CN116463423B - 基因甲基化与突变联合检测试剂及其在结直肠癌诊断中的应用 - Google Patents

基因甲基化与突变联合检测试剂及其在结直肠癌诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了基因甲基化与突变联合检测试剂及其在结直肠癌诊断中的应用。本发明中，采用包括Septin9片段、SDC2片段和MLH1片段的甲基化标志物，以及KRAS和BRAF的点突变标志物的组合，且优选了短而精简但检测效率高、检测效果优异的靶检测区域。本发明也优化设计了检测试剂以及试剂盒，大大提高了结直肠癌诊断的灵敏性和准确性。

Description

基因甲基化与突变联合检测试剂及其在结直肠癌诊断中的 应用
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体地说，本发明关于一种通过联合检测基因甲基化与突变，对结直肠癌进行诊断或筛查(包括辅助诊断或筛查)的方法和试剂。
背景技术
结直肠癌是目前发病率很高的癌种，大多数的结直肠癌一旦发现即已属晚期——I期结直肠癌的5年生存率为90％，而发生远端转移的IV期结直肠癌5年生存率仅为14％，通过结直肠癌筛查和早诊早治可以有效降低结直肠癌的死亡率。
肠镜是目前最有效的结直肠癌筛查工具。但由于其侵入性，患者依从性较差——在一项相关研究中，接受调查的受试者，63％拒绝结直肠镜检查。此外，肠镜硬件设施及专科医生资源也远远不能满足大规模的筛查需求。粪便隐血检测则是目前另一种应用广泛的筛查工具，其无创、价廉的特点尤其适合大规模人群的筛查。但粪便隐血检测的灵敏度、特异性并不尽如人意。
对癌症基因组、转录组、表观遗传及蛋白组等的大量研究，揭示了在结直肠癌发生过程中，至少存在两类早期事件：原癌基因/抑癌基因突变导致对应基因异常的功能获得/丧失，以及抑癌基因启动子的异常甲基化导致的抑癌基因沉默，且癌症发生过程，存在多种环境因素的影响，并最终表现为多个基因的共同作用，存在很大的异质性。因此，需要多因素的选择和考虑，实现高灵敏度、高特异性的检测尤其困难。
目前的基因甲基化检测技术，通常需要通过一些化学试剂，如亚硫酸盐或重亚硫酸盐，对DNA模板先进行处理，将甲基化/非甲基化的胞嘧啶，转化为PCR、测序等技术可以区分的碱基差异，从而实现检测的目的。但上述处理同时也改变了突变检测目标区段的整个序列，原有的基因突变检测体系不再适用。且该处理过程使得基因序列从四种不同的核苷酸的排列组合被大幅“简并”为几乎只有三种核苷酸，因而对后续扩增检测所必须的引物及探针设计带来很大困扰。因此，虽然PCR、测序等分子检测技术的发展，已使得多重检测在技术上成为可能，但现有产品往往只针对突变和甲基化这两种分子多态性中的一种，或者，需要采集两份生物检材，一份提取到的DNA直接用于突变检测，另一份提取到的DNA则进行重硫酸盐转化等处理，后续用于甲基化检测。这种方式，不单意味着更繁琐的操作、更大的失误几率、更高的成本及人员负荷、以及更长的检测周期，更重要的是，需要更多的原始检材。在某些情况下，可能造成由于原始检材量较少而不能够完成整个检测，降低检测成功率，影响临床诊断及治疗决策。
因此，迫切需要开发更有效的、可以基于一份生物检材、一次实验流程，对多个靶基因的甲基化水平及突变位点进行平行检测的方法，以实现更有效，且患者可及、负担得起的结直肠癌无创辅助诊断及早期筛查。
发明内容
本发明的目的在于提供基因甲基化与突变联合检测试剂及其在结直肠癌诊断中的应用。
在本发明的第一方面，提供甲基化标志物和点突变标志物的用途，用于作为诊断靶标、制备检测(包括诊断)结直肠癌的检测试剂或试剂盒，其中：(1)所述甲基化标志物为Septin9、SDC2和MLH1的片段；其中，所述Septin9含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述SDC2含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述MLH1含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；(2)所述点突变标志物为KRAS和BRAF的片段；其中，所述KRAS含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述BRAF含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述点突变包括：KRAS的G12和G13突变，BRAF的V600突变；其中，所述甲基化和突变标志物以亚硫酸盐转化产物为模板进行PCR扩增和检测。
在一种或多种优选实施方式中，所述甲基化标志物Septin9、SDC2和MLH1的片段不包括其全长序列。
在一种或多种优选实施方式中，所述突变标志物KRAS和BRAF的片段不包括其全长序列。
在一种或多种优选实施方式中，一种或多种甲基化和/或突变标志物同步扩增和检测。
在一种或多种优选实施方式中，所述甲基化(修饰)包括5-甲基化修饰(5mC)。
在本发明的另一方面，提供特异性检测甲基化标志物和点突变标志物的检测试剂的用途，用于制备检测结直肠癌的试剂盒；其中，(1)所述甲基化标志物为Septin9、SDC2和MLH1的片段；其中，所述Septin含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述SDC2含有如SEQID NO:2所示的核苷酸序列，所述MLH1含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；(2)所述点突变标志物为KRAS和BRAF的片段；其中，所述KRAS含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述BRAF含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述点突变包括：KRAS的G12和G13突变，BRAF的V600突变；其中，所述甲基化和突变标志物以亚硫酸盐转化产物为模板进行PCR扩增和检测。
在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述的检测试剂为用于检测待测样本中所述甲基化标志物的甲基化水平的试剂；较佳地，所述的检测试剂为引物和/或探针。
