 20개의 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있으나, 바람직하게는, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 가장 바람직하게는 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.

본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에 따른 폐렴연쇄상구균 감염 여부 확인용 키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 전형적으로 동결 건조 형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorophore), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

한편, 일 구체예에 따른 단일클론 항체는 면역분석 키트(예를 들어, ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 폐렴연쇄상구균 감염 여부 검출 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에도 이용될 수 있다.

상기 키트는 예를 들어, 면역분석에 사용될 수 있으며, 상기 뉴로텐신 및/또는 콜레시스토키닌 검출 방법은 면역분석에 기초한 방법을 설명한 것이다. 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예를 들어, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 표지된 항체가 뉴로텐신 및/또는 콜레시스토키닌을 검출하는 데 이용될 수 있다.

상기 키트가 예를 들어, ELISA 방법을 이용하도록 제작되는 경우, 상기 키트를 이용한 특정 실시예는 (i) 정상인 개체와 폐렴연쇄상구균 감염이 의심되는 개체의 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 뉴로텐신 또는 콜레시스토키닌 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 시료를 접촉시켜 항원-항체 반응을 유도시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예를 들어, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 겔이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(pphenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 tNBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

아울러, 본 발명은

상기 분석 방법을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 폐렴 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 폐렴 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 폐렴 의심 환자의 실제 폐렴 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 폐렴 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에 는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 폐렴 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 폐렴 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 폐렴 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 폐렴 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 폐렴이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 폐렴 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 폐렴 조직 및 폐렴으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출 라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 폐렴 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 폐렴 발병 여부를 확인할 수 있다. 본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨를 의미하고, 가장 바람직하게는 뇨를 의미한다.

이에, 본 발명의 상기 폐렴환자의 소변에서 분리한 폐렴연쇄상구균 유래 단백질을 이용하여 폐렴연쇄상구균 감염 여부 진단에 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 폐렴환자 유래 단백질의 확보

<1-1> 폐렴 환자의 소변으로부터 단백질 스크리닝

본 발명에서는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 유래 단백질을 분리하기 위해 폐렴환자의 소변을 확보하였다.

구체적으로, 중환자실 및 호흡기내과를 통해 24명의 폐렴환자로부터 소변을 확보하였다. 확보된 소변 시료는 Binox NOW streptococcus pneumoniae(Alere, USA) 키트를 이용하여 양성반응을 나타내는 시료 5개를 확보하였다. 그리고 대조군으로써 건강한 성인 3명의 소변시료를 확보하였다. 상기 시료들을 3 kDa vivaspin(Sartorius, USA)으로 4,500 rpm으로 회전시켜 필터링하여 염(salt) 등을 제거하고 3 kDa 이상의 단백질들만을 모아 100 ul씩 동결건조 하였다. 동결건조된 시료는 SDS-sample buffer 20 ㎕에 녹여 12% SDS gel에 로딩하여 120 V로 1시간30분간 전기영동을 실시하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다(도 1).

<1-2> LC - MS / MS 분석

상기 실시예 <1-1>에서 얻은 전기영동 결과를 토대로 LC-MS/MS를 실시하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 전기영동하여 분리한 gel을 한 레인당 6개로 잘라 총 36개로 나누어 In-gel digestion을 실시하였다. 각 gel을 가로세로 1 mm의 크기로 자른 뒤 55 mM DTT(dithiothreitol) 첨가 후 1시간 반응시켰으며 100 mM IAA(Iodoacetamide)를 넣고 암실에서 50분간 처리 후 Trypsin 0.1 ㎍을 첨가하여 37℃에서 16~18시간 반응시켜 펩티드(peptide)화 시켰다. 그 후 펩티드(peptide)가 들어있는 상등액을 취합하여 Speed vac으로 건조시켰다. 건조된 시료는 각각 15 ㎕ solvent A(DW+0.1% FA)로 녹여 LC-MS/MS를 실시하였다. 각각의 시료 5 ㎕씩을 nanoACQUITY UPLC(Waters, USA)에서 2G-V/VTrap 5 um Symmetry® C18(180 um x 20 mm) trapping column(Waters, Ireland)을 이용하여 포착(trapping) 하였고 이렇게 포착된 펩티드는 10 cm × 5 μm i.d. C18 reversephase column(PROXEON, Denmark)을 이용하여 solvent B(80% ACN+0.1% FA)로 70분간 농도구배(gradient)의 조건에서 분리를 하였다. LC-MS/MS는 LTQ-Velos(Thermo, USA)를 사용하였다. 여기서 얻은 시료에 대한 스펙트럼을 이용하여 단백질 동정에 사용하였다. 정확도를 높이기 위해 같은 시료는 3회씩 반복하였다(도 2).

