CN107267609A

CN107267609A - 一种用于罗森沙门菌的CRISPRs子分型检测试剂盒

Info

Publication number: CN107267609A
Application number: CN201710470366.9A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 潘志明; 周子皓; 胡亚辰; 郑慧娟; 孙林
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2017-10-20

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种用于罗森沙门菌（S.Rissen）的CRISPRs子分型检测试剂盒。本发明的试剂盒及分型方法的分辨力高于MLST方法，且一株沙门菌只需要扩增2种产物，而MLST要扩增7种产物。较于被誉为“金标准”的PFGE,其快速高通量的优点得以凸显，大量样品的子分型仅仅需要2‑3天，而PFGE只能在3天时间内完成12株样品的子分型，耗时耗力，且需要专业人员操作。并且，本发明方法对分离自不同时间和地区的分离株有一定的区分度，还可以将亲缘关系相近的分离株进行聚类，这为沙门菌流行病学调查提供了技术支持。

Description

一种用于罗森沙门菌的CRISPRs子分型检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种用于罗森沙门菌(S.Rissen)的CRISPRs子分型检测试剂盒。

背景技术

沙门菌是最重要的人兽共患病原菌之一，可以导致严重的公共卫生问题，鼠伤寒、肠炎和德尔卑沙门菌是常见的血清型。近年来，罗森沙门菌(S.Rissen)也在全国各地食源性暴发中频繁检出，导致感染者的痢疾和腹泻，威胁人类健康。

快速、有效、准确地对沙门菌进行子分型，以判定其同源性，追溯致病食品的共同来源，可以从根本上控制食源性疾病的传播，最大限度地减少对消费者健康的损害。常见的沙门菌分型有多位点基因序列分析(multilocus sequence typing，MLST)和脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis，PFGE)。MLST是基于沙门菌管家基因的变异来生成不同的等位基因谱，从而对不同沙门菌进行分型，尽管快速、简单，但是测序成本高且分辨率低。PFGE基于基因组的酶切片段在脉冲场电泳后的排布对沙门菌进行分型，被认为是沙门菌分型的金标准，具有高分辨力、重复性好等优点，但是操作复杂、费时。

发明内容

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速快速、有效、准确地对罗森沙门菌(S.Rissen)进行子分型的试剂盒。

罗森沙门菌(S.Rissen)中存在规律间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPRs)是罗森沙门菌(S.Rissen)中存在的一种免疫防御系统，罗森沙门菌(S.Rissen)存在CRISPR1和CRISPR2，均由间隔子(spacer)和重复子(DR)组成。本发明所述试剂盒采用CRISPRs子分型技术，基于规律间隔的短回文重复序列中的间隔子的排布对罗森沙门菌(S.Rissen)进行分型，操作简单、快速，且分辨力高，重复性好，不要需要昂贵的仪器，有望会成为未来的主流分型技术。

为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于罗森沙门菌(S.Rissen)的CRISPRs子分型检测试剂盒，所述试剂盒中包括CRISPR1检测引物对和CRISPR2检测引物对。

优选地，所述CRISPR1检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

优选地，所述CRISPR2检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。

本发明的试剂盒采用PCR技术扩增罗森沙门菌(S.Rissen)两个CRISPR位点(CRISPR1和CRISPR2)，根据测序结果及后续分析，得出CRISPR结构中的spacers的排列方式，以此作为分型依据。因此，引物对的设计是本发明试剂盒及分型方法的关键。

基于本发明所述试剂盒是采用PCR技术来进行分型的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：超纯水、Taq Master mix、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR反应体系。

所述PCR反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR反应体系加入引物对获得。例如，所述试剂盒中还可以包括超纯水、Taq Master mix、样品基因组DNA提取试剂。加入本发明的引物对、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。

优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。例如，所述阳性对照可以是罗森沙门菌的DNA样本。

优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为其他血清型沙门菌的DNA样本。

本发明的第二方面，提供了前述用于罗森沙门菌(S.Rissen)的CRISPRs子分型检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管，所述PCR反应体系中含有前述CRISPR1检测引物对或CRISPR2检测引物对；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，测序，分析结果。

