CN1858219A - 一种单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法及其在核酸检测中的应用。反应液含内套引物和外套引物，内套引物与目标基因顺序有错配或在5’端带一段非基因专一顺序。内套引物与原始模板的最高允许退火温度低于第一轮反应的退火温度，而内套引物与匹配模板的解链温度高于外套引物的最高允许退火温度。控制第一轮PCR循环的退火温度使外套引物能退火扩增但内套引物不能退火扩增。提高第二轮PCR循环的退火温度使外套停止退火扩增而内套引物能退火扩增。在第一和第二轮之间有二至若干循环退火温度低于二者的过渡阶段，使内套引物能与原始模板退火扩增形成匹配模板启动第二轮反应。整个PCR反应过程中不开管盖反应管也不移离基因扩增仪。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及嵌套式聚合酶链式反应的方法及其应用。
技术背景
聚合酶链式反应(PCR)是一种高效体外扩增特定DNA的方法，在此基础上发展起来的嵌套式PCR(巢式PCR，Nested-PCR)的扩增专一性和灵敏性均显著提高。但传统的嵌套式PCR需要中途开启反应管盖分二轮进行既麻烦又显著增加了滞后污染的机会。九十年代建立了一种基于控制低外套引物浓度和高外套引物解链温度的单管嵌套式方法，(Gookin等：Journal-Clinical-Microbiology，2002，40，4126，Forsman等：Journal-Viological-Methods，2003，111：1-11)这种方法需要通过试验来摸索确定合适的外套引物浓度。近年来出现将内套引物置于毛细管(ES，P9801642，July，31，1998和Nucleic-Acid-Research(1999)27(6)：1564)，置于反应管盖内壁上(Walsh等Journal-Medical-Virology，2001，63：259-63，Ratcliff等：Journal-clinical-Microbiology，2002，40：4091-9，Abath等：Biotechniques，2002，33：1210-2)，或通过矿物油层使内套引物与反应液分开的单管嵌套式方法(Ratge等：J-Clinical-Virology，2002，24：161-72，Hu等：American-Journal-Clincal-Pathology，2003，119：95-100)，但这些物理方法必须小心操作而且要将反应管从扩增仪上移开并增加了离心等步骤。此外，所有上述各种方法均不能在第二轮内套反应阶段立即和完全停止外套引物的作用。本发明提供了一种通过含错配顺序或“带尾”(5‘端带一段非基因专一顺序)的内套引物，循环退火温度按中温-低温-高温的模式进行的单管原位嵌套式PCR，反应过程中既不需要开启管盖也不需要将试管从基因扩增仪上移开，克服了各种已公开的嵌套式PCR技术的种种缺点有着广泛的实际应用价值。
发明内容
所需要解决的技术问题
本发明提供了一种单管原位嵌套式PCR方法，以克服现行各种嵌套式PCR方法步骤繁琐、易污染、内外套引物的扩增相互影响或需要特殊反应容器的缺点。
发明构思
单管原位嵌套式PCR反应液同时含有外套和内套引物。设计内套引物与目标基因顺序有错配或在5‘端带一段非基因专一顺序，使内套引物基因专一部分与原始模板的解链温度比外套引物解链温度低20℃左右，同时又使整个内套引物顺序与匹配模板之间的解链温度比外套引物解链温度高3℃以上。PCR反应开始阶段控制退火温度较高只有外套引物能扩增而内套引物不能退火扩增。第一轮反应进行一定循环数后降低退火温度使内套引物能与外套引物的扩增产物退火进行扩增。数个循环后再将退火温度提高至比第一轮反应更高，使外套引物停止退火扩增而内套引物能继续退火扩增。
技术方案
根据通常引物设计严谨性要求的原则借助引物设计软件选择相互嵌套的二对引物。在内套引物中引进若干错配硷基或在5’端除去一段順序而另加一段非基因专一顺序，使内套引物基因專一部份与原始模板之间的解链温度比外套引物低20℃左右，而整個内套引物与匹配模板之间的解链温度比外套引物高3℃以上。PCR反应液包括缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、模板核酸、外套引物和内套引物。PCR反应步骤依次包括：
(1)DNA模板变性解链；
(2)引物与模板退火；
(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；
(4)按步骤(1)-(3)循环进行合成反应；
