CN107604082A - 用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的snp位点组合 - Google Patents
用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的snp位点组合 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107604082A CN107604082A CN201710887563.0A CN201710887563A CN107604082A CN 107604082 A CN107604082 A CN 107604082A CN 201710887563 A CN201710887563 A CN 201710887563A CN 107604082 A CN107604082 A CN 107604082A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sites
- bifidobacterium
- base
- seq
- full
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的SNP位点组合。本发明还公开了用于鉴定乳粉中双歧杆菌菌株的HRM方法以及所述的SNP位点组合在鉴定乳粉中双歧杆菌菌株中的应用。通过本发明的SNP位点组合物和HRM方法，可以实现对乳粉中的双歧杆菌菌株的精确鉴定。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体的说，是关于一种用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的SNP位点组合。
背景技术
食品安全是关乎人民生命健康和社会和谐的重大战略问题。婴幼儿配方食品是部分婴幼儿的唯一食物来源，对婴幼儿健康及生命安全有重要影响。添加益生菌是婴幼儿配方乳粉的最新发展趋势。
2002年FAO/WHO对益生菌的定义为：益生菌是活的微生物，当摄入足够数量时，对宿主产生有益健康的作用。益生菌菌种(株)是益生菌制品品质控制中最重要的指标，最常用的为双歧杆菌、乳杆菌、链球菌、乳球菌等。大量研究表明，双歧杆菌能抑制致病菌入侵和定植、调节机体免疫、降低胆固醇、抑制肿瘤发生等，在维持机体肠道微生态平衡和宿主健康方面发挥着重要的作用。因此，双歧杆菌成为近年来食品、药品研究开发的热点，部分菌株大量用于婴幼儿配方食品、保健食品、药品的生产中。但双歧杆菌发挥有益功能具有很强的菌株特异性，为此FAO/WHO益生菌评价指南中指出，精确的菌株识别是益生菌使用的前提，并要求食品标签要注明使用菌种的属名、种名和菌号等菌株名称，及货架期内活性菌数量。
为规范婴幼儿配方食品中的益生菌使用，我国卫生部于2011年10月发布《关于公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告》，规定允许使用：动物双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌HN019和Bi-07、嗜酸乳杆菌NCFM、鼠李糖乳杆菌LGG和HN001。其中双歧杆菌包括：动物双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌HN019和Bi-07。尽管如此，目前市场上销售的婴幼儿配方乳粉存在菌株标签标示不明等诸多问题，使消费者陷入模糊消费的境地，也带来了安全隐患。例如，部分产品仅列明菌种名称，缺乏具体的菌株信息；部分标示名称为厂家自行命名，在卫生部公告和国际标准菌种库中无对应名称，无法对菌株进行溯源。因此，精确的菌株鉴定是益生菌婴幼儿配方乳粉安全监管的重要前提，有助于菌株的质量控制，以避免健康风险和误导性宣称；同时对了解市场产品中益生菌株与核准菌株的相符和变异情况，探索其可能的功能改变，具有重要的应用意义。
传统鉴定乳制品中益生菌的方法多以表型鉴定为主。结合形态学和生理生化特性，结果常因培养条件等因素出现偏差，对同种内菌株之间的鉴定较困难。如我国现行乳酸菌检测标准GB 4789.35-2010、GB/T 4789.34-2008为传统鉴定方法，仅能对双歧杆菌属进行常见种的生化分型，不能鉴定到菌株水平。
而分子生物学方法，无需进行繁杂的微生物培养，成为益生菌分类鉴定和溯源的主要手段。依据益生菌基因序列的特异性,可以进行属间、种间、亚种间、乃至菌株之间的区分。目前乳制品中双歧杆菌鉴定的常用方法，包括随机扩增多态性DNA分析 (RAPD)；脉冲场凝胶电泳法(PFGE)；基于rDNA序列16S、16S-23S ITS测序方法等。其中，RAPD分辨率高，但对反应条件非常敏感，重复性差，很难将乳酸菌鉴定到种的水平。PFGE具备很强的鉴别能力，但操作繁琐，需要大型仪器支持，试剂成本高，常规实验室难以承受。而16S和16S-23S ITS方法仅能将细菌快速鉴定到菌种和亚种水平。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP指在DNA某特定位点上的单碱基突变，遗传稳定性高，是继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记,近几年被广泛用于生物以及医学研究的诸多领域。但普通实时荧光PCR仅能满足部分SNP检测需求。
因此，提供一种快速高分辨的双歧杆菌菌株水平分子分型方法具有重要的应用价值，为婴幼儿食品的风险发现、监测和安全监管提供技术手段和科学依据。
发明内容
由于动物双歧乳双歧亚种各个商业菌株基因组背景的高度相似性，申请人拟对5株动物双歧乳双歧亚种菌株进行全基因组SNP分析并寻找合适的SNP位点，用于菌株特异分辨。由于B.animalis subsp.Lactis HN019菌株在NCBI和PATRIC数据库中不包含完整的全基因组序列，所以只对4株动物双歧乳双歧亚种进行全基因组SNP 分析。申请人通过找到4株动物双歧乳双歧亚种的相关位置的序列(虽然不是拼接完整的基因组)，并进行了分析。申请人通过分析，最终获得61个全基因组SNP位点。根据SNP位点的特异性以及SNP位点所在的基因的功能，申请人从41个位于基因内部的SNP位点中进行了全面的筛选，并最终选出了4个SNP位点用于乳双歧杆菌的区分。结果显示，4个SNP位点的组合物可以将乳粉中的B.animalis subsp.Lactis DSM 10140，B.animalis subsp.Lactis Bb-12，B.animalissubsp.Lactis Bi-07， B.animalis subsp.Lactis BL-04，B.animalis.ssp.lactis HN019精确区分，即达到菌株区分水平。
本发明的第一个目的是提供一种用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的SNP位点组合，以快速、精确鉴定双歧杆菌菌株；本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定乳粉中双歧杆菌菌株的HRM方法，以鉴定乳粉中的双歧杆菌菌株，并对双歧杆菌菌株进行溯源等；本发明的第三个目的是提供SNP位点组合在鉴定乳粉中双歧杆菌菌株中的应用。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的SNP位点组合，其中，所述组合包括4个SNP位点，分别为BXY位点、HIK1位点、HIK2位点和YKE 位点。
