CN111621606A

CN111621606A - 新型冠状病毒实时荧光rpa检测试剂盒

Info

Publication number: CN111621606A
Application number: CN202010629216.XA
Authority: CN
Inventors: 李晓鲁; 蓝海
Original assignee: Chengdu Haizhiyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Haizhiyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2020-09-04

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒RPA荧光法检测试剂盒，属于病毒检测领域。本发明的试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1和2所述的引物，以及序列如SEQ ID NO.3所示的探针。本发明的试剂盒能够以低于常规RPA检测试剂盒50％的试剂成本，实现高灵敏度、特异性的快速检测，十分适用于当前疫情防控形势。

Description

新型冠状病毒实时荧光RPA检测试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测领域。

背景技术

新型冠状病毒，即SARS-Cov-2，人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。新型冠状病毒所引发疾病也被称为 “COVID-19”，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

新型冠状病毒的检测是疫情防控中的重要一环，目前已有各种检测试剂盒，按检测对象可分为核酸检测试剂盒、蛋白检测试剂盒。核酸检测试剂盒中，主流的是qRT-PCR试剂盒，通常在1-2h内才能得到检测结果，检测等待时间较长。

重组酶聚合酶扩增技术，简称RPA技术，是2006年由英国TwistDX公司开发的一种新型核酸恒温扩增技术，与传统PCR相比反应不再需要热循环装置，只需在恒温条件下即可实现DNA的扩增，且检测耗时短。

RPA技术扩增产物有2种主流的检测方法：实时荧光检测仪(比如常规的荧光定量PCR仪)检测和侧向流检测试纸(简称“试纸条”；例如：胶体金免疫层析试纸条)检测，不同检测方法对应原理不同，其探针构造略有不同。

实时荧光检测仪检测方法，简称“实时荧光法”，对应的探针带有碱基替代物dSpcacer(通常为四氢呋喃)，dSpcacer两侧有荧光基团(5’侧)和淬灭基团(3’侧)。扩增时，核酸外切酶III从dSpcacer剪断探针，得到可延伸的 3’-OH，DNA聚合酶可继续进行DNA延伸合成；因为荧光基团与淬灭基团分开，荧光信号得以释放(图1)。随着反应进行，荧光信号逐渐增强，因此可以通过实时荧光检测仪检测。

试纸条检测方法简称“试纸条法”，对应探针同样带有碱基替代物dSpcacer(通常为四氢呋喃)，同时探针的5’端还带有荧光基团，但不含淬灭基团。扩增时，核酸内切酶IV剪切dSpcacer，留下可延伸3’-OH，DNA聚合酶以探针为“正向引物”继续延伸合成DNA，与反向引物(带亲和标记，例如生物素)一起扩增出一种带有双重标记(荧光基团标记、亲和标记)的扩增产物；该产物在侧向流检测试纸中层析，遇到可识别亲和标记的试纸区域(通常为一条线，带有链霉亲和素)时，则被富集，表现出线形荧光信号。

目前尚无检测新型冠状病毒的RPA检测试剂盒，其主要原因是：RPA引物设计不同于普通PCR或qRT-PCR，目前没有一种统一的设计标准，也无法用引物设计软件直接得到，人工设计的难度较大，成功率较低。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种新型冠状病毒的RPA检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种SARS-Cov-2的RPA检测试剂盒，所述试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1和2所述的引物，以及序列如SEQ ID NO.3所示的探针；

探针带有荧光基团，3’端阻断基团，以及能被核酸外切酶III所识别的碱基替代物dSpcacer。

如前所述的试剂盒，所述试剂盒还包括逆转录基础反应单元、反应缓冲液、乙酸镁。

如前所述的试剂盒，所述试剂盒是荧光法检测试剂盒；

所述探针还带有荧光淬灭基团，所述荧光基团与荧光淬灭基团分别位于dSpcacer的两侧；

所述逆转录基础反应单元包括：重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸外切酶III、逆转录酶。

如前所述的试剂盒，重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸外切酶 III、逆转录酶的质量比为4:1:9:3:1。

如前所述的试剂盒，碱基替代物dSpcacer位于探针第30-31碱基之间。

如前所述的试剂盒，所述dSpcacer为四氢呋喃；和/或，所述阻断基团为 C3-spacer。

如前所述的试剂盒，所述试剂盒还包括标准品；

所述标准品为SARS-Cov-2的ORF1ab基因片段；

优选的，标准品的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

一种非疾病诊断目的的SARS-Cov-2检测方法，

它是使用前述试剂盒对样品DNA进行重组酶聚合酶扩增，检测扩增产物即可。

如前述的方法，每个RPA反应的体系为25μL。

如前述的方法，RPA反应温度为39摄氏度。

本发明是第一个检测新型冠状病毒的RPA检测试剂盒，相比传统的 qRT-PCR试剂盒，具有更高的灵敏度，且更为省时。

本发明的RPA检测试剂盒，相比现有RPA试剂盒，能减少50％的试剂成本，且灵敏度、特异性均不弱于现有RPA试剂盒。

本发明的RPA检测试剂盒，在检测阳性样本时，检测时间可以缩短到5min 以内，可很大程度节约检测时间，尤其适用于即时诊断。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.实时荧光检测中探针工作原理图。

