KR20120125164A

KR20120125164A - Ｅｇｆｒ 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 그 용도

Info

Publication number: KR20120125164A
Application number: KR1020120045309A
Authority: KR
Inventors: 아키 이구치
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2011-05-06
Filing date: 2012-04-30
Publication date: 2012-11-14
Also published as: US20120282610A1; KR101669089B1; JP2012249630A; CN102776276B; EP2520666A1; CN102776276A; JP5930825B2; EP2520666B1; US8748590B2

Abstract

[과제] EGFR 엑손 19의 다형을 간편 또한 고감도로 검출 가능한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 그 용도를 제공한다.
[해결수단] 하기 (P1) 또는 (P1')인 EGFR 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드: (P1) 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 115번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 9?80의 염기 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드; (P1') 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 115번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 9?80의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드; 및, 그 용도.

Description

ＥＧＦＲ 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 그 용도{OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION TEST OF POLYMORPHISM OF EGFR EXON 19 AND USE THEREOF}

본 발명은, EGFR 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 그 용도에 관한 것이다.

상피 증식 인자 리셉터(EGFR)는, 폐암에 있어서 중요한 역할을 한다고 여겨지고 있으며, EGFR의 기능 억제를 목적으로 하는 약제가, 폐암 치료의 분야에서 사용되고 있다. 이러한 약제로서는, 비소세포(非小細胞) 폐암 환자의 치료에 사용되고 있는 게피티니브 또는 에를로티니브 등의 EGFR 티로신키나제 저해제가 알려져 있으며, 이들의 약제에 대해서는, 폐암 외에 선암(腺癌)에의 적용이 시험되고 있다. 그러나, 어느 범위의 환자에게는, EGFR 티로신키나제 저해제의 효과가 충분히 얻어지지 않는 일이 있다. 또한 다른 범위의 환자에게는, EGFR 티로신키나제 저해제에 대해서 초기에는 반응이 있지만, 점차 약제의 효과가 기대된 이상으로 오르지 않게 되는 일이 있다.

이 때문에, EGFR 티로신키나제 저해제를 사용할 때에, 그 효과를 예측하기 위해 예측 인자의 탐색이 시도되어, EGFR 유전자 변이가 중요한 인자인 것을 알아내게 되었다(비특허문헌1, 2).

약제의 감수성에 관련하는 변이로서는, 예를 들면, EGFR 유전자의 790번째 및 858번째에 있어서의 치환 변이, EGFR 유전자의 엑손 19에 있어서의 결실 변이 등이 알려져 있다(비특허문헌1, 2). 특히, 상기 EGFR 유전자의 엑손 19에 있어서의 결실 변이는, 상기 엑손 19에 있어서, 연속한 수염기?십수염기가 결실한 복수의 변이형이 알려져 있다.

한편, 최근, 유전자 다형을 검출하는 검출 시험으로서, 융해 곡선 분석(Tm 분석)을 이용한 검출이 행해지고 있다. 이 방법에서는, 변이를 포함하는 영역을 PCR법으로 증폭한 후, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 염기 서열의 변이를 해석한다(예를 들면, 특허문헌1 참조).

또한, 간편하고, 감도와 신뢰성이 뛰어난 다형 검출 방법으로서는, 변이형 프라이머와 야생형(정상형) 프라이머를 동일한 반응계에서 사용하고, 변이형 염기를 갖는 핵산 서열을 우선적으로 증폭시키는 것을 포함하는 다형 검출 방법이 알려져 있다(특허문헌2 참조).

일본 특개2002-119291호 공보 국제 공개 제2010/001969호 팸플릿

PLoS Medicine, 2005년, Vol.2, No.3, p.225-235 Journal of Clinical Oncology, 2005년, Vol.23, No.11, p.2513-2520

그러나, EGFR 엑손 19의 변이에는, 상술과 같이 다양한 변이가 존재하고 있다. 이 때문에, 각각의 변이에 대한 프라이머를 사용하는 검출 시험에서는, 변이형 특이적인 프라이머를 반응액 중에 다수 포함시킬 필요가 있다. 다수의 프라이머를 제작하는 것은, 설계가 복잡화할 가능성이 있으며, 또한, 복수의 프라이머를 동시에 사용하는 것은 PCR 반응 그 자체 진행하지 않게 될 가능성이 있다. 또한, 복수의 변이가 존재하는 경우에는, 충분한 비율로 변이가 포함되어 있지 않으면 검출할 수 없는 경우가 있다.

따라서 본 발명은, EGFR 엑손 19의 다형을 검출하는 검출 시험에 있어서 당해 다형을 간편하고 감도 좋게 검출하기 위해 유용한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 그 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 이하와 같다.

[1] 하기 (P1) 및 (P')로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종인 EGFR 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드:

(P1) 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 115번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 9?80의 염기 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

(P1') 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 115번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 9?80의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드.

[2] EGFR 엑손 19의 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 하기 (P2) 및 (P2')로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종인 [1]에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드:

(P2) 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 104번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 20?80의 염기 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드;

(P2') 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 104번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 20?80의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드.

[3] 상기 (P2) 또는 (P2')의 올리고뉴클레오티드는, 상기 104번째의 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어 1?3번째의 위치에 갖는 [2]에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.

[4] 상기 (P2) 또는 (P2')의 올리고뉴클레오티드는, 상기 104번째의 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖는 [2]에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.

[5] 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 25?50인 [1]?[4] 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.

[6] 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 26?42인 [1]?[4] 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.

[7] 상기 3' 말단측의 신장 저해 처리가 인산기의 부가인 [1]?[6] 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.

[8] 상기 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소에 의해 표지되어 있는 염기를 포함하는, [1]?[7] 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.

[9] [1]?[8] 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 적어도 1종 사용하여 EGFR 엑손 19의 다형을 검출하는 것을 포함하는 EGFR 엑손 19의 다형을 검출하는 다형 검출 방법.

[10] 서열 번호1에 나타내는 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산을 포함할 수 있는 핵산 시료를 준비하는 것, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 당해 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 당해 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 당해 1본쇄 핵산을 포함하고 또한 당해 1본쇄 핵산의 핵산 증폭이 억제되는 하이브리드를 얻는 것, 당해 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 당해 1본 핵산의 접촉시 또는 접촉 후의 상기 핵산 시료에 대해서 핵산 증폭을 행하는 것을 포함하는 [9]에 기재된 다형 검출 방법.

[11] 상기 핵산 증폭을, 표적으로 하는 EGFR 엑손 19의 다형 부위를 포함하는 핵산에 하이브리다이즈 가능한 프로브의 존재 하에서 행하는 [10]에 기재된 다형 검출 방법.

[12] 상기 프로브가, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기 서열에 대해서 45% 이상의 동일성을 갖는 [11]에 기재된 다형 검출 방법.

[13] 상기 프로브가, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때에 형광을 발하고, 당해 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는 프로브인 [11] 또는 [12]에 기재된 다형 검출 방법.

[14] [9]?[13] 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 방법에 의해 EGFR 엑손 19에 있어서의 다형을 검출하는 것, 및, 상기 검출 결과에 의거하여 EGFR 티로신키나제 저해제에 대한 내성 또는 EGFR 티로신키나제 저해제의 약효를 판정하는 것을 포함하는 EGFR 티로신키나제 저해제의 약효 판정 방법.

[15] 적어도 1종의 [1]?[8] 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 포함하는 EGFR 다형 검출 시험용 시약 키트.

[16] 표적으로 하는 EGFR 엑손 19의 다형 부위를 포함하는 핵산 서열에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 더 포함하는 [15]에 기재된 EGFR 다형 검출 시험용 시약 키트.

[17] 상기 프로브가, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기 서열에 대해서 45% 이상의 동일성을 갖는 [16]에 기재된 EGFR 다형 검출 시험용 시약 키트.

[18] 상기 표적으로 하는 EGFR 엑손 19 다형 부위를 포함하는 핵산 서열을 증폭 가능한 프라이머 세트를 더 포함하는 [15]?[17]의 어느 하나에 기재된 EGFR 다형 검출 시험용 시약 키트.

본 발명에 의하면, EGFR 엑손 19의 다형을 검출하는 검출 시험에 있어서 당해 다형을 간편하고 감도 좋게 검출하기 위해 유용한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 그 용도를 제공할 수 있다.