根据本发明，所述BXY位点如下：
1)BXY位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140全基因组的F链5’端起第617884位碱基，其碱基为C；
2)BXY位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12全基因组的F链5’端起第1253257位碱基，其碱基为C；
3)BXY位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种B1-04全基因组的F链5’端起第617882位碱基，其碱基为C；
4)BXY位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07全基因组的F链5’端起第617883位碱基，其碱基为T。
根据本发明，所述HIK1位点如下：
1)HIK1位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140全基因组的F链5’端起第776139位碱基，其碱基为C；
2)HIK1位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12全基因组的F链5’端起第1411376位碱基，其碱基为T；
3)HIK1位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种B1-04全基因组序的F链5’端起第776136位碱基，其碱基为T；
4)HIK1位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07全基因组的F链5’端起第776137位碱基，其碱基为T。
根据本发明，所述HIK2位点如下：
1)HIK2位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140全基因组的R链3’端起第777041位碱基，其碱基为A；
2)HIK2位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12全基因组的R链3’端起第1412278位碱基，其碱基为C；
3)HIK2位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种B1-04全基因组的R链3’端起第777038位碱基，其碱基为A；
4)HIK2位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07全基因组的R链3’端起第777039位碱基，其碱基为A。
根据本发明，所述YKE位点如下：
1)YKE位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140全基因组的R链3’端起第839428位碱基，其碱基为T；
2)YKE位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12全基因组的R链3’端起第1474481位碱基，其碱基为T；
3)YKE位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种B1-04全基因组的R链3’端起第839425位碱基，其碱基为C；
4)YKE位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07全基因组的R链3’端起第839426位碱基，其碱基为C。
本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定乳粉中双歧杆菌菌株的HRM方法，包括如下步骤：
步骤一：分别以含有上述所述的BXY位点、HIK1位点、HIK2位点和YKE位点的 DNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；扩增循环结束后增加HRM分析步骤，建立高分辨率熔解曲线标准曲线；
步骤二：以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；扩增循环结束后增加HRM分析步骤，建立高分辨率熔解曲线样品曲线；
步骤三：通过标准菌株和样品中菌株的高分辨率熔解曲线鉴定或检测乳粉中双歧杆菌到菌株水平；
其中，用于HRM扩增的反应体系中含有动物双歧杆菌区分SNP位点扩增引物。
根据本发明，所述的含有BXY位点的DNA序列如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12所示；
所述的含有HIK1位点的DNA序列如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO： 15、SEQ ID NO：16所示；
所述的含有HIK2位点的DNA序列如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO： 19、SEQ ID NO：20所示；
所述的含有YKE位点的DNA序列如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO： 23、SEQ ID NO：24所示。
根据本发明，所述动物双歧杆菌区分SNP位点扩增引物如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO： 7和SEQ ID NO：8所示。
根据本发明，所述步骤一和步骤二的PCR扩增体系均为：
PCR扩增体系：总体积20μl，包含2×LightCycler 480High Resolution MeltingMaster10μl、引物(F、R)各1μl、模板5μl(4ng/μl)、Mg2+2μl、水1μl；
PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性5min 10s，65-55℃(梯度PCR)退火 10s，72℃延伸20s，扩增40-50个循环。
根据本发明，所述步骤一和步骤二的HRM分析步骤的体系均为：95℃1min， 40℃10s，65℃到95℃(Ramp Rate0.02℃/s)，Acquisitions 25per℃。
本发明的第三个目的在于提供上述所述的SNP位点组合在鉴定乳粉中双歧杆菌菌株中的应用。
本发明的有益效果是：
1、可快速、简便地检测乳粉中是否存在双歧杆菌；
2、可以实现对乳粉中的双歧杆菌菌株的快速、精确鉴定。
附图说明
图1为实施例5的BXY位点对双歧杆菌扩增的原始熔解曲线图。
图2为实施例5的BXY位点对双歧杆菌扩增的熔解曲线导数图。
图3为实施例5的HIK1位点对双歧杆菌扩增的原始熔解曲线图。
图4为实施例5的HIK1位点对双歧杆菌扩增的熔解曲线导数图。
图5为实施例5的HIK2位点对双歧杆菌扩增的原始熔解曲线图。
图6为实施例5的HIK2位点对双歧杆菌扩增的熔解曲线导数图。
图7为实施例5的YKE位点对双歧杆菌扩增的原始熔解曲线图。
图8为实施例5的YKE位点对双歧杆菌扩增的熔解曲线导数图。
图9为实施例6的BXY对乳双歧杆菌灵敏度实验检测结果，其中，从左到右各点分别代表500pg、200pg、50pg、20pg、5pg梯度稀释。
