CN118006744A - 一种定量检测TP53基因拷贝数变异的ddPCR方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于ddPCR检测TP53基因拷贝数变异的检测方法和试剂盒，其引物和探针是根据TP53和RPP30基因DNA序列设计的，针对TP53基因第5和第7外显子基因序列分别设计了两条探针，针对RPP30基因第7外显子基因序列设计了一条探针，当TP53基因存在拷贝数变异时，通过ddPCR即可检测出其第5和/或第7外显子的拷贝数与RPP30基因拷贝数的比值发生了相应变化。本发明的试剂盒检测TP53基因拷贝数变异操作简单，灵敏度高，重复性好，价格低廉。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种定量检测TP53基因拷贝数变异的方法和试剂盒。
背景技术
肿瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)基因位于人类染色体17p13.1，共有13个外显子，编码一种分子量为53kDa的抑癌蛋白。TP53突变是急性髓系白血病(AML)的不良预后因素之一，且即使在经过强化治疗后，仍仅有12.8％的患者可以达到欧洲白血病网络指南所规定的AML不良预后分组患者的中位生存期。
拷贝数变异(copy number variations，CNV)，通常被定义为一个长度达到或超过1kb的DNA片段在与一个参照基因组相比较时，存在拷贝数的变化。CNV包含缺失、插入、重复排列和复杂的多位点改变等。在TP53的CNV中，缺失型的变异常受到特别关注，因为其一条染色体上TP53基因的缺失，常导致细胞内野生型TP53基因的完全缺失，且这种变异在TP53突变患者中的发生率高达70.2％。有研究报道，TP53的拷贝数缺失与AML病人更短的总体生存期相关，尤其是对于那些同时携带有1个TP53突变位点的患者而言。
目前临床上有多种检测CNV的方法，包括旨在对于全基因组CNV进行检测的基于阵列的基因组杂交技术(aCGH)、单核苷酸多态性阵列技术(SNP array)、全外显子测序(WES)和全基因组测序技术等，以及旨在对于靶位点进行CNV评估的荧光实时定量PCR(qPCR)技术，多重连接探针扩增技术(MLPA)等。对于全基因组CNV进行检测常常价格不菲，且依赖于检测机构的算法，文库构建水平等，很大一部分检测出的CNV无法判定其临床意义，因此需要针对靶位点的CNV评估进行补充。而qPCR检测CNV存在重复性差、灵敏度低、需要多重复孔等问题，MLPA则需要专门的仪器，操作流程复杂，当探针互补片段存在点突变时，易出现假阳性结果。故而针对CNV的评估方法有待进一步优化和补充。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明提出一种定量检测TP53基因拷贝数变异的ddPCR方法和试剂盒。本发明提供的用于ddPCR技术检测TP53基因拷贝数变异的引物和探针是根据TP53和RPP30基因DNA序列设计的，针对TP53基因第5和第7外显子基因序列分别设计了两条探针，针对RPP30基因第7外显子基因序列设计了一条探针，当TP53基因存在拷贝数变异时，通过ddPCR即可检测出其第5和/或第7外显子的拷贝数与RPP30基因拷贝数的比值发生了相应变化。
为达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种用于ddPCR定量检测TP53基因拷贝数变异的试剂盒，包含针对TP53和RPP30基因的特异性引物和探针，其中特异性引物的序列如下：
TP535号外显子正向引物：5’-TACTCCCCTGCCCTCAA-3’(SEQ ID No.1)
TP535号外显子反向引物：5’-CTGCTCACCATCGCTATCT-3’(SEQ ID No.2)
TP537号外显子正向引物：5’-AGGTTGGCTCTGACTGTA-3’(SEQ ID No.3)
TP537号外显子反向引物：5’-GTGATGATGGTGAGGATG-3’(SEQ ID No.4)
RPP30正向引物：5’-TGGCTTTTGAACTTGTCT-3’(SEQ ID No.5)和