在一种或多种优选实施方式中，(2)中，所述的检测试剂为用于检测待测样本中所述点突变标志物的点突变存在情况试剂；较佳地，所述的检测试剂为引物和/或探针。
在一种或多种优选实施方式中，(1)和/或(2)中所述的检测试剂并合并使用，进行多重检测(如多重PCR检测)。
在一种或多种优选实施方式中，所述的检测试剂是以血浆或血清为待测样本的诊断试剂，或以组织或细胞为待测样本的诊断试剂；较佳地是以血浆或血清为待测样本的诊断试剂。
在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述引物和/或探针包括：用于Septin9片段的甲基化水平检测：SEQ ID NO:7～8所示的引物对，SEQ ID NO:9所示的探针；用于SDC2片段的甲基化水平检测：SEQ ID NO:10～11所示的引物对，SEQ ID NO:12所示的探针；用于MLH1片段的甲基化水平检测：SEQ ID NO:13～14所示的引物对，SEQ ID NO:15所示的探针。
在一种或多种优选实施方式中，(2)中，所述引物和/或探针包括：用于KRAS的G12和G13突变检测：SEQ ID NO:16～20任一所示的正向引物(依次对应于G12S，G12R及G12C，G12D，G12A及G12V，G13D)、SEQ ID NO:21所示的反向引物，SEQ ID NO:22所示的探针；用于BRAF的V600突变(包括V600E)检测：SEQ ID NO:23～24所示的引物对，SEQ ID NO:25所示的探针。
在一种或多种优选实施方式中，所述的检测试剂还包括内控基因的检测试剂；更佳地所述内控基因为GAPDH或ACTB；更佳地，以SEQ ID NO:26～27所示的引物对，SEQ IDNO:28所示的探针作为所述内控基因的检测试剂。
在一种或多种优选实施方式中，所述探针为荧光探针。
在一种或多种优选实施方式中，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所属荧光探针的3’端标记有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团包括但不限于：FAM，ROX，VIC，JOE，TAMRA，TET，CY5，CY3，Texas Red，HEX中的任意一种；所述荧光淬灭基团包括但不限于MGB，BHQ，Eclipse，Dabcyl中的任意一种。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒中包括：(1)特异性检测甲基化标志物的检测试剂，所述甲基化标志物为Septin9、SDC2和MLH1的片段；其中，所述Septin含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述SDC2含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述MLH1含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和(2)特异性检测点突变标志物KRAS和BRAF的检测试剂；其中，所述KRAS含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述BRAF含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述点突变包括：KRAS的G12和G13突变，BRAF的V600突变。
在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述的检测试剂为用于检测待测样本中所述甲基化标志物的甲基化水平的试剂；较佳地，所述的检测试剂为引物和/或探针。
在一种或多种优选实施方式中，(2)中，所述的检测试剂为用于检测待测样本中所述点突变标志物的点突变存在情况试剂；较佳地，所述的检测试剂为引物和/或探针。
在一种或多种优选实施方式中，所述的检测试剂并合并使用，进行多重检测(如多重PCR检测)。
在一种或多种优选实施方式中，所述的检测结直肠癌的试剂盒的(1)中，所述引物和/或探针包括：用于Septin9片段的甲基化水平检测：SEQ ID NO:7～8所示的引物对，SEQID NO:9所示的探针；用于SDC2片段的甲基化水平检测：SEQ ID NO:10～11所示的引物对，SEQ ID NO:12所示的探针；用于MLH1片段的甲基化水平检测：SEQ ID NO:13～14所示的引物对，SEQ ID NO:15所示的探针；(2)中，所述引物和/或探针包括：用于KRAS的G12和G13突变检测：SEQ ID NO:16～20任一所示的正向引物(依次对应于G12S，G12R及G12C，G12D，G12A及G12V，G13D)、SEQ ID NO:21所示的反向引物，SEQ ID NO:22所示的探针；用于BRAF的V600突变(包括V600E)检测：SEQ ID NO:23～24所示的引物对，SEQ ID NO:25所示的探针。
在一种或多种优选实施方式中，所述试剂盒中还包括内控基因的检测试剂；更佳地所述内控基因为GAPDH或ACTB。
在一种或多种优选实施方式中，以SEQ ID NO:26～27所示的引物对，SEQ ID NO:28所示的探针作为所述内控基因的检测试剂。
在一种或多种优选实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂或组件：亚硫酸盐转化试剂，用于将核酸(DNA)样本转化为适于甲基化水平检测的样本；较佳地，所述亚硫酸盐转化试剂包括：亚硫酸氢盐(如亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵)、偏重亚硫酸盐(如偏重亚硫酸钠)、重亚硫酸盐(如重亚硫酸钠)或其组合。
在一种或多种优选实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂或组件：质控品；标准品；对照品；核酸提取试剂；DNA扩增试剂；核酸序列分析软件；和/或说明操作方法的使用说明书。
在本发明的另一方面，提供一种检测(包括诊断)结直肠癌的方法，所述方法包括：