图10为实施例6的HIK2对乳双歧杆菌灵敏度实验检测结果，其中，从左到右各点分别代表500pg、200pg、50pg、20pg、5pg梯度稀释。
图11为实施例6的YKE对乳双歧杆菌灵敏度实验检测结果，其中，从左到右各点分别代表500pg、200pg、50pg、20pg、5pg梯度稀释。
图12为实施例7的BXY对乳双歧杆菌检出限实验检测结果，其中，从左到右各点分别代表1*108、1*107、1*106、1*105、1*104、1*103数量梯度。
图13为实施例7的HIK2对乳双歧杆菌检出限实验检测结果，其中，从左到右各点分别代表1*108、1*107、1*106、1*105、1*104、1*103数量梯度。
图14为实施例7的YKE对乳双歧杆菌检出限实验检测结果，其中，从左到右各点分别代表1*108、1*107、1*106、1*105、1*104、1*103数量梯度。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
1、以下实施例所用到的仪器如下：
电子天平：瑞士梅特勒PB1501。
多功能智能厌氧系统：荷兰MART ANOXOMAT MARKII。
厌氧培养箱：美国SHEL LAB。
超净工作台(SW-CJ-2D)：苏州净化。
生物安全柜(Class II A2)：美国LABCONCO。
漩涡振荡器(Vortex Genie2)：美国SI。
台式告诉冷冻离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R)：德国Eppendorf。
核酸蛋白测定仪(Eppendorf BioPhotometer)：德国Eppendorf。
移液枪(10μL、20μL、100μL、200μL和1000μL)：美国GILSON。
梯度PCR仪：美国ABI。
实时荧光定量PCR仪：瑞士Roche LightCycler 480。
电泳仪、凝胶成像系统：美国Biorad。
2、以下实施例的试剂与培养基如下：
(1)培养基的制备
MRS固体培养基(北京陆桥公司)：取32.125g于500g蒸馏水中搅拌至完全溶解，121℃灭菌。
TOS固体培养基(美国默克公司)：取32.89g于500g蒸馏水中搅拌至完全溶解， 121℃灭菌。
(2)DNA抽提实验试剂：
1M Tris-HCl：121.1g三(羟甲基)氨基甲烷，49ml浓HCl，加超纯水定容至1000ml，测定其PH值在8.0左右。
CTAB裂解液：15gCTAB(溴代十六烷基三甲胺)，加600ml ddH2O加热溶解，加入75ml 1M Tris-HCL(pH＝8.0)，58.5g NaCl，30ml 0.5M EDTA，定容至1000ml，混合后备用。
TE buffer：1M的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)1mL，加上0.5MEDTA(pH＝8.0)
200μL，用超纯水定容至100mL，于4℃冷藏备用；
溶菌酶(50mg/ml)：工作液为10mg/ml，于4℃冷藏备用；
蛋白酶K：工作液为20mg/ml，于4℃冷藏备用；
Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇：工作液为Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇＝25:24:1；
无水乙醇(分析纯)、70％乙醇等。
(3)PCR和HRM扩增试剂
Premix Ex Taq(1.0mL)：Takara公司；
LightCycler 480High Resolution Melting Master(高分辨率熔解曲线分析反应预混液)：Roche公司。
DL2000DNA Marker：Takara公司。
3、动物双歧杆菌SNP位点扩增引物，如表1所示。
表1动物双歧杆菌区分SNP位点扩增引物
4、菌株来源
(1)7株标准菌株
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种(B.animalis.ssp.lactis ATCC27673)
动物双歧杆菌动物双歧杆菌亚种(B.animalis.ssp.animalis ATCC25527)
长双歧杆菌长双歧杆菌亚种(B.longum.ssp.longum ATCC15707)
长双歧杆菌婴儿双歧杆菌亚种(B.longum.ssp.infantis ATCC15697)
青春双歧杆菌(B.adolescentis ATCC15703)
两歧双歧杆菌(B.bifidum ATCC25921)
短双歧杆菌(B.breve CICC6182)
(2)5株商业菌株
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种(B.animalis.ssp.lactis Bi-07)
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种(B.animalis.ssp.lactis Bb-12)
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种(B.animalis.ssp.lactis Bl-04)
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种(B.animalis.ssp.lactis HN019)
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种(B.animalis.ssp.lactis DSMZ10140)
5、基因组分析确定分子分型用基因
5株双歧杆菌全基因组序列下载
5株双歧杆菌的数据下载于致病系统资源整合中心(PathoSystems ResourceIntegration Center,PATRIC)，具体信息如表2。
表25株双歧杆菌的基因组来源
| 物种名称 | 菌株编号 | PATRIC编号 |
| B.animalissubsp.lactis(动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种) | Bb-12 | CP001853 |
| B.animalissubsp.lactis(动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种) | Bi-07 | CP003495 |
| B.animalissubsp.lactis(动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种) | Bl-04 | NC-012814 |
| B.animalissubsp.lactis(动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种) | DSM10140 | NC-012815 |
| B.animalissubsp.lactis(动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种) | HN019 | NZ-ABOT0100001 |
注：由于B.animalis subsp.Lactis HN019菌株在NCBI和PATRIC数据库中不包含完整的全基因组序列，所以以下实施例只对4株动物双岐乳双歧亚种进行全基因组 SNP分析。