[도 1] (A)는, 핵산 혼합물의 융해 곡선의 일례이며, (B)는 미분 융해 곡선의 일례.
[도 2] (A)?(D)는, 본 발명의 실시예1에 관한 시료의 융해 곡선.
[도 3] (A)?(D)는, 본 발명의 실시예2에 관한 시료의 융해 곡선.
[도 4] (A)?(D)는, 본 발명의 실시예3에 관한 시료의 융해 곡선.
[도 5] (A)?(D)는, 본 발명의 비교예1에 관한 시료의 융해 곡선.
[도 6] (A) 및 (B)는, 본 발명의 비교예2에 관한 시료의 융해 곡선.
[도 7] (A)?(D)는, 본 발명의 비교예3에 관한 시료의 융해 곡선.
[도 8] (A) 및 (B)는, 본 발명의 비교예4에 관한 시료의 융해 곡선.
[도 9] (A)?(E)는, 본 발명의 실시예4에 관한 시료A?E의 융해 곡선.
[도 10] (A)?(E)는, 본 발명의 실시예4에 관한 시료F?J의 융해 곡선.
[도 11] (A)?(E)는, 본 발명의 실시예5 및 비교예5에 관한 시료5-1?5-5의 융해 곡선.

본 발명에 관한 EGFR 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드(이하, 단지 「다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드」라고 하는 일이 있다)는, 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 115번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 9?80의 염기 서열과 동일 염기길이이며 또한 상동적인 서열인 올리고뉴클레오티드, 즉, 하기 (P1) 및 (P')로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종인 EGFR 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명에 관한 다형 검출 시험용 시약 세트는, 상기 EGFR 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이다.

본 발명에 관한 EGFR 유전자 다형 검출 방법은, 상기 EGFR 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 적어도 1종 사용하여 EGFR 엑손 19의 다형을 검출하는 것을 포함하는 방법이다.

본 발명에 관한 EGFR 티로신키나제 저해제의 약효 판정 방법은, 상기 EGFR 엑손 19 다형 검출 방법에 의해 EGFR 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 것, 및 상기 검출 결과에 의거하여 EGFR 티로신키나제 저해제에 대한 내성 또는 EGFR 티로신키나제 저해제의 약효를 판정하는 것을 포함하는 방법이다.

본 발명에 의하면, 서열 번호1에 나타내는 EGFR 유전자의 특정한 일부와 동일한 염기길이이며, 또한 상동적인 염기 서열, 즉, 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 및/또는 당해 특정의 일부의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈 가능한 서열을 갖고, 3' 말단측이 신장 저해 처리된 올리고뉴클레오티드가, 다형을 포함할 수 있는 야생형 EGFR 엑손 19의 염기 서열의 당해 일부분에 높은 친화성을 가지므로, 변이형 EGFR 엑손 19의 핵산보다도 야생형 EGFR 엑손 19의 핵산에 우선적으로 또한 강고하게 하이브리다이즈한다. 또한, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, 3' 말단측이 신장 저해 처리되어 있으므로, 야생형 EGFR 유전자의 핵산에 하이브리다이즈한 후, DNA 폴리머라제를 적용해도 신장하지 않는다.

상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, EGFR 엑손 19 다형 검출 시험에 바람직하게 사용되는 올리고뉴클레오티드이다. 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 EGFR 유전자 다형 검출 시험에 사용했을 경우, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, 그 유사성의 높음에 기인하여 야생형 EGFR 유전자 핵산에 하이브리다이즈한다. 하이브리다이즈한 야생형 EGFR 유전자 핵산과, 당해 하이브리다이즈한 영역에 대응하는 영역 내에 결손이나 1염기 다형을 포함하는 변이형(다형) EGFR 유전자 핵산이 혼재하는 환경 하에서, 핵산 증폭 등의 처리를 행했을 경우에, 야생형 유전자의 핵산 서열의 증폭은, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 존재에 의해 억제된다. 한편, 변이형 EGFR 유전자의 핵산 서열에는, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하고 있지 않기 때문에, 변이형 EGFR 유전자의 핵산 증폭이 억제되지 않고, 변이형 EGFR 유전자의 핵산 서열이 우위로 증폭한다. 이 결과, 시료 중에, 변이형 EGFR 유전자의 핵산 서열이 야생형 EGFR 유전자의 핵산 서열보다도 많이 존재하는 것에 의해, EGFR 엑손 19의 다형을 감도 좋게 검출할 수 있다. 또, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈 가능한 야생형 EGFR 유전자 핵산은, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 상보적인 서열을 갖는 핵산이다.

또한, 본 발명에 의하면, 이와 같이 EGFR 엑손 19의 다형을 간편하고 감도 좋게 검출할 수 있으므로, EGFR 엑손 19 다형에 의거하는 EGFR 티로신키나제 저해제에 대한 내성 또는 EGFR 티로신키나제 저해제의 약효를 간편 또한 감도 좋게 판정할 수 있다.

본 발명에 있어서의 「EGFR 유전자」란, 구체적으로는 EGFR 엑손 19를 의미한다. 본 발명에 있어서의 EGFR 엑손 19는, 이미 공지이며, 그 염기 서열은, NCBI 액세션 No.NT_033968(버전: NT_033968.6)의 4831717?4832003의 서열을 의미한다. 서열 번호1의 염기 서열은, EGFR 엑손 19의 핵산의 염기 서열의 일부에 상당한다.

본 명세서에서는, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈할 수 있는 야생형 EGFR 유전자의 염기 서열의 영역을, 특별히 「증폭 억제 표적 영역」이라고 한다.

본 명세서에 있어서, 검출 대상이 되는 EGFR 유전자의 다형에는, 야생형 EGFR 유전자가 대응하는 서열에 있어서, 복수의 연속한 염기로 구성되는 영역이 결손하는 다형을 포함하고, 검출 가능한 한, 염기가 1개 결손하는 다형, 염기가 1개 또는 2개 이상 연속하여 다른 염기로 치환하는 다형을 포함해도 된다. 또, 본 발명에 있어서의 검출 대상이 되는 EGFR 유전자의 다형은, 증폭 억제 표적 영역을 그 일부에 포함하는 한, 동시에 2개 이상의 다형을 포함하는 것이어도 된다.

본 발명에 있어서, 「다형 검출 시험」이란, 특정한 유전자 다형을 검출하기 위해 사용할 수 있는 시험을 의미하고, 시험, 어세이, 검출 방법, 평가 방법, 판정 방법 등의 표현에 상관없이, 핵산 시료 중의 핵산에, 다형을 갖는 변이형이 포함되어 있는지 아닌지를 판정하는 것을 포함하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 검출 대상이 되는 시료 중의 시료 핵산, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브의 개개의 서열에 관하여, 이들 서로의 상보적인 관계에 의거하여 기술된 사항은, 특별히 언급하지 않는 한, 각각의 서열과, 각 서열에 대해서 상보적인 서열에 대해서도 적용된다. 각 서열에 대해서 상보적인 당해 서열에 대해서 본 발명의 사항을 적용할 때에는, 당해 상보적인 서열이 인식하는 서열은, 당업자에 있어서의 기술 상식의 범위 내에서, 대응하는 본 명세서에 기재된 서열에 상보적인 서열로, 명세서 전체를 바꿔 읽는 것으로 한다.

본 명세서에 있어서 「주형 핵산 서열」이란, 핵산 증폭을 행할 때에 프라이머가 주형으로서 인식하여 어닐링하는 염기 서열을 의미한다.

본 발명에 있어서, 「Tm값」이란, 2본쇄 핵산이 해리하는 온도(해리 온도 : Tm)이며, 일반적으로, 260㎚에 있어서의 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다. 즉, 2본쇄 핵산, 예를 들면, 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이는, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어지고, 1본쇄 DNA에 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 의해 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. Tm값은, 이 현상에 의거해 설정된다. 본 발명에 있어서의 Tm값은, 특별히 언급하지 않는 한, 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도를 말한다.

본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 서열에 관하여 「3' 말단으로부터 세어 1?3번째」라고 하는 경우는, 올리고뉴클레오티드쇄의 3' 말단을 1번째로서 센다. 마찬가지로 「5' 말단으로부터 세어 1?3번째」라고 하는 경우는, 올리고뉴클레오티드쇄의 5' 말단을 1번째로서 센다.

