CN110484611B - 一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，由PCR扩增引物、质谱延伸引物、PCR反应缓冲液、dNTP Mix、MgCl2、Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、MassARRAY芯片等组成。本发明试剂盒能检测高苯丙氨酸血症45种热点基因变异位点，其中包括PAH基因39种变异位点，PTS基因6种变异位点，检测基因位点覆盖度高，高通量，用时短，低成本，高准确性。因此，该试剂盒应用潜力大。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，尤其涉及一种基于MassARRAY质谱平台的高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒。
背景技术
高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，HPA)是由于苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏或其辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏，导致血苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)增高的一组常见的氨基酸代谢病。PAH缺乏症和BH4缺乏症均为常染色体隐性遗传病。正常状况下，天然食物中的蛋白质分解产生的Phe在肝脏PAH的作用下转化成酪氨酸，PAH缺乏可导致HPA，旁路代谢增强，大量苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸从尿中排出。BH4是PAH、酪氨酸及色氨酸羟化酶的辅酶，BH4缺乏症是由于BH4代谢途径中5种酶中的1种缺乏导致的HPA及神经递质合成障碍，其中6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(6-pyruvoyl tetrahydropterinsynthase，PTPS)缺乏最多见，其次为二氢蝶啶还原酶(dihydropteridinereductase，DHPR)缺乏，鸟苷三磷酸环化水解酶(GTPcyclohydrolase，GTPCH)、墨蝶呤还原酶(sepiapterinreductase，SR)和蝶呤4-α-甲醇氨脱水酶(pterin-4α-carbinolamine dehydratase，PCD)缺乏较少见。据报道，我国256例BH4缺乏症患者中96％为PTPS缺乏，DHPR缺乏占2.4％。1985-2011年我国3500万新生儿筛查资料显示，HPA患病率为1：10397。国际资料报道，高加索人HPA病因中PAH缺乏症占98％，BH4缺乏症约2％。2000-2007年我国新生儿筛查资料显示，HPA中12.9％为BH4缺乏症，以PTPS缺乏最常见，并存在显著的地域差异，南部地区BH4缺乏症发病率较高，台湾发病率最高。
PAH缺乏症在新生儿期多无临床症状，出生3～4个月后逐渐表现典型苯丙酮尿症(PKU)的临床特点：头发由黑变黄，皮肤颜色浅淡，尿液、汗液鼠臭味，随着年龄增长，智能发育落后明显、小头畸形、癫痫发作(多表现为痉挛发作)，也可出现行为、性格、神经认知等异常，如多动、自残、攻击、自闭症、自卑、忧郁等。由于症状缺乏特异性，临床诊断困难，易被误诊为脑性瘫痪、癫痫等神经系统疾病，需要依靠生化分析进行病因诊断。BH4缺乏症患儿除表现PKU症状外，主要表现为躯干肌张力低下，四肢肌张力增高或低下，如吞咽困难、口水增多、松软、角弓反张等。
PAH缺乏症和BH4缺乏症的病因和发病机制明确，是一种可以治疗的遗传病，基因诊断是HPA的确诊方法。患儿通过早期诊断并采用饮食控制或药物治疗方法可有效阻断病程发展，有希望像正常孩子一样成长。因此，患儿的早期检出和治疗是非常必要的，通过对PAH和BH4相关基因检测进行疾病筛查和诊断是解决该问题的重要手段。现有的基因检测方法主要包括聚合酶链反应-变性凝胶梯度电泳(PCR-DGGE)，聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，聚合酶链-短重复序列多态分析(PCR-STR)，Sanger测序，高分辨率熔解曲线法，微型DNA芯片，二代测序技术等。以上技术应用于PAH缺乏症和BH4缺乏症基因检测，都难以使检测通量和成本达到有效的平衡，而且大部分方法都存在检测的基因位点有限，增加了漏检的可能性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，是一种基于MassARRAY质谱平台的高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒。
本发明的试剂盒，由PCR扩增引物、质谱延伸引物、10×PCR反应缓冲液、dNTP Mix(25mM)、MgCl2(25mM)、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlexTermination Mix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成，其中：PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.90所述；质谱延伸引物序列如SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.135所示。
所述的PCR扩增引物包含2管扩增引物混合物；所述的质谱延伸引物包含2管延伸引物混合物。
扩增引物混合物：第1管的扩增引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.46所示，第2管的扩增引物序列如SEQ ID NO.47～SEQ ID NO.90所示。
延伸引物混合物：第1管的延伸引物序列如SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.113所示，第2管的延伸引物序列如SEQ ID NO.114～SEQ ID NO.135所示。
本发明提供的一种基于MassARRAY质谱平台的高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，能检测45种HPA基因变异位点，包括如下步骤：
(1)设计扩增引物：本发明的扩增引物由SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.90组成。
(2)设计延伸引物：本发明的延伸引物由SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.135组成。
(3)检测模板的制备：提取待测样本DNA
(4)以步骤(3)中提取的DNA为模板，利用步骤(1)中的2管扩增引物混合物分别进行PCR扩增，获得靶序列的PCR产物。
(5)SAP酶处理，除去步骤(4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。
(6)以步骤(5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤(2)中的延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。
