CN111910012A - 一种检测艰难梭菌耐莫西沙星gyrA基因点突变的荧光PCR方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组用于荧光PCR引物和探针的多核苷酸以及一种检测艰难梭菌gyrA基因点突变的荧光PCR方法，使用所述荧光PCR方法单个反应即可以同时检测艰难梭菌莫西沙星耐药及敏感株的gyrA基因的点突变。本发明提供的方法简化了检测工作量，避免了通过扩增测序比对来获得gyrA基因点突变信息，缩短了检测时间；对于莫西沙星耐药艰难梭菌和莫西沙星敏感艰难梭菌的检测灵敏度均为10¹拷贝；对临床常见的6种肠道细菌均无非特异扩增，显示出良好的特异度。本发明方法反应体系稳定，显示出良好的组内和组间重复性，检测结果与基因扩增测序相比，具有较高的一致性和准确性。

Description

一种检测艰难梭菌耐莫西沙星gyrA基因点突变的荧光PCR 方法

技术领域

本发明公开了一组多核苷酸及在检测基因点突变中的应用，属于核苷酸应用领域。

背景技术

艰难梭菌是抗生素相关性腹泻的重要病原，被美国CDC列为紧迫公共卫生威胁的第三位(参考文献：U.S.Department of Health and Human Services,CDC,Antibioticresistance threats in the united states 2019)。BI/NAP1/RT027菌株引起北美、欧洲和澳洲的多起暴发流行，具有高水平喹诺酮耐药、毒素分泌和致死率(参考文献：DanielA.N Engl J Med 2015；372:1539-48)。传统耐药菌株主要依赖药物敏感性检测的表型实验发现，如琼脂稀释、肉汤稀释和商品化的E-test条等。近年来，随着全基因组测序技术的普及，基于耐药基因分析来推测耐药表型已成为可能(参考文献：David W Eyre,等.JAntimicrob Chemother 2017；72(7):1937-1947.N Stoesser,等.J AntimicrobChemother 2013；68(10):2234-44.)。根据申请人前期的实验结果和文献报道，发现gyrA基因点突变(Thr→IIe)与艰难梭菌莫西沙星耐药具有较高相关性。gyrA基因，即DNA gyrasesubunit A，位于喹诺酮耐药决定区(QRDR)，与氟喹诺酮类耐药相关。点突变Thr→IIe即第82位的氨基酸由苏氨酸Thr突变为异亮氨酸IIe(genbank登记号PRJNA479396),对应核苷酸由ACT突变为ATT。可通过检测该基因的点突变，来提示判断艰难梭菌对莫西沙星是敏感或耐药，当检测突变为ACT时，提示莫西沙星敏感；而检测突变为ATT时，则提示莫西沙星耐药(参考文献：Yuan Wu,等.mSystems,2019,4(2):e00252-18.Patrizia Spigaglia.Ther AdvInfect Dis 2016；3(1):23-42)。

然而，目前国内外还没有针对艰难梭菌gyrA基因点突变的荧光PCR方法。通过对其它细菌相关研究的检索，发现其对喹诺酮耐药相关的gyrA基因点突变的检测，主要依赖于普通PCR扩增测序比对或退火温度变化发现点突变(参考文献：尹小毛等.实用医学杂志,2010,26(005):724-726.王红宁等.CN104611422A)。与荧光PCR方法相比，该方法操作步骤较多，耗时较长，且不易与检测产毒艰难梭菌的荧光PCR方法进行组合。

因此，本发明旨在快速检出艰难梭菌莫西沙星耐药或敏感株，并可与已有的产毒艰难梭菌的荧光PCR方法结合，对艰难梭菌流行株(BI/NAP1/RT027)的判断起到提示和预警作用。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有高灵敏度，高特异度，重复性好，准确度高的可以同时检测艰难梭菌莫西沙星耐药或敏感的方法，提高艰难梭菌莫西沙星耐药或敏感的检测能力，结合艰难梭菌毒力检测，可对艰难梭菌流行株的判断起到提示和预警作用。

基于上述目的，本发明首先提供了一组用于荧光PCR引物和探针的多核苷酸，所述多核苷酸包括：序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物Gyr-F，序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物Gyr-R，序列如SEQ ID NO.3所示的探针P-ATT，序列如SEQ ID NO.4所示的探针P-ACT2。

在一个优选的实施方案中，在所述探针P-ATT上标记第一荧光发光基团和荧光淬灭基因，在所述探针P-ACT2上标记第二荧光发光基团和荧光淬灭基因。

在一个更为优选的实施方案中，在所述探针P-ATT的5’端标记第一荧光发光基团，在所述探针P-ATT的3’端标记荧光淬灭基因，在所述探针P-ACT2的5’端标记第二荧光发光基团，在所述探针P-ACT2的3’端标记荧光淬灭基因。

更为优选地，所述第一荧光发光基团为VIC，所述第二荧光发光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为MGB。

作为可选的另一个优选实施方案，所述第一荧光发光基团为FAM，所述第二荧光发光基团为VIC，所述荧光淬灭基团为MGB。

其次，本发明提供了一种用于非诊断目的的检测艰难梭菌gyrA基因点突变的荧光PCR方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备待检测样品的基因组DNA；

(2)准备如上所述的多核苷酸组合作为扩增引物和探针；

(3)在所述扩增引物存在的PCR工作环境中扩增所述基因组DNA；

(4)检测步骤(3)的扩增结果。

在一个优选的实施方案中，所述PCR工作环境的退火温度为56-60℃。

在一个更为优选的实施方案中，所述PCR工作环境的退火温度为58-59℃。在本发明的一个具体实施方案中，将PCR工作环境的退火温度设定为59℃。

在另一个优选的实施方案中，所述步骤(4)的检测为荧光定量检测。

最后，本发明提供了一种含有如上所述多核苷酸组合的试剂盒。

本发明分别对艰难梭菌莫西沙星耐药及敏感株的gyrA基因的点突变设计特异性探针和引物，通过实验室条件优化，建立了单个反应可同时检测该两种类型艰难梭菌的方法，简化了检测工作量，避免了通过扩增测序比对来获得gyrA基因点突变信息，缩短了检测时间，相比于普通PCR扩增测序所需48小时，本发明可以将检测时间缩短至1小时；本发明方法对于莫西沙星耐药艰难梭菌和莫西沙星敏感艰难梭菌的检测灵敏度均为10¹拷贝；对临床常见的6种肠道细菌均无非特异扩增，显示出良好的特异度；且该方法的检测结果与基因扩增测序相比，具有较高的一致性和准确性。除此之外，本方法反应体系稳定，显示良好的组内和组间重复性。

附图说明

图1.突变位点及引物和探针在gyrA基因上的位置示意图；

图2.退火温度为59℃时的扩增曲线图；

图3.对莫西沙星耐药艰难梭菌体系的标准曲线图；

图4.对莫西沙星敏感艰难梭菌体系的标准曲线图；

图5.特异性检测扩增图；

图6. 73株艰难梭菌gyrA基因部分测序比对图；

图7. 73株艰难梭菌应用本发明的双重荧光PCR检测扩增图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

通过前期的艰难梭菌药敏试验，以及基于全基因组测序的关联分析(GWAS)，发现gyrA基因点突变(Thr→IIe)与艰难梭菌莫西沙星耐药具有较高相关性。可通过检测该基因的点突变，来提示判断艰难梭菌对莫西沙星是敏感或耐药。

本发明分别对艰难梭菌莫西沙星耐药及敏感株的gyrA基因的点突变设计特异性探针和引物。根据已有的耐药和敏感的gyrA基因序列(genbank登记号：PRJNA479396.)，应用primer express3.0设计引物探针，并在NCBI的primer blast中验证序列特异性。最终获得特异性引物一对：

Gyr-F：TGTGCCATTCTTACCATA(SEQ ID NO.1)，和

Gyr-R：AAGCCAGTTCATAGAAGA(SEQ ID NO.2)；

以及耐药点突变ATT的探针P-ATT：

5’VIC-TAAACAGCAATATCTCC-MGB 3’(SEQ ID NO.3)，和

敏感菌株ACT的探针P-ACT2：

5’FAM-ATAATAAACAGCAGTATC-MGB 3’(SEQ ID NO.4)。

gyrA基因全长2427bp，突变位点及引物探针的位置以图1所示的敏感株630和耐药R20291为示例示出：单划线标注的序列为引物，双划线标注的序列为探针，探针序列中的灰色标注为序列突变区域。Gyr-F引物在敏感株630的起始位置为121bp,在耐药株R20291的起始位置为133bp；Gyr-R引物在敏感株630的起始位置为261bp,在耐药株R20291的起始位置为279bp；探针P-ACT2在敏感株630的起始位置为239bp；探针P-ATT在耐药株R20291的起始位置为253bp。

以上序列交由生工生物工程有限公司合成。

实验所需的荧光PCR反应液及荧光试剂购自TaKaRa公司，仪器为ABI公司的7500Fast。

其中，在探针P-ATT的5’端标记荧光染料VIC，3’端标记荧光淬灭基团MGB，在探针P-ACT2的5’端标记荧光染料FAM，3’端标记荧光淬灭基团MGB(作为一种可选择的方案，也可以在探针P-ATT的5’端标记荧光染料FAM，在探针P-ACT2的5’端标记荧光染料VIC)。

本方法的检测原理为：应用TaqMan探针荧光PCR方法进行等位基因鉴别分析(AD)，是一种多重(每个反应包括一个以上的引物和探针对)、终点(在PCR过程的终点收集数据)分析实验，用于检测某个核酸序列的变异。每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核苷酸多态性(SNP)位点上出现两个可能的变异基因型。对于等位基因鉴别(AD)分析中的每一个样本，使用唯一的一对荧光探针，例如，两个

MGB探针来标记一个SNP位点。一个荧光探针与野生型(等位基因1)完全匹配，另一个荧光探针与突变完全匹配(等位基因2)。通过分析测量与探针关联的荧光信号变化来判定结果。如果有某种荧光明显升高，则说明标记该种荧光的探针与带有该突变的基因结合，为等位基因1或2，具体到本申请即为结合特定基因的荧光探针所指向的菌株类型即敏感株ACT或者耐药株ATT。荧光淬灭基团MGB在反应终点来终止反应。本申请所述的荧光淬灭基团MGB(MinorGroove Binder)是美国ABI公司在2000年推出的一种新的探针技术，以解决传统探针荧光淬灭不彻底的问题。标记MGB的探针与模板杂交更为稳定，使较短的探针同样能达到较高的Tm值，由于短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，信噪比更高，对于等位基因的区分更为理想，使得检测单碱基突变成为可能。

实施例1.多重荧光PCR扩增体系及扩增条件

实验步骤：

1.提取待检测艰难梭菌的基因组DNA；

2.按下述配置反应体系；

检测体系：

3.上机检测；

使用仪器为ABI公司的7500Fast，扩增条件：

95℃2min，接着对以下程序进行40个循环扩增：95℃10s，59℃30s。

4.结果判读：

ATT阳性：VIC通道Ct≤37，且有明显扩增曲线，空白对照无明显扩增曲线，则说明检测样本中检测到ATT突变(图3)；

ATT阴性：VIC通道Ct>37，且无明显扩增曲线，空白对照无明显扩增曲线，则说明检测样本未检测到ATT突变(图7上，图中仅出现ACT扩增曲线，而ATT无荧光信号)；

ACT阳性：FAM通道Ct≤35，且有明显扩增曲线，空白对照无明显扩增曲线，则说明检测样本中检测到ACT突变(图4)；

ACT阴性：FAM通道Ct>35，且无明显扩增曲线，空白对照无明显扩增曲线，则说明检测样本中未检测到ACT突变(图7下，图中仅出现ATT扩增曲线，而ACT无荧光信号)；

无效结果：如果阳性对照(ATT和ACT)任一没有出结果，或空白对照出现明显扩增曲线，则说明本次检测无效。

实施例2.多重荧光PCR退火温度的优化：

本发明多重荧光PCR退火温度可以处于一个适当的温度范围中进行，例如56-60℃。为了提高扩增效率，分别对莫西沙星耐药和敏感艰难梭菌进行荧光PCR，并在56-60℃的范围内改变退火温度，根据扩增效率选择最优化的多重体系退火温度(表1)。

表1.多重荧光PCR退火温度优化对照表

如表1所示，在56-60℃范围内的退火温度下，扩增效率均在70％以上，可以满足荧光PCR的应用需求。其中对莫西沙星耐药艰难梭菌最优反应退火温度为59℃，对莫西沙星敏感艰难梭菌的最优退火温度为58℃，因此，优化的退火温度为58-59℃的范围，本申请在进行多重荧光PCR时将退火温度设定为59℃(图2)。图2展示退火温度设定为59℃时，耐药ATT和敏感ACT的扩增曲线，其中纵坐标ΔRn的值表示PCR过程中探针降解的量，也即PCR产物的量，横坐标表示反应循环数。

