CN101501212B - 基于渐消波生物传感器的实时pcr微阵列 - Google Patents
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Abstract
用于样品中核酸的同时、定量测量的系统和方法。通过与寡探针杂交将靶核酸的荧光标记的扩增子固定在基底表面，该寡探针已经以预定的二维模式排列并且系于基底表面。然后使用合适波长的渐消波光通过激发其荧光标记，检测杂交的扩增子。由于渐消波的有限穿透(约100～300nm)，反应室剩余部分中的荧光标记的核苷酸不发荧光。通过测量基底表面各个位置的荧光，可测定每一靶核酸的杂交的扩增子的当前丰度。然后可以使用实时PCR的分析技术获得样品中每一核酸的准确、定量测量。
Description
发明领域
本发明涉及核酸定量测量的系统和方法，并且具体涉及多个核酸实时、同时定量测定的系统和方法。
发明背景
在基础生物学研究中以及例如临床微生物学领域中，核酸定量测定十分重要。通常在两个阶段里完成定量测定。首先将样品中的靶核酸扩增，以产生用于定量化工具的可检测量的核酸。然后将可检测量的靶核酸用于计算样品中最初存在的核酸的量。
聚合酶链反应(PCR)是扩增核酸的强大途径，尤其是脱氧核糖核酸(DNA)。对实践PCR关键的是热稳定性DNA聚合酶的使用，即，能催化DNA复制的蛋白质，在将DNA螺旋分离成两条单链核酸所需的升高的温度下，该蛋白质不变性。
通过将靶双链DNA放置于核苷酸缓冲液中，同时提供叫做引物的单链DNA小序列和热稳定性DNA聚合酶来启动PCR，该引物与靶DNA互补。通过在三个阶段循环混合物的温度，可以将靶DNA指数扩增。第一阶段是高温(94℃)变性阶段，此阶段中双链DNA分离成两条单链。第二阶段是低温(60℃)退火阶段，此阶段中引物与单链DNA结合。最后，延伸阶段在中等温度(72～78℃)发生。在延伸阶段，DNA聚合酶催化已经与靶DNA单链退火的引物的延伸，从而添加合适的核苷酸直到完整的双链DNA螺旋形成。在每一个PCR循环中，靶DNA的拷贝数几乎加倍，从而使得靶DNA能够快速积聚。
原则上，在一系列PCR循环结束时产生的靶DNA(也称作“终产物”)的量与原始样品中靶DNA的拷贝数成比例。然而，实际上，扩增的指数特性，以及启动复制的引物退火的微妙，导致饱和和其他作用，其使PCR终产物成为对原始样品中靶DNA量的非常不可靠的估计。
为了改进原始的PCR方法，20世纪90年代中期，开发了实时聚合酶链反应(实时PCR)，其在某种程度上避免这些困难并且提供样品中任何靶DNA拷贝数的可靠的、准确的定量测量。在实时PCR中，将仅当与靶DNA结合时才有活性的荧光探针添加入PCR缓冲液中。这些荧光探针是单链DNA，链中部有与靶DNA互补的核苷酸序列。该中部的每一侧，是彼此互补的延伸核苷酸序列，以便未附着的探针可以以发夹构型自身折叠。荧光探针一端有荧光分子，另一端有荧光猝灭分子。所以未附着的、折叠的探针有彼此相邻的发荧光和猝灭分子，并且因此当照射未附着的探针时没有荧光被发射。然而，当荧光探针附着于其靶DNA时，探针是非折叠的，这样发荧光和猝灭分子彼此分离。当用合适波长的光照射附着的探针时，荧光分子因此发射荧光。
通过为特定的靶DNA提供足够的荧光探针，并且测量PCR反应每阶段结合的探针发出的荧光，可以测量反应每个阶段的扩增子数目。由于达到预定阈值的扩增子数目的循环的分数与原始样品中拷贝数的对数之间存在直线关系，所以这种测量可以用于非常精确地测定原始样品中DNA的拷贝数。
使用这种方法，实时PCR可以用于测定一种样品中靶DNA的量，在9个数量级的范围内误差小于2％，即，它能计数小到5，且多达五十亿条原始样品中的靶DNA拷贝链。
然而，实时PCR技术确实有局限，其中最重要的是，由于具有合适的对应的荧光激发光源的合适荧光染料数目有限，所以迄今为止实时PCR仅能测量一个反应管中少数的核酸。
对很多应用而言，多于一种核酸的同时定量分析是高度需要的。所需要的是一种仪器和方法，其允许实时PCR使用少量荧光染料，并且优选仅一种荧光染料，用于同时定量数百种不同核酸。
发明概述
本发明提供样品中多个核酸同时、定量测量的一种系统和方法。