采用树脂纯化步骤(6)中获得的延伸产物。
采用飞行时间质谱基因分型系统对纯化产物进行扫描、检测，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果，通过质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否突变。
本发明试剂盒能检测苯丙酮尿症45种热点基因变异位点，其中包括PAH基因39种变异位点，PTS基因6种变异位点。通过使用如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.90所示的扩增产物进行扩增反应，接着消化反应，再使用如SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.135所示的延伸引物进行延伸反应，得到的产物经纯化后进行MassARRAY质谱平台分析。本发明试剂盒，检测基因位点覆盖度高，高通量，用时短，低成本，高准确性。因此，该试剂盒应用潜力大，实用性强。本方法能检测45种HPA的热点基因变异位点，包括PAH基因39种变异位点，PTS基因6种变异位点，基因检测位点的高覆盖度有利于提升疾病筛查的检出率。基于MassARRAY质谱平台的检测技术可同时检测多种突变位点，实验设计灵活，检测方法简便，可提高疾病的检出率，同时还具有高通量、低成本的特点。
附图说明
图1表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6252.1Da的G峰位置和6236.1Da的A峰位置，此数据表明该样本为纯合A，为PAH c.728G>A野生纯合型样本的质谱峰图结果。
图2表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6252.1Da的G峰位置和6236.1Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合，为PAH c.728G>A杂合型样本的质谱峰图结果。
图3表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6306.1Da的C峰位置和6381.0Da的T峰位置，此数据表明该样本为纯合，为PAH c.721C>T野生型纯合型样本的质谱峰图结果。
图4表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为为6306.1Da的C峰位置和6381.0Da的T峰位置，此数据表明该样本为杂合，为PAHc.721C>T杂合型样本的质谱峰图结果。
图5表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6385.2Da的C峰位置和6425.1Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合，为PAH c.1068C>A杂合型样本的质谱峰图结果。
图6表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5234.5Da的A峰位置和5290.4Da的T峰位置，此数据表明该样本为杂合，为PAH c.1197A>T杂合型样本的质谱峰图结果。
图7表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5584.6Da的G峰和5624.7Da的C峰位置，此数据表明该样本为杂合，为PAH c.1238G>C杂合型样本的质谱峰图结果。
图8表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为7549.0Da的del峰和7533.0Da的峰位置，此数据表明该样本为杂合，为PAH c.208_210del杂合型样本的质谱峰图结果。
图9表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6058.9Da的T峰和5978.9Da的C峰位置，此数据表明该样本为杂合，为PAH c.208T>C杂合型样本的质谱峰图结果。
图10表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5233.4Da的C峰和5313.4Da的T峰位置，此数据表明该样本为纯合，为PTS c.259C>T野生型纯合型样本的质谱峰图结果。
图11表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5233.4Da的C峰和5313.4Da的T峰位置，此数据表明该样本为杂合，为PTS c.259C>T杂合型样本的质谱峰图结果。
图12表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为8908.7Da的A峰和8828.8Da的G峰位置，此数据表明该样本为杂合，为PTS c.272A>G杂合型样本的质谱峰图结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
本发明的实施例提供了一种高苯丙氨酸血症基因检测的试剂盒。
1.引物设计
(1)PCR扩增引物
根据所选择的待检测的39种PAH和6种PTS基因突变型(具体的突变位点信息见表1)，设计出特异性针对每种PAH、PTS基因突变型的PCR扩增引物，PCR扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。共设计90条引物，45条正向，45条反向。
(2)延伸引物：
设计延伸引物，所述延伸引物长度为15-28个碱基，并且其3’端位于PAH/PTS基因突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为PAH/PTS基因突变位点。
表1：PAH(NM_000277.1)/PTS(NM_000317.2)基因突变位点信息
其中，上述符号“>”表示碱基突变。
实施例2检测模板的制备
应用Tiangen的干血斑基因组DNA提取试剂盒提取收集血样的基因组DNA，具体操作过程按说明书要求进行。
实施例3高苯丙氨酸血症基因检测
(1)以实施例2中提取的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.90中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表2，其中，所用试剂购自Agena Bioscience公司。PCR扩增反应条件见表3。
表2：PCR扩增反应体系
表3：PCR扩增反应条件
(2)通过SAP酶处理，除去步骤(1)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。SAP酶反应体系见表4。所用试剂购自Agena Bioscience公司。SAP反应条件见表5。
表4：SAP酶反应体系
| 试剂 | 体积(ul)/反应 |
| 水 | 1.53 |
| SAP反应缓冲液 | 0.17 |
| SAP酶 | 0.3 |
| 步骤(1)中获得PCR扩增产物 | 5.0 |
| 总体积 | 7.0 |
表5：SAP反应条件
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | 40min |
| 85℃ | 5min |
| 4℃ | Hold |