实施例3检测体系对莫西沙星耐药及敏感艰难梭菌检测灵敏度判断及标准曲线的制作

依次使用拷贝数浓度为4.11copies/μl～4.11×10¹⁰copies/μl、5.14copies/μl～5.14×10¹⁰copies/μl的重组质粒(用pGEM-T载体分别构建的含耐药株和敏感株扩增片段的质粒，并导入大肠杆菌JM109中)各2μl扩增，模板量分别为10～10⁹copies，共10个稀释梯度。用已优化的多重荧光PCR分别对不同稀释度的莫西沙星耐药及敏感艰难梭菌标准质粒为模板扩增，建立标准曲线，检验该体系的灵敏度即检测下限(图3和图4)。本体系对莫西沙星耐药艰难梭菌(VIC荧光)检测灵敏度为4.11×10¹copies，扩增效率＝84.43％，R2＝0.998；本体系对莫西沙星敏感艰难梭菌(FAM荧光)检测灵敏度为5.14×10¹copies，扩增效率＝90.92％，R2＝0.992。

实施例4多重荧光PCR检测体系的特异性评价

用优化的多重荧光PCR检测6种常见肠道细菌(表2)，同时分别以莫西沙星耐药和敏感艰难梭菌模板DNA作为阳性对照。结果除阳性对照外，其余6种常见肠道细菌模板均扩增阴性，体系的检测特异度为100％(图5)。

表2.用于检测多重荧光PCR体系特异性模板

实施例5.本检测方法应用于73株临床分离株的检测结果与基因测序方法间准确性比较

为了验证本发明荧光PCR检测的准确性，对73株的基因扩增测序并比对，使用普通PCR分别对73株临床分离株gyrA基因进行扩增、测序和比对，结果显示携带ATT的耐药株为34株，而携带ACT的敏感株为39株，图6主要展示的部分菌株的比对结果，在图6高光的位置可以看出一些菌株携带ATT突变，另一些携带ACT突变。本发明中的两重荧光PCR检测(图7)结果显示携带ATT突变的菌株为33株，携带ACT的菌株为40株，二者结果比较仅各有一株艰难梭菌的检测结果与测序结果不一致。应用Kappa进行一致性评价，多重荧光PCR检测结果与基因测序结果有较高的一致性(表3)。

表3.两种方法检测73株临床分离株结果

实施例6本发明中双重荧光PCR检测体系重复性评价

隔天进行三次试验，每次试验做三个平行样品，获得以下批内变异系数和批间变异系数(表4和表5)，三个梯度的批内变异系数和批间变异系数均小于5％，证明该方法的重复性良好。

表4.对莫西沙星耐药艰难梭菌的多重荧光PCR重复试验的批内和批间变异系数

表5.对莫西沙星敏感艰难梭菌的多重荧光PCR重复试验的批内和批间变异系数

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 一种检测艰难梭菌耐莫西沙星gyrA基因点突变的荧光PCR方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 艰难梭菌(Clostridium difficile)

<400> 1

tgtgccattc ttaccata 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 艰难梭菌(Clostridium difficile)

<400> 2

aagccagttc atagaaga 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 艰难梭菌(Clostridium difficile)

<400> 3

taaacagcaa tatctcc 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 艰难梭菌(Clostridium difficile)

<400> 4

ataataaaca gcagtatc 18

Claims (10)

1.一组用于荧光PCR引物和探针的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括：序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物Gyr-F，序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物Gyr-R，序列如SEQID NO.3所示的探针P-ATT，序列如SEQ ID NO.4所示的探针P-ACT2。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，在所述探针P-ATT上标记第一荧光发光基团和荧光淬灭基因，在所述探针P-ACT2上标记第二荧光发光基团和荧光淬灭基因。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，在所述探针P-ATT的5’端标记第一荧光发光基团，在所述探针P-ATT的3’端标记荧光淬灭基因，在所述探针P-ACT2的5’端标记第二荧光发光基团，在所述探针P-ACT2的3’端标记荧光淬灭基因。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一荧光发光基团为VIC，所述第二荧光发光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为MGB。

5.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一荧光发光基团为FAM，所述第二荧光发光基团为VIC，所述荧光淬灭基团为MGB。

6.一种用于非诊断目的的检测艰难梭菌gyrA基因点突变的荧光PCR方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备待检测样品的基因组DNA；

(2)准备如权利要求2-5任一所述的多核苷酸作为扩增引物和探针；

(3)在所述扩增引物和探针存在的PCR工作环境中扩增所述基因组DNA；

(4)检测步骤(3)的扩增结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR工作环境的退火温度为56-60℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR工作环境的退火温度为58-59℃。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的检测为荧光定量检测。

10.一种含有权利要求1-5任一所述多核苷酸的试剂盒。

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