(i)检测待测核酸(DNA)样本的甲基化标志物和点突变标志物；所述甲基化标志物为Septin9、SDC2和MLH1的片段，所述Septin含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述SDC2含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述MLH1含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述点突变标志物为KRAS和BRAF的片段，其中，所述KRAS片段含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述BRAF片段含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述点突变包括：KRAS的G12和G13突变，BRAF的V600突变；
(ii)分析(i)的检测结果，确定待测核酸样本中甲基化标志物的甲基化水平和点突变标志物的突变情况，任一甲基化标志物和点突变标志物存在甲基化或突变，则诊断为结直肠癌阳性。
在一种或多种优选实施方式中，对甲基化和突变标志物进行分析时，以亚硫酸盐或重亚硫酸盐处理，将核酸(DNA)样本转化为适于甲基化和突变检测的样本。
在一种或多种优选实施方式中，通过PCR技术进行检测；较佳地，检测试剂包括前面所述的引物和/或探针。
在一种或多种优选实施方式中，所述的内控基因是GAPDH或ACTB。
在一种或多种优选实施方式中，所述的方法为非诊断性的方法。例如，应用于在实验室中分析待测核酸样本的变异情况，或应用于不以诊断为目的的辅助性样本参数测定。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、以SEPT9-F、SEPT9-R以及SEPT9-P作为引物探针，检测扩增经亚硫酸盐转化的SW48样本DNA(不同梯度)的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图2、以SDC2-F、SDC2-R以及SDC2-P作为引物探针，检测经亚硫酸盐转化的SW48样本DNA(不同梯度)的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图3、利用复合扩增反应-1体系，扩增甲基化阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图4、利用复合扩增反应-2体系，扩增甲基化阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图5、利用复合扩增反应-1体系，扩增BRAF突变阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图6、利用复合扩增反应-2体系，扩增BRAF突变阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图7、利用复合扩增反应-1体系，扩增KRAS突变阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图8、利用复合扩增反应-2体系，扩增KRAS突变阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图9、利用复合扩增反应-1体系，扩增甲基化和突变阴性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图10、利用复合扩增反应-2体系，扩增甲基化和突变阴性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛筛选和分析，揭示了一种利用甲基化标志物及点突变标志物联合检测结直肠癌的方法、试剂及试剂盒。本发明中，采用至少包括Septin9片段、SDC2片段和MLH1片段的甲基化标志物，以及至少包括KRAS的G12和G13突变、BRAF的V600突变的点突变标志物的组合，优选了短而精简但检测效率高、检测效果优异的靶检测区域。本发明也优化设计了检测试剂以及试剂盒，大大提高了结直肠癌诊断的灵敏性和准确性。
如本文所用，“待测样本”、“待测样品”或“生物检材”是指待检测的样本。本发明中，所述的待测样本可以是：血浆，血清，取自病变部位的组织或细胞等；优选地为血浆或血清。
如本文所用，“诊断”一词是指本领域技术人员用以评估及/或决定一个体罹患一特定疾病、病症或症征的可能性的方法。“诊断”一词也包含侦测罹患一疾病、病症或症征的倾向，决定一药物治疗的治疗功效，或是预测对药物治疗的反应。本揭示内容的诊断方法可单独进行，或与其他用以分析疾病、病症或症征的诊断及/或分期方法同时进行。
如本文所用，所述“试剂盒”可以与“套组”、“药盒”、“包装”等术语互换使用。
如本文所用，所述“多重检测”是指多组检测试剂被同时用于在一个体系中实施检测。所述“多重PCR检测”也可称为“复合PCR检测”，它是在同一PCR反应体系里加上二对或二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。
本发明人经过广泛地研究筛选和反复试验，发现在临床结直肠癌诊断中，以甲基化标志物以及点突变标志物作为靶标，联合运用检测甲基化标志物的技术以及检测点突变标志物的技术，可以极为有效地提高临床诊断的准确性、敏感性。
基于本发明人的新发现，提供了甲基化标志物以及点突变标志物作为诊断靶标在制备诊断结直肠癌的诊断试剂或试剂盒中的用途；所述甲基化标志物为Septin9、SDC2和MLH1的片段；其中，所述Septin含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述SDC2含有如SEQID NO:2所示的核苷酸序列，所述MLH1含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述点突变标志物为KRAS和BRAF；优选地，所述KRAS含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述BRAF含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述点突变包括：KRAS的G12和G13突变，BRAF的V600突变。更优选的实施方式中，所述KRAS突变检测包括KRAS基因第二外显子第12及13号密码子突变G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D。优选的实施方式中，BRAF突变检测为BRAF基因第十五外显子第600号密码子突变V600E；检测的靶区域如SEQ ID NO:5所示。