实施例1
使用MUMmer v3.0软件对4株动物双歧乳双歧亚种的全基因组SNP进行分析，最终获得61个全基因组SNP位点。在61个全基因组SNP位点中，41个SNP位点位于基因内部，20个基因位于基因间区。根据SNP位点的特异性以及SNP位点所在的基因的功能，申请人从41个位于基因内部的SNP位点中进行了全面的筛选，并最终选出了4个 SNP位点用于乳双歧杆菌的区分，筛选的SNP位点见表3。
表3用于分辨动物双歧乳双歧亚种菌株的SNP位点分布
以上筛选的四个SNP位点在基因中的信息如下：
(1)BXY位点
位点位置:
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140|617884|C
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12|1253257|C
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bl-04|617882|C
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07|617883|T
(2)HIK1位点
位点位置:
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140|776139|C
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12|1411376|T
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bl-04|776136|T
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07|776137|T
(3)HIK2位点
位点位置:
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140|777041|A
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12|1412278|C
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bl-04|777038|A
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07|777039|A
(4)YKE位点
位点位置：
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140|839428|T
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12|1474481|T
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bl-04|839425|C
动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07|839426|C
实施例2菌株分离和菌体培养
标准菌株和商业菌株的菌株分离和菌株培养
1)分别挑取上述标准菌株与商业菌株磁珠放入MRS肉汤培养基中，36±1℃厌氧培养48小时；
2)用接种环沾取少量菌液划线接种于TOS固体培养基，36±1℃厌氧培养48小时；
3)挑取单菌落，在TOS固体培养基上进行涂布，36±1℃厌氧培养48小时。
实施例3核酸提取步骤
1)用无菌棉棒将实施例2培养好的菌株取下，加至含有1mlTE缓冲液的离心管中，混匀，13000rpm，离心5min，去除上清；
2)加入200μl 20mg/ml溶菌酶，37℃，水浴2小时；
3)每管中加入500μl CTAB裂解液，10μl蛋白酶K，混匀，56℃过夜；
4)取过夜裂解的标准菌株或样品菌株，向每管裂解液中加入800μl Tris饱和酚/三氯甲烷/异戊醇(25:24:1)，混匀，13000rpm，10min；
5)取上清至新离心管中，加入等体积三氯甲烷/异戊醇(24:1)，混匀，13000rpm，10min；
6)取上清至新离心管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀，静置一会儿，13000rpm，2min；
7)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀2次；
8)将沉淀放于室温下进行自然风干，风干后加入100μl TE溶液，溶解沉淀；
9)待沉淀溶解后，涡旋离心，用核酸蛋白仪测定提取菌株的DNA浓度。
实施例4普通PCR扩增和测序
PCR扩增体系：总体积25μl，包含2×Premix Ex Taq 12.5μl、引物(F、R)各 1μl、模板2μl、水8.5μl。
PCR反应程序：98℃变性10s，55-60℃(根据引物的不同而确定)退火45s，72℃延伸50s，扩增35个循环。
电泳：配制含有溴化已锭的1.5％的琼脂糖凝胶，取5μlPCR产物上样，110V，30min，电泳结果在凝胶成像系统中进行观察、拍照。
测序：PCR扩增所得到的阳性产物以及相应的引物送至英潍捷基(上海)贸易有限公司和上海生工生物工程股份有限公司进行纯化与测序工作。
结论：所得到的扩增序列均为正反向测序结果的拼接完整系列；确认标准菌株和商业菌株符合对应的基因组特征。
实施例5 HRM扩增和分析
1、PCR扩增体系：总体积20μl，包含2×LightCycler 480High ResolutionMelting Master10μl、引物(F、R)各1μl、模板5μl(4ng/μl)、Mg2+2μl、水1μl。
2、PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性5min 10s，65-55℃(梯度PCR) 退火10s，72℃延伸20s，扩增40-50个循环。
3、HRM分析：扩增循环结束后增加HRM分析步骤，95℃1min，40℃10s，65℃到 95℃(Ramp Rate0.02℃/s)，Acquisitions 25per℃，获取高分辨率熔解曲线，LightCycler480Software 1.5.1分析结果和图形。
4、结果分析：6株动物双歧杆菌乳双歧亚种扩增测序结果与PATRIC中提交的参考基因组中SNP结果完全相符，验证了商业菌株的真实性(表4)。将BXY中T定义为类型1，C定义为2；HIK1中T为1，C为2；HIK2中A为1，C为2；YKE中T为1， C为2，建立动物双歧杆菌乳双歧亚种鉴定模型如表5。
表4动物双歧杆菌区分SNP测序结果与HRM结果比较
表5乳双歧亚种鉴定模型
| 菌种名称 | BXY | HIK1 | HIK2 | YKE |
| Bb-12 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| Bi-07 | 1 | 1 | 1 | 2 |
| HN019 | 2 | 1 | 1 | 1 |
| BL-04 | 2 | 1 | 1 | 2 |
| DSMZ 10140 | 2 | 2 | 1 | 1 |
| ATCC 27673 | 2 | 1 | 1 | 2 |
5、图形分析：对4个SNP位点建立HRM扩增和高分辨率熔解曲线分析方法，获得的原始熔解曲线图和熔解曲线导数图如下：