본 명세서에 있어서 「공정」이라는 말은, 독립한 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우에 있어서도 본 공정의 소기의 작용이 달성되면, 본 용어에 포함된다.

또한, 본 명세서에 있어서 「?」을 사용하여 나타낸 수치 범위는, 「?」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.

또한, 본 발명에 있어서, 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재하는 경우에는, 특별히 언급하지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수의 물질의 합계량을 의미한다.

이하, 본 발명에 관하여 설명한다.

<다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드>

상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, 하기 (P1) 및 (P')로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종인 EGFR 유전자 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드:

상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 115?123번째의 염기를 포함하는 소정 영역의 염기 서열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는, 또는 당해 소정 영역의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열인 것을 필요로 한다. 115번째?123번째의 염기를 포함하는 것에 의해, 예를 들면, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 115번째 이후에 하나 또는 복수의 염기의 결실을 갖는 다형을 감도 좋게 검출 가능하게 할 수 있다. 또 서열 번호1에 나타내는 115번째의 염기는, EGFR 엑손 19의 744번째의 코돈의 3'측의 염기에 해당한다.

상기 P1 올리고뉴클레오티드의 상기 소정 영역의 염기 서열에 대한 동일성은, 적어도 80% 이상인 것을 요한다. 또한, 검출 감도의 관점에서, 85% 이상으로 할 수 있고, 90% 이상으로 할 수 있고, 95% 이상으로 할 수 있고, 또한 96% 이상으로 할 수 있고, 97% 이상으로 할 수 있고, 98% 이상으로 할 수 있고, 99% 이상으로 할 수 있다.

상기 P1' 올리고뉴클레오티드는, 상기 서열 번호1에 나타내는 염기 서열 중 상기 소정 영역의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열이다.

하이브리다이제이션은, 공지의 방법 혹은 그에 준하는 방법, 예를 들면, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재된 방법 등에 따라서 행할 수 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다.

스트린젠트한 조건이란, 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 전형적인 스트린젠트한 조건이란, 예를 들면, 칼륨 농도는 약 25mM?약 50mM, 및 마그네슘 농도는 약 1.0mM?약 5.0mM 중에 있어서, 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있다. 본 발명의 조건의 일례로서 Tris-HCl(pH8.6), 25mM의 KCl, 및 1.5mM의 MgCl₂ 중에 있어서 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것이 아니다. 그 외, 스트린젠트한 조건으로서는, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재되어 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 당업자는, 하이브리다이제이션 반응이나, 하이브리다이제이션 반응액의 염농도 등을 변화시키는 것에 의해, 이러한 조건을 용이하게 선택할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 상기 P1 또는 상기 P1'의 올리고뉴클레오티드에는, 상기 P1 또는 상기 P1'의 올리고뉴클레오티드에 1개 또는 2개 이상의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드도 포함된다.

당해 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, 상기 P1 또는 상기 P1' 올리고뉴클레오티드와 동등 정도의 작용을 나타내면 되며, 1개 또는 2개 이상의 염기가 삽입, 결실 또는 치환되어 있을 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환의 위치는, 특별히 한정되지 않는다. 삽입, 결실 또는 치환한 염기의 수로서는 1염기 또는 2염기 이상을 들 수 있고, 형광 표지 올리고뉴클레오티드 전체의 길이에 따라 다르지만, 예를 들면 1염기?10염기, 1염기?5염기, 또는 1염기?3염기로 할 수 있다.

상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드가 갖는 염기 서열의 제1번째의 염기의 위치는, 서열 번호1의 115번째의 위치에 한정되지 않고, 예를 들면, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 60번째?115번째의 어느 염기로 해도 되며, 100번째?110번째의 어느 염기로 해도 되며, 102번째?106번째의 어느 염기로 해도 된다.

상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기길이는, 상기 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 115번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 9mer?80mer의 염기 서열과 동일하게 되는 9mer?80mer인 것을 요한다. 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 8mer 이하 또는 81mer 이상에서는, 목적으로 하는 검출의 감도를 기대할 수 없다. 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기길이는, 20mer?80mer로 해도 되며, 10mer?70mer로 해도 되며, 25mer?50mer로 해도 되며, 26mer?42mer로 해도 된다. 보다 짧은 염기길이의 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 보다 확실하게 야생형 핵산의 핵산 증폭을 억제하여, 검출 감도가 향상하는 경향이 있다.

이러한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드로서는, 예를 들면, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 제60?115번째의 어느 염기를 제1번째의 염기로 하는 10mer?80mer의 올리고뉴클레오티드로 할 수 있고, 제100?110번째의 어느 염기를 제1번째의 염기로 하는 25mer?50mer의 올리고뉴클레오티드로 해도 되며, 제102?106번째의 어느 염기를 제1번째의 염기로 하는 26mer?42mer의 올리고뉴클레오티드로 해도 된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 보다 확실하게 야생형 핵산의 핵산 증폭을 억제하여, 검출 감도가 향상하는 경향이 있다.

이러한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드로서는, 예를 들면, 하기의 (P2) 및 (P2')로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종을 들 수 있다.

(P2) 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 제104?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 20?80의 염기 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

(P2') 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도, 104번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 20?80의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드.

상기 P2 또는 P2' 올리고뉴클레오티드에서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 제104번째?제123번째의 염기를 포함하는 염기길이 20mer?80mer의 염기 서열이면, P2 또는 P2' 올리고뉴클레오티드의 제1번째의 염기가 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 어느 염기에 대응하는 염기여도 된다. 예를 들면, P2 또는 P2' 올리고뉴클레오티드는, 상기 104번째의 염기를, P2 또는 P2' 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 세어 1?3번째의 위치에 갖는 것이어도 되며, 5' 말단측, 즉 P2 또는 P2' 올리고뉴클레오티드의 제1번째의 염기로 해도 된다. 상기 104번째의 염기를 3' 말단으로부터 1?3번째, 특히 3' 말단측에 갖는 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 야생형 핵산에 핵산 증폭을 보다 확실하게 억제할 수 있는 경향이 있다.

상기 P2' 올리고뉴클레오티드에 있어서의 스트린젠트한 조건에 대해서는, 상기 P1' 올리고뉴클레오티드에 대해서 기술한 사항을 그대로 적용한다.

또한, 본 발명에 있어서의 상기 P2 또는 상기 P2'의 올리고뉴클레오티드에는, 상기 P2 또는 상기 P2'의 올리고뉴클레오티드에 1개 또는 몇개 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드도 포함된다.

상기 P2 또는 상기 P2'의 올리고뉴클레오티드의 염기 서열에 대해서, 삽입, 결실 또는 치환되는 1개 또는 2개 이상의 염기에 대해서는, 상기 P1 및 P1' 올리고뉴클레오티드의 염기 서열에 대해서 삽입, 결실 또는 치환되는 1개 또는 2개 이상의 염기로서 기술한 사항을 그대로 적용한다.

상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, 또한, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 또는 그 상보쇄를 검출하기 위함 등을 목적으로 하여, 표지화되어 있어도 된다.

다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드에 부착되는 표지화 물질로서는, 일반적으로 형광 색소 및 형광단 등을 들 수 있다. 표지화 물질은, 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 염기에 부착되지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 표지화 물질이 부착된 염기는, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 어느 염기여도 되며, 어느 위치여도 된다. 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 어느 위치의 염기가 형광 색소에 의해 표지화된 염기로 하는 것에 의해, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈한 핵산의 유무를 유의(有意)하게 검출 가능하게 하는 등의 이점을 갖는다.

상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 3' 말단측은, 신장 저해 처리되어 있는 것을 요한다. 여기에서, 「신장」이란, DNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제 등의 효소를 사용한 핵산 증폭 처리에 의한 뉴클레오티드쇄의 신장을 의미한다. 신장 저해 처리는, 올리고뉴클레오티드쇄의 5' 말단으로부터 3' 말단으로의 신장이 저해되는 처리이면 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드쇄의 3' 말단측의 핵산에 대한 치환기 또는 화합물의 부가를 들 수 있다.