< 실시예 2> 폐렴연쇄상구균( Streptococcus pneumoniae ) 유래 단백질의 확보

상기 실시예 <1-2>에서 분석한 LC-MS/MS 결과로부터 폐렴연쇄상구균 유래 단백질을 동정하고 분리하기 위해 MASCOT(Ver 2.4)을 이용하였다.

구체적으로, MASCOT search 프로그램에 S. pneumoniae R6 단백질 데이터베이스를 등록한 다음 LC-MS/MS 스펙트럼을 넣어 데이터 베이스와 일치하는 펩타이드들을 검출하였고 폐렴연쇄상구균 유래의 단백질을 선별하였다. 또한, 폐렴환자와 정상인의 결과를 비교하여 정상인에서 동정된 단백질은 제거하기 위해, MASCOT search 프로그램에 인간(Human) 단백질 데이터 베이스를 등록하고 상기 폐렴연쇄상구균 search에 사용한 결과를 입력하고 소변에서 검출된 사람 유래 단백질을 동정하였다. 여기서 나온 펩티드서열과 폐렴연쇄상구균 데이터 베이스에서 나온 펩티드들을 비교하여 겹치는 펩티드를 제거하여 폐렴환자 소변에서 폐렴연쇄상구균에서 유래한 단백질을 분리하였다. 또한, 여기서 요도에 감염되는 세균 유래 펩타이드를 제거하기 위해 요도 감염 세균들의 단백질 서열 데이터베이스를 이용하여 검색한 후, 일치하는 단백질을 제거하였다. 정확도를 높이기 위해, 3회 반복한 결과에서 2회 이상 동정 된 단백질만 정리하였고 그 결과를 표 1에 나타내었다(표 1).

도 3 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 폐렴환자 소변에서 발굴된 폐렴연쇄상구균 유래 단백질의 각각의 유전자 이름과 단백질 이름, 분자량, pI, 단백질 길이 및 전체 리스트 중에서 차지하는 양에 따른 순위(rank), 3회 반복에 따른 평균값, 표준편차, 3회 분석중 카운팅(count)된 수를 나타내었으며(표 1 내지 표 3), 이 중에서 90%이상 일치하는 단백질을 확인하였고(표 4 및 도 3), 그 단백질들은 pstS(phosphate ABC transporter substrate+B766-binding protein), carR(DNA-binding response regulator) 및 ABC-NBD(sugar ABC transporter ATP-binding protein)으로 확인되었다.