RPP30反向引物：5’-AACCATACCTTTCCTTTG-3’(SEQ ID No.6)。
优选的，所述探针的序列如下：
TP535号外显子探针：5’-TGGTGGGGGCAGCGC-3’(SEQ ID No.7)
TP537号外显子探针：5’-CAACTACATGTGTAAC-3’(SEQ ID No.8)和
RPP30探针：5’-ACCTTCTCATTGTGGAGTCTT-3’(SEQ ID No.9)。
优选的，所述TP535号外显子探针的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1；所述TP537号外显子探针的5’端标记荧光基团VIC，3’端标记荧光淬灭基团MGB；所述RPP30探针的5’端标记荧光基团CY5，3’端标记荧光淬灭基团BHQ3。
本发明的第二方面提供了一种定量检测TP53基因突变的ddPCR方法，包括如下步骤：
(1)提供待测样本，获得待测样本的DNA；
(2)取上述待测样品DNA作为模板，与上述试剂盒中的特异性引物和探针混合，配制ddPCR反应混合液；
(3)利用步骤(2)制备的ddPCR反应混合液与油相混合，通过微滴制备仪制备可独立进行PCR扩增反应的PCR微反应液滴，并导入芯片；
(4)对步骤(3)制备的芯片中的PCR微反应液滴进行PCR扩增反应；
(5)对经步骤(4)PCR扩增反应后芯片中的微滴进行信号收集，从而计算得出样本中TP53基因和RPP30基因的浓度；
(6)根据步骤(5)中所获得的TP53基因和RPP30基因的浓度，计算该二者的比值，从而得出样本中TP53基因的拷贝数变异情况。
优选的，所述步骤(1)中的待测样本为患者外周血、骨髓组织或者肿瘤组织。
优选的，FAM标记的TP535号外显子探针或VIC标记的TP537号外显子探针，与CY5标记的RPP30探针在同一PCR反应体系内，根据微滴分析仪自动分析的结果，读取样本中FAM、VIC及CY5通道的拷贝数浓度，并计算出样本基因组中TP535号和/或7号外显子的平均拷贝数，从而获得样本TP53基因拷贝数变异的情况。
优选的，样本基因组中TP535号外显子的平均拷贝数＝2*FAM拷贝数/CY5拷贝数；TP537号外显子的平均拷贝数＝2*VIC拷贝数/CY5拷贝数。
优选的，ddPCR反应混合液配制体系如下：
| 10xdPCR反应缓冲液 | 3.5μl |
| dPCR酶 | 1μl |
| TP535号外显子正向引物 | 10pmol |
| TP535号外显子反向引物 | 10pmol |
| RPP30正向引物 | 10pmol |
| RPP30反向引物 | 10pmol |
| TP535号外显子探针 | 10pmol |
| RPP30探针 | 10pmol |
| 待测模板 | 40-500ng(以gDNA计) |
| 无核酶水补至35μl |
和/或
更优选的，ddPCR反应混合液配制体系如下：
| 10xdPCR反应缓冲液 | 3.5μl |
| dPCR酶 | 1μl |
| TP535号外显子正向引物 | 10pmol |
| TP535号外显子反向引物 | 10pmol |
| RPP30正向引物 | 10pmol |
| RPP30反向引物 | 10pmol |
| TP535号外显子探针 | 10pmol |
| RPP30探针 | 10pmol |
| 待测模板 | 200ng(以gDNA计) |
| 无核酶水补至35μl |
和/或
| 10xdPCR反应缓冲液 | 3.5μl |
| dPCR酶 | 1μl |
| TP537号外显子正向引物 | 12pmol |
| TP537号外显子反向引物 | 12pmol |
| RPP30正向引物 | 12pmol |
| RPP30反向引物 | 12pmol |
| TP537号外显子探针 | 7pmol |
| RPP30探针 | 7pmol |
| 待测模板 | 200ng(以gDNA计) |
| 无核酶水补至35μl |
。
优选的，ddPCR反应程序如下：
| 1 | 50℃ | 10min |
| 2 | 95℃ | 10min |
| 3 | 95℃ | 20s |
| 4 | 57℃ | 40s |
| 5 | Goto3 | For45times |