이러한 신장 저해를 목적으로 하여 부가되는 치환기의 예로서는, 인산기, ddNTP기 등을 들 수 있고, 신장 저해를 목적으로 하여 부가되는 화합물의 예로서는, 형광 색소, 2',3'ddA, 2',3'ddC, 2',3'ddG, 2',3'ddT 등을 들 수 있다. 올리고뉴클레오티드쇄의 신장 저해 처리로서는, 예를 들면, 확실한 신장 저해 등의 관점에서, 3' 말단측의 핵산에 대한 인산기의 부가로 해도 된다. 또, 상기 치환기 또는 화합물이 부가되는 핵산의 위치는, 핵산의 신장에 사용되는 수단에 따라 다르지만, DNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제를 사용하는 경우에는, (데옥시)리보스의 3위치로 하면 되지만, 이에 한정되지 않는다.

또한 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, 염기 서열 상의 염기로서, 형광 색소에 의해 표지된 염기를 포함해도 된다.

상기 형광 색소로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있고, 시판의 형광 색소로서는, 예를 들면, BODIPY FL, Pacific Blue, FluorePrime, Fluoredite, FAM, Cy3 및 Cy5, TAMRA 등을 들 수 있다.

본 발명에 관한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 일례는, 이하와 같다. 표 중의 「(P)」는 인산기를 나타낸다. 또, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 각각, Cmp-1은 제104번째의 염기에서 40mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-2는 제104번째의 염기에서 29mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-3은 제115번째의 염기에서 28mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-4는 제89번째의 염기에서 49mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-5는 제79번째의 염기에서 47mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-6은 제107번째의 염기에서 36mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-7은 제104번째의 염기에서 20mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-8은 제104번째의 염기에서 80mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-9는 제63번째의 염기에서 80mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-10은 제105번째의 염기에서 39mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-11은 제106번째의 염기에서 38mer길이의 올리고뉴클레오티드, Cmp-12는 제111번째의 염기에서 33mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-13은 제115번째의 염기에서 29mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-14는 제115번째의 염기에서 10mer의 올리고뉴클레오티드, Cmp-15는 제106번째의 염기에서 78mer길이의 올리고뉴클레오티드이다.

[표 1]

상술한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것에 의해 검출 가능한 EGFR 유전자의 변이(다형)는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 115번?123번째의 염기의 영역에 1개 또는 복수의 염기가 결실하고 있는 다형을 들 수 있다. 이러한 변이형 EGFR 유전자로서는, 예를 들면, 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 표 2에 중, 「-」은 결손부, 소문자는 변이부, 「WT」는 야생형 EGFR 엑손 19(서열 번호1의 제104번째?151번째), 야생형 유전자의 볼드체 밑줄친 「G」는, 치환부를 각각 의미한다.

[표 2]

후술하는 EGFR 유전자 다형 검출 방법에서는, 검출 대상이 되는 EGFR 유전자 다형을 검출하기 위한 EGFR 유전자 다형 검출 프로브(이하, 단지 다형 검출 프로브라고 한다)가 사용된다.

상기 다형 검출 프로브로서는, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 증폭 억제 표적 부위에 대응하는 위치에 변이를 갖는 다형을 검출 가능한 다형 검출 프로브이면 되며, 또한, 당해 증폭 억제 표적 부위에 대응하는 위치에 결실을 갖는 다형을 검출 가능한 다형 검출 프로브이면 된다.

이러한 다형 검출 프로브는, 구체적으로는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 제115번째?제123번째의 염기를 포함하는 염기 서열에 상보적인 핵산에 대해서 하이브리다이즈 가능한 서열이면 된다. 또, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 제115번째?제123번째의 염기를 포함하는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로서, 다형 검출 프로브가 하이브리다이즈 가능한 서열을 「표적 서열」이라 하는 경우가 있다.

프로브의 길이로서는, 특별히 제한은 없지만, 5mer?50mer로 해도 되며, 10mer?30mer로 해도 된다. 프로브의 길이가 이와 같은 범위이면, 예를 들면 검출 감도를 높일 수 있다.

상기 다형 검출 프로브는, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기 서열에 대해서 45% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 갖고 있어도 된다. 이와 같이 상기 다형 검출 프로브를, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기 서열에 대해서 45% 이상의 동일성을 갖는 프로브로 하는 것에 의해, 예를 들면, 변이형의 EGFR 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 감도를 향상시킬 수 있다. 상기 다형 검출 프로브의 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드에 대한 동일성은, 55% 이상으로 해도 되며, 65% 이상으로 해도 되며, 80% 이상으로 해도 된다.

또한, 다형 검출 프로브의 서열에는, 검출 대상이 되는 변이(예를 들면, 결실) 부위의 5' 말단측의 염기에 대응하는 염기가 포함되어 있으면 특별히 제한은 없다. 다형 검출 프로브의 염기 서열은, 검출 대상이 되는 변이(결실) 부위에 대응하는 염기가, 프로브의 5' 말단으로부터 세어 5번째 이후에 위치해도 되며, 10번째 이후에 위치해도 된다. 다형 검출 프로브에 있어서의 변이 부위에 대한 염기의 위치가 이와 같은 위치이면, 예를 들면, 검출 감도를 높일 수 있다.

또한, 다형 검출 프로브의 서열로서는, 야생형의 서열에 대응한 염기 서열로 해도 되며, 변이를 더 포함하는 것이어도 된다. 다형 검출 프로브로서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열 또는 그 상보적인 서열에 대해서, 70%?100%의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드이여도 되며, 80%?100%의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드이여도 된다. 다형 검출 프로브의 서열을 야생형이 대응한 염기로 하는 것에 의해, 예를 들면, 검출 감도를 높일 수 있다.

또한, 다형 검출 프로브로서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열 또는 그 상보적인 서열에 대해서, 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드이여도 되며, 1개 또는 2개 이상의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드이여도 된다.

또, 스트린젠트한 조건에 대해서는, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 항에 기재한 조건과 같은 조건을 적용할 수 있다. 또한, 동일성이나, 삽입, 결실 또는 치환의 범위에 대해서도, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 항에 기재한 것과 같은 범위를 적용할 수 있다.

또한, 다형 검출 프로브를 증폭 공정에서 프라이머와 함께 존재시켜서 사용하는 경우에는, DNA 폴리머라제의 반응 대상이 되어 프로브 자체의 신장을 예방하기 때문에, 다형 검출 프로브는, 3' 말단측에 후술하는 형광 표지가 부가되어 있어도 되며, 프로브의 3' 말단에 더 인산기가 부가되어 있어도 된다.

다형 검출 프로브에는, 검출의 효율성의 관점에서, 표지가 부착되어 있는 표지화 프로브로 해도 된다.

표지화 프로브에 있어서의 표지 물질의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 형광 색소 및 형광단을 들 수 있다.

상기 다형 검출 프로브는, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하거나 또는 증가하는 형광 표지 프로브로 할 수 있다. 그 중에서도 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소하는 형광 표지 프로브로 할 수 있다.

이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로, 구아닌 소광 프로브라고 불리고 있고, 소위 Q Probe(등록상표)로서 알려져 있다. 그 중에서도, 3' 말단 혹은 5' 말단이 시토신(C)이 되도록 설계되어, 그 말단의 C가 구아닌(G)에 가까워지면 발광이 약해지도록 형광 색소로 표지화된 올리고뉴클레오티드인 것을 들 수 있다.

이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.

또, Q Probe를 사용한 검출 방법 이외에도, 공지의 검출 양식을 적용해도 된다. 이러한 검출 양식으로서는, Taq-man Probe법, Hybridization Probe법, Moleculer Beacon법 또는 MGB Probe법 등을 들 수 있다.

상기 형광 색소로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있다. 이들 형광 색소의 시판품으로서는, 예를 들면, Pacific Blue, BODIPY FL, FluorePrime, Fluoredite, FAM, Cy3 및 Cy5, TAMRA 등을 들 수 있다.

형광 표지 올리고뉴클레오티드의 검출 조건은 특별히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 의해 적절히 결정할 수 있다. 예를 들면, Pacific Blue는, 검출 파장 445㎚?480㎚, TAMRA는, 검출 파장 585㎚?700㎚, BODIPY FL은, 검출 파장 520㎚?555㎚으로 검출할 수 있다. 이러한 형광 색소를 갖는 프로브를 사용하면, 각각의 형광 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드에의 결합은, 통상의 방법, 예를 들면 일본 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다.