在示例性的实施方案中，在单一反应室中用聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR、滚环(roll cycle)复制或T7转录线性扩增来扩增样品中所有的核酸，其中扩增缓冲液中额外含有荧光标记的核苷酸或荧光标记的引物，从而靶核酸的扩增子能进行自身荧光标记。
在扩增过程的退火和/或延伸阶段期间，以预定的二维模式，通过与已经排列且系于基底表面的寡探针(oligoprobe)进行杂交，将荧光标记的靶核酸扩增子定位于基底表面上。寡探针有与靶核酸互补的核苷酸序列，并且可以使用商业上可获得的微阵列技术，通过自动印刷将其排列。
当由合适波长的光的渐消波激发了它们的荧光标记时，就可以通过发射的荧光检测杂交的、荧光标记的靶扩增子。因为当进入反应室时，渐消波指数衰减，具有大约100～300nm的有效范围，所以渐消波穿透到反应室中的深度仅仅足以激活与基底表面非常靠近的荧光标记，即，与系于表面的寡探针杂交的荧光标记的靶扩增子。因此，渐消波不能激活反应室剩余部分的荧光标记的核苷酸。
通过在基底表面的各个区域监控荧光的强度，可以测定每一靶核酸的杂交扩增子的当前丰度。这可以在PCR反应进行时实时完成，并且然后将实时PCR的分析技术用于获得原始样品中每一靶核酸丰度的准确的、定量的测量。
通过参考下面的附图可以更加全面地理解本发明的这些和其它特性。
附图简述
图1是在PCR方法的起始阶段微阵列PCR反应中能进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒(cartridge)的横截面视图。
图2是在PCR方法的退火和延伸阶段结束时微阵列PCR反应中能进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图。
图3是在PCR方法的变性阶段微阵列PCR反应中能进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图。
图4是在PCR方法的检测阶段微阵列PCR反应中显示进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图。
图5是荧光强度对PCR循环的示例性图。
图6是原始样品中靶DNA链拷贝数的对数(log[N])对所述靶DNA循环阈值(CT)的示例性图。详述
本发明提供能实时、同时、定量测量样品中多个核酸的系统和方法。
在示例性实施方案中，用聚合酶链反应(PCR)扩增样品中的核酸。PCR是众所周知的扩增一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)链的方法，其开始于将靶DNA置于含有引物DNA，核苷酸腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)(共同称为dNTP)，DNA聚合酶和引物的缓冲液中。引物是短链DNA，其具有与要扩增的核酸一端互补的序列。引物启动靶DNA的复制。
PCR方法有三个主要的步骤：变性、退火和延伸。在变性步骤中，将混合物加热至约94℃，在此温度下所有的DNA分离成单链。然后将混合物快速冷却。当温度降至约60℃时，退火步骤发生，在此步骤中引物与靶DNA上其互补序列杂交或结合。然后为进行延伸步骤将温度升至最佳72～78℃的范围之内。在此步骤中，DNA聚合酶利用溶液中的dNTPs延伸退火后的引物，并且形成称为扩增子的DNA新链。扩增子是原始靶DNA链的互补拷贝，并且最初以双螺旋构型与其结合。然后将混合物短暂地重新加热回约94℃，以使新形成的双螺旋链分离成单链核酸，且这样开始了PCR方法的另一个循环。对于每个PCR方法的循环，原始靶DNA的拷贝数大概翻倍。
在本发明优选实施方案中，PCR缓冲液额外含有荧光标记的dNTPs，即，具有附着其上的荧光染料分子的dNTPs，从而在每个PCR循环结束时，生成的扩增子是被荧光标记的。然后使用称为寡探针的DNA探针链定位靶DNA的扩增子。寡探针具有与靶DNA互补的核苷酸序列。将寡探针以已知的二维模式系于基底表面，同时基底表面形成含有PCR成分的反应室的部分。