| 6 | 25℃ | Hold |
。
优选的，TP535号外显子拷贝数变异检测的空白限(LOB)为1.74copies/基因组，最低检测下限(LOD)为1.69copies/基因组；TP537号外显子拷贝数变异检测的空白限(LOB)为1.79copies/基因组，最低检测下限(LOD)为1.69copies/基因组。
优选的，所述定量检测TP53基因突变的ddPCR方法为非诊断、非治疗目的的。
本发明的第三方面提供上述试剂盒在制备用于ddPCR定量检测TP53基因拷贝数变异的试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的基于ddPCR检测TP53基因拷贝数变异的方法，基于二项分布原理，不依赖目的基因扩增效率，无需复孔，无需参照样本，仅通过1次PCR扩增即可获得结果，操作简单，价格低廉，重复性好。
2、本发明提供的基于ddPCR检测TP53基因拷贝数变异的检测方法，实验结果不易受到目的基因点突变的影响。
3、本发明提供的基于ddPCR检测TP53基因拷贝数变异的检测方法，最低检测下限为1.69copies/基因组，灵敏度高。
附图说明
图1示出本申请实施例1的ddPCR检测结果图。左上象限代表TP535号外显子阳性液滴，右下象限代表RPP30阳性液滴，右上象限代表双阳性液滴，左下象限代表双阴性液滴。
图2示出本申请实施例2的ddPCR检测结果图。左上象限代表TP537号外显子阳性液滴，右下象限代表RPP30阳性液滴，右上象限代表双阳性液滴，左下象限代表双阴性液滴。
图3示出本申请实施例3的不同浓度HL60细胞株掺入正常细胞后TP535号外显子基因ddPCR检测结果的线性分析。
图4示出本申请实施例3的不同浓度HL60细胞株掺入正常细胞后TP535号外显子基因ddPCR检测结果的FAM通道一维散点图。
图5示出本申请实施例4的不同浓度HL60细胞株掺入正常细胞后TP537号外显子基因ddPCR检测结果的线性分析。
图6示出本申请实施例4的不同浓度HL60细胞株掺入正常细胞后TP537号外显子基因ddPCR检测结果的HEX通道一维散点图。
图7示出本申请实施例7试验组1的扩增结果。
图8示出本申请实施例7试验组2的扩增结果。
图9示出本申请实施例7试验组3的扩增结果。
图10示出本申请实施例7试验组4的扩增结果。
图11示出本申请实施例7试验组5的扩增结果。
图12示出本申请实施例7试验组6的扩增结果。
图13示出本申请实施例7试验组7的扩增结果。
图14示出本申请实施例7试验组8的扩增结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。需说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
以TP-535号外显子拷贝数正常者外周血样本为例，详细说明该检测方法。
1.分离外周血单个核细胞以及提取DNA
(1)外周血样本加5ml红细胞裂解液混匀，静置1min；
(2)离心12000×rpm 20sec，弃上清，留沉淀；
(3)加900μL细胞裂解液，充分吹打混匀；
(4)加入4.5μLRNA酶，颠倒混匀，37℃下孵育15分钟，再于冰上孵育1分钟；
(5)加入300μL蛋白质沉降溶液，涡旋振荡混匀；
(6)离心13000×rpm 1分钟；
(7)取一个新的EP管，吸取600μL异丙醇，加入前述离心后的600μL上清液到异丙醇中并颠倒混匀；
(8)再次13000rpm×1min离心；
(9)吸出上清液，加入600μL 70％的乙醇溶液，颠倒混匀；
(10)再次13000rpm×1min离心；
(11)弃上清，干燥沉淀并加入适量DNA溶解液，置于65℃金属浴中孵育5min；
(12)通过紫外分光光度仪检测DNA样品的吸光度(A)值，并调整至40ng/μl，4℃保存；
2.使用上述DNA模板，配制ddPCR反应混合液，配制比例如下：
| 10xdPCR反应缓冲液 | 3.5μl |
| dPCR酶 | 1μl |
| TP535号外显子正向引物 | 10pmol |
| TP535号外显子反向引物 | 10pmol |
| RPP30正向引物 | 10pmol |
| RPP30反向引物 | 10pmol |
| TP535号外显子探针 | 10pmol |
| RPP30探针 | 10pmol |
| 待测模板 | 5μl |
| 无核酶水补至35μl |
将上述反应液混合均匀，涡旋混匀30s，瞬时离心将反应液收集于管底后置于冰上待用。
3.按照如下比例配制油相混合液：
| 油相A | 2mL |
| 油相B | 1mL |
按上表配方反应油相(油相A和B均为上海小海龟科技有限公司生产的ddPCR仪器配套油液试剂)混合后，涡旋或移液器吹打混匀30s，瞬时离心除去气泡，并将液体收集于管底，然后置于冰上待用。
注：混合后的油相混合液在30min以内使用。
4.微滴制备
(1)打开仪器前面板仓门，接通BioDigital Loader Z200样本处理系统电源,启动面板，将数字PCR芯片置于Loader Z200芯片仓，放入上述反应体系，油相混合液，关闭仓门并按照仪器电脑操作面板提示完成加样程序设置。
(2)进样完成后，取出装有微滴的芯片。
5.PCR反应
将芯片置于Cycler Z200 PCR扩增仪的芯片槽内，进行如下反应：
| 1 | 50℃ | 10min |
| 2 | 95℃ | 10min |
| 3 | 95℃ | 20s |
| 4 | 57℃ | 40s |
| 5 | Goto3 | For45times |
| 6 | 25℃ | Hold |
6.芯片阅读，数据分析
PCR扩增反应结束后将芯片移至Imager Z200生物芯片阅读仪上，依据芯片的阅读结果进行数据分析后，可得到如图1的实验结果以及相关数据。由结果可知，样本DNA中，FAM浓度为9446.600copies/μl，CY5浓度为10226.909copies/μl，计算得到样本基因组中TP535号外显子的平均拷贝数为1.85copies/基因组，未达到本方法的空白检测限，判定样本不存在TP535号外显子的拷贝数变异。
实施例2
以基因组存在单条chr17p13.3p11.2(此区带包含TP53基因)缺失的细胞株SKM1为例，详细说明该检测方法。
1.收集SKM1细胞株细胞以及提取DNA
(1)收集SKM1细胞株约6×106个；
(2)离心12000×rpm 20sec，弃上清，留沉淀；
(3)加900μL细胞裂解液，充分吹打混匀；
(4)加入4.5μLRNA酶，颠倒混匀，37℃下孵育15分钟，再于冰上孵育1分钟；
(5)加入300μL蛋白质沉降溶液，涡旋振荡混匀；
(6)离心13000×rpm 1分钟；
(7)取一个新的EP管，吸取600μL异丙醇，加入前述离心后的600μL上清液到异丙醇中并颠倒混匀；
(8)再次13000rpm×1min离心；
(9)吸出上清液，加入600μL 70％的乙醇溶液，颠倒混匀；
(10)再次13000rpm×1min离心；
(11)弃上清，干燥沉淀并加入适量DNA溶解液，置于65℃金属浴中孵育5min；
(12)通过紫外分光光度仪检测DNA样品的吸光度(A)值，并调整至40ng/μl，4℃保存；
2.使用上述DNA模板，配制ddPCR反应混合液，配制比例如下：
| 10xdPCR反应缓冲液 | 3.5μl |
| dPCR酶 | 1μl |
| TP537号外显子正向引物 | 12pmol |
| TP537号外显子反向引物 | 12pmol |
| RPP30正向引物 | 12pmol |
| RPP30反向引物 | 12pmol |
| TP537号外显子探针 | 7pmol |
| RPP30探针 | 7pmol |
| 待测模板 | 5μl |
| 无核酶水补至35μl |
将上述反应液混合均匀，涡旋混匀30s，瞬时离心将反应液收集于管底后至于冰上待用。
3.按照如下比例配制油相混合液：
| 油相A | 2mL |
| 油相B | 1mL |
按上表配方反应油相混合后(油相A和B均为上海小海龟科技有限公司生产的ddPCR仪器配套油液试剂)，涡旋或移液器吹打混匀30s，瞬时离心除去气泡，并将液体收集于管底，然后置于冰上待用。
注：混合后的油相混合液在30min以内使用。
4.微滴制备
(1)打开仪器前面板仓门，接通BioDigital Loader Z200样本处理系统电源,启动面板，将数字PCR芯片置于Loader Z200芯片仓，放入上述反应体系，油相混合液，关闭仓门并按照仪器电脑操作面板提示完成加样程序设置。
