CN116855639A - 一种快速检测人腺病毒4型的引物、探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请针对HAdV‑4的Hexon基因设计特异性引物和探针，将RAA与荧光探针相结合，建立了一种特异性强、灵敏度高的快速实时荧光RAA测定法，用于HAdV‑4的快速检测。该方法可在42℃条件下在30分钟内完成实验，可检出低至101copies/μlHAdV‑4，为HAdV‑4的临床诊断或现场评估提供了新的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及了用于检测4型人腺病毒特异性引物和探针及试剂盒，本发明还涉及一种利用特异性引物探针进行等温核酸扩增检测人腺病毒4型的方法。
背景技术
人腺病毒(HAdV)是双链无包膜DNA病毒，具有高度传染性，可在人群中引起广泛的疾病，如急性呼吸道感染、急性胃肠炎、流行性角膜结肠炎和泌尿生殖系统疾病等。HAdV很容易在人群中传播，所有年龄组的人都容易感染HAdV，而儿童、免疫功能低下的患者、心血管疾病患者和军事学员患严重疾病的风险更高。HAdV分为7物种(HAdV-A至HAdV-G)，包括100多种血清型，HAdV-B种病毒(HAdV-3、-7、-11、-14、-55)和HAdV-E(HAdV-4)是导致呼吸道感染的主要病原体。其中HAdV-4于1950年首次被发现，可导致儿童和成人患者患上严重的急性呼吸道疾病，该亚型与军事上爆发的发热性呼吸道疾病有关，是新兵中急性呼吸道疾病的主要病原体。
因此，开发快速、灵敏、特异的HAdV-4诊断方法，及时诊断HAdV-4，对于控制HAdV-4感染至关重要。
目前针对HAdV的检测方法主要包括病毒分离培养法、血清学检测和分子生物学检测。病毒分离法是通过观察特征性细胞致病作用(CPE)来检测腺病毒，被认为是诊断腺病毒的“金标准”，但其培养细胞耗时较长，对技术水平要求较高，不能满足临床快速诊断的需求，也不适用于现场的疾病快速诊断。血清学检测对设备等要求条件较低，可以快速检测出病毒，但该方法依赖于特异性抗体，稳定性差且灵敏度低。随着分子诊断技术的发展，以聚合酶链反应(PCR)为基础的变温扩增技术(如PCR、实时荧光定量PCR、巢式PCR等)已经成为检测腺病毒感染的常用工具，这些方法具有灵敏度高、特异强等优点，即便核酸含量较少也能检测，但其操作过程繁琐，且对仪器设备要求较高，无法实现腺病毒的现场快速检测，尤其对农村或者条件艰苦的地区所发生的疫情难以发挥其优势。与以聚合酶链反应(PCR)为基础的变温扩增技术相比，核酸等温扩增方法简单、快速且具有成本效益。重组酶介导等温扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)是一种新型的等温核酸扩增技术，包含三种重要的蛋白质：重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。在RAA过程中，反应体系中的重组酶与引物结合形成复合物，在DNA模板中寻找同源序列。一旦同源序列定位，发生链交换反应，SSB与单链DNA结合稳定DNA单链，DNA聚合酶启动DNA扩增。RAA可在恒定温度下，5-30分钟完成基因扩增，该过程不需要高温变性或低温退火，反应简单、快速、高效。
中国专利《一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒》[1](申请号：201910029711.4)公开了一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒，能够准确地检测出呼吸道腺病毒，操作方便，检测时间短。《基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的研究》[2]报道了利用重组酶介导核酸扩增技术(RAA)建立快速检测呼吸道腺病毒的方法。文献[1]和[2]公开的技术是用于人腺病毒通用检测，无法完成腺病毒4型的检测，腺病毒目前有80余种亚型，各亚型腺病毒在致病性和感染部位上存在差异，因此对于腺病毒的亚型检测具有重要的诊疗意义。