在PCR方法的退火和延伸阶段期间，荧光标记的靶扩增子与其相应的寡探针杂交。然后用合适波长的光的渐消波照射杂交的、荧光标记的靶扩增子，以激活标记的dNTPs的荧光染料分子。这种渐消波通过寡探针系于其上的基底表面进入反应室后以指数幂衰减，其有效穿透范围大约为300nm。这就意味着渐消波穿透反应室的深度足以激活与那些寡探针杂交的荧光标记的扩增子，但是不能激活在反应室主体的溶液中的荧光标记的dNTPS。通过监控基底表面各个位置的荧光强度，可以测定相应靶DNA的扩增子的当前丰度。这可以在PCR反应进行时实时完成，并且结果用于获得原始样品中特定靶丰度的定量测量，在某种意义上类似于实时PCR计算。
现在通过参考附图，将更详细地描述方法中示例性的实施方案，在附图中尽可能同样的数字指同样的元件。
图1是在微阵列PCR反应中能进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图，其包括反应筒10、有表面13的基底12、第一寡探针14、第二寡探针15、缓冲液16、第一DNA链18、第二DNA链20、dNTPs 22、荧光标记的dNTPs 24、引物26、热稳定的DNA聚合酶28、加热元件30和冷却元件31。
在优选的实施方案中，基底12包含光学上比缓冲液16更致密的材料，从而可以使用下文详细描述的渐消波检测。例如基底12可以是玻璃，或合适涂覆的塑料或聚合物。
第一和第二寡探针14和15是DNA链，各自具有它们用于检测的DNA18和20的靶链之一的特定核苷酸序列。在优选的实施方案中，这些寡探针是不可延伸的。换句话说，不能将核苷酸添加于寡探针的任一端。寡探针14和15可以是天然的或合成制作的多核苷酸、具有人造碱基和/或人造碳水化合物的多核苷酸、肽核酸(“PNA”s)、二环核酸、或其他核苷酸类似物，用商业上可获得的寡核苷酸合成仪构建，例如，但不限于，Ann Arbor，MI的Genomic Solutions，Inc.提供的Polyplex
合成仪，或其可以是，但不限于选自DNA序列文库的序列，例如已知有一些生物学重要意义的表达序列标签(EST)文库。
将寡探针14和15排列在基底表面13上。在优选实施方案中，用自动印刷将寡探针14和15作为小点排列在基底上，其中使用商业上可提供的微阵列技术，例如，但不限于，Ann Arbor，MI的Genomic Solutions，Inc.提供的Omnigrid
微阵列仪(microarrayer)。
使用众所周知的技术之一将寡探针固定化在基底表面，例如，但不限于，将活性甲硅烷基部分共价缀合到寡探针上。在手动或自动沉积后这样硅烷化的分子即刻固定化于玻璃表面。通过适当地使表面带电交替地固定寡探针，优选通过使用合适的涂层，例如，但不限于，硅烷或聚-L-赖氨酸。
荧光标记的dNTPs 24是用荧光染料标记的核苷酸，例如，但不限于，荧光素或罗丹明绿色染料，或有类似发荧光特性的类似的、相关化合物，如官能化或嵌入染料和发光的、官能化的纳米颗粒(nanoparticle)(“量子点”)。dNTPs 24可以具有荧光标记的四个碱基核苷酸dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一个、两个、三个或四个。在优选的实施方案中，仅将核苷酸之一标记，例如，仅仅dCTP。
加热元件30可以是任意合适的电阻性材料，例如，但不限于碳，该元件在电流通过它时可以提供热。加热元件30需要能在数分钟内将反应室加热至94℃。冷却元件31可以是任意合适的固态冷却元件，例如，但不限于，众所周知的发挥蒸汽泵功能的Peltier固态装置。加热元件和冷却元件也能在筒外部。
图2是在PCR方法的退火和/或延伸阶段结束时微阵列PCR反应中能进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图，其进一步包含第一和第二荧光标记的扩增子32和34。第一荧光标记的扩增子32是具有核苷酸序列的DNA链，该序列是第一靶DNA链18的互补拷贝，即，对于在第一靶DNA链18中的每一腺嘌呤(A)核苷酸，在第一扩增子32中有胸腺嘧啶(T)核苷酸，并且反之亦然。类似地，对于第一靶链18中的每一胞嘧啶(C)核苷酸，在第一扩增子32中有鸟嘌呤(G)核苷酸。