또한, 상기 프로브가, 형광 색소 등의 표지화 물질로 표지화된 표지화 프로브인 경우, 예를 들면, 검출하는 형광 강도 등의 시그널 강도를 조절하기 때문에, 상기 표지화 프로브와 같은 서열인 미표지 프로브를 병용해도 된다. 이 미표지 프로브는, 예를 들면, 그 3' 말단에 인산이 부가되어도 된다.

<프라이머>

후술하는 EGFR 유전자 다형 검출 방법에서는, 검출 대상이 되는 EGFR 유전자 다형을 포함하는 서열을 증폭하는 경우에는, 프라이머를 사용할 수 있다.

핵산 증폭에 적용하는 프라이머는, 목적으로 하는 검출 대상이 되는 EGFR 유전자 다형의 부위(예를 들면, 결실한 염기의 영역에 대응하는 서열 번호1에 나타내는 서열)를 포함하는 핵산을 증폭 가능하면 특별히 제한되지 않는다.

이러한 프라이머의 설계에 대해서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열로부터, 당업자라면 적절히 설계할 수 있다.

프라이머의 길이 및 Tm값은, 12mer?40mer 및 40℃?70℃, 또는 16mer?30mer 및 55℃?60℃로 할 수 있다.

또한, 프라이머 세트의 각 프라이머의 길이는 동일하지 않아도 된다. 한편, 양 프라이머의 Tm값은 거의 동일(또는, Tm값의 양 프라이머에서의 차가 5℃ 이내)이여도 된다.

본 발명에 관한 EGFR 유전자 다형 검출 방법은, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 적어도 1종 사용하여 EGFR 유전자의 다형을 검출하는 것을 포함하는 EGFR 유전자 다형 검출 방법이다.

본 검출 방법에 의하면, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 적어도 1종이 야생형의 EGFR 유전자에 우선적으로 하이브리다이즈하므로, 야생형의 EGFR 유전자와, 변이형의 EGFR 유전자를 간편하게 구별하고, 감도 좋게 변이형의 EGFR 유전자를 검출 가능하게 한다.

상기 EGFR 유전자 다형 검출 방법은, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드가 야생형 EGFR 유전자 핵산에 대해서 변이형 EGFR 유전자 핵산보다도 우선적으로 하이브리다이즈하는 것을 이용하는 방법이면 특별히 제한되지 않는다.

이러한 방법으로서는, 예를 들면, 핵산 증폭을 이용하는 방법을 들 수 있다. 핵산 증폭을 이용한 방법이면, 상기 다형 검출 프로브의 염기 서열이 야생형 EGFR 유전자 핵산에 우선적으로 하이브리다이즈한 결과, 야생형 EGFR 유전자 핵산의 증폭이 억제되어, 변이형 EGFR 유전자 핵산을 우선적으로 증폭시킬 수 있다.

구체적으로는, 상기 EGFR 유전자 다형 검출 방법은, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산을 포함할 수 있는 핵산 시료를 준비하는 것(핵산 시료 준비 공정), 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 상기 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 당해 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 당해 1본쇄 핵산을 포함하고 또한 당해 1본쇄 핵산의 핵산 증폭이 억제되는 하이브리드를 얻는 것(제1 하이브리다이제이션 공정), 당해 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 당해 1본쇄 핵산의 접촉시 또는 접촉 후의 상기 핵산 시료에 대해서 핵산 증폭을 행하는 것(핵산 증폭 공정)을 포함하는 다형 검출 방법으로 할 수 있다. 이러한 다형 검출 방법으로 하는 것에 의해, 예를 들면, 간편하고 감도 좋게, EGFR 유전자 다형을 검출할 수 있는 등의 이점을 갖는다.

상기 핵산 시료 준비 공정에서 준비되는 핵산 시료는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 생체 시료 유래의 핵산을 포함하는 시료를 들 수 있다. 상기 생체 시료로서는, 예를 들면, 대장이나 폐 등의 조직, 백혈구 세포 등의 혈구, 전혈, 혈장, 객담, 구강 점막 등의 구강내 세포, 손톱 및 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위세정액, 요(尿), 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것을 들 수 있다. 또, 시료의 채취 방법, 핵산을 포함하는 시료의 조제 방법 등은, 제한되지 않고, 어느 것이나 종래 공지의 방법을 사용할 수 있다. 또한, 주형이 되는 핵산은, 당해 기원에서 얻어진 채로 직접적으로, 혹은 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해 전처리한 후 사용할 수 있다. 또한, 생체 시료 유래의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭법을 행한 반응액을, 본 발명에 있어서의 핵산 시료로 하고, 상기 반응액에 포함되는 증폭 산물을 주형 핵산 서열로 해도 된다.

예를 들면, 전혈을 시료로 하는 경우, 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE헬스케어바이오사이엔스사제) 등을 사용할 수 있다.

또, 상기 시료는, 예를 들면, 목적의 염기 부위가 변이형 및 정상형의 어느 것을 나타내는지 불분명한 핵산을 포함하는 시료, 변이형을 갖는 핵산과 정상형을 갖는 핵산을 포함하는 시료, 이들을 포함할 가능성이 있는 시료 등의 어느 것이어도 된다. 시료 중의 핵산, 예를 들면, DNA나 RNA 등의 핵산의 유래는, 제한되지 않고, 예를 들면, 각종 암 세포 등의 세포, 바이러스, 미토콘드리아 등을 들 수 있다. 특히, 변이형을 나타내는 핵산과 정상형을 나타내는 핵산을 갖는 시료에의 적용이 바람직하고, 예를 들면, 폐암 등의 각종 암 세포 등의 생체 시료, 구체적인 예로서는, 혈액 중에 유리하는 세포 등에 적용하는 것이 바람직하다. 혈액 중에 포함되는 암화한 세포에는, 변이형이 발생한 핵산을 갖는 세포와, 정상형을 나타내는 핵산을 갖는 세포가 포함되기 때문에, 이러한 세포 유래의 핵산 시료에 대해서, 본 다형 검출 방법을 적용하는 것은, 요구되는 감도를 실현할 수 있는 점에서, 바람직하다. 또, 본 발명에 있어서, 시료의 채취 방법, 핵산의 조제 방법 등은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다.

시료 중의 핵산은, 1본쇄여도 되며, 2본쇄여도 된다. 시료 중의 핵산 서열로서는, 예를 들면, DNA, 및, 토털 RNA, mRNA 등의 RNA 등을 들 수 있다. 또한, 상기 핵산 서열은, 예를 들면, 생체 시료 등의 시료에 포함되는 핵산을 들 수 있다.

시료 중의 핵산은, 예를 들면, 생체 시료 중에 원래 포함되어 있는 핵산이어도 되지만, 예를 들면, 다형 검출의 정밀도를 향상할 수 있으므로, 상기 생체 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물 등을 들 수 있다. 구체적인 예로서는, 예를 들면, 상기 생체 시료에 원래 포함되어 있는 DNA를 주형으로 하여, 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물이나, 상기 생체 시료에 원래 포함되어 있는 RNA로부터 역전사-PCR 반응(RT-PCR : Reverse Transcription PCR)에 의해 생성시킨 cDNA를 주형으로 하여, 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물을 들 수 있다. 이들의 증폭 산물을, 본 발명에 있어서의 주형 핵산 서열로 해도 된다. 상기 증폭 산물의 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 50?1000염기이며, 바람직하게는 80?200염기이다.

제1 하이브리다이제이션 공정은, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 당해 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 당해 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 당해 1본쇄 핵산을 포함하고 또한 당해 1본쇄 핵산의 핵산 증폭이 억제되는 하이브리드를 얻는다. 상기 하이브리드는, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 1본쇄 핵산의 하이브리다이즈 가능한 조건에서 하이브리다이제이션을 행하는 것에 의해 얻을 수 있다.