图2.实时荧光RPA试剂盒的灵敏度。

图3.实时荧光RPA试剂盒的特异性。

具体实施方式

实施例1新型冠状病毒RPA荧光法检测试剂盒的组成和使用方法

试剂盒主要组成部分如表1所示。

表1试剂盒主要组成部分

注：包装规格：48次/盒袋，需自备病毒核酸提取试剂盒、RNA酶抑制剂(推荐：Takara：货号：9766、2313Q)

其中表1中引物、探针及其他部分试剂的详细介绍如下：

(1)引物、探针

本发明的引物和探针序列如表2所示，探针序列中，第31-32碱基之间碱基替代物dSpcacer(供核酸外切酶III识别切割)为四氢呋喃，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰(它还可以是磷酸盐生物素或胺)；第31碱基的胸腺嘧啶被荧光基团FAM取代(dT-FAM)，第32碱基的胸腺嘧啶被淬灭基团 BHQ1取代(dT-BHQ1)。

(2)其它试剂

逆转录基础反应单元：重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸外切酶III、逆转录酶(质量比4∶1∶9∶3∶1)。

2×反应缓冲液：含有足以支持RPA反应的三羟甲基氨基甲烷、聚乙二醇、 dNTP、ATP、Tris乙酸钾等(PH值：7.9)(Tiwist DX^TM)

表2引物、探针序列

反应推荐体系如表3所示。

表3反应体系表(推荐反应用量25μL/管)

适用检测仪器：

可检测FAM荧光的恒温设备均可。

RPA反应参数：设置检测温度39℃，荧光检测间隔(Sample rate)为20s，共 60个循环，检测总时长(Scan duration)20min，荧光阈值为设定为800mv。样本处理：待检测核酸样本提取可采用核酸提取试剂盒或全自动核酸提取仪，具体方法按照相应说明书执行

基于ORFlab新型冠状病毒标准品(SEQ ID NO.4，由生工生物工程有限公司合成)：

以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。

实验例1 RPA试剂盒对新型冠状病毒检测的特异性与灵敏度检测

1.灵敏度检测：

质粒标准品用紫外分光光度计测量浓度为40ng/μL，pUC57-KANA的碱基数为2710bp，目的片段大小为253bp，每个碱基平均相对分子质量为660 道尔顿/bp，每ul样品中的拷贝数按照计算公式：样品拷贝数(copies/ul) ＝(6.02×10²³)×质粒浓度(ng/μL)×10^-9/(660×碱基数)，最终计算出的拷贝数为1.23×10¹⁰copies/ul。以上的标准品按照10倍倍比稀释，取浓度在10⁷-10¹ copies/ul进行实验，在实时荧光定量PCR仪中39℃反应20min。

结果如图2所示：随着拷贝浓度的降低，出现扩增曲线的时间延长，在 10⁷-10²copies/ul范围内的样品均能被检出，检测下限为10²copies/ul。

2.特异性检测：

以上述体系进行反应，加入模板分别为新型冠状病毒阳性质粒，阴性对照为不含靶基因的溶液(加入DEPC水即可)，在实时荧光定量PCR仪中39℃ 反应20min。

结果如图3所示只有新型冠状病毒出现明显的荧光扩增曲线。

可见，本发明的试剂盒具有良好的灵敏度和特异性，且能在20min内检出结果，有助于提升目前新型冠状病毒检测的准确性和效率。

实验例2引物筛选

目前没有明确的RPA引物序列设计规则，也没有设计软件可应用，发明人的引物设计主要遵循如下规则：

1)引物的长度应为30-35个碱基，以最佳地形成重组酶/引物丝；不建议使用更长的引物(＞45个碱基)；

2)应该避免一个特定核苷酸的长轨道或大量小重复序列(比如 AAAAA)；

3)RPA可以扩增长达1.5kb的长序列，但是使用较短的扩增子在 80-400bp(最佳100-200bp)范围内可获得更好的结果；

4)尽量避免引物二聚体、发夹结构；

5)GC含量过高(＞70％)或过低(＜30％)都不利于RPA扩增；

6)对于3’末端的3个核苷酸来说，鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能；

7)下游引物与探针不能有碱基重叠；

8)在NCBI进行大量比对；

9)进行引物筛选实验。

发明人设计了很多引物，经过层层排列组合筛选，得到了本发明的引物组合。本实验例是从候选引物中选择6条，以20ng/ul的阳性对照为模板，用实施例1的方法进行RPA扩增，以展示不同引物效果存在差别，以及本发明试剂盒引物的优良性能。