폐렴 환자 소변에서 발굴된 폐렴연쇄상구균 유래 단백질

유전자	설명	MW	pI	cello 2.5	대조군
유전자	설명	MW	pI	cello 2.5	rank	average	count
spr0156	flavoprotein NrdI	22779	6.9	Cytoplasmic	4	5.707491794	3
spr1205	hypothetical protein	101476	5.78	Cytoplasmic	56	1.285100384	2
spr0553	HIT family protein	19607	6.46	Cytoplasmic	18	3.05758489	3
ABC - NBD ^*	sugar ABC transporter ATP-binding protein	55029	5.47	Cytoplasmic	33	2.13592233	1
kdgA	keto-hydroxyglutarate-aldolase/keto-deoxy-phosphogluconate aldolase	22068	5.04	Cytoplasmic	22	2.649906904	3
pstS ^*	phosphate ABC transporter substrate+B766-binding protein	33261	6.85	Extracellular			0
ftsE	ABC transporter ATP-binding protein	25781	9.58	Cytoplasmic	29	2.242228919	3
csrR ^*	DNA-binding response regulator	26863	6.56	Cytoplasmic			0
mutR	positive transcriptional regulator MutR	33156	7.57	Cytoplasmic	40	1.834550934	3
serS	seryl-tRNA synthetase	47694	4.99	Cytoplasmic	63	1.223033956	3
spr0695	hypothetical protein	45249	5.61	OuterMembrane	63	1.223033956	3
ABC-NBD	ABC transporter ATP-binding protein	58360	5.18	Cytoplasmic	55	1.324445268	3
gatB	aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase subunit B	53625	5.09	Cytoplasmic	81	1.019194963	3
pulA	alkaline amylopullulanase	140193	5.46	Periplasmic	106	0.417342221	2

	P1			P2			P3
유전자	rank	average	count	rank	average	count	rank	average	count
spr0156	2	6.0359	3	1	7.0351	3	3	4.9229	3
spr1205	38	0.5437	3	34	0.7538	3	38	0.5275	3
spr0553	6	2.7187	3	5	3.7688	3	10	2.6373	3
ABC - NBD ^*	7	2.4113	3	11	2.605	2	11	2.6219	3
kdgA	8	2.3562	3	7	3.2663	3	14	2.3211	2
pstS ^*	11	2.1718	3	4	4.25	2	15	2.0934	3
ftsE	12	1.9937	3	9	2.7638	3	16	1.934	3
csrR ^*	12	1.9937	3	9	2.7638	3	16	1.934	3
mutR	17	1.6312	3	13	2.2613	3	20	1.5824	3
serS	25	1.0875	3	22	1.5075	3	26	1.0549	3
spr0695	25	1.0875	3	22	1.5075	3	21	1.4524	3
ABC-NBD	32	0.9062	3	27	1.2563	3	36	0.8791	3
gatB	32	0.9062	3	27	1.2563	3	36	0.8791	3
pulA	39	0.3625	3	33	0.8037	2	41	0.344	2

	P4			P5
유전자	rank	average	count	rank	average	count
spr0156	1	5.0653	3	1	6.3465	3
spr1205	39	0.7094	3	37	0.68	3
spr0553	8	2.7135	3	7	3.3999	3
ABC - NBD ^*	11	2.3233	3	6	3.4252	2
kdgA	12	2.263	2	10	2.9466	3
pstS ^*	14	2.1281	3	17	1.8134	2
ftsE	15	1.9899	3	12	2.4932	3
csrR ^*	15	1.9899	3	12	2.4932	3
mutR	18	1.6281	3	16	2.0399	3
serS	21	1.5089	3	23	1.36	3
spr0695	28	1.0854	3	23	1.36	3
ABC-NBD	34	0.9045	3	31	1.1333	3
gatB	37	0.8704	2	28	1.2659	2
pulA	43	0.4729	3	41	0.403	2

^* 시퀀스 커버리지 90% 이상의 후보 물질

	유전자 이름	단백질 이름	서열번호
단백질 서열	pstS	phosphate ABC transporter substrate+B766-binding protein	서열번호 1
	ABC-NBD	sugar ABC transporter ATP-binding protein	서열번호 2
	csrR	DNA-binding response regulator	서열번호 3
DNA 서열	pstS	phosphate ABC transporter substrate+B766-binding protein	서열번호 4
	ABC-NBD	sugar ABC transporter ATP-binding protein	서열번호 5
	csrR	DNA-binding response regulator	서열번호 6

< 실시예 3> 발굴 단백질을 이용한 폐렴 감염의 진단

본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 발굴한 폐렴환자 소변 유래 단백질을 이용하여 실제 폐렴 감염 여부를 진단하고자, pstS 및 ABC-NBD에 대한 항체를 토끼를 이용하여 제작하고 폐렴환자 및 정상인의 소변시료를 이용하여 Dot-Blotting 테스트를 진행하였다.