제1 하이브리다이제이션 공정에 있어서의 하이브리다이즈 가능한 조건이란, 1본쇄 핵산끼리를 하이브리다이즈하기 위해 통상 적용되는 조건을 그대로 적용하면 되며, 후술하는 프라이머와 1본쇄 핵산의 하이브리다이즈할 때에 적용되는 조건을 그대로 채용하면 된다. 이에 의해, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 서열 번호1에 나타내는 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산에 의하여, 하이브리드를 얻을 수 있다. 이 하이브리드는, 시료 중의 1본쇄 핵산이 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드에 의해 2본쇄 핵산으로 되어 있기 때문에, 하이브리드를 구성하는 핵산 서열에 대한 핵산 증폭이 억제된다.

상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드는, 핵산 시료, 예를 들면 단리한 게놈 DNA를 포함하는 액체 시료에 첨가해도 되며, 적당한 용매 중에서 게놈 DNA와 혼합해도 된다. 상기 용매로서는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 포함하는 용매, PCR 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.

또한, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 시료 중의 검사 대상이 되는 1본쇄 핵산의 접촉에는, 특별히 제한은 없고, 소정의 양비가 되도록, 예를 들면, 소정량의 핵산을 포함하는 시료 중에 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 첨가하면 된다.

제1 하이브리다이제이션 공정에 있어서, 검사 대상이 되는 시료는, 바람직하게는, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 함께 상기 다형 검출 프로브를 포함한다. 이에 의해, 간편 또한 감도 좋게 EGFR 유전자 다형을 검출할 수 있는 등의 이점을 갖는다.

본 발명에 있어서, 시료 중의 핵산에 있어서의 상기 다형 검출 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 핵산(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대해서 10배 이하로 해도 되며, 5배 이하로 해도 되며, 3배 이하로 해도 된다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.0001배 이상으로 해도 되며 0.001배 이상으로 해도 되며, 0.01배 이상으로 해도 된다.

여기에서, 시료 중의 핵산이란, 예를 들면, 검출 목적의 다형이 발생하고 있는 검출 대상 핵산과 상기 다형이 발생하고 있지 않는 비검출 대상 핵산의 합계여도 되며, 검출 목적의 다형이 발생하고 있는 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 다형이 발생하고 있지 않는 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물의 합계여도 된다.

또, 상기 핵산에 대한 상기 다형 검출 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비여도 되며, 1본쇄 핵산에 대한 몰비여도 된다.

반응계에 있어서의 다형 검출 프로브의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 프로브를 10nmol/L?400nmol/L로 해도 되며, 20nmol/L?200nmol/L로 해도 된다.

핵산 증폭 공정에 있어서의 핵산 증폭은, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와의 접촉시 또는 접촉 후의 핵산 시료에 대해서 행해진다. 또, 핵산 증폭 처리는, 시료 중에 상기 하이브리드 형성이 거의 완료한 것이면, 제1 하이브리다이제이션 공정의 후여도, 거의 동시여도 된다. 이에 의해, 제1 하이브리다이제이션 공정에 의한 하이브리드를 구성하지 않은 핵산 시료 중의 1본쇄 핵산에 대해서 핵산 증폭이 행해진다.

증폭 공정에서는, 핵산 시료와 프라이머쌍을 접촉시켜서, 핵산 시료 중의 핵산 서열을 주형 핵산 서열로 한 핵산의 증폭을 행한다. 이때, 각 프라이머는, 동일한 시료(동일의 반응액) 중에서, 각각 주형 핵산 서열에 어닐링하여, 핵산의 증폭이 개시된다. 또, 본 발명에 있어서의 주형 핵산 서열에는, 상기 증폭 억제 표적 부위를 포함하는 야생형의 주형 핵산 서열이 포함된다.

증폭 공정에 있어서, 증폭 반응의 반응계(예를 들면, 반응액)에 있어서의 상기 핵산 시료의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서, 상기 핵산 시료가 생체 시료(예를 들면, 전혈 시료)의 경우, 상기 반응계에 있어서의 첨가 비율의 하한이, 예를 들면, 0.01체적% 이상으로 해도 되며, 0.05체적% 이상으로 해도 되며, 0.1체적% 이상으로 해도 된다. 또한, 상기 첨가 비율의 상한도, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 2체적% 이하로 해도 되며, 1체적% 이하로 해도 되며, 0.5체적% 이하로 해도 된다.

또한, 후술하는 변이의 검출에 있어서, 예를 들면, 표지화 프로브를 사용한 광학적 검출을 행하는 경우, 상기 반응계에 있어서의 전혈 시료 등의 생체 시료의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.1?0.5체적％로 해도 된다. 이 범위이면, 예를 들면, 변성에 의한 침전물 등의 발생에 의한 영향을 충분히 방지할 수 있고, 광학적 수법에 의한 측정 정밀도를 향상할 수 있다. 또한, 전혈 시료 중의 협잡물(夾雜物)에 의한 핵산 증폭 PCR의 저해도 충분히 억제되기 때문에, 증폭 효율을 보다 한층 향상할 수 있는 것도 기대된다.

또한 증폭 반응의 개시 전에, 반응계에 알부민을 더 첨가하는 것이 바람직하다. 이러한 알부민의 첨가에 의해, 예를 들면, 침전물 또는 탁함의 발생에 의한 영향을, 보다 한층 저감할 수 있으며, 또한, 증폭 효율도 더 향상할 수 있다.

상기 반응계에 있어서의 알부민의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.01질량％?2질량％로 해도 되며, 0.1질량％?1질량％로 해도 되며, 0.2질량％? 0.8질량％로 해도 된다. 상기 알부민으로서는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민, 래트(rat) 혈청 알부민, 말 혈청 알부민 등을 들 수 있고, 이들은 어느 1종류여도 되고 2종류 이상을 병용해도 된다.

증폭 공정에 있어서의 핵산 증폭법으로서는, 예를 들면 폴리머라제를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 그 예로서는, 예를 들면, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, ICAN법, LAMP법, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있다. 또, 핵산 증폭법의 조건은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

증폭 공정에 있어서의 증폭에 대해서, PCR법을 예를 들어서 설명하지만, 본 발명은, 이에 한정되지 않는다. PCR의 조건은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

상기 반응액에 있어서의 다른 조성 성분은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 성분을 들 수 있고, 그 비율도 특별히 제한되지 않는다. 상기 조성 성분으로서는, 예를 들면, DNA 폴리머라제, 뉴클레오티드 3인산(dNTP) 등의 뉴클레오티드 및 용매 등을 들 수 있다. 상기 반응액에 있어서, 각 조성 성분의 첨가 순서는 조금도 제한되지 않는다.

PCR법에 사용하는 DNA 폴리머라제로서는, 통상 사용할 수 있는 DNA 폴리머라제를 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, GeneTaq(니뽄진사제), PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제), Taq 폴리머라제 등을 들 수 있다.

폴리머라제의 사용량으로서는, 당업계에서 통상 사용되고 있는 농도이면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Taq 폴리머라제를 사용하는 경우, 예를 들면, 반응 용액량 10㎕에 대해서 0.01U?10U의 농도로 할 수 있고, 반응 용액량 10㎕에 대해서 0.05U?1U로 할 수 있다. 이에 의해, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 야생형 핵산 친화성을 높일 수 있는 등의 경향이 있다.

PCR의 방법은, 일반적인 공정을 사용하고, 온도나 사이클수 등의 조건은 특별히 제한되지 않는다. 각 스텝의 온도 변화는, 예를 들면, 서멀사이클러 등을 사용하여 자동적으로 제어하면 된다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 다형 평가 공정을 더 포함해도 되며, 다형 평가 공정은, 이하의 (Ⅰ)?(Ⅳ)의 각 공정을 포함할 수 있고, 또한 하기 공정(Ⅴ)을 포함하고 있어도 된다.

(Ⅰ) 상기 다형 검출 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 다형 검출 프로브와 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시킨 하이브리드를 얻는 것(제2 하이브리다이제이션 공정이라고 한다).

(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시키는 것에 의해, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 의거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것(측정 공정이라고 한다).

(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것(Tm값 측정 공정).

(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, EGFR 유전자에 있어서의 다형의 존재를 검출하는 것(다형 검출 공정).

(Ⅴ) 상기 다형의 존재에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 다형을 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 검출하는 것(다형 존재비 검출 공정).

이러한 다형 검출 방법으로 하는 것에 의해, EGFR 유전자 다형을 간편하고 감도 좋게 검출하고, 평가할 수 있다.