基于本发明的新发现，也提供了特异性检测甲基化标志物或点突变标志物的试剂的用途，用于制备诊断结直肠癌的试剂盒。
本发明中，经由反复筛选及实验验证所确定的靶向检测的甲基化区段是短而精简的，具有高的甲基化水平、从而灵敏度获得极显著的提高。Septin9甲基化水平检测的靶区域的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:1所示；所述的SDC2甲基化水平检测的靶区域的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:2所示；所述的MLH1甲基化水平检测的靶区域的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:3所示。
此外，优选地，所述的KRAS的片段的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:4所示；所述的BRAF的片段的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:5所示。
本发明还包括上述甲基化标志物或突变标志物的保守性序列变异形式。
基于本发明的新发现，也提供了一种兼具较高灵敏性和高特异性的甲基化标志物和点突变标志物联合检测试剂盒，以提高结直肠癌的早期诊断率。所述试剂盒中装入实施本发明所述的检测所需的必要的检测试剂(如PCR检测试剂，更具体如引物和探针)。也可装入其它辅助试剂。
作为本发明的优选方式，提供了一种用于结直肠癌辅助诊断和无创筛查的方法，使用提取自一份生物检材、并经亚硫酸盐转化的受试者DNA，平行检测多个靶基因的甲基化水平，以及突变存在情况，以实现高灵敏度和特异性，且高成功率、高效的结直肠癌检测。为了达到以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
从受试者的生物检材中提取DNA并进行亚硫酸盐转化；以上述经亚硫酸盐转化的受试者DNA为模板，检测1)生物标志物基因Septin9、SDC2和/或MLH1的甲基化水平；以及2)生物标志物基因KRAS和/或BRAF的突变；将1)及2)中检测到的甲基化水平及突变存在情况与正常人群体中的相应生物标志物基因甲基化水平及突变存在情况进行比较，以确定所述受试者的结直肠癌状态。
测定多核苷酸的甲基化可通过已有的技术(如甲基化特异性PCR(MSP)或实时定量甲基化特异性PCR，Methylight)来进行，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。检测甲基化水平时也可使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)的方法。这种方法是基于一种荧光PCR的持续性的光学监控，其较MSP方法更为敏感。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。其他可用的技术还有：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、qPCR法、二代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术或HPLC法以及组合基因群组检测法等该领域常规方法。应理解，在本发明的新揭示的基础上，本领域公知的这些技术以及即将发展的一些技术，均可被应用于本发明中。
作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中多核苷酸的甲基化的方法。所述的方法基于的原理是：亚硫酸盐转化试剂可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在后续的PCR扩增过程中转变为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过亚硫酸盐转化试剂处理多核苷酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的多核苷酸多态性(SNP)。基于上述原理来鉴定检测样品中多核苷酸的甲基化谱式，可以有效区分出甲基化与非甲基化的胞嘧啶。
优选的实施方式中，所述亚硫酸盐转化使用亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、偏重亚硫酸钠中的一种或任意两种及以上组合。
优选的实施方式中，用于扩增所述Septin9基因甲基化检测靶区域的引物对和荧光探针组合物序列如SEQ ID NO:7-9所示。
优选的实施方式中，用于扩增所述SDC2基因甲基化检测靶区域的引物对和荧光探针组合物序列如SEQ ID NO:10-12所示。
优选的实施方式中，用于扩增所述MLH1基因甲基化检测靶区域的引物对和荧光探针组合物序列如SEQ ID NO:13-15所示。
优选的实施方式中，用于扩增所述KRAS基因靶突变的引物对和荧光探针组合物序列如SEQ ID NO:16-22所示。
优选的实施方式中，用于扩增所述BRAF基因靶突变的引物对和荧光探针组合物序列如SEQ ID NO:23-25所示。
优选的实施方式中，在扩增检测所述Septin9、SDC2和/或MLH1基因甲基化水平的体系中，以及在扩增检测所述KRAS和/或BRAF基因突变的体系中，同时扩增GAPDH和/或ACTB基因，作为甲基化及突变检测的内控。
优选的实施方式中，所述内控基因GAPDH检测的靶区域如SEQ ID NO:6所示
优选的实施方式中，用于扩增所述内控基因的引物对和荧光探针组合物序列如SEQ ID NO:26-28所示；
优选的实施方式中，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所属荧光探针的3’端标记有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团为FAM，ROX，VIC，JOE，TAMRA，TET，CY5，CY3，Texas Red，HEX中的任意一种；所述荧光淬灭基团为MGB，BHQ，Eclipse，Dabcyl中的任意一种。