(1)BXY：能够特异区分Bi-07菌株，见图1和图2所示。
(2)HIK1：能够特异区分DSMZ10140菌株，见图3和图4。
(3)HIK2：能够特异区分Bb-12菌株，见图5和图6。
(4)YKE：能够将Bi-07、BL-04、ATCC 27673与其余三株区分开来，见图7 和图8。
6、结论：
(1)BXY、HIK1、HIK2、YKE能成功扩增出上述所有动物双歧杆菌乳双歧亚种；
(2)如表4和表5以及图1-8所示，上述4个SNP位点中，BXY能特异区分Bi-07， HIK1能特异区分DSMZ 10140，HIK2能特异区分Bb-12，YKE将Bi-07、BL-04、ATCC 27673与其余三株区分开来。4个位点结果组合可以将这几株乳双歧杆菌全部进行菌株区分；
(3)如表5所示，对于婴幼儿配方乳粉中我国允许使用的3个商业菌株，Bb-12、 Bi-07、HN019，仅用BXY、HIK2、YKE就能实现菌株区分。
实施例6灵敏度实验
针对商业菌株Bi-07，进行梯度DNA稀释，考察HRM方法的灵敏度。做浓度梯度为500pg、200pg、50pg、20pg、5pg的梯度浓度PCR实验(如图9-图11)。
结论：三个SNP位点BXY、HIK2、YKE，针对Bi-07基因组DNA，都有阳性扩增曲线出现，Ct值<40，检出灵敏度都达到5pg/孔。
实施例7检出限实验
针对商业菌株HN019，进行菌株培养后，稀释成不同浓度菌株数量的梯度，而后抽提DNA，考察方法的检出限。做数量梯度为1*108、1*107、1*106、1*105、1*104、 1*103的PCR实验(图12-图14)。
结论：三个SNP位点BXY、HIK2、YKE，针对不同菌株数量梯度的HN019基因组 DNA，检出限不同。依据Ct值<40的标准，BXY、HIK2能检测到的菌株数量达到1*103。 YKE能检测到的菌株数量达到1*104。
实施例8BXY、HIK1、HIK2、YKE位点的实际验证
1、申请人对目前国内各乳粉品牌的益生菌婴幼儿配方乳粉进行统计、分析。通过对国内各乳粉品牌的调研发现，近几年，国内乳粉品牌不仅仅只在婴幼儿配方乳粉中添加益生菌，部分品牌也将益生菌添加到女士乳粉和老年乳粉中。为此，申请人共收集国内外益生菌配方乳粉共15个品牌，19个样品，进行菌株培养和分子鉴定。共分离菌株19个，-L，-M，-S分别代表大、中、小菌落形态。
2、样品菌株的分离与培养如下：
1)按照样品菌株计数的操作，将乳粉进行梯度稀释，注意每个样品的具体稀释倍数根据样品标识中得含菌量进行，此外每进行一次稀释，需要更换1ml灭菌吸管。
2)选取2-3个连续的适宜稀释度样品匀液，分别取0.1ml的样品匀液加入到TOS 固体培养基中，用涂布棒进行均匀涂布，每个稀释度做2个平板，36±1℃厌氧培养 48小时。
3)挑取单菌落，在TOS固体培养基上进行涂布，36±1℃厌氧培养48小时。
4)取适量样品菌株接种于磁珠保存管中，混匀，静止几分钟，弃去保存管中的液体，放于-80℃下保存。
3、核酸提取步骤，按照实施例3的方法制备。
4、4个SNP位点建立的HRM方法用于样品中分离菌株的鉴定。
菌株分离培养后，参照GB 4789.35-2016，进行双歧杆菌的初步鉴定，而后用HRM方法进行菌株鉴定。其中，HRM方法将BXY中T定义为类型1，C定义为2；HIK1中T 为1，C为2；HIK2中A为1，C为2；YKE中T为1，C为2，结果如下表6所示。
表6动物双歧杆菌区分SNP测序结果与4个SNP位点建立的HRM结果比较
5、结果显示：
(1)采用BXY、HIK1、HIK2、YKE位点，可以将配方乳粉中常添加的3种商业菌株Bb-12，Bi-07，HN019精确区分；
(2)可以将标签没有明确表示菌株名称的8-L、8-S、10、21-L、21-S、SN7-L、 SN7-S、SN10鉴定成功；
(3)对于部分添加两种菌株的样品(如菌株17-L、17-S)，通过培养挑选不同形态大小的菌株，辅以HRM快速鉴别技术，可以将菌株进行快速鉴定；
(4)菌株25标签没有标注添加菌株，可能混入了少量Bi-07。
6、结论：采用BXY、HIK1、HIK2、YKE位点的组合物可以实现对乳粉中的双歧杆菌的精确鉴定。
综上所述，采用本发明的BXY、HIK1、HIK2、YKE位点的组合物建立HRM扩增和高分辨率熔解曲线分析方法，可以实现对乳粉中的双歧杆菌的精确鉴定，为快速准确地检测乳粉中是否添加有与乳粉标签标识一致的双歧杆菌提供了一种很好的方法，有助于对乳粉中双歧杆菌菌株进行质量控制，避免健康风险和误导性宣称。因此在乳粉中双歧杆菌的检测把关上，具有较好的应用前景。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市质量监督检验技术研究院
复旦大学
<120> 用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的SNP位点组合
<130> 171035
<141> 2017-09-27
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 1
ttcgcactgt tcacccaagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 2
gcatcgtgat aacggaagcg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 3
gctacttggc ggttccttgg 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 4
tcttcgcggc ggtcttct 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 5
cgtcagaagg gcggcacc 18
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 6
cggtcggact ggcatagata cg 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 7
atcaccaccg tgctttccg 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 8
tctggcgatg ccaagataca g 21
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 9
aagtcggcat gtcctccaac atgctgggtc gct 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 10
aagtcggcat gtcctccaac atgctgggtc gct 33
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 11
aagtcggcat gtcctccaac atgctgggtc gct 33
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 12
aagtcggcat gtcctctaac atgctgggtc gct 33
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 13