제2 하이브리다이제이션 공정에 있어서 적용되는 하이브리다이제이션의 수법 및 조건으로서는, 특별히 제한은 없고, 2본쇄 핵산 서열을 변성하여 1본쇄 핵산 서열로 하는 것, 1본쇄 핵산 서열끼리를 하이브리다이즈하는 것을 목적으로서 당업계에서 기지의 조건을 그대로 적용하면 된다.

예를 들면, 해리에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물을 해리할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 85℃?95℃다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않지만, 통상, 1초?10분이며, 1초?5분으로 해도 된다. 또한, 해리한 1본쇄 핵산 서열과 다형 검출 프로브의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 해리 후, 해리에 있어서의 가열 온도를 강하시키는 것에 의해 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예를 들면, 40℃?50℃다.

또, 본 명세서에 있어서, 증폭 산물에 있어서의 「1본쇄 핵산 서열」의 용어에는, 시험 대상으로 되어 있는 당초의 핵산 시료에 있어서의 1본쇄 핵산 서열도 포함한다.

측정 공정에서는, 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시키고, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 의거하는 시그널의 변동을 측정한다.

상기 증폭 1본쇄 핵산과 다형 검출 프로브의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널값의 측정은, 260㎚의 흡광도 측정이어도 되지만, 상기 다형 검출용 프로브에 부가한 표지의 시그널에 의거하는 시그널로서, 1본쇄 DNA와 상기 다형 검출용 프로브의 하이브리드 형성의 상태에 따라 변동하는 시그널의 측정이어도 된다. 표지 물질의 시그널 측정으로 하는 것에 의해, 예를 들면 검출 감도를 높일 수 있다.

표지화 프로브로서는, 예를 들면, 표적 서열(상보 서열)에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 또는 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(예를 들면, 2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않거나, 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 해리하면 시그널을 나타내게 되거나, 시그널이 증가한다.

또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(예를 들면, 2본쇄 DNA)를 형성하는 것에 의해 형광 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 해리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표지에 의거하는 시그널의 변화를 시그널 특유의 조건(흡수 파장 등)으로 검출하는 것에 의해, 상기 260㎚의 흡광도 측정과 같이, 융해의 진행 및 Tm값의 결정 등을 행할 수 있다.

하이브리드의 해리에 의거하는 시그널의 변동은, 반응액의 온도를 변화시켜서 행한다. 예를 들면, 상기 반응액을 가열하고, 즉, 상기 1본쇄 DNA와 상기 표지화 프로브의 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 따르는 시그널의 변동을 측정한다. 예를 들면, Q Probe를 사용했을 경우, 1본쇄 DNA와 하이브리다이즈한 상태에서는, 해리한 상태에 비하여 형광 강도가 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다. 또, 상기 표지화 프로브를 사용하는 경우, 상기 시그널값은, 예를 들면, 상기 표지화 프로브의 표지 물질에 따른 조건으로 측정할 수 있다.

형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 개시 온도가 실온?85℃로 해도 되며, 또는 25℃?70℃로 해도 된다. 종료 온도는, 예를 들면, 40?105℃로 할 수 있다. 또한, 온도의 상승 속도는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1℃?20℃/초, 또는 0.3?5℃/초로 할 수 있다.

Tm값 측정 공정에서는, 상기 측정 공정에서 얻어진 시그널의 변동을 해석하여 Tm값을 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 미분값(-d형광 강도/dt)을 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로 하여 결정할 수 있다. 혹은, 예를 들면, 각 온도에 있어서의 단위 시간당의 형광 강도 변화량을 산출하고, 그 변화량을 (-d형광 강도 증가량/dt)로 하는 경우에는, 예를 들면, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로 하여 결정할 수 있다. 또한, 변화량을 (d형광 강도 증가량/dt)로 하는 경우에는, 예를 들면, 가장 높은 점을 Tm값으로 하여 결정할 수도 있다. 또, 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아니라, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용했을 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.

Tm값은, 예를 들면, 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http:/www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있으며, 또한, 인접법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다.

다형 검출 공정에서는, 결정된 Tm값에 의거하여, EGFR 엑손 19의 다형의 존재를 검출한다. 또한, 임의의 다형 존재비 검출 공정에서는, 결정된 Tm값에 의거하여, EGFR 엑손 19의 다형을 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 검출한다.

또, 하이브리드의 해리 온도를 평가하는 것뿐만 아니라, 하이브리드의 융해시에 온도에 따라 변동하는 형광 시그널의 미분값의 크기를 평가하는 것을 포함한다. 미분값의 크기에 의해, 다형을 갖는 염기 서열(DNA)의 존재비를 평가할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 상술과 같이, 하이브리드를 가열하여, 온도 상승에 따르는 시그널 변동(바람직하게는 형광 강도의 증가)을 측정하지만, 이 방법 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 강하시켜서 하이브리드를 형성할 때의 상기 온도 강하에 따르는 시그널 변동을 측정해도 된다.

구체예로서, 단독으로 시그널을 나타내고 또한, 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브(예를 들면, Q Probe)를 사용했을 경우, 1본쇄 핵산 서열과 표지화 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 상기 반응액의 온도를 서서히 강하시켜서, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다. 한편, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 사용했을 경우, 1본쇄 핵산 서열과 표지화 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지 않지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광을 발하게 된다. 따라서, 예를 들면, 상기 반응액의 온도를 서서히 강하시켜서, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

EGFR 엑손 19에 있어서의 변이형 및 야생형의 핵산 서열에 존재비를 정량적으로 측정하기 위해서는, 미리, 변이형 및 야생형 각각의 핵산 서열을 제작하여 얻어진 검량선을 작성하고, 그에 의거하여 각각의 존재비를 검출하는 것이 바람직하다.

검량선의 작성의 일례에 대해서 이하에 설명한다.

우선, 예를 들면, 야생형의 핵산Wt와 변이형의 핵산Mt의 2종류의 핵산의 존재비를 각각 다르게 한 복수의 핵산 혼합물을 제작하고, 복수의 핵산 혼합물의 각각에 대해서, 융해 곡선 해석 장치를 사용하여 융해 곡선을 얻는다.

도 1A에, 어느 1개의 핵산 혼합물의 온도와 흡광도 또는 형광 강도 등의 검출 신호의 관계로 나타낸 융해 곡선, 및 동(同)도 1B에 온도와 검출 신호의 미분값의 관계로 나타낸 융해 곡선(미분 융해 곡선이라고도 한다)을 나타낸다. 이 미분 융해 곡선에서 피크를 검출하는 것에 의해, 핵산Wt의 융해 온도Tm_W 및 핵산Mt의 융해 온도Tm_M을 검출하여, Tm_W 및 Tm_M을 포함하는 온도 범위의 각각을 설정한다.

Tm_W를 포함하는 온도 범위ΔT_W로서는, 예를 들면, Tm_W와 Tm_M의 사이에서 검출 신호의 미분값이 최소가 되는 온도를 하한, 검출 신호의 피크의 발치에 대응하는 온도를 상한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다. 또한, Tm_M을 포함하는 온도 범위ΔT_M으로서는, 예를 들면, Tm_W와 Tm_M의 사이에서 검출 신호의 미분값이 최소가 되는 온도를 상한, 검출 신호의 피크의 발치에 대응하는 온도를 하한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다.

또, 온도 범위ΔT_W 및 온도 범위ΔT_M은, 동일한 폭(예를 들면, 10℃) 또는 다른 폭(예를 들면, 온도 범위ΔT_W가 10℃, 온도 범위ΔT_M이 7℃)이 되도록 설정해도 된다. 또한, 온도 범위ΔT_W 및 온도 범위ΔT_M은, 각각의 융해 온도Tm에서 +X℃, -X℃의 폭(X℃는 예를 들면 15℃ 이내, 바람직하게는 10℃ 이내)으로 하도록 설정해도 된다.

다음으로, 온도 범위ΔT_W 및 온도 범위ΔT_M의 각각에 대해서, 미분 융해 곡선의 온도 범위의 하한에 대응하는 점과 상한에 대응하는 점을 지나는 직선과 미분 융해 곡선으로 둘러싸인 면적(도 1B의 사선 부분)을 구한다. 면적의 구하는 방법의 일례로서, 구체적으로 이하와 같이 구할 수 있다. 온도T에 있어서의 검출 신호의 미분값을 f(T)로 하고, 온도T에 있어서의 베이스값을 B(T)로 하여, 하기 (1)식에 의해 구한다.

