CN118028537A - 一种实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的引物探针组合、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。所述引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示。使用本发明提供的引物探针组合检测样本中的犬肺炎病毒，操作简便、快速准确、灵敏度高，对犬肺炎病毒的检测、流行病学调查和相关疫苗及药物的研发产生积极的影响。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，特别是涉及一种实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。
背景技术
犬肺炎病毒（Canine pneumovirus, 可简称为CPV）是一种近年新发现的感染犬类的病毒，由美国的两个动物收容所对狗的呼吸道疾病进行的回顾性实验中发现。此后，北美、欧洲和亚洲均有从犬传染性呼吸道疾病的犬中发现犬肺炎病毒的报道。CPV感染后容易使犬受到继发性病毒或细菌感染，导致长期或更严重的临床疾病，通常在犬舍和动物收容所等密集居住环境中经常发生，CPV感染从6个月幼犬开始，主要见于细支气管上皮细胞中，感染后的阳性犬无发热迹象，可能会出现食欲不振、咳嗽和/或流鼻物和支气管肺炎等症状。基因组分析表明，CPV属于副粘病毒科肺炎病毒亚科肺炎病毒属，是一种包膜的负链单股不分节RNA病毒，全长约15 kb。
现有技术中，犬肺炎病毒检测方法主要包括分离培养、血清学检测或常规PCR等，分离培养的优点在于分离培养出来的是活的病毒，诊断的特异性为100%，但该方法病毒培养耗时较长，容易被其他病原微生物污染，灵敏度较低，且对培养要求较高，不能满足临床诊断的需求；血清学检测方法与各种病原体之间存在交叉反应，易产生假阳性，给病原体鉴别诊断提供了一定的困难；常规PCR检测技术灵敏度不高，容易受到环境的污染而产生假阳的情况，且无法实时监测PCR过程。
目前，国内犬肺炎病毒相关的研究较少。目前市面上鲜有报道能够特异性检测犬肺炎病毒的实时荧光定量PCR试剂盒。因此，本领域亟需建立一种快速、准确和灵敏度高的检测方法，对犬肺炎病毒的检测和流行病学调查以及相关疫苗及药物的研发提供可靠依据，产生积极的影响。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合，所述引物探针组合包括：
正向引物：5’- GGGTGTGCAGTACATGGC -3’，如SEQ ID NO:1所示；
反向引物：5’- AGTATTATGGATGAATTTGGCAGCT -3’，如SEQ ID NO:2所示；
探针：5’- TGCAGTCCCTTCCCACGAGGT -3’，如SEQ ID NO:3所示，所述探针中，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
具体地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LCRED460中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。
本发明的第二方面提供了前述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合在制备检测犬肺炎病毒试剂盒中的应用。
本发明的第三方面提供了一种实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增试剂、阴性对照和阳性对照，所述PCR扩增试剂包括前述的基于PCR技术检测犬肺炎病毒的引物探针组合，其中，正向引物的浓度为0.1-1.0 μM，反向引物的浓度为0.1-1.0 μM，探针的浓度为0.1-1.0 μM。
具体地，所述PCR扩增试剂还包括PCR反应液、酶混合液和无菌无酶水。
具体地，所述PCR反应液包括MgCl2、Tris、BSA和dNTPs，其中，MgCl2的浓度为1-5mM，Tris的浓度为30-70 mM，BSA的浓度为100-400 mg/L，dNTPs的浓度为10-100 mΜ。
具体地，所述酶混合液包括5-10 U/μL的DNA聚合酶和1-5 U/μL热启动修饰抗体。
具体地，所述阳性对照为犬肺炎病毒保守基因序列区域的质粒，所述阴性对照为无菌无酶水。
本发明的第四方面提供了一种非诊断目的的基于前述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒的检测方法，包括步骤：
1）提取待测样本总DNA；
2）制备反应体系，所述反应体系包括所述PCR扩增试剂；
3）以提取的待测样本总DNA为模板，同时添加阴性对照和阳性对照为质控模板，进行实时荧光定量PCR反应；
4）反应结束，根据Ct值判定检测结果。
具体地，所述实时荧光定量PCR反应的程序为：
Step1：48℃，10 min；
Step2：94℃，3 min；
Step3：94℃，10 s，60℃，30 s；
执行40个循环，60℃设置采集荧光信号。
有益效果：
本申请提供了用于实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的正、反向引物以及探针，能够快速且准确地检测出待测样本中犬肺炎病毒基因，特异性强、灵敏度高，可应用于犬肺炎病毒的及时检测与防治，对犬肺炎病毒流行病学调查以及相关疫苗及药物的研发提供可靠依据，产生积极的影响。
附图说明
图1为实施例1中，本发明提供的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法的检测结果图。
图2为实施例3中，本发明提供的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒及检测方法的特异性测试结果图。
图3为实施例3中，本发明提供的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒及检测方法的重复性测试结果图。
图4为实施例3中，本发明提供的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒及检测方法的灵敏度测试结果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、引物探针组合
本实施例示出了实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合，包括：
正向引物：5’- GGGTGTGCAGTACATGGC -3’，如SEQ ID NO:1所示；
反向引物：5’- AGTATTATGGATGAATTTGGCAGCT -3’，如SEQ ID NO:2所示；
探针：5’- TGCAGTCCCTTCCCACGAGGT -3’，如SEQ ID NO:3所示，探针中，5’端标记有荧光报告基团（FAM），3’端标记有荧光淬灭基团（BHQ1）。
2、试剂盒的制备
本实施例还示出了实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒，包括：
（1）前述的基于PCR技术检测犬肺炎病毒的引物探针组合，其中，正向引物的浓度为0.1 μM，反向引物的浓度为0.1 μM，探针的浓度为0.1 μM。