cgaaccttga gcccgcccaa acgaatagag aag 33
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 14
cgaaccttga gcccgctcaa acgaatagag aag 33
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 15
cgaaccttga gcccgctcaa acgaatagag aag 33
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 16
cgaaccttga gcccgctcaa acgaatagag aag 33
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 17
acgatcgaca atgcgatggc aagcccgagt ccg 33
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 18
acgatcgaca atgcgagggc aagcccgagt ccg 33
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 19
acgatcgaca atgcgagggc aagcccgagt ccg 33
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 20
acgatcgaca atgcgatggc aagcccgagt ccg 33
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 21
atacaggtac cacatgacca cgccggcgac gag 33
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 22
atacaggtac cacatgacca cgccggcgac gag 33
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 23
atacaggtac cacatggcca cgccggcgac gag 33
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 其他信息(Acanthamoeba castellanii)
<400> 24
atacaggtac cacatggcca cgccggcgac gag 33
Claims (11)
1.用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的SNP位点组合，其特征在于，所述组合包括4个SNP位点，分别为BXY位点、HIK1位点、HIK2位点和YKE位点。
2.如权利要求1所述的SNP位点组合，其特征在于，所述BXY位点如下：
1)BXY位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140全基因组的F链5’端起第617884位碱基，其碱基为C；
2)BXY位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12全基因组的F链5’端起第1253257位碱基，其碱基为C；
3)BXY位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种B1-04全基因组的F链5’端起第617882位碱基，其碱基为C；
4)BXY位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07全基因组的F链5’端起第617883位碱基，其碱基为T。
3.如权利要求1所述的SNP位点组合，其特征在于，所述HIK1位点如下：
1)HIK1位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140全基因组的F链5’端起第776139位碱基，其碱基为C；
2)HIK1位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12全基因组的F链5’端起第1411376位碱基，其碱基为T；
3)HIK1位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种B1-04全基因组序的F链5’端起第776136位碱基，其碱基为T；
4)HIK1位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07全基因组的F链5’端起第776137位碱基，其碱基为T。
4.根据权利要求1所述的SNP位点组合，其特征在于，所述HIK2位点如下：
1)HIK2位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140全基因组的R链3’端起第777041位碱基，其碱基为A；
2)HIK2位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12全基因组的R链3’端起第1412278位碱基，其碱基为C；
3)HIK2位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种B1-04全基因组的R链3’端起第777038位碱基，其碱基为A；
4)HIK2位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07全基因组的R链3’端起第777039位碱基，其碱基为A。
5.如权利要求1所述的SNP位点组合，其特征在于，所述YKE位点如下：
1)YKE位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种DSM 10140全基因组的R链3’端起第839428位碱基，其碱基为T；
2)YKE位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bb-12全基因组的R链3’端起第1474481位碱基，其碱基为T；
3)YKE位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种B1-04全基因组的R链3’端起第839425位碱基，其碱基为C；
4)YKE位点为动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种Bi-07全基因组的R链3’端起第839426位碱基，其碱基为C。
6.一种用于鉴定乳粉中双歧杆菌菌株的HRM方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：分别以含有权利要求1所述的BXY位点、HIK1位点、HIK2位点和YKE位点的DNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；扩增循环结束后增加HRM分析步骤，建立高分辨率熔解曲线标准曲线；
步骤二：以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；扩增循环结束后增加HRM分析步骤，建立高分辨率熔解曲线样品曲线；