(2)进样完成后，取出装有微滴的芯片。
5.PCR反应
将芯片置于Cycler Z200 PCR扩增仪的芯片槽内，进行如下反应：
| 1 | 50℃ | 10min |
| 2 | 95℃ | 10min |
| 3 | 95℃ | 20s |
| 4 | 57℃ | 40s |
| 5 | Goto3 | For45times |
| 6 | 25℃ | Hold |
6.芯片阅读，数据分析
PCR扩增反应结束后将芯片移至Imager Z200生物芯片阅读仪上，依据芯片的阅读结果进行数据分析后，可得到如图2的实验结果以及相关数据。由结果可知，样本DNA中，VIC浓度为6602.979copies/μl(以HEX通道检测结果表示)，CY5浓度为12333.785copies/μl，计算得到样本基因组中TP537号外显子的平均拷贝数为1.07copies/基因组。
实施例3
以基因组存在单条染色体TP535号外显子缺失的细胞株HL-60、不同来源基因组TP53拷贝数正常者样本进行ddPCR灵敏度实验。
根据实施例1方法，重复检测不同来源基因组TP53拷贝数正常者样本TP535号外显子拷贝数21次，计算LOB为1.74copies/基因组，将HL-60细胞株DNA以低浓度掺入不同来源基因组TP53拷贝数正常者样本DNA中，重复检测该批样本TP535号外显子拷贝数21次，计算LOD为1.69copies/基因组。
根据实施例2方法将HL60细胞株DNA掺入基因组TP53拷贝数正常者DNA样本中并使得TP-535号外显子平均拷贝数分别为1、1.2、1.4、1.6、1.7、1.8，每个模板重复检测3次，得到如下数据：
如图3-4所示，理论值与实际检测值的线性关系好，因此本发明提供的TP53基因拷贝数变异的ddPCR检测方法，检测TP535号外显子拷贝数变异的最低检测下限为1.69copies/基因组，且检测线性好。
实施例4
以基因组TP537号外显子完全缺失的细胞株HL60和不同来源基因组TP53拷贝数正常者样本进行ddPCR灵敏度实验。
根据实施例2方法，重复检测不同来源基因组TP53拷贝数正常者样本TP537号外显子拷贝数20次，计算LOB为1.79copies/基因组，将HL60细胞株DNA以低浓度掺入不同来源基因组TP53拷贝数正常样本DNA中，重复检测该批样本TP537号外显子拷贝数21次，计算LOD为1.69copies/基因组。
根据实施例2方法将HL60细胞株DNA掺入基因组TP53拷贝数正常者DNA样本中并使得TP-537号外显子平均拷贝数分别为0、0.5、1、1.5、1.7、1.8，每个模板重复检测3次，得到如下数据，其中VIC平均浓度以HEX通道检测结果表示：
如图5-6所示，理论值与实际检测值的线性关系好，因此本发明提供的TP53基因拷贝数变异的ddPCR检测方法，检测TP537号外显子拷贝数变异的最低检测下限为1.69copies/基因组，且检测线性好。
实施例5
以基因组存在单条染色体TP535号外显子缺失的细胞株HL-60和基因组TP535号外显子拷贝数正常的细胞株MV4-11、MOLM-13为例，进行TP535号外显子拷贝数检出限验证实验。
根据实施例1方法，将HL60细胞株细胞以低浓度分别掺入MV4-11(样本编号1-5)及MOLM-13(样本编号6-10)细胞株细胞当中，使得样本的理论基因组TP535号外显子拷贝数为1.69copies/基因组，而后提取样本DNA，重复检测该批样本DNA 10次，得到如下数据：
测得TP535号外显子拷贝数均达到空白检测限，故而本ddPCR检测TP535号外显子拷贝数方法的检出限验证通过。
实施例6
以基因组TP537号外显子完全缺失的细胞株HL-60和基因组TP537号外显子拷贝数正常的细胞株MV4-11、MOLM-13为例，进行TP537号外显子拷贝数检出限验证实验。
根据例2实施方法，将HL60细胞株细胞以低浓度分别掺入MV4-11及MOLM-13细胞株细胞当中，使得样本的理论基因组TP537号外显子拷贝数为1.69copies/基因组，而后提取样本DNA，重复检测该批样本DNA 10次，得到如下数据，其中VIC浓度以HEX通道检测结果表示：
/>
测得TP537号外显子拷贝数均达到空白检测限，故而本ddPCR检测TP537号外显子拷贝数方法的检出限验证通过。
实施例7、不同特异性引物对组合的筛选试验
1、试验方法
以TP-53基因拷贝数正常者外周血样本为例，参照实施例1方法，将ddPCR反应混合液中的引物对替换为表1中各引物对的组合进行实验，具体引物对序列信息如下表所示。
/>
2、试验结果
各试验组的扩增效果如下表1所示。
表1不同特异性引物对组合的扩增结果
从图7-14的扩增结果可以看出，引物对组合1、5、7和8的扩增结果区分度较好，引物对组合3和6的扩增结果区分度不佳，峰值分辨性能不如前述组合，而引物对组合2和4的扩增结果基本无法区分阴性和阳性液滴。另外，引物对组合7和8在对正常拷贝数样本测量中获得的实际拷贝数较理论值偏差明显较大，因此使用这两个引物对组合的方案空白限较高，灵敏度较低。结合表1和图7-14的结果，最终分别选择5号外显子引物对1和RPP30引物对1的组合(引物对组合1)及7号外显子引物对1和RPP30引物对1的组合(引物对组合5)作为本申请优选的特异性引物对组合。
尽管已经对本方法实施步骤进行详细说明，但是对于本领域的技术人员来讲，依然可以在本发明范围内对方法中部分参数及整体方案进行修改。因此，凡在本发明精神和原则范围之内做的更改、替换、调整等行为均应在该发明所涵盖范围内。
Claims (7)
1.一种用于ddPCR定量检测TP53基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，包含针对TP53和RPP30基因的特异性引物和探针，其中特异性引物的序列如下：
TP535号外显子正向引物：5’-TACTCCCCTGCCCTCAA-3’
TP535号外显子反向引物：5’-CTGCTCACCATCGCTATCT-3’
TP537号外显子正向引物：5’-AGGTTGGCTCTGACTGTA-3’
TP537号外显子反向引物：5’-GTGATGATGGTGAGGATG-3’
RPP30正向引物：5’-TGGCTTTTGAACTTGTCT-3’和
RPP30反向引物：5’-AACCATACCTTTCCTTTG-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的序列如下：
TP535号外显子探针：5’-FAM-TGGTGGGGGCAGCGC-BHQ1-3’
TP537号外显子探针：5’-VIC-CAACTACATGTGTAAC-MGB-3’和
RPP30探针：5’-CY5-ACCTTCTCATTGTGGAGTCTT-BHQ3-3’。
3.一种定量检测TP53基因突变的ddPCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提供待测样本，获得待测样本的DNA；
(2)取上述待测样品DNA作为模板，与权利要求1-2任一项所述的试剂盒中的特异性引物和探针混合，配制ddPCR反应混合液；
(3)利用步骤(2)制备的ddPCR反应混合液与油相混合，通过微滴制备仪制备可独立进行PCR扩增反应的PCR微反应液滴，并导入芯片；
(4)对步骤(3)制备的芯片中的PCR微反应液滴进行PCR扩增反应；
(5)对经步骤(4)PCR扩增反应后芯片中的微滴进行信号收集，从而计算得出样本中TP53基因和RPP30基因的浓度；
(6)根据步骤(5)中所获得的TP53基因和RPP30基因的浓度，计算该二者的比值，从而得出样本中TP53基因的拷贝数变异情况。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的待测样本为患者外周血、骨髓组织或者肿瘤组织。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，ddPCR反应混合液配制体系如下：
和/或
。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，ddPCR反应程序如下：
7.权利要求1-2任一项所述试剂盒在制备用于ddPCR定量检测TP53基因拷贝数变异的试剂中的应用。
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