（2）PCR反应液：2 mM的MgCl2，70 mM的Tris，300 mg/L的BSA，100 mΜ的dNTPs。
（3）酶混合液：10 U/μL的DNA聚合酶和2 U/μL热启动修饰抗体。
（4）阳性对照为犬肺炎病毒保守基因序列区域的质粒，具体操作为：将犬肺炎病毒保守基因序列插入pUC 57载体质粒，经由扩大培养、鉴定并质粒提取，得到CPV人工合成质粒。
（5）阴性对照为无菌无酶水。
（6）PCR扩增试剂的制备见表1。将表中6种物质混合，使用移液器将PCR扩增试剂分装到PCR单管中，每管15 μL，存储于-20℃备用。
表1 PCR扩增试剂
实施例2
本实施例示出使用前述的试剂盒检测犬肺炎病毒的方法，步骤如下：
(1) 使用商品化核酸提取试剂盒，进行DNA提取，作为待测样本备用。
(2) 取出相应数量的PCR扩增试剂，溶解混匀并离心，分别加入处理好的待测样本、阳性对照、阴性对照各5.0 μL，盖好PCR反应盖，转移到PCR仪上进行PCR扩增，反应程序为：48℃逆转录10 min；94℃预变性3 min；94℃反应10 s，60℃反应30 s，循环40次，60℃设置采集荧光信号。
(3) 读取检测结果，阈值设定原则为阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
阳性对照Ct值小于38，阴性对照Ct无数值；在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的S型曲线，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
采用本发明提供的方法检测犬肺炎病毒时，判断标准如下：
1、检测样本Ct≤38.0者判为阳性。
2、38.0＜Ct≤40的检测样本建议重做，重做结果中Ct值<40者为阳性，否则为阴性。
如图1所示，1为犬肺炎病毒阳性检测结果，2为犬肺炎病毒阴性检测结果，3为阈值线。可以看出，本申请提供的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法可在短时间内准确检测出待测样本中的犬肺炎病毒，且灵敏度较好。
实施例3：
本实施例对实施例1的引物探针组合、试剂盒和实施例2的检测方法进行特异性、重复性和灵敏度测试。
1、特异性测试
分别对犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬呼吸道冠状病毒、犬支原体、小鼠肺炎病毒、犬肺炎病毒临床样本进行核酸提取，提取后的病原体核酸使用测序方法进行验证，以确认为该病原体。
使用实施例1的引物探针组合、试剂盒和实施例2的检测方法对提取好的病原体核酸进行检测。测试结果如图2所示，犬肺炎病毒的引物探针只扩增犬肺炎病毒病原体，对其他病原体均无交叉扩增，可以看出，本发明提供的试剂盒及其检测方法具有较强的检测特异性。
2、重复性测试
使用实施例1的引物探针组合、试剂盒和实施例2的检测方法对犬肺炎病毒样本进行扩增，重复扩增10次，计算其CT值的变异系数（CV）。
结果如图3所示，经过计算CV为0.45%，小于5%，可以看出，本发明提供的试剂盒及其检测方法重复性好。。
3、灵敏度测试
将犬肺炎病毒样本质粒分别稀释至103copies/mL、5×102copies/mL 2个浓度梯度进行灵敏度试验。检出率在95%以上的最低样本浓度即为检测限浓度。
结果如图4所示，本发明的试剂盒的检测灵敏度在浓度为103copies/mL时能够100%检出，说明本发明提供的试剂盒的检测灵敏度为103copies/mL。。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：
正向引物：5’- GGGTGTGCAGTACATGGC -3’，如SEQ ID NO:1所示；
反向引物：5’-AGTATTATGGATGAATTTGGCAGCT -3’，如SEQ ID NO:2所示；
探针：5’-TGCAGTCCCTTCCCACGAGGT -3’，如SEQ ID NO:3所示，所述探针中，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2. 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LC RED460中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。
3.权利要求1或2中任一项所述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合在制备检测犬肺炎病毒试剂盒中的应用。
4. 一种实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR扩增试剂、阴性对照和阳性对照，所述PCR扩增试剂包括权利要求1或2中任一项所述的基于PCR技术检测犬肺炎病毒的引物探针组合，其中，正向引物的浓度为0.1-1.0 μM，反向引物的浓度为0.1-1.0 μM，探针的浓度为0.1-1.0 μM。
5.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂还包括PCR反应液、酶混合液和无菌无酶水。
6. 根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括MgCl2、Tris、BSA和dNTPs，其中，MgCl2的浓度为1-5 mM，Tris的浓度为30-70 mM，BSA的浓度为100-400 mg/L，dNTPs的浓度为10-100 mΜ。
7. 根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括5-10 U/μL的DNA聚合酶和1-5 U/μL热启动修饰抗体。
8.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为犬肺炎病毒保守基因序列区域的质粒，所述阴性对照为无菌无酶水。
9.一种非诊断目的的基于权利要求4-8中任一项所述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括步骤：
1）提取待测样本总DNA；
2）制备反应体系，所述反应体系包括所述PCR扩增试剂；
3）以提取的待测样本总DNA为模板，同时添加阴性对照和阳性对照为质控模板，进行实时荧光定量PCR反应；
4）反应结束，根据Ct值判定检测结果。
10.根据权利要求9所述的实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应的程序为：
Step1：48℃，10 min；
Step2：94℃，3 min；
Step3：94℃，10 s，60℃，30 s；
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- 2024-03-13 CN CN202410287801.4A patent/CN118028537A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
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