(3)以步骤(2)中获得的扩增产物为模板，使用实施例1中的延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端链接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系见表6。所用试剂购自Agena Bioscience公司。延伸反应条件见表7。
表6：延伸反应体系
| 试剂 | 体积(ul)/反应 |
| 水 | 0.659 |
| iPlex反应缓冲液 | 0.2 |
| iPlex Termination Mix | 0.2 |
| PCR延伸引物混合物 | 0.9 |
| Extension反应Taq酶 | 0.041 |
| 步骤(2)中获得PCR扩增产物 | 7.0 |
| 总体积 | 9.0 |
表7：延伸反应条件
(4)采用树脂resin纯化步骤(3)中获得延伸产物，去除干扰离子。
在延伸产物中加入20ul水和6mg洁净干燥的树脂，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触。4000rpm离心5min使树脂沉入孔底部，上清可直接用于质谱检测。
(5)芯片点样
启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
(6)质谱分析
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果。
(7)检测结果
图2为1例PAH c.728G>A杂合突变样本的检测结果，图1为其阴性对照，该位点野生型A的分子量为6236.1Da，突变型G的分子量6252.1Da；图4为1例PAH c.721C>T杂合突变样本的检测结果，图3为其阴性对照，该位点野生型T碱基的分子量为6381.0Da，突变型C分子量6306.1Da的。图5为1例PAH c.1068C>A杂合型样本，突变型C分子量6385.2Da；图6为1例PAH c.1197A>T杂合型样本，突变型A分子量5234.5Da；图7为1例PAH c.1238G>C杂合型样本，突变型G分子量5584.6Da；图8为1例PAH c.208_210del杂合型样本，该位点缺失型分子量为7549.0Da；图9为1例PAH c.208T>C杂合型样本，突变型T的分子量6058.9Da；图10为1例PTS c.259C>T野生型纯合型样本，该位点野生型T的分子量5313.4Da；图11为1例PTSc.259C>T杂合型样本，该位点突变型T的分子量5313.4Da；图12为1例PTS c.272A>G杂合型样本，突变位点A的分子量8908.7Da。
以上所述的实验结果，仅为表示本发明的PAH/PTS基因的突变位点的检测方法实际应用的效果，因此不应以此实验结果限制本发明的范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒
<160> 136
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
<400> 1
acgttggatg gccttgaaaa atcaggtgtc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
<400> 2
acgttggatg cggtagttgt aggcaatgtc 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
<400> 3
acgttggatg ggaaaagatg gcgctcattg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
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<211> 30
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<211> 30
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<211> 30
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acgttggatg tgttcaagac tctgaagtcc 30
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acgttggatg gagtgtgctc tcagattgac 30
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<211> 30
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acgttggatg gcctttatgg agtctccttg 30
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acgttggatg cttttcatcc cagcttgcac 30
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<211> 30
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acgttggatg aaaactgggc aaagctgcga 30
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<211> 30
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<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
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acacgttgga tgatcctttg ggtgtatggg tc 32
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acgttggatg ttccgtcttg cacggtacac 30
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<212> DNA
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acgttggatg ttgtcaccac ctcaccttac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
<400> 34
acgttggatg ccaaaattac actgtcacgg 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
<400> 35
acgttggatg tgaaaagtac tgtggcttcc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
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acgttggatg atgtggactt actctgcagg 30
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acgttggatg tgtgtgcagt ggaagactcg 30