구체적으로, 소변 시료로써 대조군인 건강한 사람의 소변과 폐렴연쇄상구균 감염에 의한 폐렴 환자의 소변을 이용하였다. 폐렴 환자의 소변은 폐렴연쇄상구군의 진단 키트로 알려져 있는 BinaxNOW kit를 이용하여 위양성(week positive) 또는 양성 결과가 나온 환자의 소변을 이용하였다. 소변의 사용양은 각각 100 ul로 하였다. 항체의 희석비율의 경우 pstS는 1:5,000, ABC-NBD는 1:10,000으로 3% skim milk로 희석하였고 16시간 반응시켰다. 그 후 TBST로 5분씩 3회 걸쳐 씻은 후, 2차 항체(anti-rabbit IgG)를 1:6,000 비율로 3% skim milk로 희석하여 두 시간 반응 시킨 후 TBST로 5분씩 3회 걸쳐 씻어내었다. 그 후 ECL kit을 사용하여 발색시켰다(도 4).

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 정상인 소변 및 BinaxNOW 진단 음성 소변에서와 달리 폐렴환자의 소변에서 발색이 강하게 나타난 것을 확인하였다(도 4).

<110> Korea Basic Science Institute <120> Diagnostic method for Pneumonia using ABC-NBD, pstS and csrR discovered in urine proteomics from Streptococcus pneumoniae <130> 2016P-12-025 <150> KR 10-2015-0186170 <151> 2015-12-24 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS_P <400> 1 Met Leu Asp Tyr Lys Cys Ser Lys Pro Thr Gln Glu Lys Tyr Ile Glu 1 5 10 15 Ile Lys Val Ile Ile Met Lys Phe Lys Lys Met Leu Thr Leu Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Leu Ser Gly Phe Gly Leu Val Ala Cys Gly Asn Gln Ser Ala 35 40 45 Ala Ser Lys Gln Ser Ala Ser Gly Thr Ile Glu Val Ile Ser Arg Glu 50 55 60 Asn Gly Ser Gly Thr Arg Gly Ala Phe Thr Glu Ile Thr Gly Ile Leu 65 70 75 80 Lys Lys Asp Gly Asp Lys Lys Ile Asp Asn Thr Ala Lys Thr Ala Val 85 90 95 Ile Gln Asn Ser Thr Glu Gly Val Leu Ser Ala Val Gln Gly Asn Ala 100 105 110 Asn Ala Ile Gly Tyr Ile Ser Leu Gly Ser Leu Thr Lys Ser Val Lys 115 120 125 Ala Leu Glu Ile Asp Gly Val Lys Ala Ser Arg Asp Thr Val Leu Asp 130 135 140 Gly Glu Tyr Pro Leu Gln Arg Pro Phe Asn Ile Val Trp Ser Ser Asn 145 150 155 160 Leu Ser Lys Leu Gly Gln Asp Phe Ile Ser Phe Ile His Ser Lys Gln 165 170 175 Gly Gln Gln Val Val Thr Asp Asn Lys Phe Ile Glu Ala Lys Thr Glu 180 185 190 Thr Thr Glu Tyr Thr Ser Gln His Leu Ser Gly Lys Leu Ser Val Val 195 200 205 Gly Ser Thr Ser Val Ser Ser Leu Met Glu Lys Leu Ala Glu Ala Tyr 210 215 220 Lys Lys Glu Asn Pro Glu Val Thr Ile Asp Ile Thr Ser Asn Gly Ser 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ile Thr Ala Val Lys Glu Lys Thr Ala Asp Ile Gly Met 245 250 255 Val Ser Arg Glu Leu Thr Pro Glu Glu Gly Lys Ser Leu Thr His Asp 260 265 270 Ala Ile Ala Leu Asp Gly Ile Ala Val Val Val Asn Asn Asp Asn Lys 275 280 285 Ala Ser Gln Val Ser Met Ala Glu Leu Ala Asp Val Phe Ser Gly Lys 290 295 300 Leu Thr Thr Trp Asp Lys Ile Lys 305 310 <210> 2 <211> 511 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ABC-NBD_P <400> 2 Met Ala His Glu Asn Val Ile Glu Met Arg Asp Ile Thr Lys Val Phe 1 5 10 15 Gly Gly Phe Val Ala Asn Asp Lys Ile Asn Leu His Leu Arg Lys Gly 