所选择的6条候选引物序列如表4所示，使用的探针序列如SEQ ID NO.3 所示。

表4引物序列

代号	SEQ ID NO.	序列(5′-3′)
			F1	5	ATGCTTTTCCACTGCTTCAGACACTTATGCC
R1	2	AGGATATTCAATAGTCCAGTCAACACGCTTA
			F2	1	TGCCACATGCTTTTCCACTGCTTCAGACACT
R2	6	TGTCGTGAAGAACTGGGAATTTGTCTGCTAA
			F3	7	TCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGT
R3	8	ACTACCTGGCGTGGTTTGTATGAAATCACCGA

引物组合扩增结果如表5所示。本发明的引物组合能在不到5分钟内出现扩增信号，优于其他引物组合。

表5引物扩增达到阈值的时间的对比

注：总体扩增时长为20min，扩增达到阈值时间不足5min记录为“+++”，5min-15min记录为“++”，大于15min-20min记录为“+”，没有出现扩增曲线记录为“-”。

由本实验例还可推知，本发明的引物组合在检测阳性样本时能进一步缩短检测时间。

实验例3反应体系体积优化

在已报道的RPA检测相关现有技术中，每个RPA体系的体积均为50μ L，试剂用量较大，成本较高。但随意减少反应体系体积会降低RPA的检测能力(例如稳定性、灵敏度、特异性等)。

本发明的试剂盒每个反应体系推荐使用25μL，试剂用量减半。为了检验该25μL体系的检测能力，发明人对比了本发明试剂盒使用25μL和50 μL的最低检测限。方法同实验例1“灵敏度检测”部分。

结果发现，25μL和50μL体系的最低检测限没有区别(如表6)。

表6 25μL和50μL体系检测限比较

本实验例结果表明，本发明的试剂盒能兼顾试剂成本和高灵敏度。

综上，本发明的试剂盒可以快速、灵敏、特异地检测新型冠状病毒，且试剂成本比普通RPA试剂节省50％，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都海之元生物科技有限公司

<120> 新型冠状病毒实时荧光RPA检测试剂盒

<130> GY720-2020P0110546CCZ

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgccacatgc ttttccactg cttcagacac t 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggatattca atagtccagt caacacgctt a 31

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctagttgt gatgcaatca tgactaggtg ttagctgtcc acgagt 46

<210> 4

<211> 1010

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttgggggag gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat 60

gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa 120

cgacggccag tgaattcgag ctcggtacct cgcgaatgca tctagatgac actgtgatag 180

acgtgccaca tgcttttcca ctgcttcaga cacttatgcc tgttggcatc attctattgg 240

atttgattac gtctataatc cgtttatgat tgatgttcaa caatggggtt ttacaggtaa 300

cctacaaagc aaccatgatc tgtattgtca agtccatggt aatgcacatg tagctagttg 360

tgatgcaatc atgactaggt gtctagctgt ccacgagtgc tttgttaagc gtgttgactg 420

gactattgaa tatcctataa ttggtgatga actgaagatt aatgcggctt gtagaaaggt 480

tcaacacatg gttgttaaag ctgcattatt agcagacaaa ttcccagttc ttcacgacat 540

tggtaagaca catcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg 600

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 660

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 720

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 780

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 840

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 900

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caagaaagaa catgtgagca 960

aagccagcaa aagggccagg gaaaccgtta aaaaggccgg cgcgatggcg 1010

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgcttttcc actgcttcag acacttatgc c 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtcgtgaag aactgggaat ttgtctgcta a 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tctgcggtat gtggaaaggt tatggctgta gt 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actacctggc gtggtttgta tgaaatcacc ga 32

Claims

1.一种SARS-Cov-2的RPA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括序列如SEQ IDNO.1和2所述的引物，以及序列如SEQ ID NO.3所示的探针；

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括逆转录基础反应单元、反应缓冲液、乙酸镁。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是荧光法检测试剂盒；

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸外切酶III、逆转录酶的质量比为4:1:9:3:1。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：碱基替代物dSpcacer位于探针第30-31碱基之间。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述dSpcacer为四氢呋喃；和/或，所述阻断基团为C3-spacer。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品；

所述标准品为SARS-Cov-2的ORF1ab基因片段；

优选的，标准品的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

8.一种非疾病诊断目的的SARS-Cov-2检测方法，其特征在于：

它是使用如权利要求1～7任一所述试剂盒对样品DNA进行重组酶聚合酶扩增，检测扩增产物即可。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：

每个RPA反应的体系为25μL。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：RPA反应温度为39摄氏度。