《人腺病毒感染现状及分型检测技术的研究进展》[3]报道了：例如根据Hexon基因上的保守区域Hexon3和Hexon4设计引物，使用SYBR Green荧光染料法，可以实现HAdV-1、HAdV-2、HAdV-3、HAdV-4、HAdV-5、HAdV-6、HAdV-8和HAdV-11的实时检测。使用SYBR Green荧光染料法为非等温扩增，且该荧光染料为非特异性结合，检测结果需要进一步的鉴定，结果的准确性、特异性不足。
《METHODS AND KITS FOR IDENTIFYING HUMAN ADENOVIRUS SEROTYPES》[4](专利申请号：WO2010US61256)报道了：用于在样品中方便且快速地检测和鉴定四种或多种人类腺病毒(HAdV)血清型的方法、试剂盒、引物和寡核苷酸探针。在用特异性引物进行核酸扩增反应后，血清型特异性寡核苷酸探针不仅用于检测样品中存在的HAdV，而且用于区分样品中存在HAdV血清型，特别是用于区分临床相关血清型HAdV-3、HAdV-4、HAdV-7、HAdV-14和HAdV-21和/或HAdV-I，和HAdV-6。这些引物和寡核苷酸探针的组合允许HAdV的快速和方便的血清分型。该技术采用的为芯片技术，采用常规PCR扩增，而非本申请采用的等温扩增技术。
《一种用于人腺病毒7型检测的探针、试剂盒及其使用方法》[5](专利申请号：CN202110793218.7)报道了：本发明提供了一种用于人腺病毒7型检测的探针、试剂盒及其使用方法。该试剂盒为基于MIRA荧光法的人腺病毒7型核酸检测试剂盒。其中，MIRA的引物是根据腺病毒7型hexon基因特异序列设计的，本发明提供了一种快速、特异、灵敏、无需复杂仪器设备的核酸检测试剂盒及其使用方法。该技术虽为等温扩增技术但与本申请研究的RAA技术存在本质上的区别，且检测的为7型腺病毒，与本申请研究的4型腺病毒并不相同。
《人4型腺病毒拷贝数SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立》[6]报道了：取本实验室构建的4型腺病毒全基因组质粒，以梯度稀释质粒为标准模板，选取人4型腺病毒六邻体区域基因设计一对特异性引物，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线。结论建立了检测人4型腺病毒基因拷贝数的荧光定量RT-PCR方法，该方法灵敏度高、特异性强。该技术为非等温扩增技术且用的是SYBR Green荧光染料法，该荧光染料为非特异性结合，检测结果需要进一步的鉴定，结果的准确性、特异性不足。
目前，已有基于RAA技术检测腺病毒的方法，但基于RAA技术用于腺病毒分型的检测方法很少，基于RAA技术检测HAdV-4的方法还未被报道。鉴于现存HAdV-4病毒检测方法的不足以及HAdV-4病毒快速现场检测的需求，研究一种能在基层应用，可在常温下快速检测HAdV-4病毒的扩增方法非常有必要。
现有技术文献
[1]郑伟,王刚,吕沁风,等.一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物,探针及检测试盒:CN201910029711.4[P].CN109652595A[2023-06-30].
[2]陈淑丹,鲍哲英,张小平,等.基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的研究[J].中国国境卫生检疫杂志，2020，43(4):3.
[3]董静肖1,2,赵秀英1,2.人腺病毒感染现状及分型检测技术的研究进展[J].中华检验医学杂志，2023，(第1期).
[4]Washington,Cicely."Methods and kits for identyfinghuman adenovirusserotypes."WO2010US61256
[5]曹现涛,etal."一种用于人腺病毒7型检测的探针,试剂盒及其使用方法.",CN202110793218.7.2021.
[6]张文宁1,王芃2,周建光2,王健2,秦崇涛1,李宗3,李山虎2.人4型腺病毒拷贝数SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯,2017,(第4期).
发明内容
发明所要解决的问题：
鉴于现存HAdV-4病毒检测方法的不足以及HAdV-4病毒快速现场检测的需求，本申请针对HAdV-4的Hexon基因设计特异性引物和探针，将RAA与荧光探针相结合，建立了一种特异性强、灵敏度高的快速实时荧光RAA测定法，用于HAdV-4的快速检测，该技术能在基层应用，可在常温下快速检测HAdV-4病毒。
本发明第一个方面，提供一种基于RAA荧光法检测HAdV-4的引物
通过以下技术方案来实现：一种基于RAA荧光法检测HAdV-4的引物，该引物包括上游引物和下游引物，该上游引物序列为：CTGAAAAGTGGGACAAAGATGACACCACAG(SEQ IDNO.1)；该下游引物序列为：AGGCAAATAGAGGGCAACATTGGCATAGAG(SEQ ID NO.2)。
本发明第二个方面，提供一种基于RAA荧光法检测HAdV-4的探针
在本发明的一些实施方式中，探针的核苷酸序列为：
TGCTAATGAAATCCATGTAGGCAATCCTTT[FAM-dT]G[THF]CA[BH Q1-dT]GGAAATCAACATCCAAG[C3spacer](SEQ ID NO.3)
本发明的第三个方面，提供一种检测和鉴别人腺病毒4型的RAA试剂
在本发明的一些实施方式中，所述RAA法试剂中含有本发明的第一个方面中的引物和本发明第二个方面中的探针。
本发明的第四个方面，提供了一种本发明第三个方面中的RAA试剂在制备HAdV-4检测和鉴定试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述HAdV-4检测和鉴定试剂盒中还包括RAA检测试剂、阴性质控品和阳性质控品。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的使用包括以下步骤：
(1)提取检测样本中的核酸；
(2)使用所述人腺病毒4型检测和/或鉴别试剂盒中的引物和探针进行RAA扩增；
(3)根据扩增曲线定性或定量样品中的人腺病毒4型。
在本发明的一些实施方式中，本发明中的RAA扩增反应体系为：
RAA反应体系50μL
在本发明的一些优选的实施方式中，本发明中RAA扩增反应程序为：42℃，2分钟；42℃，30秒，60个循环。
本发明具有以下有益效果：
本发明针对HAdV-4的Hexon基因设计特异性引物和探针，将RAA与荧光探针相结合，建立了一种特异性强、灵敏度高的快速实时荧光RAA测定法，用于HAdV-4的快速检测。该方法可在42℃条件下在30分钟内完成实验，可检出低至101copies/μl HAdV-4，为HAdV-4的临床诊断或现场评估提供了新的方法。本发明弥补了现有传统检测技术的不足，非常适用于现场快速检测，与传统PCR法相比，RAA法是在恒温下反应,操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，大大缩短了反应时间，不需变温,非常适用于缺乏精密仪器设备、医疗资源相对有限的地区和医院。
附图说明
图1、不同引物探针组合筛选结果图，其中，
1、2、3分别为F1-R1-P、F2-R2-P和F3-R3-P组合进行实时荧光RAA扩增之后的结果，NC为阴性对照；
图2、39℃条件下HAdV-4实时荧光RAA扩增结果图；
图3、40℃条件下HAdV-4实时荧光RAA扩增结果图；
图4、42℃条件下HAdV-4实时荧光RAA扩增结果图；
图5、HAdV-4实时荧光RAA测定法灵敏度验证，其中，
1、2、3、4分别为104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl浓度HAdV-4阳性质粒标准品进行实时荧光RAA扩增之后的结果，NC为阴性对照；
图6、HAdV-4实时荧光RAA测定法临床样本验证，其中，
1为阳性对照，2-5为HAdV-4阳性样本进行实时荧光RAA扩增之后的结果，6-51为HAdV其他亚型(HAdV-3、HAdV-7、HAdV-14、HAdV-21、HAdV-55)阳性样本、甲型流感病毒阳性样本、2019新型冠状病毒阳性样本、呼吸道合胞病毒阳性样本、肺炎支原体阳性样本、肺炎链球菌阳性样本进行实时荧光RAA扩增之后的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1设计合成引物探针及构建阳性质粒标准品
1、确定HAdV-4特异性的保守序列(GenBank:AY594253.1)
以HAdV-4的Hexon基因为目标序列，使用Jaview软件进行多序列比对，确定HAdV-4特异性的保守序列(GenBank：AY594253.1)。以保守序列作为靶标设计特异性引物和探针，建立检测HAdV-4的实时荧光RAA测定法。根据RAA引物探针设计原则，使用Primer Premier6和Snap Gene设计引物和荧光探针。引物设计参数为：引物大小30-35bp，产物大小120-250bp，GC含量30％-70％，Tm 50％-100％，所有其他参数均设置为默认值。探针设计原则：探针长度应为46-52bp，距离5’端的30-35bp的中部位置标记一个dspacer(四氢呋喃，THF，脱碱基核苷酸类似物)，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游T碱基上标记一个荧光基团(如FAM)，下游在T碱基上标记一个淬灭基团(如BHQ1)，两个基团的间距为2-5bp；THF距离3’末端至少15bp，并且3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-spacer。本发明设计的引物和探针如表格1所示，本发明中使用的引物和探针均由生工生物技术(上海)有限公司(中国上海)合成。
表1、4型腺病毒的候选引物和探针
2、制备HAdV-4阳性质粒标准品
HAdV-4阳性质粒标准品由生工生物技术(上海)有限公司直接合成，并返还质粒和菌液，将上述质粒从106至100copies/μl进行梯度稀释，并保存至-80℃冰箱备用。
HAdV-4阳性质粒标准品插入序列：
GAAAACCATGGTGTGGAGGATGAATTGCCAAACTATTGCTTTCCGTTGAATGGTGTGGGATTGACAGACACTTACCAGGGTGTTAAAGTTAAAACAGATGCAGGTTCTGAAAAGTGGGACAAAGATGACACCACAGTTAGTAATGCTAATGAAATCCATGTAGGCAATCCTTTTGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTATGCCAATGTTGCCCTCTATTTGCCTGATAAATACAAATACACACCGGCCAACATCACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGAGTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACGCCTACATTAACATTGGGGCGCGCTGGTCGCTGGACCCCATGGACAACGTAAATCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGCTTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCATTCCACATCCWGGTGCCCCAGAAATTTTT(SEQ ID NO.8)
HAdV-4阳性质粒标准品载体序列：
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGC
TCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGA
CAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTG
GCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAT
GCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCA
GGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGG
TGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTG
CAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTT
GTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATC
TAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGC
TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGC
TCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCC
TGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCA
CTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGA
ATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
GCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGA
GCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCA
GGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGG
CCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCC
GCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGG
CGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAG
CTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTG
TCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCT
GTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG
TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACT
ATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAG
CAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCT
ACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACA
GTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGA
GTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGT
TTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA
GAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAA
AACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTC
ACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGT
ATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAG
GCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGAC
TCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCC
CCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATT
TATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGT
CCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG
CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCA
TTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATT
CAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTT
GTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAG
TAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAA
TTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAG
TACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGC
TCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACT
TTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCA
AGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCA
CCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAG
CAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGAC
ACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGC
ATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTT
AGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTG
CCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC(SEQ ID NO.9)
实例2引物探针筛选实验
上游引物：
F1：5'-GGTTCTGAAAAGTGGGACAAAGATGACACC-3'(SEQ ID NO.4)；F2：5'-CTGAAAAGTGGGACAAAGATGACACCACAG-3'(SEQ ID NO.1)；F3：5‘-AGTGGGACAAAGATGACACCACAGTTAGTA-3'(SEQ ID NO.5)；
下游引物：
R1：5'-AAATAGAGGGCAACATTGGCATAGAGGAAG-3'(SEQ ID NO.6)；R2：5'-AGGCAAATAGAGGGCAACATTGGCATAGAG-3'(SEQ ID NO.2)；R3:5'-TTATCAGGCAAATAGAGGGCAACATTGGCATA-3'(SEQ ID NO.7)；
探针序列为：
P:TGCTAATGAAATCCATGTAGGCAATCCTTT[FAM-dT]G[THF]CA[BHQ1-dT]GGAAATCAACATCCAAG[C3spacer](SEQ ID NO.3)
1、实验过程
依照RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)(江苏奇天基因生物科技有限公司)说明书，构建RAA反应体系(50μL)：25μL缓冲液VI、2.1μL正向引物(10μM)、2.1μL反向引物(10μM)、0.6μL(10μM)探针、5μL的模板、12.7μL纯化水。为确保所有反应系统同时进行，将2.5μL乙酸镁加到PCR管盖中，瞬时离心后，立即置于ABI 7500型实时荧光定量PCR仪中(ABI公司)，荧光检测程序设置为：42℃，2分钟；42℃，30秒，60个循环。根据RAA引物探针设计原则，基于HAdV-4亚型Hexon基因的保守区域，设计了3组候选引物和1个探针，使用不同的引物探针组合分别对104copies/μlHAdV-4阳性质粒标准品进行扩增，以筛选出最佳的引物探针组合，起峰时间较早且荧光值较高的引物探针对为最佳组合。
2、检测结果
如图1所示，所有设计的3组引物探针均出现了特异性荧光曲线，起峰时间最早荧光值较高的引物探针对为最佳组合，因此选择组合2进行后续的检测，本研究筛选的最佳引物探针组合为本研究筛选的最佳组合为F2-R2-P。HAdV4-F2：CTGAAAAGTGGGACAAAGATGACACCACAG(SEQ ID NO.1)HAdV4-R2：AGGCAAATAGAGGGCAACATTGGCATAGAG(SEQ ID NO.2)HAdV4-P：
TGCTAATGAAATCCATGTAGGCAATCCTTT[FAM-dT]G[THF]CA[BHQ1-dT]GGAAATCAACATCCAAG[C3spacer](SEQ ID NO.3)
实例3温度调整实验
上游引物：F2：CTGAAAAGTGGGACAAAGATGACACCACAG(SEQ ID NO.1)
下游引物：R2：AGGCAAATAGAGGGCAACATTGGCATAGAG(SEQ ID NO.2)
探针序列P：
TGCTAATGAAATCCATGTAGGCAATCCTTT[FAM-dT]G[THF]CA[BHQ1-dT]GGAAATCAACATCCAAG[C3spacer](SEQ ID NO.3)
1、实验过程
依照RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)(江苏奇天基因生物科技有限公司)说明书，构建RAA反应体系(50μL)：25μL缓冲液VI、2.1μL正向引物(10μM)、2.1μL反向引物(10μM)、0.6μL(10μM)探针、5μL的模板、12.7μL纯化水。为确保所有反应系统同时进行，将2.5μL乙酸镁加到PCR管盖中，瞬时离心后，立即置于ABI 7500型实时荧光定量PCR仪中(ABI公司)。以HAdV-4重组质粒为阳性模板优化RAA反应条件，根据RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)(江苏奇天基因生物科技有限公司)说明书推荐的RAA反应体系，选择最佳引物探针组合对反应温度进一步优化。在39℃、40℃和42℃条件下，对102copies/μl HAdV-4重组质粒进行实时RAA扩增。
2、检测结果
结果如图2-4所示，结果表明，在42℃条件下，特异性荧光曲线起峰时间最早。因此，选择42℃作为RAA检测的最佳反应温度。
实例4灵敏度验证实验
上游引物：F2：CTGAAAAGTGGGACAAAGATGACACCACAG(SEQ IDNO.1)
下游引物：R2：AGGCAAATAGAGGGCAACATTGGCATAGAG(SEQ ID NO.2)
探针序列P：
TGCTAATGAAATCCATGTAGGCAATCCTTT[FAM-dT]G[THF]CA[BHQ1-dT]GGAAATCAACATCCAAG[C3spacer](SEQ ID NO.3)
1、实验过程
根据RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)(江苏奇天基因生物科技有限公司)说明书，构建RAA反应体系(50μL)：25μL缓冲液VI、2.1μL正向引物(10μM)、2.1μL反向引物(10μM)、0.6μL(10μM)探针、将重组质粒梯度稀释为104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、12.7μL纯化水。为确保所有反应系统同时进行，将2.5μL乙酸镁加到PCR管盖中，瞬时离心后，立即置于ABI 7500型实时荧光定量PCR仪中(ABI公司)，荧光检测程序设置为：42℃，2分钟；42℃，30秒，60个循环。将HAdV-4阳性质粒标准品梯度稀释为104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl，使用建立好的实时荧光RAA方法进行检测，以无核酶水为阴性对照，每个稀释度重复8次，分析建立的实时荧光RAA测定法的灵敏度。
2、检测结果
结果如图5所示，HAdV-4实时荧光RAA检测方法的最低检测限可低至101copies/μl，灵敏度良好。
实例5临床样本分析
上游引物：F2：CTGAAAAGTGGGACAAAGATGACACCACAG(SEQ ID NO.1)
下游引物：R2：AGGCAAATAGAGGGCAACATTGGCATAGAG(SEQ ID NO.2)
探针序列：P：
TGCTAATGAAATCCATGTAGGCAATCCTTT[FAM-dT]G[THF]CA[BHQ1-dT]GGAAATCAACATCCAAG[C3spacer](SEQ ID NO.3)
1、样本收集
从2021年到2023年，共收集了50份来着本医院自发热性呼吸综合征患者的临床样本(咽拭子)，这些样本之前曾使用来自同一公司的实时PCR或实时RT-PCR试剂盒进行检测，包括5个HAdV-3阳性样本、1个HAdV-4阳性样本、5个HAdV-7阳性样本、1个HAdV-14阳性样本、1个HAdV-21阳性样本、5个HAdV-55阳性样本、10个甲型流感病毒阳性样本、10个2019新型冠状病毒阳性样本、10个呼吸道合胞病毒阳性样本、1个肺炎支原体阳性样本和1个肺炎链球菌阳性样本。采用磁珠提取法，使用核酸提取或纯化试剂盒(圣湘生物科技股份有限公司)从收集的临床样本中提取核酸，-80℃保存，以用于进一步检测和分析。样本均通过中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院医学伦理委员会审核[批准文号20230303/01/01/001]。
2、实验过程
依照RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)(江苏奇天基因生物科技有限公司)说明书，构建RAA反应体系(50μL)：25μL缓冲液VI、2.1μL正向引物(10μM)、2.1μL反向引物(10μM)、0.6μL(10μM)探针、5μL的模板、12.7μL纯化水。为确保所有反应系统同时进行，将2.5μL乙酸镁加到PCR管盖中，瞬时离心后，立即置于ABI 7500型实时荧光定量PCR仪中(ABI公司)，荧光检测程序设置为：42℃，2分钟；42℃，30秒，60个循环。采用HAdV-4实时荧光RAA检测法对其上述50份临床样本进行检测，将实时荧光RAA检测结果与实时荧光PCR获得的结果进行比较，并计算两种不同检测方法的一致程度，评估HAdV-4实时荧光RAA测定法在临床样本中的检测性能。
3、检测结果
如图6所示，HAdV-4阳性样本核酸为模板时出现特异性荧光信号，但是当HAdV其他亚型(HAdV-3、HAdV-7、HAdV-14、HAdV-21、HAdV-55)与其他呼吸道感染性疾病常见病原体的核酸作为模板时，无特异性荧光信号。这表明，本研究建立的实时荧光RAA检测方法对HAdV-4具有高度特异性，不与其他常见的呼吸道感染性疾病病原体发生交叉反应，这表明本研究建立的实时荧光RAA法在应用于患者临床样本检测时具有可行性和可靠性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种基于RAA荧光法检测人腺病毒4型的引物和探针组合，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种检测和鉴别人腺病毒4型的RAA试剂，其特征在于，所述RAA试剂含有权利要求1所述的引物和探针组合。
3.权利要求2所述的RAA试剂在制备人腺病毒4型检测和/或鉴别试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人腺病毒4型的检测和/或鉴别试剂盒中还包括阳性质控标准品、阴性质控标准品和RAA试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述人腺病毒4型的检测和/或鉴别试剂盒使用步骤为：
(1)提取检测样本中的核酸；
(2)使用所述人腺病毒4型检测和/或鉴别试剂盒中的引物和探针进行RAA扩增；
(3)根据扩增曲线定性或定量样品中的人腺病毒4型。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述RAA扩增的体系为：
RAA反应体系50μL
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述RAA扩增的程序为：42℃，2分钟；42℃，30秒，60个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310865935.5A CN116855639A (zh) | 2023-07-14 | 2023-07-14 | 一种快速检测人腺病毒4型的引物、探针及试剂盒 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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