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<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
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<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
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acgttggatg ctaagtgatg aagaaaactt g 31
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
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acgttggatg tgaagggctg aaatgtcatc 30
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<212> DNA
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acgttggatg attacactgt cacggagttc 30
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<212> DNA
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acgttggatg ctttcttctt ttcatcccag c 31
<210> 50
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<212> DNA
<213> 人工合成(Unknown)
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<400> 58
acgttggatg gtcttaggaa ctttgctgcc 30
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<211> 30
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acgttggatg tggaagccac agtacttttc 30
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<400> 70
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acgttggatg cggtagttgt aggcaatgtc 30
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<211> 30
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<400> 72
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<211> 30
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<400> 136
acgttggatg ccaaaattac actgtcacgg 30
Claims (1)
1.一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，其特征在于：由PCR扩增引物、质谱延伸引物、10×PCR反应缓冲液、dNTP Mix、MgCl2、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlex Termination Mix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成，其中： PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.90所示，质谱延伸引物序列如SEQ ID NO.91～SEQID NO.135所示；
所述的PCR扩增引物包含2管扩增引物混合物；所述的延伸引物包含2管延伸引物混合物；
扩增引物混合物：第1管的扩增引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO. 46所示，第2管的扩增引物序列如SEQ ID NO.47～SEQ ID NO. 90所示；
延伸引物混合物：第1管的延伸引物序列如SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.113所示，第2管的延伸引物序列如SEQ ID NO.114～SEQ ID NO.135所示。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201910429571.XA CN110484611B (zh) | 2019-05-22 | 2019-05-22 | 一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN201910429571.XA CN110484611B (zh) | 2019-05-22 | 2019-05-22 | 一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒 |
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Family
ID=68545844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (1)
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105755109A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-07-13 | 苏州市立医院 | 一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒 |
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2019
- 2019-05-22 CN CN201910429571.XA patent/CN110484611B/zh active Active
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Phenylketonuria mutations in Northern China;Fang Song等;《Molecular Genetics and Metabolism》;20051026;第86卷(第2005期);第107-118页 * |
| 西北地区苯丙酮尿症患者PAH基因突变谱分析及无创产前诊断的初步研究;闫有圣;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20171115;表1.10及第2.3.3.2-2.3.3.7部分 * |
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