优选的实施方式中，基于所述方法的结直肠癌辅助诊断及筛查试剂盒，包括用于检测来自所述受试者的生物标志物基因Septin9、SDC2和/或MLH1的甲基化水平的试剂，以及检测所述受试者生物检材中生物标志物基因KRAS和/或BRAF的突变的试剂。
优选的实施方式中，基于所述方法的结直肠癌辅助诊断及筛查试剂盒，包括两个PCR扩增反应，其一用于对生物标志物基因Septin9、SDC2的甲基化水平和/或BRAF的突变水平，以及内控基因GAPDH进行多重检测，其二用于对生物标志物基因MLH1的甲基化水平和/或KRAS的突变水平，以及内控基因GAPDH进行多重检测。
优选的实施方式中，基于所述方法的结直肠癌辅助诊断及筛查试剂盒，所包括的两个PCR扩增反应，均以提取自一份生物检材、并经亚硫酸盐转化的受试者DNA为扩增模板。
优选的实施方式中，基于所述方法的结直肠癌辅助诊断及筛查试剂盒，包括空白质控品、阴性质控品和阳性质控品。
优选的实施方式中，基于所述方法的结直肠癌辅助诊断及筛查试剂盒，所述空白质控品为纯化水。
优选的实施方式中，基于所述方法的结直肠癌辅助诊断及筛查试剂盒，所述阴性质控品为从检测靶区域甲基化均为阴性、且检测突变靶点均为野生型的细胞系中提取的DNA。
优选的实施方式中，基于所述方法的结直肠癌辅助诊断及筛查试剂盒，所述阳性质控品为从检测靶区域甲基化均为阳性、且检测突变靶点均为突变型的细胞系中提取的DNA，或由提取自不同的检测靶区域甲基化阳性、检测突变靶点为突变型的若干种细胞系的DNA经精确定量并混合而成，以确保所有甲基化及突变检测靶区域含量均高于检测限。
优选的实施方式中，基于所述方法的结直肠癌辅助诊断及筛查试剂盒，还包括说明书，所述说明书用于阐述所述试剂盒的使用方法，及对检测结果进行判断的方法与说明。
根据本发明，所述结直肠癌辅助诊断包括早、中、晚不同分期的结直肠癌，以及癌前病变如进展期腺瘤。
本发明的技术方案，可以适用于绝大多数的复杂样本。例如，所述生物检材可以为受试者血液、血清、血浆、粪便、活检组织、FFPE样本。作为本发明的优选方式，所述的检测对象为人血浆或血清。血浆(或血清)稀释液或原液或其它加工制品均可用于本发明中。
本发明的有益效果主要包括：采用对结直肠癌生物标志物基因Septin9、SDC2和/或MLH1的甲基化水平；以及生物标志物基因KRAS和/或BRAF的突变的联合检测，实现更高灵敏度、特异性的结直肠癌辅助诊断及无创筛查；通过创新性的引物探针设计，使得所述甲基化及突变检测，可以使用同一份从受试者的生物检材中提取并经过亚硫酸盐转化的DNA完成，降低了检测方法对生物检材的消耗，提高了成功率，同时简化了实验流程，提升了检测效率。同时，本发明的实时荧光PCR方法和试剂盒检测周期短、检测试剂成本低，适用于复杂体系的检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
材料
甲基化阳性细胞系：采用SW48作为甲基化阳性细胞系，该细胞系来源于结直肠癌；其中Septin9、SDC2和MLH1基因靶序列区域甲基化均为阳性。
BRAF突变细胞系：采用A375作为BRAF突变阳性细胞系，该细胞系来源于结直肠癌，包含V600E突变。
KRAS突变细胞系：采用Aspc-1作为KRAS基因G12D突变阳性细胞系，SW480作为KRAS基因G12V突变阳性细胞系，DLD-1作为KRAS基因G13D突变阳性细胞系，其它四种突变型(G12S、G12R、G12C和G12A)采用人工合成的基因片段作为阳性对照品。
甲基化和突变阴性细胞系：采用H1299作为甲基化和突变的阴性细胞系，该细胞系来源于非小细胞肺癌，实施例中涉及的Septin9、SDC2和MLH1基因靶序列区域甲基化均为阴性，且不包含KRAS和BRAF基因突变。
方法1、受试者血浆中的游离DNA的提取
本实施例以结直肠癌患者的全血样本为例，经过提取，获得患者血浆中的游离DNA。游离DNA提取使用QIAamp MinElute ccfDNA Mini Kit(QIAGEN，货号55284)，提取方法包括如下步骤：
(1)使用水平转子，将10ml左右新鲜采集的EDTA抗凝全血4℃、1900g离心10分钟，将上清小心的转移到新的15ml锥形底离心管中；
(2)使用角转子，将上述上清4℃、16000g离心10分钟，进一步去除附着于细胞碎片上的核DNA；小心的转移4ml上清到新的15ml离心管中；
(3)加入600ul磁珠结合缓冲液、220ul蛋白酶K以及120ul磁珠，在室温下缓慢振荡孵育10分钟；
(4)瞬离以将管盖及管壁上的液体甩到管底；
(5)将离心管放置在磁力架上，直至液体澄清(至少1分钟)；弃上清；
(6)从磁力加上取下离心管，加入200ul磁珠洗脱缓冲液，漩涡震荡重悬磁珠，用移液器将黏附于离心管管壁上的磁珠冲洗下去；
(7)将所有液体连同磁珠转移到磁珠洗脱管中，室温下300rpm振荡孵育5分钟；
(8)将上述磁珠洗脱管放置在适配2ml离心管的磁力架上，直至液体澄清(至少1分钟)；
(9)将上清小心转移至新的磁珠洗脱离心管中，不带出任何磁珠；加入300ul ACB缓冲液，漩涡震荡混匀并瞬离；
(10)取一个UCP MiniElute纯化柱，套在2ml离心管中；将上清转移至纯化柱中，6000g离心1min，弃废液；
(11)向纯化柱中加入500ul ACW2缓冲液，6000g离心1min，弃废液；
(12)将纯化柱转入一个新的2ml离心管中，20000g以上离心3min；
(13)将纯化柱转入一个新的1.5ml洗脱管中，开盖56℃孵育3min，以使纯化柱底部的膜完全干燥；
(14)加50ul洗脱液至膜上，盖上管盖，室温放置1min后，20000g以上离心1min以洗脱游离DNA。
根据上述，获得受试者血浆中的游离DNA样本。
方法2、受试者DNA的亚硫酸盐转化
使用甲基化检测样本前处理试剂盒(基因科技(上海)股份有限公司，沪闵械备20220053)，对实施例1提取的结直肠癌患者游离DNA进行亚硫酸盐转化处理并纯化：
(1)取30μL上述提取好的游离DNA至PCR反应管中；同时取阴性对照和阳性对照各30μL至相应的对照管中，与待测样本同步处理；