在PCR方法的退火和/或延伸阶段结束时，由退火的引物26延伸产生的扩增子32和34仍与其相应的靶DNA链18和20杂交。此外，将PCR方法的前面循环产生的扩增子与系着的寡探针14和15杂交。例如，在表面位点36，第二荧光标记的扩增子34与第二寡探针15杂交。类似地，在表面位点38，第一荧光标记的扩增子32与第一寡探针15杂交。设计寡探针14和15使其在PCR方法中不被扩增，方法如下，例如，通过其3’端将其系于基底，或通过用双脱氧化(dideoxidation)修饰3’端，或通过将稳定基团添加于3’端，或通过在特定引物存在的情况下使寡探针不参与PCR方法的其他众所周知的方法。
图3是在PCR方法的变性阶段微阵列PCR反应中能进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图。在这个阶段，已将反应室12中的混合物加热至接近100℃，并且最优是大约94℃。在此温度下，DNA发生变性，即，其分离成单独的单链。在PCR方法的下一阶段将其冷却时，单独DNA靶链18和20的每一条，以及荧光扩增子32和34的每一个将与第一引物26退火。在每一单独DNA靶链18和20，以及每一荧光扩增子32和34与作为原始靶链18和20的拷贝或互补拷贝的新扩增子杂交之前，在热稳定的DNA聚合酶28添加合适的核苷酸时，将延伸退火的引物26。
图4是在PCR方法的检测阶段微阵列PCR反应中显示进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图，其进一步包含光入射束40、入射角42、光反射束44、光渐消束46、光荧光束48和荧光检测器50。检测阶段可与退火和/或延伸阶段同时发生。
选择光入射束40为适于激发用于标记dNTPs 24的荧光团(flurophore)的波长。在优选的实施方案中，光入射束40是氩离子激光器的488nm谱线，该谱线与优选用于标记dNTPs 24的荧光染料的激发最大值(494nm)相匹配。
选择比基底与缓冲液界面临界角大的光入射束40的入射角42。入射临界角是全内反射发生时的角并且取决于形成界面的材料的折射率。从Snell’s折射定律来看，
入射临界角＝sin-1(n1/n2)
其中n1和n2是界面每一侧材料的折射率。在本发明的优选实施方案中，基底12包含玻璃并且折射率大约1.5，然而缓冲液16主要包含折射率约1.3的水，从而入射临界角大约是61度。
当光以大于临界角的入射角42从界面13反射，从而发生全内反射时，渐消波46形成并且通过界面传播。对于距离界面的距离每增加130nm，渐消波46的强度以e因子降低。这样使用渐消波46仅可以照射与界面距离很近的物体。这个特性用于本发明的优选实施方案中，以优选地照射与第一和第二寡探针14和15杂交的第一和第二荧光标记的扩增子32和34。然后可以且通过荧光检测器50检测并分析由荧光标记的扩增子14和15发射的荧光48。荧光检测器50通常包含收集光学装置，例如，但不限于，将光线聚焦于检测系统上的显微镜物镜，该检测系统例如，但不限于，光电倍增管或电荷耦合设备(CCD)照相机或光电二极管。
收集的荧光来源和强度然后可用于估计荧光发射分子的数目，并且因此用例如在实时或动态PCR分析中使用的众所周知的定量技术，估计目前与特定种类的寡探针杂交的荧光标记的扩增子的数目。其中，反应的特征在于第一次检测到PCR产物的扩增时在循环期间的时间点，而不是在固定循环数之后累积的PCR产物的量。原始样品中核酸靶的拷贝数越高，观察到荧光显著的增加越快。
在本发明进一步的实施方案中，通过监控反射光和测定荧光标记吸收的光的量，可以检测荧光信号。
图5是荧光信号对三条靶DNA链的循环数的示例性图52、54和56，每一条在原始样品中都有不同的拷贝数。即使当没有PCR循环发生时，也有开始或基线，背景荧光信号，可检测。在PCR的起始循环中，该荧光信号有很小改变。超过基线的荧光增加显示累积的PCR产物的检测。通过设置固定的超过基线的荧光阈值，循环阈值(CT)参数可定义为特定寡探针的荧光通过该固定阈值的部分循环，如三个部分值CT1、CT2和CT3所示的。
图6是原始样品中靶DNA链拷贝数的对数(log[N])对靶DNA循环阈值(CT)的示例性图。由于PCR的指数特性，原始靶拷贝数对数对CT的图是直线60。通过引入大量校准DNA靶，其具有已知的原始样品中拷贝数，与其相应的寡探针结合的荧光可用于产生原始拷贝数的对数对CT的直线校准线60。通过测量已知有特定寡探针的反应室上位置的CT，然后可以从校准曲线推断出与该寡探针相应的靶DNA的拷贝数。