步骤三：通过标准菌株和样品中菌株的高分辨率熔解曲线鉴定或检测乳粉中双歧杆菌到菌株水平；
其中，用于HRM扩增的反应体系中含有动物双歧杆菌区分SNP位点扩增引物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的含有BXY位点的DNA序列如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示；
所述的含有HIK1位点的DNA序列如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16所示；
所述的含有HIK2位点的DNA序列如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQID NO：20所示；
所述的含有YKE位点的DNA序列如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24所示。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述动物双歧杆菌区分SNP位点扩增引物如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤一和步骤二的PCR扩增体系均为：
PCR扩增体系：总体积20μl，包含2×LightCycler 480High Resolution MeltingMaster10μl、引物(F、R)各1μl、模板5μl(4ng/μl)、Mg2+2μl、水1μl；
PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性5min 10s，65-55℃(梯度PCR)退火10s，72℃延伸20s，扩增40-50个循环。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤一和步骤二的HRM分析步骤的体系均为：95℃1min，40℃10s，65℃到95℃(Ramp Rate0.02℃/s)，Acquisitions 25per℃。
11.如权利要求1-5中任一项所述的SNP位点组合在鉴定乳粉中双歧杆菌菌株中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710887563.0A CN107604082B (zh) | 2017-09-27 | 2017-09-27 | 用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的snp位点组合 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710887563.0A CN107604082B (zh) | 2017-09-27 | 2017-09-27 | 用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的snp位点组合 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107604082A true CN107604082A (zh) | 2018-01-19 |
| CN107604082B CN107604082B (zh) | 2018-09-25 |
Family
ID=61058542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710887563.0A Active CN107604082B (zh) | 2017-09-27 | 2017-09-27 | 用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的snp位点组合 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107604082B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105385762A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-03-09 | 扬州市扬大康源乳业有限公司 | 一种快速鉴定双歧杆菌的方法 |
| CN105483250A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-13 | 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 | 双歧杆菌的实时荧光pcr检测方法 |
| CN105695560A (zh) * | 2014-11-25 | 2016-06-22 | 上海市质量监督检验技术研究院 | 婴幼儿配方乳粉中乳双歧杆菌的鉴定方法 |
| CN105724584A (zh) * | 2016-03-14 | 2016-07-06 | 上海晨冠乳业有限公司 | 一种含益生元和益生菌的婴幼儿配方奶粉及其制备方法 |
-
2017
- 2017-09-27 CN CN201710887563.0A patent/CN107604082B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105695560A (zh) * | 2014-11-25 | 2016-06-22 | 上海市质量监督检验技术研究院 | 婴幼儿配方乳粉中乳双歧杆菌的鉴定方法 |
| CN105385762A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-03-09 | 扬州市扬大康源乳业有限公司 | 一种快速鉴定双歧杆菌的方法 |
| CN105483250A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-13 | 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 | 双歧杆菌的实时荧光pcr检测方法 |
| CN105724584A (zh) * | 2016-03-14 | 2016-07-06 | 上海晨冠乳业有限公司 | 一种含益生元和益生菌的婴幼儿配方奶粉及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BRICZINSKI EP ET AL.: "Strain-specific genotyping of Bifidobacterium animalis subsp. lactis by using single-nucleotide polymorphisms, insertions, and deletions", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| LOMONACO S ET AL.: "Development of a rapid SNP-typing assay to differentiate Bifidobacterium animalis ssp. lactis strains used in probiotic-supplemented dairy products", 《J DAIRY SCI》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107604082B (zh) | 2018-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lewis et al. | Validating bifidobacterial species and subspecies identity in commercial probiotic products | |