(2)向样品及对照管中分别加入60μL转化液A(含亚硫酸盐溶液)及10μL转化液B(含转化保护剂)，漩涡震荡混匀，短时离心将反应液收集至管底；
(3)将反应管置于PCR仪中，95℃温浴5分钟，60℃温浴1小时，重复5个循环(总反应时间约为5.5小时)，反应结束后20℃温浴保存；
(4)取出反应管，将100μL转化产物转移至1.5mL离心管中；
(5)加入330μL MB结合缓冲液和1μL Carrier RNA，振荡混匀；
(6)向离心管中再加入270μL无水乙醇，振荡混匀；
(7)将纯化柱B套入2ml离心管；将上述溶液全部转入纯化柱B中，8000rpm离心1min，弃废液；
(8)加500μL洗涤液B至纯化柱B中，8000rpm离心1min，弃废液；
(9)加500μL脱硫液至纯化柱B中，室温放置15min后，8000rpm离心1min，弃废液；
(10)再加500μL洗涤液B至纯化柱B中，8000rpm离心1min，弃废液；
(11)将纯化柱B转入新的2ml离心管中，13000rpm离心1min，去除残留溶液；
(12)将纯化柱B转入新的1.5mL离心管中，加30μL DNA洗脱液至滤膜的中央，室温放置3min。
(13)8000rpm离心1min，所得溶液用于后续PCR扩增，或贮存于-20℃备用。
根据上述，获得经亚硫酸盐转化的DNA样本。
实施例1、引物探针组合筛选和验证-实时荧光定量PCR分别检测Septin9、SDC2和MLH1的甲基化水平，以及KRAS和BRAF的突变
以实时荧光定量PCR为手段，检测各个甲基化生物标志物基因的甲基化水平，以及突变生物标志物基因的突变状态，以筛选和验证本方法的各引物探针组合。
经过筛选及分析，发明人确定以Septin9、SDC2和MLH1作为甲基化生物标志物基因；以KRAS和BRAF作为突变生物标志物基因，所检测的KRAS突变位点包括KRAS基因第二外显子第12及13号密码子突变G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D；BRAF突变位点为BRAF基因第十五外显子第600号密码子突变V600E；内控基因为GAPDH。
本发明人的实验研究分析发现，由于所检测的甲基化生物标志物基因Septin9、SDC2和MLH1均涉及多个甲基化位点，KRAS及BRAF基因的突变检测亦可有多种引物和探针设计，不同的引物探针组合在扩增效率等性能上存在差异，而这些差异在进行多重检测时会影响检测效果。
因此，本发明人设计了多组引物和探针组合，使用相对应的基因甲基化阳性细胞系、突变阳性细胞系(包括人工合成KRAS突变型片段)和(或)甲基化和突变阴性的细胞系中提取并经亚硫酸盐转化后的DNA作为模板，对所涉及的多组引物和探针组合的性能进行了评估验证，最终筛选出的针对相应基因甲基化和变变的检测靶区域如下：
Septin9甲基化水平检测的靶区域(SEQ ID NO:1；人源；74bp；chr17:77,373,411-77,373,484；甲基化CG位点以下划线标示(下同))：
CGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTG
SDC2甲基化水平检测的靶区域(SEQ ID NO:2；人源；72bp；chr8:96,494,117-96,494,188)：
CCCGAGCCCCGAGCCCGAGTCCCCGAGCCTGAGCCGCAATCGCTGCGGTACTCTGCTCCGGATTCGTGTGCG
MLH1甲基化水平检测的靶区域(SEQ ID NO:3；人源；94bp；chr3:36,993,262-36,993,355)：
CGAACCAATAGGAAGAGCGGACAGCGATCTCTAACGCGCAAGCGCATATCCTTCTAGGTAGCGGGCAGTAGCCGCTTCAGGGAGGGACGAAGAG
KRAS突变检测的靶区域(SEQ ID NO:4；人源；96bp；下划线区为对应G12和G13的密码子)：
CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATC
BRAF突变检测的靶区域(SEQ ID NO:5；人源；92bp；下划线区为对应V600的密码子)：
TAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATG
GAPDH检测的靶区域(SEQ ID NO:6；人源；121bp)：
GCTCTGGGTGGTCATTGTGAAAAGCCCGCACCAACCATGCCAGTGGCAGCCAGACGAGGACACAGCCTGGCTCTGGGTCCCAGCAGGAAAGGCAATCCCAGAAAGGCAGGGTCAGGGACTG
筛选出的引物探针组合汇总如表1(其中，-F表示正向扩增引物，-R表示反向扩增引物，-P表示探针)。
表1
采用梯度稀释的SW48样本DNA，经亚硫酸盐转化后，分别扩增Septin9和SDC2目标基因片段。
扩增体系：1×PCR缓冲液，0.4mM dNTPs，0.4mM引物，0.2uM探针，1U Taq酶，0.1ng-100ng经亚硫酸盐转化处理的DNA。
扩增条件：第一阶段95℃3分钟；第二阶段95℃15秒，60℃60秒，45个循环。
结果显示，低至0.1ng的DNA样本可以稳定获得特异性的荧光扩增信号(图1和图2)，表明筛选出的引物和探针组合对目标基因片段具有极高的扩增效率。
同时，本发明筛选出的用于甲基化和突变检测的引物和探针组合具有扩增片段短(＜100bp)，扩增效率高(E＞90％)的优点，这对于提高血液样本中甲基化和突变的检出率尤为重要。
实施例2、多重实时荧光定量PCR检测Septin9、SDC2和MLH1的甲基化水平，以及KRAS和BRAF的突变
本实施例中，以实时荧光定量PCR为例，基于实施例1所提供的检测靶点以及检测试剂，对多重实时荧光定量PCR反应体系进行测试和优化，确定多重扩增反应体系。
对SW48细胞系(Septin9、SDC2及MLH1甲基化均为阳性)DNA通过数字PCR方法进行精确定量。根据定量结果将细胞系DNA稀释，得到Septin9、SDC2及MLH1甲基化程度均高于检测限的甲基化阳性质控品(梯度样品)；该质控品不包含KRAS和BRAF基因突变。
对A375细胞系DNA通过数字PCR方法进行精确定量。根据定量结果将细胞系DNA稀释，得到BRAF基因V600E突变含量高于检测限的BRAF突变阳性质控品(梯度样品)；该质控品中Septin9基因呈甲基化阳性。