PCR反应完成前无需开盖也不需将反应管从基因扩增仪上移开。PCR程序按退火温度高低变化分成中温阶段，低温过渡阶段和高温阶段。反应开始5-25循环为中温阶段，在该阶段退火温度下外套引物能退火完成扩增，但内套引物与原始模板之间不能发生退火不进行扩增。随后2-5循环为低温过渡阶段，在该阶段退火温度下内套引物能与原始模板退火开始扩增，而外套引物也能继续扩增。最后5-25个循环为高温阶段，在该阶段退火温度下外套引物不能退火扩增，而内套引物能继续扩增直至反应结束。反应结束后可用常规的电泳分离和染色检测目标条带，或者直接向反应管内加双链DNA专一荧光试剂如SYBR录I来检测，或者将上述荧光试剂预加在反应管内但不与反应液接触，反应完成后在闭管状态下使荧光试剂与反应液接触来检测目标扩增产物。按相同方法在PCR反应溶液内加SYBR录I同时或分别标记荧光基团和淬灭基团的分子探针可进行实时荧光定量PCR。本发明的一个技术方案将方法扩展至彼此独立的双重单管原位嵌套PCR。设计二组内套引物的错配特性和解链温度参数彼此相同或接近，二组外套引物的解链温度等参数也彼此相同或接近。本发明的另一个技术方案将方法扩展至含一对外套引物和二对内套引物的PCR反应，即二对内套引物各自独立且错配特性和解链温度等参数彼此相同或接近
有益效果
1，本发明所述嵌套式PCR操作与标准PCR一样简单但更专一、灵敏。
2，本发明所述嵌套式PCR操作比传统开管式嵌套PCR操作简单又无滞后污染。
3，本发明所述嵌套式PCR与控制外套引物浓度的嵌套式PCR相比不需前期预备试验并且更可靠。
4，本发明所述嵌套式PCR与用物理方法达到的嵌套PCR相比操作更简单也更可靠。
5，本发明所述嵌套式PCR可扩展成为双重嵌套和一外套二内套等多种形式，可同时专一地扩增二个基因及减少假阴性结果。
6，本发明所述嵌套式PCR排除了非专一扩增产物使目标扩增产物检测方法更简单
7，本发明所述嵌套式PCR可用于各种实时荧光定量PCR使之更专一、灵敏。
8，本发明所述嵌套式PCR对引物在目标基因中的位置没有特殊要求可普遍应用。
具体实施方式
实施例1.
实施例1目标基因为人beta肌动球蛋白基因(美国国家生物信息中心基因库编号BC016045)。引物顺序和特性示于表1和2，下划线为非基因专一顺序。
表1.实施例1引物顺序
| 名称 | 位置 | 顺序(5’至3’) |
| A外套引物 | 20-37 | CAC AGA GCC TCG CCT TTG |
| 941-958 | CGT ACA GGT CTT TGC GGA | |
| A内套引物 | 185-207 | CGG GGT CCG TGG TGG GCG TGA TG |
| 560-585 | CCG CGT GGG GAG CAT CAT GGG CAC AG |
表2.实施例1引物特性
| 引物名称 | 长度 | 解链温度(℃) | 与模板结合强度 | |||
| 总长 | 匹配碱基 | 原始模板 | 匹配模板 | 原始模板 | 匹配模板 | |
| A外套 | 18 | 69.2 | 440 | |||
| 18 | 66.9 | 445 | ||||
| A内套 | 23 | 10 | 43.1 | 88.0 | 350 | 578 |
| 26 | 10 | 37.0 | 90.1 | 296 | 592 | |
以cDNA为模板时外套和内套扩增产物长分别为939和401硷基，扩增产物解链温度分别为92.2和91.0℃，内套和外套引物之间的3‘端硷基数均等于或小于2。采用ClonTech公司的Advantage2-PCR试剂盒，引物0.4uM，每管反应体积为10ul。核酸模板为cDNA，用ClonTech公司的反转录试剂盒由人组织总RNA用Oligo(dT)为引物反转录合成，每管含上述制备的cDNA 1ul。表3显示A外套引物(试验A)，A内套引物与基因匹配部分(试验B)和整个引物(试验C)完成扩增的最高允许退火温度。试验A、B和C的首次变性94℃1分钟，循环变性94℃10秒钟，延伸75℃1分钟，试验A和B退火时间30秒，退火温度示于表3，共30个循环。试验C最初二个循环退火50℃1分钟，其余循环条件与试验A和B相同示于表3。
表3，实施例1外套和内套引物的最高允许退火温度
| 试验项目 | 不同退火温度(℃)下扩增产物的形成 | ||||||||
| 55 | 58.2 | 60.5 | 63.5 | 66.8 | 69.6 | 71.9 | 73.4 | 75 | |
| A | + | + | + | + | + | + | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | - | - | - |
| C | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
由表3可见内套引物在约63℃以上完全不能退火，而一旦退火形成匹配模板后就能在高温下继续退火扩增。
表4为应用A外套引物和A内套引物的嵌套PCR程序
表4.实施例1PCR程序
| 变性 | 退火 | 延伸 | |
| 首次 | 94℃1分钟 | ||
| 1-13循环 | 94℃10秒钟 | 68℃2分钟 | |
| 14-15循环 | 94℃10秒钟 | 45℃1分钟 | 76℃1分钟 |
| 16-30循环 | 94℃10秒钟 | 76℃1分钟 | |
| 结束 | 76℃2分钟 | ||
PCR反应结束加1ul 100倍稀释的SYBR录I荧光试剂在紫外光下显示强荧光，另一份样品反应结束后电泳染色得到预期的401个碱基条带并没有非专一扩增条带。
实施例2.
实施例2设计一对外套引物和二组内套引物的嵌套PCR，目标基因、试剂和PCR程序方法与实施例1相同。除表1所示外套和内套引物外，反应液另增加一对内套引物，其顺序和特性示于表5和6，下划线为非基因专一顺序。A内套引物2扩增产物长度为276个碱基，扩增产物解链温度90.2℃
表5.实施例2引物顺序
| 名称 | 位置 | 顺序(5’至3’) |
| A内套引物2 | 614-627 | GCC AGC CGG CGG ACC TGA CTG ACT |
| 866-892 | GTG CCC CGA GGT ACG CCA GGA AGG AAG |
表6.实施例2部分引物特性
| 引物名称 | 长度 | 解链温度(℃) | 与模板结合强度 | |||
| 总长 | 匹配碱基 | 原始模板 | 匹配模板 | 原始模板 | 匹配模板 | |
| A内套引物2 | 24 | 14 | 46.5 | 85.3 | 277 | 555 |
| 27 | 12 | 44.8 | 85.4 | 296 | 583 | |
PCR扩增可得到预期的长度为401个碱基和279个碱基的二条带。
实施例3
实施例3设计二对外套引物和二对内套引物的多重嵌套PCR，目标基因，试剂和PCR程序方法与实施例1相同。二对外套和二对内套引物顺序和特性示于表7和8，下划线为非基因专一顺序。
表7，实施例3引物顺序
| 名称 | 位置 | 顺序(5’至3‘) |
| A3外套引物 | 213-234 | CAT GGG TCA GAA GGA TTC CTA T |
| 553-570 | GAT GGG CAC AGT GTG GGT | |
| A3内套引物 | 301-324 | CCG TGG CTG ACG GAC GAC ATG GAG |
| 472-497 | CCG TCG TGC CGG TGG ATA CCA ACG TA | |
| A4外套引物 | 1184-1201 | TCC ACC GCA AAT GCT TCT |
| 1639-1661 | CGA AGG CTC ATC ATT CAA AAT AA | |
| A4内套引物 | 1244-1268 | CGG GCT GGC ACG CCA GAA AAC AAG A |
| 1493-1528 | CCC TCC TCC CCC GTG CCT TTT AGG AT |
表8.实施例3引物特性
| 引物名称 | 长度 | 解链温度(℃) | 与模板结合强度 | ||||
| 总长 | 匹配碱基 | 原始模板 | 匹配模板 | 原始模板 | 匹配模板 | ||
| A3外套引物 | 22 | 67.7 | 395 | ||||
| 18 | 69.0 | 418 | |||||
| A3内套引物 | 24 | 13 | 49.4 | 84.0 | 302 | 466 | |
| 26 | 14 | 48.1 | 84.4 | 288 | 556 | ||
| A4外套引物 | 18 | 68.9 | 436 | ||||
| 23 | 68.8 | 404 | |||||
| A4内套引物 | 25 | 13 | 42.5 | 85.0 | 268 | 553 |
| 26 | 14 | 47.8 | 83.3 | 312 | 575 |
PCR扩增可得到预期的长度为197个碱基和275个碱基的二条带。
Claims (6)
1，一种以基因组DNA或cDNA为模板的单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法，反应液含至少一对外套引物和至少一个内套引物，内套引物顺序与原始目标模板顺序有错配或在5’端有一段非基因专一顺序。PCR反应依次包括如下步骤：
(1)DNA模板变性解链；
(2)引物与模板退火；
(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；
(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；
按退火温度擴增分为二輪反應，其特征在于二輪反應之間不打開反應管蓋並保持原位。第二轮内套反应的退火温度高于第一轮外套反应的退火温度，二轮反应之间的过渡循环的退火温度比二轮反应都低。
2，根据权利要求1所述单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法的反应液含一对外套引物和一对内套引物，正反内套引物的顺序均与原始目标模板顺序有错配或在5’端有一段非基因专一顺序。
3，根据权利要求1和2所述单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法用于闭管荧光终点、直接荧光终点和其他终点检测方法。
4，根据权利要求1和2所述单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法用于SYBR录I荧光染料、TaqMan探针、分子信标、双重探针和其他应用分子探针的实时荧光定量PCR。
5，根据权利要求1所述单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法的反应液含一对外套引物和二对内套引物。二对内套引物顺序均与原始目标模板顺序有错配或在5’端有一段非基因专一顺序。
6，根据权利要求1所述单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法的反应液所含二对外套引物和二对内套引物分属不同基因或位置上相互隔开。二对内套引物顺序均与原始目标模板顺序有错配或在5’端有一段非基因专一顺序。
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