| Ventura et al. | Specific identification and targeted characterization of Bifidobacterium lactis from different environmental isolates by a combined multiplex-PCR approach | |
| Harmsen et al. | Development of 16S rRNA-based probes for the Coriobacterium group and the Atopobium cluster and their application for enumeration of Coriobacteriaceae in human feces from volunteers of different age groups | |
| Delétoile et al. | Species delineation and clonal diversity in four Bifidobacterium species as revealed by multilocus sequencing | |
| CN109706235A (zh) | 一种肠道微生物菌群的检测和分析方法及其系统 | |
| CN107430644A (zh) | 用于测定胃肠道菌群失调的方法 | |
| CN106661606A (zh) | 用于检测和表征微生物的方法 | |
| Raeisi et al. | Variation, viability and validity of bifidobacteria in fermented milk products | |
| Gurtler et al. | A novel method for simultaneous Enterococcus species identification/typing and van genotyping by high resolution melt analysis | |
| Briczinski et al. | Strain-specific genotyping of Bifidobacterium animalis subsp. lactis by using single-nucleotide polymorphisms, insertions, and deletions | |
| CN105483250A (zh) | 双歧杆菌的实时荧光pcr检测方法 | |
| Appelt et al. | Development and comparison of loop-mediated isothermal amplification and quantitative polymerase chain reaction assays for the detection of Mycoplasma bovis in milk | |
| Kao et al. | Identification of Lactobacillus spp. in probiotic products by real-time PCR and melting curve analysis | |
| Nakajima et al. | Population structure and characterization of viridans group streptococci (VGS) isolated from the upper respiratory tract of patients in the community | |
| Vitali et al. | Quantitative detection of probiotic Bifidobacterium strains in bacterial mixtures by using real-time PCR | |
| Kim et al. | Real-time PCR assay for detecting Lactobacillus plantarum group using species/subspecies-specific genes identified by comparative genomics | |
| Kim et al. | Development of real-time PCR assay to specifically detect 22 Bifidobacterium species and subspecies using comparative genomics | |
| Li et al. | Evaluation of ir biotyper for lactiplantibacillus plantarum typing and its application potential in probiotic preliminary screening | |
| Hassanzadazar et al. | Identification and molecular characterisation of lactobacilli isolated from traditional Koopeh cheese | |
| CN104946769B (zh) | 肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒 | |
| Mahenthiralingam et al. | Use of colony-based bacterial strain typing for tracking the fate of Lactobacillus strains during human consumption | |
| Vaugien et al. | Bifidobacteria identification based on 16S rRNA and pyruvate kinase partial gene sequence analysis | |
| CN102108400B (zh) | 一种鉴定双歧杆菌的方法 | |
| CN107604082B (zh) | 用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的snp位点组合 | |
| Collado et al. | Microbiological evaluation and molecular characterization of bifidobacteria strains in commercial fermented milks |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |