CN111286542A - 一种用于估测鱼类死亡时间的引物及其应用 - Google Patents

一种用于估测鱼类死亡时间的引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水产品检测技术领域，公开了一种用于估测鱼类死亡时间的引物及其应用，该引物序列见 SEQ ID. NO:1~8；其应用方法包括：1）提取鱼类死后不同冷藏时间点的肌肉组织，提取总RNA，合成cDNA；2）以cDNA为模板，用引物进行PCR扩增反应，电泳检测PCR扩增情况；3）根据电泳结果，建立鱼类死亡时间与不同引物对扩增结果的对应关系，对待检鱼类进行检测以估测其死亡时间。本发明以鱼类死亡后RNA耗尽程度与死亡时间呈正相关为理论依据，首次利用死后动物体内的RNA降解动态来衡量其死亡时间。运用此方法可通过单个指标较为稳定地判别鱼类死亡时间。

Description

一种用于估测鱼类死亡时间的引物及其应用
技术领域
本发明涉及水产品检测技术领域，尤其涉及一种用于估测鱼类死亡时间的引物及其应用。
背景技术
目前常见的鱼类死亡或新鲜度判别方法是感官方法、微生物学方法、化学方法、物理方法等。这些方法综合使用，可以解决鱼类死亡时间的初步判定。但需要依赖操作人员的经验以及较多的仪器，所以推广起来会有影响。能否找到一个单一指标可以用于指示鱼类死亡时间的方法显得有必要。
RNA是在各类细胞中广泛存在的大分子。相比较DNA的双螺旋结构，更容易受到核酸酶水解等因素的作用，而造成核酸链的断裂。本发明团队在前期研究中也验证了，动物死亡其细胞内完整的RNA分子因降解断裂而逐步耗尽。RNA耗尽程度理论上与死亡时间呈正相关，可能存在一定的规律。因此，找到动物组织内RNA分子在死后的变化规律成为了利用RNA降解度判别鱼类死后保存时间的核心内容。理论上，死后动物细胞内的RNA降解主要受核酸酶的水平及活性所决定。动物肌肉组织的核酸酶通常以RNase A为主，所以在外界确定条件下，死后动物肌肉中的RNA降解能呈现一定的规律性。此外，细胞内的所有的RNA分子中核糖体RNA(rRNA)约占85％左右。目前尚未有报道，利用死后动物体内的核酸(RNA)降解动态来衡量其死亡时间。运用此方法可通过单个指标较为稳定地判别鱼类死亡时间。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于估测鱼类死亡时间的引物及其应用，本发明以鱼类死亡后RNA耗尽程度与死亡时间呈正相关为理论依据，首次利用死后动物体内的核酸(RNA)降解动态来衡量其死亡时间。运用此方法可通过单个指标较为稳定地判别鱼类死亡时间。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种用于估测鱼类死亡时间的引物，包括以下4对扩增鱼类18S rRNA特定区域的引物：
第一对引物的序列分别入SEQ ID NO.1-2所示：
SEQ ID NO.1：18S-1700-F：ACTTGGATAACTGTGGCAATTC；
SEQ ID NO.2：18S-1700-R：ACNGAAACCTTGTTACGA；
第二对引物的序列分别入SEQ ID NO.3-4所示：
SEQ ID NO.3：18S-1600-F：CGTTACTTGGATAACTGTGGC；
SEQ ID NO.4：18S-1600-R：CCGATCCGAGGACCTCACTAA；
第三对引物的序列分别入SEQ ID NO.5-6所示：
SEQ ID NO.5：18S-1600-F：GCCGCTTTGGTGACTCTAGAT；
SEQ ID NO.6：18S-1600-R：CGCTTACTGGGAATTCCTCGT；
第四对引物的序列分别入SEQ ID NO.7-8所示：
SEQ ID NO.7：18S-1600-F：AATGTCTGCCCTATCAACTTTC；
SEQ ID NO.8：18S-1600-R：ATCGCTCCACCAACTAAGAA。
本发明在引物验证实验过程中发现，所设计的引物扩增出的产物片段大小与死亡时间存在一定的关系，后针对不同的扩增片段长度进行引物设计，多次验证后得出扩增出的产物片段大小与死亡时间确实存在联系。
为进一步确定通用引物的灵敏度、精确度，采用克隆方式，克隆大黄鱼、小黄鱼、带鱼、梅童鱼、银鲳等鱼的18s RNA序列，并测序，测序的结果采用MEGA7软件进行序列比对，在比对序列中验证通用引物。此外，采用引物稀释的方法，进行普通PCR验证引物的灵敏度。以上，均是通过大量PCR技术检测验证。
第二方面，本发明提供了一种利用18S rRNA片段PCR扩增检测估测鱼类死亡时间的方法，包括以下步骤：
1)提取与待检鱼类同类的样本死后不同冷藏时间点的肌肉组织，并进行总RNA共提取，然后进行cDNA合成；
2)以步骤1)合成的cDNA为模板，采用上述4对引物进行PCR扩增反应，进行电泳检测每个时间点中对应特定片长18S rRNA的cDNA模板的PCR扩增情况；
3)根据电泳结果，建立鱼类死亡时间与不同引物对扩增结果的对应关系，最后对待检鱼类进行检测以估测其死亡时间。
本发明以鱼类死亡后RNA耗尽程度与死亡时间呈正相关为理论依据，首次利用死后动物体内的核酸(RNA)降解动态来衡量其死亡时间。运用此方法可通过单个指标较为稳定地判别鱼类死亡时间。
作为优选，步骤1)中，所述不同冷藏时间点的间隔为1天。
作为优选，步骤1)中，肌肉组织的提取方法为：将样本经麻醉处理后，迅速转移至0～1℃条件下进行冷冷藏保存处理，在各时间点，在各样本的背部相似位置采集肌肉组织，置于无菌管中。
作为优选，步骤1)中，总RNA共提取具体包括：将获得的肌肉组织置于离心管中，加入RNA isolater试剂，用手持匀浆机进行研磨，最后吸附柱吸附核酸并洗脱RNA，获得提取液。
作为优选，步骤1)中，cDNA的合成反应具体包括：取所得的总RNA，采用
Figure BDA0002385416970000031
IIQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒进行反转录合成cDNA；先去除基因组DNA：4×gDNA wiper Mix 4μL、模板RNA 500ng、RNase free ddH2O补足16μL，42℃、2min；后进行逆转录：5×
Figure BDA0002385416970000032
II qRT SuperMix II 4μL、去除基因组后的混合液16μL，50℃15min、85℃5s；得到的产物cDNA存于-20℃，便于后续PCR反应。
作为优选，步骤2)中，PCR扩增反应的PCR反应体系为：PCR反应预混液10μL、cDNA模板或质粒模板0.5μL、上下游引物0.8μL，最后用水补足至20μL。
作为优选，步骤2)中，PCR扩增反应的反应体系如下：94℃预变性2min；接30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；以及终延伸2min。
作为优选，步骤2)中，PCR扩增反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳的方式检查扩增结果；PCR扩增产物的凝胶电泳上样量为5-8μL；电泳后的琼脂凝胶使用GelRed核酸染色剂进行染色，使用Bio-Rad凝胶成像系统中进行观察及拍照，获得电泳条带结果。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明以鱼类死亡后RNA耗尽程度与死亡时间呈正相关为理论依据，首次利用死后动物体内的核酸(RNA)降解动态来衡量其死亡时间。
(2)运用本贩卖给你方法可通过单个指标较为稳定地判别鱼类死亡时间。
附图说明
图1为实施例1中经过1～14天冷藏处理后斑马鱼肌肉样品18s逆转录PCR扩增结果电泳图；
图2为已知斑马鱼死亡时间的肌肉样品18s逆转录PCR扩增结果电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种用于估测鱼类死亡时间的引物，包括以下4对扩增鱼类18S rRNA特定区域的引物：
第一对引物的序列分别入SEQ ID NO.1-2所示：
SEQ ID NO.1：18S-1700-F：ACTTGGATAACTGTGGCAATTC；
SEQ ID NO.2：18S-1 700-R：ACNGAAACCTTGTTACGA；
第二对引物的序列分别入SEQ ID NO.3-4所示：
SEQ ID NO.3：18S-1600-F：CGTTACTTGGATAACTGTGGC；
SEQ ID NO.4：18S-1600-R：CCGATCCGAGGACCTCACTAA；
第三对引物的序列分别入SEQ ID NO.5-6所示：
SEQ ID NO.5：18S-1600-F：GCCGCTTTGGTGACTCTAGAT；
SEQ ID NO.6：18S-1600-R：CGCTTACTGGGAATTCCTCGT；
第四对引物的序列分别入SEQ ID NO.7-8所示：
SEQ ID NO.7：18S-1600-F：AATGTCTGCCCTATCAACTTTC；
SEQ ID NO.8：18S-1600-R：ATCGCTCCACCAACTAAGAA。
一种利用18S rRNA片段PCR扩增检测估测鱼类死亡时间的方法，包括以下步骤：
1)提取与待检鱼类同类的样本死后不同冷藏时间点的肌肉组织，并进行总RNA共提取，然后进行cDNA合成；
2)以步骤1)合成的cDNA为模板，采用上述的4对引物进行PCR扩增反应，进行电泳检测每个时间点中对应特定片长18S rRNA的cDNA模板的PCR扩增情况；
3)根据电泳结果，建立鱼类死亡时间与不同引物对扩增结果的对应关系，最后对待检鱼类进行检测以估测其死亡时间。
本发明以鱼类死亡后RNA耗尽程度与死亡时间呈正相关为理论依据，首次利用死后动物体内的核酸(RNA)降解动态来衡量其死亡时间。运用此方法可通过单个指标较为稳定地判别鱼类死亡时间。
作为优选，步骤1)中，所述不同冷藏时间点的间隔为1天。
作为优选，步骤1)中，肌肉组织的提取方法为：将样本经麻醉处理后，迅速转移至0～1℃条件下进行冷冷藏保存处理，在各时间点，在各样本的背部相似位置采集肌肉组织，置于无菌管中。
作为优选，步骤1)中，总RNA共提取具体包括：将获得的肌肉组织置于离心管中，加入RNA isolater试剂，用手持匀浆机进行研磨，最后吸附柱吸附核酸并洗脱RNA，获得提取液。
作为优选，步骤1)中，cDNA的合成反应具体包括：取所得的总RNA，采用
Figure BDA0002385416970000041
IIQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒进行反转录合成cDNA；先去除基因组DNA：4×gDNA wiper Mix 4μL、模板RNA 500ng、RNase free ddH2O补足16μL，42℃、2min；后进行逆转录：5×
Figure BDA0002385416970000042
II qRT SuperMix II 4μL、去除基因组后的混合液16μL，50℃15min、85℃5s；得到的产物cDNA存于-20℃，便于后续PCR反应。
作为优选，步骤2)中，PCR扩增反应的PCR反应体系为：PCR反应预混液10μL、cDNA模板或质粒模板0.5μL、上下游引物0.8μL，最后用水补足至20μL。
作为优选，步骤2)中，PCR扩增反应的反应体系如下：94℃预变性2min；接30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；以及终延伸2min。
作为优选，步骤2)中，PCR扩增反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳的方式检查扩增结果；PCR扩增产物的凝胶电泳上样量为5-8μL；电泳后的琼脂凝胶使用GelRed核酸染色剂进行染色，使用Bio-Rad凝胶成像系统中进行观察及拍照，获得电泳条带结果。
实施例1
1、斑马鱼肌肉样品的采集
将15尾斑马鱼经麻醉处理后，迅速转移至0～1℃条件下进行冷冻保存处理，冷藏保存处理，处理时间为1～14d，每相隔1d为一个时间点。在各冷冻时间点，在各组样品鱼的背部相似位置采集肌肉组织～30mg，置于1.5ml的无菌管中。
2、RNA的提取
立即将上述的获得的肌肉组织用于总RNA的提取。在离心管中加入300μL RNAisolater试剂(南京诺唯赞生物科技有限公司；商品号R401-01)，用手持匀浆机进行研磨，最后吸附柱吸附核酸并洗脱RNA步骤，获得20μL提取液，具体操作按照试剂说明书进行；随后将提取的RNA样品进行逆转录反应(即cDNA的合成)。
3、cDNA的合成反应
取步骤2中获得500ng总RNA，采用
Figure BDA0002385416970000051
II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司；商品号R223-01)进行反转录合成cDNA。先去除基因组DNA：4×gDNAwiper Mix 4μL、模板RNA 500ng、RNase free ddH2O补足16μL，42℃、2min；后进行逆转录：5×
Figure BDA0002385416970000052
II qRT SuperMix II4μL、去除基因组后的混合液16μL，50℃15min、85℃5s。得到的产物cDNA存于-20℃，便于后续PCR反应。
4、引物设计
设计特异性扩增重要经济鱼类18S rRNA的引物，本例中的4对引物基于斑马鱼以及大黄鱼、小黄鱼、梅童鱼和带鱼等常见经济鱼类18S rRNA序列中的保守区域设计，以确保方法可对市场常见的海水鱼类适用。引物对18S-1700-F/R的扩增片段长度约为1700bp(不同鱼类物种间存在长度差异)，具体引物序列见SEQ ID NO.1～2；引物对18S-1600-F/R的扩增片段长度约为1600bp，具体引物序列见SEQ ID NO.3～4；引物对18S-1400-F/R的扩增片段长度约为1400bp，具体引物序列见SEQ ID NO.5～6；引物对18S-1000-F/R的扩增片段长度约为1000bp，具体引物序列见SEQ ID NO.7～8。
18S-1700-F：ACTTGGATAACTGTGGCAATTC；(SEQ ID NO.1)
18S-1700-R：ACNGAAACCTTGTTACGA；(SEQ ID NO.2)
18S-1600-F：CGTTACTTGGATAACTGTGGC：(SEQ ID NO.3)
18S-1600-R：CCGATCCGAGGACCTCACTAA；(SEQ ID NO.4)
18S-1400-F：GCCGCTTTGGTGACTCTAGAT；(SEQ ID NO.5)
18S-1400-R：CGCTTACTGGGAATTCCTCGT；(SEQ ID NO.6)
18S-1000-F：AATGTCTGCCCTATCAACTTTC；(SEQ ID NO.7)
18S-1000-R：ATCGCTCCACCAACTAAGAA；(SEQ ID NO.8)
同时，经验证，上述引物均有特定18S rRNA区域的特异性。
5、PCR检测以步骤3中获得的cDNA为模板，检测每个时间点中对应特定片长18SrRNA的cDNA模板的PCR扩增情况。PCR反应体系为2×ES Taq MasterMix预混液(康为世纪生物公司；商品号：CW0690)10μL、cDNA模板或质粒模板0.5μL、上下游引物0.8μL，最后用超纯水补足至20μL；PCR反应条件：94℃预变性2min；接30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸时间按2kb/min设置；以及终延伸2min。经检测，上述条件下PCR反应的灵敏度为103～104拷贝数/μL(以参照模板质粒为PCR反应模板测得)。
6、结果分析
PCR扩增反应结果后，采用1％琼脂糖凝胶电泳的方式检查扩增结果；PCR扩增产物的凝胶电泳上样量为5μL；电泳后的琼脂凝胶使用GelRed核酸染色剂进行染色，使用Bio-Rad凝胶成像系统中进行观察及拍照，获得电泳条带结果。以图1为例，使用引物对18S-1700-F/R、18S-1600-F/R、18S-1400-F/R、18S-1000-F/R进行对斑马鱼肌肉样品18s逆转录PCR扩增，其中阳性扩增的临界点分别为1d、5d、7d和13d。通过此结果，可以肌肉样品18s逆转录PCR结果与斑马鱼死亡时间对照表参见表1。基于此对照表，则通过各引物对的单独或组合的使用进行对未知样品18s进行逆转录扩增，可以分析待测样品的大致死亡时间区间范围。
表1、肌肉样品18s逆转录PCR结果与斑马鱼死亡时间对照表
Figure BDA0002385416970000061
Figure BDA0002385416970000071
实施例2(验证例)
将已知死亡时间为0、2、4、6、8、10、12、14d的斑马鱼待检样品进行检测，其肌肉样品18s逆转录PCR扩增结果电泳图如图2所示，结果与本发明的判断结果基本一致。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种用于估测鱼类死亡时间的引物及其应用
<130> 2020
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
acttggataa ctgtggcaat tc 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
acngaaacct tgttacga 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cgttacttgg ataactgtgg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ccgatccgag gacctcacta a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gccgctttgg tgactctaga t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
cgcttactgg gaattcctcg t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
aatgtctgcc ctatcaactt tc 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
atcgctccac caactaagaa 20

Claims (9)

1.一种用于估测鱼类死亡时间的引物，其特征在于包括以下4对扩增鱼类18S rRNA特定区域的引物：
第一对引物的序列分别入SEQ ID NO.1-2所示：
SEQ ID NO.1：18S-1700-F：ACTTGGATAACTGTGGCAATTC；
SEQ ID NO.2：18S-1700-R：ACNGAAACCTTGTTACGA；
第二对引物的序列分别入SEQ ID NO.3-4所示：
SEQ ID NO.3：18S-1600-F：CGTTACTTGGATAACTGTGGC；
SEQ ID NO.4：18S-1600-R：CCGATCCGAGGACCTCACTAA；
第三对引物的序列分别入SEQ ID NO.5-6所示：
SEQ ID NO.5：18S-1600-F：GCCGCTTTGGTGACTCTAGAT；
SEQ ID NO.6：18S-1600-R：CGCTTACTGGGAATTCCTCGT；
第四对引物的序列分别入SEQ ID NO.7-8所示：
SEQ ID NO.7：18S-1600-F：AATGTCTGCCCTATCAACTTTC；
SEQ ID NO.8：18S-1600-R：ATCGCTCCACCAACTAAGAA。
2.一种利用18S rRNA片段PCR扩增检测估测鱼类死亡时间的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取与待检鱼类同类的样本死后不同冷藏时间点的肌肉组织，并进行总RNA共提取，然后进行cDNA合成；
2）以步骤1）合成的cDNA为模板，采用权利要求1中所述的引物进行PCR扩增反应，进行电泳检测每个时间点中对应特定片长18S rRNA的cDNA模板的PCR扩增情况；
3）根据电泳结果，建立鱼类死亡时间与不同引物对扩增结果的对应关系，最后对待检鱼类进行检测以估测其死亡时间。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述不同冷藏时间点的间隔为1天。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）中，肌肉组织的提取方法为：将样本经麻醉处理后，迅速转移至0~1℃条件下进行冷冷藏保存处理，在各时间点，在各样本的背部相似位置采集肌肉组织，置于无菌管中。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1）中，总RNA共提取具体包括：将获得的肌肉组织置于离心管中，加入RNA isolater试剂，用手持匀浆机进行研磨，最后吸附柱吸附核酸并洗脱RNA，获得提取液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）中，cDNA的合成反应具体包括：取所得的总RNA ，采用HiScript® II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂盒进行反转录合成cDNA；先去除基因组DNA：4×gDNA wiper Mix 4μL、模板RNA 500 ng、RNase freeddH2O补足16μL，42℃、2min；后进行逆转录：5×HiScript® II qRT SuperMix II 4μL、去除基因组后的混合液16μL，50℃ 15min、85℃ 5s；得到的产物cDNA存于-20℃，便于后续PCR反应。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中，PCR扩增反应的PCR反应体系为：PCR反应预混液10 µL、cDNA模板或质粒模板0.5µL、上下游引物0.8 µL，最后用水补足至20µL。
8.根据权利要求2或6所述的方法，其特征在于，步骤2）中，PCR扩增反应的反应体系如下：94℃预变性2 min；接30个循环：94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min；以及终延伸2 min。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中，PCR扩增反应后，采用1% 琼脂糖凝胶电泳的方式检查扩增结果；PCR扩增产物的凝胶电泳上样量为5 -8 µL；电泳后的琼脂凝胶使用GelRed核酸染色剂进行染色，使用Bio-Rad凝胶成像系统中进行观察及拍照，获得电泳条带结果。
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