虽然上述讨论已经用DNA作为示例性核酸，但是对本领域的技术人员显而易见的是将本发明应用于其它核酸，包括RNA序列或RNA和DNA序列的组合。
虽然上述讨论已经用PCR作为示例性的反应，但是对本领域的技术人员显而易见的是利用任何合适的扩增反应应用本发明的方法，例如，但不限于，逆转录PCR、随机引物扩增、滚环扩增或线性扩增“T7”。
虽然上述讨论已经将荧光标记的dNTP用于标记靶DNA，但是对本领域的技术人员显而易见的是将相关结构，例如，但不限于，荧光标记的引物、官能化的纳米颗粒、或嵌入染料用于标记靶DNA。
虽然为了简单起见，已经按照两个靶核酸讨论了上述讨论，但是对本领域的技术人员显而易见的是将本方法和装置用于一个靶核酸或多个靶核酸的定量评估。
虽然已经用对结构特征和/或方法行为特定的语言进行了描述，但是应该理解在附加权利要求中定义的本发明不需要限于所描述的特定特性或行为。而是，以实现请求保护的发明的示例性形式，公开特定的特性和行为。
Claims (9)
1.在微阵列中定量分析多个靶核酸的方法，其包括：
提供具有反应室的筒，其用于扩增靶核酸且在相同的反应室中使靶核酸与在有上表面的基底上的多个探针进行杂交；
提供与所述基底上表面附着且排列于其上的多个寡探针，所述寡探针特异于所述多个靶核酸并且处于预定的二维模式；
提供具有所述靶核酸的荧光标记的扩增子的溶液，其中所述荧光标记的扩增子通过扩增反应制备，所述扩增反应包括在荧光标记的核苷酸存在下的变性、退火和延伸；
将所述荧光标记的扩增子与所述寡探针在所述扩增反应的所述退火步骤期间杂交；
使用预定波长的渐消波，由与所述寡探针杂交的所述荧光标记的扩增子激活荧光，但不由溶液中未掺入到扩增子中的荧光标记的核苷酸或溶液中未结合到一个或多个寡探针的荧光标记的扩增子激活荧光；以及
同时检测所述荧光以用于定量分析所述靶核酸。
2.权利要求1的方法，其中检测所述荧光发生在所述扩增反应的所述退火或延伸步骤期间。
3.权利要求1的方法，其中提供寡探针包括用微阵列印刷机将所述寡探针印刷于所述基底上和将所述寡探针固定于所述基底上的步骤。
4.在权利要求3中所述的方法，其中固定所述寡探针进一步包括使所述基底带正电荷。
5.在权利要求4中所述的方法，其中带正电荷进一步包括用选自硅烷、抗生物素蛋白、或聚-L-赖氨酸、或其组合的试剂涂覆所述基底。
6.权利要求1的方法，其中所述扩增反应是实时聚合酶链反应。
7.用于定量分析靶核酸的装置，其包括：
具有反应室的筒，其用于扩增靶核酸且在相同的反应室中使靶核酸和与表面附着且排列于表面上的多个探针进行杂交，其包括：
有上表面和下表面并且折射率大于水的折射率的基底；
充分与所述基底的所述上表面接触的缓冲液，所述缓冲液能维持扩增反应和核苷酸杂交反应并且含有一个或多个荧光标记的核苷酸和一个或多个靶核酸，其中所述扩增反应产生所述一个或多个靶核酸的一个或多个荧光标记的扩增子，所述扩增子掺入了所述一个或多个荧光标记的核苷酸；
与所述基底的所述上表面附着且排列于其上并且在所述缓冲液中的多个不同的寡探针，所述寡探针处于预定的二维微阵列模式，并且所述寡探针中的至少一个具有与所述一个或多个靶核酸和所述一个或多个荧光标记的扩增子的核苷酸序列相应或互补的核苷酸序列；
具有一束光的光源，其具有选择用于激活所述一个或多个荧光标记的扩增子的波长，在所述基底和所述缓冲液之间的界面上以一定角入射，选择所述角从而使渐消波穿透到反应室中的深度足以激活与所述一个或多个寡探针接触的一个或多个荧光标记的扩增子，但穿透到反应室中的深度不足以激活缓冲液中未掺入到扩增子中的荧光标记的核苷酸或缓冲液中未结合到所述一个或多个寡探针的荧光标记的扩增子；和
检测器，其能同时检测和定量处于二维微阵列模式的各寡探针位置处发射的荧光。
8.权利要求7的装置，进一步包括能循环所述缓冲液温度的加热元件，因此使得能够发生所述扩增反应。
9.权利要求7的装置，其中所述扩增反应是实时聚合酶链反应。
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