对Aspc-1细胞系DNA通过数字PCR方法进行精确定量。根据定量结果将细胞系DNA稀释，得到KRAS基因G12D突变含量高于检测限的KRAS突变阳性质控品(梯度样品)；该质控品中SDC2基因呈甲基化阳性。
使用提取自H1299细胞系的DNA作为Septin9、SDC2和MLH1甲基化阴性，以及KRAS和BRAF突变阴性质控品。
复合扩增反应-1：在一个反应体系(反应管)中，同时加入表1中Septin9、SDC2甲基化检测引物探针组，BRAF突变检测引物探针组，及内控基因引物探针组，并调整引物、探针、dNTP、Mg2+浓度等条件，分别扩增模板即经亚硫酸盐转化的甲基化阳性质控品、BRAF突变阳性质控品、KRAS突变阳性质控品、甲基化或突变阴性质控品。多重PCR反应体系如表2。
复合扩增反应-2：在一个反应体系(反应管)中，同时加入表1中的KRAS突变检测引物探针组，MLH1甲基化检测引物探针组，及内控基因引物探针组，并调整引物、探针、dNTP、Mg2+浓度等条件，分别扩增模板即经亚硫酸盐转化的甲基化阳性质控品、BRAF突变阳性质控品、KRAS突变阳性质控品、甲基化或突变阴性质控品。多重PCR反应体系如表3。
表2、复合扩增反应管1中反应体系各组分组成
表3、复合扩增反应管2中反应体系各组分组成
成分 工作浓度
10X PCR Buffer 1X
dNTPs 每种0.4mM
KRAS正向引物1 0.2uM
KRAS正向引物2 0.3uM
KRAS正向引物3 0.2uM
KRAS正向引物4 0.3uM
KRAS正向引物5 0.15uM
KRAS反向引物-2 0.4uM
KRAS探针 0.2uM
MLH1正向引物 0.4uM
MLH1反向引物 0.4uM
MLH1探针 0.2uM
内控基因GAPDH正向引物 0.3uM
内控基因GAPDH反向引物 0.3uM
内控基因GAPDH探针 0.15uM
Taq酶 1U
DNA模板(经亚硫酸盐处理) 10～20ng
反应体系总体积 30ul
利用复合扩增反应-1体系，扩增甲基化阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图3所示。
利用复合扩增反应-2体系，扩增甲基化阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图4所示。
利用复合扩增反应-1体系，扩增BRAF突变阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图5所示。
利用复合扩增反应-2体系，扩增BRAF突变阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图6所示。
利用复合扩增反应-1体系，扩增KRAS突变阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图7所示。
利用复合扩增反应-2体系，扩增KRAS突变阳性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图8所示。
利用复合扩增反应-1体系，扩增甲基化和突变阴性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图9所示。
利用复合扩增反应-2体系，扩增甲基化和突变阴性质控品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图10所示。
根据图3-图10的结果可见，本发明的标志物当结合应用实时荧光定量PCR检测时，结果稳定可靠，仅需要较少的PCR循环数即可实现灵敏的检测，PCR阳性曲线起跳早，耗时短。即使针对多个靶检测区段的多组检测试剂在同一混合体系中，可实现互相无交叉干扰、保持很高的特异性和灵敏性。
对于甲基化水平检测的组，发明人经反复筛选和实验研究，与相应基因的全长/长片段相比、所指定的区段短而精简，但是检测效果却非常理想，这是令人出乎意料的。
实施例3、所述方法/试剂盒检测结直肠癌的灵敏度与特异性验证
本实施例使用实施例2中的Septin9、SDC2和MLH1甲基化与KRAS和BRAF突变联合检测体系，对临床收集的结直肠癌及非结直肠癌患者血浆进行了检测，以确定本发明所述方法及试剂盒用于结直肠癌辅助诊断和筛查的灵敏度及特异性。
共纳入病理确诊的结直肠癌病例87例(病例组)。其中男性52例(59.77％)，女性35例(40.23％)，平均年龄63岁(41-82岁)。按TNM分型分，包括早期(0-II期)病例44例(50.57％)，中期(III期)病例23例(26.44％)，晚期(IV期)病例20例(22.99％)。其中79例为腺癌(90.80％)。
同时，纳入健康及良性肺病病例45例(对照组)，包括：健康人(肠镜显示无明显病变，且无任何癌症史)17例，良性肠病(病理诊断为良性息肉，或临床诊断为肠炎等)28例。对照组性别比、年龄分布与病例组相当。
采集到的病例组及对照组患者的全血，按照前述方法1所述进行处理并提取游离DNA，按照方法2所述对提取得到的游离DNA进行亚硫酸盐转化，以经亚硫酸盐转化的DNA为模板，按照实施例2所述多重甲基化及突变检测扩增体系检测生物标志物基因Septin9、SDC2和MLH1的甲基化状态，以及生物标志物基因KRAS和BRAF的突变状态。任一生物标志物基因存在甲基化或突变，该病例即判为阳性；所有生物标志物基因均为非甲基化或野生型，该病例方判为阴性。
根据检测结果，统计每个生物标志物基因、甲基化生物标志物基因Septin9、SDC2和MLH1组合、突变生物标志物KRAS和BRAF组合、以及甲基化与突变组合的灵敏度、特异性及约登指数。
灵敏度、特异性及约登指数的统计结果如表4。
表4
根据表4可见，甲基化生物标志物基因Septin9、SDC2和MLH1组合联合突变生物标志物KRAS和BRAF组合可以极为显著地提高结直肠癌临床诊断的检测性能。
在检测灵敏度方面，单个甲基化指标表现最好的是Septin9(71.26％)，单个突变指标表现最好的是KRAS(39.08％)，而本发明中甲基化和突变联合检测的灵敏度高达93.10％。
在检测特异性方面，尽管MLH1和BRAF单独检测的特异性可以达到100％，但其灵敏度均在14％以下，单独使用的临床价值极低。