20 25 30 Glu Ile His Ala Leu Leu Gly Glu Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu 35 40 45 Met Asn Met Leu Ala Gly Leu Leu Glu Pro Thr Ser Gly Glu Ile Ala 50 55 60 Val Asn Gly Gln Val Val Asn Leu Asp Ser Pro Ser Lys Ala Ala Ser 65 70 75 80 Leu Gly Ile Gly Met Val His Gln His Phe Met Leu Val Glu Ala Phe 85 90 95 Thr Val Ala Glu Asn Ile Ile Leu Gly Ser Glu Leu Thr Lys Asn Gly 100 105 110 Val Leu Asp Ile Ala Gly Ala Ser Lys Glu Ile Lys Ala Leu Ser Glu 115 120 125 Arg Tyr Gly Leu Ala Val Asp Pro Ser Ala Lys Val Ala Asp Ile Ser 130 135 140 Val Gly Ala Gln Gln Arg Val Glu Ile Leu Lys Thr Leu Tyr Arg Gly 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Ile Phe Asp Glu Pro Thr Ala Val Leu Thr Pro Ser 165 170 175 Glu Ile Asp Glu Leu Met Ala Ile Met Lys Asn Leu Val Lys Glu Gly 180 185 190 Lys Ser Ile Ile Leu Ile Thr His Lys Leu Asp Glu Ile Arg Ala Val 195 200 205 Ser Asp Arg Val Thr Val Ile Arg Arg Gly Lys Ser Ile Glu Thr Val 210 215 220 Glu Ile Ala Gly Ala Thr Asn Ala Asp Leu Ala Glu Met Met Val Gly 225 230 235 240 Arg Ser Val Ser Phe Lys Thr Glu Lys Gln Ala Ser Lys Pro Lys Glu 245 250 255 Val Val Leu Ser Ile Lys Asp Leu Val Val Asn Glu Asn Arg Gly Val 260 265 270 Pro Ala Val Lys Asn Leu Ser Leu Asp Val Arg Ala Gly Glu Ile Val 275 280 285 Gly Ile Ala Gly Ile Asp Gly Asn Gly Gln Ser Glu Leu Ile Gln Ala 290 295 300 Ile Thr Gly Leu Arg Lys Val Glu Ser Gly Ser Ile Glu Leu Lys Gly 305 310 315 320 Asp Ser Ile Val Gly Leu His Pro Arg Gln Ile Thr Glu Leu Ser Val 325 330 335 Gly His Val Pro Glu Asp Arg His Arg Asp Gly Leu Ile Leu Glu Met 340 345 350 Met Ile Ser Glu Asn Ile Ala Leu Gln Thr Tyr Tyr Lys Glu Pro His 355 360 365 Ser Lys Asn Gly Ile Leu Asn Tyr Ser Asn Ile Thr Ser Tyr Ala Lys 370 375 380 Lys Leu Met Glu Glu Phe Asp Val Arg Ala Ala Ser Glu Leu Val Pro 385 390 395 400 Ala Ala Ala Leu Ser Gly Gly Asn Gln Gln Lys Ala Ile Ile Ala Arg 405 410 415 Glu Ile Asp Arg Asp Pro Asp Leu Leu Ile Val Ser Gln Pro Thr Arg 420 425 430 Gly Leu Asp Val Gly Ala Ile Glu Tyr Ile His Lys Arg Leu Ile Glu 435 440 445 Glu Arg Asp Asn Gly Lys Ala Val Leu Val Val Ser Phe Glu Leu Asp 450 455 460 Glu Ile Leu Asn Val Ser Asp Arg Ile Ala Val Ile His Asp Gly Lys 465 470 475 480 Ile Gln Gly Ile Val Ser Pro Glu Thr Thr Asn Lys Gln Gly Leu Gly 485 490 495 Val Leu Met Ala Gly Gly Asn Leu Gly Lys Glu Lys Ser Asp Val 500 505 510 <210> 3 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> csrR_P <400> 3 Met Gly Lys Arg Ile Leu Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asn Leu Ala His 1 5 10 15 Phe Leu Ser Leu Glu Leu Gln Lys Glu Gln Tyr Arg Val Asp Leu Val 20 25 