CN116732241A - 鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光rt-pcr引物探针组、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT‑PCR引物探针组、试剂盒及应用，属于病毒检测技术领域。所述引物探针组包括：双重荧光RT‑PCR引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑2所示；检测赤羽病病毒的如SEQ ID NO：3所示的探针和检测施马伦贝格病毒的如SEQ ID NO：4所示的探针。本发明建立了一种能够鉴别赤羽病病毒(AKAV)和施马伦贝格病毒(SBV)的双重荧光RT‑PCR方法，并对其特异性、敏感性及重复性进行检验，评估其临床应用效果。结果显示，该方法具有良好的特异性和敏感性，适用于AKAV和SBV的临床检测，为该病疫情防控提供了新的筛查手段。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT-PCR引物探针组、试剂盒及应用。
背景技术
赤羽病（Akabane disease）与施马伦贝格病(Schmallenberg disease)同属于布尼亚病毒病，分别是赤羽病病毒（Akabane virus, AKAV）和施马伦贝格病毒（Schmallenberg virus,SBV）引起的虫媒传染病，主要引起牛羊等反刍动物繁殖障碍，包括流产、死胎、先天性畸形等症状，并且二者临床症状相似。SBV与AKAV同属布尼亚病毒中辛布血清群，二者存在血清交叉反应。
目前，AKAV或SBV的分子生物学诊断方法已有报道，但尚未有采用荧光RT-PCR同时检测和鉴别AKAV和SBV的研究。建立一种快速筛查AKAV和SBV的双重荧光RT-PCR检测技术，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT-PCR引物探针组、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过双重荧光RT-PCR反应，同时检测赤羽病病毒和施马伦贝格病毒。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT-PCR引物探针组，包括：
鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT-PCR引物组，所述双重荧光RT-PCR引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；
鉴别赤羽病病毒的如SEQ ID NO：3所示的探针和鉴别施马伦贝格病毒的如SEQ IDNO：4所示的探针。
进一步地，所述探针5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团，且SEQ ID NO：3所示的探针和SEQ ID NO：4所示的探针连接的荧光基团不同。
本发明还提供所述的双重荧光RT-PCR引物探针组在制备鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒产品中的应用。
本发明还提供一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的试剂盒，包含所述的双重荧光RT-PCR引物探针组。
本发明还提供一种非诊断目的的鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的方法，包括以下步骤：
以待测样本的RNA核酸为模板，利用所述的双重荧光RT-PCR引物探针组进行双重荧光RT-PCR扩增，根据有无扩增曲线和Ct值，判断待测样本是否为赤羽病病毒和/或施马伦贝格病毒。
进一步地，若有扩增曲线，且满足Ct≤38，判定待测样本为赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸阳性；若有扩增曲线，且满足38＜Ct＜40，判定待测样本所含赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸可疑，重复检测若Ct＜40仍成立，则判定待测样本所含赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸阳性，反之判定核酸阴性；若无扩增曲线，或者Ct>40，判定待测样本为赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸阴性。
进一步地，所述双重荧光RT-PCR扩增的反应体系包括以下组分：2X one-step RT-PCR buffer 10μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.4μL，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.4μL，双重荧光RT-PCR引物组各1.0μL，探针各0.5μL，RNA模板各3μL，加ddH2O补足至20μL。
进一步地，所述双重荧光RT-PCR扩增的反应条件为：42℃，5min；95℃预变性2min；95℃5s；60℃30s，40个循环。
本发明公开了以下技术效果：
本发明为建立一种能够同时鉴别赤羽病病毒(AKAV)和施马伦贝格病毒(SBV)的方法，以AKAV和SBV的S基因为靶基因，设计其通用引物和特异性探针，通过优化反应条件，建立了AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法，并对其特异性、敏感性及重复性进行检验。同时，评估其临床应用效果。结果显示，该方法AKAV以及SBV最低检测线均可达1.5copies/μL；与牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒均无交叉反应，具有良好的特异性；50份临床样品检测结果与AKAV、SBV行业标准推荐方法符合率为100％。本发明建立的双重荧光RT-PCR方法，适用于AKAV和SBV的临床检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为AKAV和SBV双重荧光RT-PCR方法标准曲线；A：AKAV标准曲线；B：SBV标准曲线；
图2为双重荧光RT-PCR方法敏感性检测；A：AKAV-FAM；B：SBV-VIC；
图3为双重荧光RT-PCR方法特异性扩增结果；A：AKAV-FAM；B：SBV-VIC；
图4为双重荧光RT-PCR方法临床检测结果；A：AKAV-FAM；B：SBV-VIC。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1材料和方法
1.1毒株、检测样品及试剂
AKAV TJ2016毒株由中国检验检疫科学研究院实验室(以下简称本实验室)分离并保存；SBV RNA标准品由德国FLI的Bernd Hoffmann博士馈赠；牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)、蓝舌病病毒(BIV)、口蹄疫病毒(FMDV)核酸由本实验室保存；50份牛血液样品由中国农业科学院特产研究所提供；RNeasy MiNi Kit购自QIAGEN公司；One-step PrimeScriptTM RT-PCR kit购自宝日医生物技术(北京)有限公司；BHK-21细胞保存于本实验室；pTMACC载体由本实验室构建并保存。
1.2引物及探针设计
参照NCBI中AKAV以及SBV S基因序列，采用MGEA-X对比分析，选择保守区域分别设计引物及探针(表1)，引物及探针由擎科生物(北京)科技股份有限公司合成。
表1双重荧光RT-PCR的引物及探针序列
1.3AKAV和SBV参比品的制备
AKAV TJ2016毒株接种于复苏并生长旺盛的BHK-21细胞中，待细胞病变达到80％以上，收取细胞病毒液，并病毒滴度测定，毒价为1×106TCID50/mL；以SBV RNA为模板，PCR扩增获取SBV S靶基因，并构入装甲RNA表达载体pTMACC，表达纯化，收集SBV装甲RNA颗粒，浓度相当于1×109copies/μL。
1.4双重荧光RT-PCR检测方法的建立
双重荧光RT-PCR反应体系(20μL)：one-step RT-PCRbuffer(2X)10μL，TaKaRa ExTaq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.4μL，通用引物-F/R(10μmol/L)各0.4～1.2μL，AKAV-探针(10μmol/L)0.1～0.9μL，SBV-探针(10μmol/L)0.1～0.9μL，RNA模板各3μL-，加ddH2O至20μL。采用矩阵法，固定模板加入量，优化各引物和探针加入比例，筛选最佳量。扩增反应条件如下：42℃，5min；95℃预变性2min；然后采用二步法进行反应：95℃5s；50℃～60℃，30s，40个循环。每个循环结束后采集FAM以及VIC通道荧光信号数据。优化反应程序，以获得最佳扩增条件。
1.5双重荧光RT-PCR敏感性试验
将已测定浓度的AKAV细胞毒以及SBV装甲RNA参比品采用RNeasy MiNi Kit进行RNA提取，将RNA进行10倍系列梯度稀释，并以此为反应模板，用优化后的双重荧光RT-PCR方法进行扩增，建立标准曲线，并确定双重荧光RT-PCR方法的敏感性。
1.6双重荧光RT-PCR特异性试验
分别以BVDV、IBRV、BTV、FMDV核酸为模板，以AKAV和SBV RNA为阳性对照，同时以ddH2O作为空白对照，采用优化后的体系及反应条件，进行双重荧光RT-PCR反应，观察扩增曲线，以验证该方法的特异性。
1.7双重荧光RT-PCR重复性试验
采用1.5倍稀释的AKAV和SBV 3种浓度RNA(1×104copies/μL,1×103copies/μL，1×102copies/μL)作为模板，用优化后的双重荧光RT-PCR方法进行重复性试验，每种浓度RNA重复检测3次；同时进行3次不同时间的批间重复性试验，记录检测Ct值，计算批内和批间重复性试验的标准偏差和变异系数，以评估该方法的重复性。
1.8临床样品检测
牛血液临床样品50份，提取RNA核酸作为模板。采用建立的双重荧光RT-PCR方法进行扩增，分别以AKAV细胞毒和SBV装甲RNA参比品提取RNA以及ddH2O作为阳性对照和空白对照，以评估该方法临床检测效果。
2结果
2.1双重荧光RT-PCR检测方法建立
反应条件优化后，确定双重荧光RT-PCR 20μL反应体系：one-step RT-PCR buffer(2X)10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL,PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.4μL,通用引物-F/R(10μmol/L)各1.0μL,AKAV-探针(10μmol/L)0.5μL，SBV-探针(10μmol/L)0.5μL，RNA模板各3μL，加ddH2O补足至20μL。最佳反应条件：42℃，5min；95℃预变性2min；95℃5s；60℃30s，40个循环。结果判定：当FAM荧光通道有扩增曲线，且Ct≤38时判定为AKAV核酸阳性；当VIC荧光通道有扩增曲线，且Ct≤38时判定为SBV核酸阳性；当FAM和VIC荧光通道有扩增曲线时，且满足38＜Ct＜40，判定待测样本所含AKAV或/且SBV核酸可疑，需重复检测。如果Ct＜40仍成立，则判定待测样本所含AKAV或/且SBV核酸阳性，反之判定核酸阴性；当FAM和VIC荧光通道均无扩增曲线时，或Ct>40时判定为AKAV、SBV核酸阴性。
2.2双重荧光RT-PCR方法标准曲线建立
分别采用AKAV细胞毒以及SBV装甲RNA溶液提取RNA做模板制作标准曲线。AKAVRNA以及SBV RNA依次10倍稀释，对应的浓度分别是100copies/μL～1×106copies/μL和100copies/μL～1×106copies/μL。采用优化的双重荧光RT-PCR方法进行扩增。以获得的临界循环数(threshold cycle,Ct)为y轴，对应的参比品RNA拷贝数的对数为x轴，制作标准曲线(图1)。AKAV采用FAM荧光通道采集信号，标准曲线方程为Y＝-3.181x+44.56，R2为0.995；SBV采用VIC荧光通道采集信号，标准曲线方程为Y＝-2.966x+46.48，R2为0.990。
2.3双重荧光RT-PCR方法敏感性检验
以10倍倍比稀释的AKAV RNA和SBV RNA为模板，采用优化的双重荧光RT-PCR扩增体系进行扩增(见图2)。结果表明，所建方法AKAV对应FAM荧光通道和SBV对应VIC荧光通道最低检测线均为1.5copes/μL。
2.4双重荧光RT-PCR方法重复性检验
采用建立的荧光RT-PCR方法进行重复检测，组内变异系数在0.38％-0.95％之间，组间变异系数在0.72％-1.23％之间。组内和组间变异系数均不高于2％(见表2)，结果表明该双重荧光RT-PCR方法重复性良好。
表2双重荧光RT-PCR方法组内和组间重复性试验结果
2.5双重荧光RT-PCR方法特异性检验
采用优化的双重荧光RT-PCR方法对BVDV、IBRV、BTV、FMDV核酸样品进行扩增，仅AKAV RNA和SBV RNA阳性质控产生特异性扩增曲线，即FAM荧光通道及VIC荧光通道有S扩增曲线(图3)，其它样品2个通道均无扩增。结果表明双重荧光RT-PCR方法具有良好的特异性。
2.6临床样品检测
对50份牛血液样品，提取RNA为模板进行检测，4份牛血液FAM通道有特异性扩增，即AKAV核酸阳性(见图4的A)，其它样品核酸检测均无扩增。该检测结果与AKAV标准(SN/T3991-2014)以及SBV标准(SN/T 4661-2016)推荐方法检测结果一致。表明该方法所涉及50份临床样品，4份为AKAV感染，无SBV感染，且能鉴别区分AKAV以及SBV感染状态(图4的A、B)。
3 结果分析
AKAV以及SBV导致反刍动物繁殖障碍，已经严重制约牛羊等反刍动物养殖及相关奶业产业的发展。基于二者临床症状的相似性以及危害程度，急需一种同时快速筛查AKAV和SBV的检测方法。
本发明采用的AKAV TJ2016毒株以及SBV装甲RNA物质，背景清晰，AKAV TJ2016毒株溯源至日本JaLAB398毒株(AKAV首例分离毒株)，SBV装甲RNA溯源至德国FLI发布的SBVBH80/11-4毒株，且均具同病原的代表性。选择AKAV和SBV的相对保守的S基因设计一对通用引物及特异性探针，建立的双重荧光RT-PCR方法检测敏感性达1.5copes/μL，特异性强，满足临床检测的需求。通过临床样品的检测应用，AKAV阳性检出率为8％(4/50)，同AKAV行业标准推荐方法检测结果一致，同时满足AKAV和SBV的区分诊断。
AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法相比于AKAV或SBV单一病毒的检测方法，便于同步特异性筛查样品中2种病原体，减少鉴别操作流程，提高诊断效率。该方法的应用，可同时鉴别排查赤羽病和施马伦贝格病2种疫病，为实施疫病的针对性防控措施提供快速的科学技术支持。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT-PCR引物探针组，其特征在于，包括：
鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT-PCR引物组，所述双重荧光RT-PCR引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；
鉴别赤羽病病毒的如SEQ ID NO：3所示的探针和鉴别施马伦贝格病毒的如SEQ ID NO：4所示的探针。
2.根据权利要求1所述的双重荧光RT-PCR引物探针组，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团，且SEQ ID NO：3所示的探针和SEQ ID NO：4所示的探针连接的荧光基团不同。
3.一种如权利要求1所述的双重荧光RT-PCR引物探针组在制备鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒产品中的应用。
4.一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-2任一项所述的双重荧光RT-PCR引物探针组。
5.一种非诊断目的的鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测样本的RNA核酸为模板，利用权利要求1所述的双重荧光RT-PCR引物探针组进行双重荧光RT-PCR扩增，根据有无扩增曲线和Ct值，判断待测样本是否为赤羽病病毒和/或施马伦贝格病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，若有扩增曲线，且满足Ct≤38，判定待测样本为赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸阳性；若有扩增曲线，且满足38＜Ct＜40，判定待测样本所含赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸可疑，重复检测若Ct＜40仍成立，则判定待测样本所含赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸阳性，反之判定核酸阴性；若无扩增曲线，或者Ct>40，判定待测样本为赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸阴性。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述双重荧光RT-PCR扩增的反应体系包括以下组分：2X one-step RT-PCRbuffer 10μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.4μL，PrimeScriptTM RTEnzyme Mix 0.4μL，双重荧光RT-PCR引物组各1.0μL，探针各0.5μL，RNA模板各3μL，加ddH2O补足至20μL。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述双重荧光RT-PCR扩增的反应条件为：42℃，5min；95℃预变性2min；95℃5s；60℃30s，40个循环。
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