采用约登指数(灵敏度+特异性-1)来综合评价联合检测的临床应用价值，结果显示本发明的甲基化和突变组合的约登指数高达0.82，显著优于单个指标或其它组合的表现。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (9)

1.特异性检测甲基化标志物和点突变标志物的检测试剂在制备检测结直肠癌的试剂盒中的用途，所述检测试剂是以血浆或血清为待测样本的试剂；其中，
(1)所述甲基化标志物为Septin9、SDC2和MLH1的片段；其中，所述Septin9片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述SDC2片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述MLH1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；所述检测试剂为检测待测样本中所述甲基化标志物的甲基化水平的试剂，Septin9片段的甲基化水平检测试剂为SEQ ID NO: 7～8所示的引物对和SEQ ID NO: 9所示的探针，SDC2片段的甲基化水平检测试剂为SEQ ID NO: 10～11所示的引物对和SEQ ID NO: 12所示的探针，MLH1片段的甲基化水平检测试剂为SEQ IDNO: 13～14所示的引物对和SEQ ID NO: 15所示的探针；
(2)所述点突变标志物为KRAS和BRAF的片段；其中，所述KRAS片段的核苷酸序列如SEQID NO: 4所示，所述BRAF片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，所述点突变为：KRAS的G12和G13突变，BRAF的V600突变；所述检测试剂为检测待测样本中所述点突变标志物的点突变存在情况的试剂， KRAS的G12和G13突变检测试剂为SEQ ID NO: 16～20所示的正向引物、SEQ ID NO: 21所示的反向引物和SEQ ID NO: 22所示的探针，BRAF的V600突变检测试剂为SEQ ID NO: 23～24所示的引物对和SEQ ID NO: 25所示的探针；
其中，所述甲基化和突变标志物以亚硫酸盐转化产物为模板进行PCR扩增和检测；(1)和(2)中所述的检测试剂合并使用，进行多重检测。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂还包括内控基因的检测试剂，所述内控基因为GAPDH或ACTB。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，以SEQ ID NO: 26～27所示的引物对，SEQID NO: 28所示的探针作为所述内控基因的检测试剂。
4. 一种用于检测结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)特异性检测甲基化标志物的检测试剂，所述甲基化标志物为Septin9、SDC2和MLH1的片段；其中，所述Septin9片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述SDC2片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述MLH1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；所述检测试剂为检测待测样本中所述甲基化标志物的甲基化水平的试剂，Septin9片段的甲基化水平检测试剂为SEQ ID NO: 7～8所示的引物对和SEQ ID NO: 9所示的探针，SDC2片段的甲基化水平检测试剂为SEQ ID NO: 10～11所示的引物对和SEQ ID NO: 12所示的探针，MLH1片段的甲基化水平检测试剂为SEQ ID NO: 13～14所示的引物对和SEQ ID NO: 15所示的探针；和
(2)特异性检测点突变标志物KRAS和BRAF的检测试剂；其中，所述KRAS片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示，所述BRAF片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，所述点突变为：KRAS的G12和G13突变，BRAF的V600突变；所述检测试剂为检测待测样本中所述点突变标志物的点突变存在情况的试剂， KRAS的G12和G13突变检测试剂为SEQ ID NO: 16～20所示的正向引物、SEQ ID NO: 21所示的反向引物和SEQ ID NO: 22所示的探针，BRAF的V600突变检测试剂为SEQ ID NO: 23～24所示的引物对和SEQ ID NO: 25所示的探针；
使用时，(1)和(2)中所述的检测试剂合并使用，进行多重检测。
5.如权利要求4所述的检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内控基因的检测试剂，所述内控基因为GAPDH或ACTB。
6. 如权利要求5所述的检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述内控基因的检测试剂为：SEQ ID NO: 26～27所示的引物对，SEQ ID NO: 28所示的探针。
7.如权利要求4所述的检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂：
亚硫酸盐转化试剂，用于将核酸样本转化为适于甲基化水平检测的样本；
质控品；
核酸提取试剂；
DNA扩增试剂。
8.如权利要求7所述的检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述亚硫酸盐转化试剂包括：亚硫酸氢盐、偏重亚硫酸盐、重亚硫酸盐或其组合。
9. 如权利要求4所述的检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自下组的组件：
核酸序列分析软件；和/或
说明操作方法的使用说明书。
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