30 Glu Glu Gly Gln Lys Ala Leu Ser Met Ala Leu Gln Thr Asp Tyr Asp 35 40 45 Leu Ile Leu Leu Asn Val Asn Leu Gly Asp Met Met Ala Gln Asp Phe 50 55 60 Ala Glu Lys Leu Ser Arg Thr Lys Pro Ala Ser Val Ile Met Ile Leu 65 70 75 80 Asp His Trp Glu Asp Leu Gln Glu Glu Leu Glu Val Val Gln Arg Phe 85 90 95 Ala Val Ser Tyr Ile Tyr Lys Pro Val Leu Ile Glu Asn Leu Val Ala 100 105 110 Arg Ile Ser Ala Ile Phe Arg Gly Arg Asp Phe Ile Asp Gln His Cys 115 120 125 Ser Leu Met Lys Val Pro Arg Thr Tyr Arg Asn Leu Arg Ile Asp Val 130 135 140 Glu His His Thr Val Tyr Arg Gly Glu Glu Met Ile Ala Leu Thr Arg 145 150 155 160 Arg Glu Tyr Asp Leu Leu Ala Thr Leu Met Gly Ser Lys Lys Val Leu 165 170 175 Thr Arg Glu Gln Leu Leu Glu Ser Val Trp Lys Tyr Glu Ser Ala Thr 180 185 190 Glu Thr Asn Ile Val Asp Val Tyr Ile Arg Tyr Leu Arg Ser Lys Leu 195 200 205 Asp Val Lys Gly Gln Lys Ser Tyr Ile Lys Thr Val Arg Gly Val Gly 210 215 220 Tyr Thr Met Gln Glu 225 <210> 4 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS <400> 4 ttgttagact ataaatgtag taagcctaca caagaaaaat acatagagat aaaggtgatt 60 attatgaaat tcaaaaaaat gcttactctt gcagccattg gcttatcagg atttgggctt 120 gttgcctgtg gcaatcagtc agctgcttcc aaacagtcag cttcaggaac gattgaggtg 180 atttcacgag aaaatggctc tggaacacgg ggtgccttca cagaaatcac agggattctc 240 aaaaaagacg gtgataaaaa aattgacaac actgccaaaa cagctgtgat tcaaaatagt 300 acagaaggtg ttctctcagc agttcaaggg aatgctaatg ctatcggcta catctccttg 360 ggatctttaa cgaaatctgt caaggcttta gagattgatg gtgtcaaggc tagtcgagac 420 acagttttag atggtgaata ccctcttcaa cgtcccttca acattgtttg gtcttctaat 480 ctttccaagc taggtcaaga ttttatcagc tttatccact ccaaacaagg tcaacaagtg 540 gtcacagata ataaatttat tgaagctaaa actgaaacca cagaatatac aagccaacac 600 ttatcaggca agttgtctgt tgtaggttcc acttcagtat cttctttaat ggaaaaatta 660 gcagaagctt ataaaaaaga aaatccagaa gttacgattg atattacctc taatgggtct 720 tcagcaggta ttaccgctgt taaggagaaa accgctgata ttggtatggt ttctagggaa 780 ttaactcctg aagaaggtaa gagtctcacc catgatgcta ttgctttaga cggtattgct 840 gttgtggtca ataatgacaa taaggcaagc caagtcagta tggctgaact tgcagacgtt 900 tttagtggca aattaaccac ctgggacaag attaaataa 939 <210> 5 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABC-NBD <400> 5 gtgattggag gcaagaatat ggataaagat tatatattaa aagtgaaagg gctgtatcat 60 caatttttac taggaaataa taaaacgttg caagtgctga aaaatgtttc tctttctgct 120 tcgagaggag aatttataag tattctagga attagtggtt ctggaaagtc aactttatta 180 aaatgtattt ctagtttgct tgaaccaaca agtggggaag taattttaaa tggaatcaac 240 ccctataaaa tcagaaatgc aaaattgtca agtataagac gtaacgaagt atcttttata 300 tttcaagcat acaatttaat accttccctg ccggtaatag aaaatatagc acttcctttg 