优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。

步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。

优选地，步骤(2)中，PCR反应体系包括：2×Taq Master mix(Dye Plus)11μL,超纯水11μL,正向引物1μL，反向引物1μL，样品基因组DNA 1μL。

优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：94℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min 30s，27个循环；72℃10min。

本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备罗森沙门菌(S.Rissen)的CRISPRs子分型检测产品中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的试剂盒及分型方法简单，实验工作主要集中在PCR扩增特异产物，所有只要会PCR操作的人员均可以采用本发明的试剂盒进行罗森沙门菌的分型。本发明方法快速且高通量，因为只需要进行PCR实验以及后续测序，消耗时间一般在2至3天，就可以完成大量罗森沙门菌的子分型。本发明方法代价低廉，所需仪器仅仅只是一台PCR仪。并且重复性好，分辨率较高。

附图说明

图1：罗森沙门菌的PCR扩增产物的特异性；其中，泳道M为：DL3000Marker；泳道1-11为：不同罗森分离株。

图2：罗森沙门菌CRISPR1的分型树状图；其中包括46个spacers，黑色填充表示“存在”，空白表示“不存在”；共有两个子分型(1和2)；在信息栏“来源”中，有猪粪便(Pigfaeces)、猪拭子(Pig swab)、猪肠内容物(Pig intestinal contents)和人粪便(Humanfaeces)；在信息栏“位置”中，包括猪场(Farm)和屠宰场(Slaughterhouse)；在信息栏“地区”中，有徐州(XU ZHOU)、淮安(HUAI AN)、上海(SHANG HAI)、扬州(YANG ZHOU)和亳州(BOZHOU)。

图3：罗森沙门菌CRISPR2的分型树状图；其中包括31个spacers，黑色填充表示“存在”，空白表示“不存在”；共有四个子分型(3、4、5和6)；信息栏等同于上。

图4：罗森沙门菌CRISPR1和2的分型树状图；包括77个spacers，黑色填充表示“存在”，空白表示“不存在”；共有五个子分型(A、B、C、D、E+)；信息栏等同于上。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1 试剂盒的制备

引物设计与合成：以罗森沙门菌的CRISPRs序列为依据，分别设计CRISPR1和CRISPR2的正反向引物，其核苷酸序列如下表1所示：

表1

上述引物对可单独包装，也可以配成PCR反应体系。所述PCRPCR反应体系中，上述引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR反应体系。

进一步地，所述试剂盒还可以含有超纯水、Taq Master mix、样品基因组DNA提取试剂等等。

实施例2 试剂盒的使用

一、PCR扩增特异性产物时的体系配制和反应程序

进行PCR反应前的样品基因组DNA模板可采用现有的基因组提取试剂盒对样品(罗森沙门菌S.Rissen)进行提取。

采用实施例2所述试剂盒中的引物对，配置PCR扩增特异性产物时的体系(亦即PCR反应体系)。各对引物对分别配置成相对应的PCR反应的体系。

使用时用超纯水稀释引物对干粉，每对引物对稀释比例为1：100(nmol：μL)。

含有每对引物对的PCR反应的体系配制为(25μL)：2×Taq Master mix(Dye Plus)11μL,超纯水11μL，正向引物1μL，反向引物1μL，样品基因组DNA 1μL。

PCR程序为：94℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min 30s，27个循环；72℃10min。

所获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明为单一的条带，可以用于下一步的测序使用(如图1所示)。

二、测序结果的处理及分析

测序完成后，下载相应序列结果文件，运用CRISPRs Finder online(http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)网站中的CRISPRs Finder工具查找到每个CRISPRs序列中的重复子(DR)序列和间隔子(spacer)序列，选择最佳的DR序列，使用CRISPRtionary工具获得不同样品菌株的序列分布，并生成二进制Excel文件，最后使用Bionumerics 7.0软件绘制菌株的聚类分析图和spacer序列分布图。

实施例3 试剂盒在猪源沙门菌分离株中的应用

采用实施例2中的试剂盒及建立的方法，应用于58株分离于猪源的罗森沙门菌，可简单快速且低成本地完成子分型。具体步骤如下：

1)沙门菌的分离

本实验中样品分离株采集自江苏不同猪场、屠宰场，以及一株人源罗森沙门菌分离株，样品采集、增菌、选择性分离、生化鉴定以及血清型鉴定参考已有方法(Cai,etal.International Journal of Food Microbiology,2016；Zhou,et al.Food Control,2017)，共分离鉴定了58株罗森沙门菌。

2)CRISPRs子分型方法应用于罗森沙门菌

将分离得到的沙门菌三区划线于LB普通培养基平板上，37℃恒温培养箱培养12-16小时。用接种环挑取LB琼脂平板线上单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm恒温摇床，培养12-16小时。按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取沙门菌基因组DNA，提取后的基因组用于后续PCR实验。PCR反应的体系配制为(25μL)：2×Taq Master mix(Dye Plus)11μL,超纯水11μL,正向引物1μL，反向引物1μL，样品基因组DNA 1μL。PCR程序为94℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min 30s，27个循环；72℃10min。实验中所用引物参考表1。将PCR产物送至公司测序，若存在产物条带较大的情况可以让公司设计walking引物进行测序。测序结果得到后，运用CRISPRs Finder online网站中的CRISPR Finder工具查找到每个CRISPRs序列中的重复子(DR)序列和间隔子(spacer)序列，选择最佳的DR序列，使用CRISPRtionary工具获得不同样品菌株的序列分布，并生成二进制Excel文件，最后使用Bionumerics 7.0软件绘制菌株的聚类分析图和spacer序列分布图，其聚类方法使用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arthmetic means,UPGMA)。

在本实施例中，成功将58株沙门菌分离株进行CRISPRs子分型(如图2、3、4所示)，整个过程完成仅需要2天(48h)时间。结果显示存在5个CRISPRs型(A、B、C、D、E)。C、D、E中的分离株分别是2016、2014、2015年，且分别分离自淮安(一株来自上海)、扬州、徐州或亳州(如图4所示)，这证明了此分型方法对时间和地区有一定的分辨度。另外，此方法对亲缘关系近的分离株有一定的聚类作用，比如A中，包括分离自2013、2014、2016、2017年，分离自徐州、淮安、扬州、上海，分离自猪场和屠宰场，分离自猪源和人源的沙门菌(如图4所示)，这为沙门菌污染源头的追溯和传播方式的确定提供了技术支持。

综上所述，本发明的试剂盒及子分型方法相较于常见的子分型方法有很大优势：

本发明的试剂盒及分型方法的分辨力高于MLST方法，且一株沙门菌只需要扩增2种产物，而MLST要扩增7种产物。实施例3中所有的菌株经MLST分型鉴定均是ST469，而采用本发明的方法在此ST型中分辨出五种子分型，分辨率更高(如图4所示)。

较于被誉为“金标准”的PFGE,其快速高通量的优点得以凸显，大量样品(58株)的子分型仅仅需要2-3天，而PFGE只能在3天时间内完成12株样品的子分型，耗时耗力，且需要专业人员操作。

并且，此发明方法对分离自不同时间和地区的分离株有一定的区分度，还可以将亲缘关系相近的分离株进行聚类，这为沙门菌流行病学调查提供了技术支持。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种用于罗森沙门菌的CRISPRs子分型检测试剂盒

<130> 172599

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CRISPR1 正向引物

<400> 1

tgttagccac gttgagcgat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CRISPR1 反向引物

<400> 2

tcgggatggc agatgattcg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CRISPR2 正向引物

<400> 3

acctggggtg aaaacagacg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CRISPR2 反向引物

<400> 4

cgggttgctg taatgatgcg 20

Claims

1.一种用于罗森沙门菌的CRISPRs子分型检测试剂盒，所述试剂盒中包括CRISPR1检测引物对和CRISPR2检测引物对。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CRISPR1检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CRISPR2检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括超纯水、TaqMaster mix、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。

6.如权利要求1～5任一权利要求所述的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管，所述PCR反应体系中含有CRISPR1检测引物对或CRISPR2检测引物对；

(4)PCR反应结束后，测序，分析结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断目的的方法。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CRISPR1检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物；所述CRISPR2检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO.4所示的反向引物。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：94℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min 30s，27个循环；72℃10min。

10.如权利要求1～5任一权利要求所述的检测试剂盒在制备罗森沙门菌的CRISPRs子分型检测产品中的用途。