360 cgattatcac aaaaaaaatt aactattaaa aatgtagaaa acttactcaa aagaatgaag 420 tttaatgctg gcttaaacga ttttgttgga actctgtctg gtggagaaca acagaaggtt 480 gctatagcta gagcggttat tgctgatagt gatataatat ttgctgatga gccaactggg 540 gctttagaca gcgtttctcg tgaagtaatt tttgaattat tgagagagtt agtaggggcg 600 ggtaagtgtg taattatggt aacgcacgat atagaattgg cctcgaaaac tgatcgtgca 660 ttaatattga aagatggaaa aattttcaaa gaacttcata gacctagcgg ggaagagttg 720 tataaaatct tagaggtaca atcaactacg gaggaatag 759 <210> 6 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrR <400> 6 atggggaaac ggattttatt acttgagaaa gaacgaaatc tagctcattt tttaagtttg 60 gaactccaga aagagcagta tcgggttgat ctggtagagg aggggcaaaa agccctctcc 120 atggctcttc agacagacta tgatttgatt ttattgaacg ttaatctggg agatatgatg 180 gctcaggatt ttgcagaaaa attgagccga actaaacctg cctcagtcat catgatttta 240 gatcattggg aagacttgca agaagagctg gaagttgttc agcgttttgc agtttcatac 300 atctataagc cagtccttat cgaaaatctg gtagcgcgta tttcggcgat cttccgaggt 360 cgggacttca ttgatcaaca ctgcagtctg atgaaagttc caaggaccta ccgcaatctt 420 aggatagatg ttgaacatca cacggtttat cgtggtgaag agatgattgc tctgacacgc 480 cgtgagtatg accttttggc gacacttatg ggaagcaaga aagtattgac tcgtgagcaa 540 ttgttggaaa gtgtttggaa gtatgaaagt gcgaccgaga caaatatcgt agatgtctat 600 atccgctatc tacggagcaa gcttgatgtt aaaggacaaa aaagctacat taaaactgtg 660 cgtggtgttg gatataccat gcaagaatag 690

Claims

pstS(phosphate ABC transporter substrate+B766-binding protein), carR(DNA-binding response regulator protein) 또는 ABC-NBD(sugar ABC transporter ATP-binding protein)에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는, 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 감염 여부 확인용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 pstS는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 폐렴연쇄상구균 감염 여부 확인용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 carR는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 폐렴연쇄상구균 감염 여부 확인용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 ABC-NBD는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 폐렴연쇄상구균 감염 여부 확인용 키트.
1) 개체로부터 분리된 시료에서 제 1항의 키트를 이용하여 pstS, carR 또는 ABC-NBD 단백질을 검출하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 검출된 수준을 정상 대조군의 검출 수준과 비교하는 단계;
를 포함하는, 폐렴연쇄상구균 감염 여부 진단 방법.
제 5항에 있어서, 상기 시료는 소변, 뇌척수액, 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 단백질 검출 방법은 항원-항체 결합반응 방식인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 항원-항체 결합반응은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 ELISA법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 및 SPR(surface plasmon resonance)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.