면적S={f(T_s ₊₁)-B(T_s ₊₁)}+{f(T_s ₊₂)-B(T_s ₊₂)}

+…+{f(T_e _-1)-B(T_e _-1)} …(1)

단, T_s는 각 온도 범위에 있어서의 하한값, T_e는 상한값이다. 또한, 각 온도T에 있어서의 베이스값B(T)는, 하기 (2)식에 의해 구하는 값이며, 검출 신호에 포함되는 백그라운드 레벨을 나타내는 것이다. 이 베이스값을 검출 신호의 미분값에서 감산하는 것에 의해, 검출 신호에 포함되는 백그라운드의 영향을 제거한다.

B(T)=a×(T-T_s)+f(T_s) …(2)

단, a={f(T_e)-f(T_s)}/(T_e-T_s)이다.

상기 (1)식 및 (2)식을 따라, 각 핵산 혼합물에 대해서, 온도 범위ΔT_W에 있어서의 면적S_W 및 온도 범위ΔT_W에 있어서의 면적S_M을 구하고, 면적비와 각 핵산 혼합물의 존재비의 관계를 나타내는 검량선을 작성한다. 예를 들면, 가로축에 존재비(핵산 혼합물의 총량에 대한 핵산Mt의 비율)를 취하고, 세로축에 면적비(S_M/S_W)를 취한 검량선으로 할 수 있다. 또, 면적비는 S_W/S_M으로 정해도 된다.

실제의 시료를 사용하여 얻어진 융해 곡선과 미분 융해 곡선에서 면적비를 산출하고, 상기와 같이 하여 미리 작성한 검량선에 의거하여, 실제의 시료 중에 포함되는 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 결정할 수 있다.

또한, 야생형 및 변이형의 각 피크의 존재를 따라서 존재비를 계산할 수 있지만, 단지 피크의 존재를 확인하는 것에 의해, EGFR 유전자에 있어서의 다형의 존재(유무)를 검출해도 된다.

본 발명의 EGFR 티로신키나제 저해제의 판정 방법은, 상술한 다형 검출 방법에 의해 EGFR 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 것(유전자 다형 검출 공정), 및, 상기 검출 결과에 의거하여 EGFR 티로신키나제 저해제에 대한 내성 또는 EGFR 티로신키나제 저해제의 약효를 판정하는 것(약효 판정 공정)을 포함한다.

상술한 다형 검출 방법에서는, 본 발명에 있어서의 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 감도 좋게 또한 간편하게 EGFR 엑손 19 다형을 검출하므로, EGFR 엑손 19에 있어서의 이 다형에 의거하여 EGFR 티로신키나제 저해제의 판정을 감도 좋게 또한 간편하게 행할 수 있다.

EGFR 티로신키나제 저해제의 판정 방법에 있어서의 유전자 다형 검출 공정에 대해서는, 상술한 EGFR 유전자에 있어서의 다형 검출 방법에 있어서 기술한 내용을 그대로 적용할 수 있다.

EGFR 티로신키나제는, EGFR 엑손 19에 있어서의 다형에 따라 반응성이 다른 것이 알려져 있다. 구체적으로는, EGFR 유전자가 변이형일 경우에는, EGFR 티로신키나제 저해제에 의한 종양 축소 효과를 기대할 수 있다고 판정할 수 있다.

본 발명의 EGFR 티로신키나제 저해제의 판정 방법에 의해, EGFR 티로신키나제 저해제의 효과에 대한 예측을, 신뢰성 높게 또한 간편하게 행할 수 있다.

약효 판정 대상이 될 수 있는 EGFR 티로신키나제 저해약으로서는, EGFR 티로신키나제를 특이적으로 저해하면 되며, 예를 들면, 게피티니브, 에를로티니브 등을 들 수 있다.

EGFR 엑손 19 다형의 약효 판정의 구체적인 방법으로서는, 이미 알려져 있고, 예를 들면, Journal of Thoracic Oncology : March 2006-Volume 1-Issue 3-pp260-267(EGFR Mutation of Tumor and Serum in Gefitinib-Treated Patients with Chemotherapy-Naive Non-small Cell Lung Cancer)에 기재되어 있다.

<시약 키트>

본 발명의 EGFR 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 EGFR 다형 검출 시험용 시약 키트는, 상술한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

이 시약 키트에는, EGFR 엑손 19에 있어서의 다형을 간편하고 감도 좋게 검출하기 위해 사용 가능한 상술한 증폭 억제 표적 영역에 대해서 하이브리다이즈 가능한 기술의 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드가 포함되므로, EGFR 유전자에 있어서의 다형의 검출을 보다 간편하게 행할 수 있다.

또한, 본 시약 키트에는, 표적으로 하는 EGFR 유전자의 다형 부위를 포함하는 영역에 하이브리다이즈 가능한 상기 프로브를 더 포함해도 되며, 또한, 상기 표적으로 하는 EGFR 유전자 다형 부위를 포함하는 핵산을 증폭 가능한 상기 프라이머 세트를 포함하고 있어도 된다. 이에 의해, 본 발명에 있어서의 다형 검출 시험용 시약 키트는, 보다 간편하고 정밀도 좋게 EGFR 유전자에 있어서의 다형의 검출을 행할 수 있다. 또, 본 시약 세트에 포함될 수 있는 프로브 및 프라이머에 대해서는, 상술한 사항을 그대로 적용할 수 있다.

상기 시약 키트에 포함되는 각 시약은, 다른 용기에 포함되어 있어도 되며, 동일한 용기에 포함되어 있어도 된다. 또, 본 명세서에 있어서의 「다른 용기」란, 각 시약이 비접촉 상태를 유지할 수 있도록 구분된 것이면 되며, 반드시, 독립하여 취급 가능한 개별의 용기가 아니어도 된다.

본 시약 키트에는, 상기 외에, 증폭에 필요한 폴리머라제 등의 시약 또는 완충액, 하이브리다이즈를 위해 필요한 시약 또는 완충액, 검체 시료를 희석하기 위한 희석제 등을 포함해도 된다. 또한, 본 시약 키트에는, 상술한 다형 검출 방법을 기재한 설명서, 키트에 포함되는 혹은 추가적으로 포함하는 것이 가능한 각종의 시약에 관한 사용 설명서 등을 포함하는 것이 바람직하다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에서 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 그들에 조금도 한정되는 것이 아니다. 또, 특별히 언급이 없는 한, 「부」 또는 「％」는 질량 기준이다.

[실시예1?3]

서멀사이클러(상품명 Mastercycler ep gradient S, eppendorf사제)와 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)와, 하기 표 3?5에 기재한 처방의 검사용 시약을 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 또, 사용한 폴리머라제는, Taq 폴리머라제이다.

PCR은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 54℃에서 15초를 1사이클로 하여, 50사이클 반복했다.

또한 Tm 해석은, PCR 후, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 여기 파장을 420㎚?485㎚로 하고, 측정 파장을 520?555㎚로 하여, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다. 야생형의 유전자의 경우에는 66℃ 부근, 변이형의 유전자의 경우에는, 51℃ 부근 및 66℃ 부근에 각각 피크가 인정되는 것을 알 수 있다.

시료 중의 1본쇄 핵산의 핵산 증폭을 억제하기 위해 사용한 본 발명에 관한 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드(이하, WI핵산이라고 한다)는, 서열 번호1의 104번째?143번째와 동일한 서열을 갖는 Cmp-1(서열 번호2, 실시예1), 서열 번호1의 104번째?132번째와 동일한 서열을 갖는 Cmp-2(서열 번호3, 실시예2) 또는 서열 번호1의 115번째?142번째와 동일한 서열을 갖는 Cmp-3(서열 번호4, 실시예3)으로 하고, 각각 0.2μM 또는 0.4μM으로 사용했다.

야생형의 EGFR 엑손 19의 서열은 서열 번호1과 같다.

변이형의 EGFR 엑손 19로서는 E746_A750del을 사용했다(표 2, No.2).

프로브에는, 서열 번호1의 104?136번째의 서열을 인식하고, 5' 말단에 표지를 갖는 5FP-EGFR-EX19-WT-FW-3(5'-(FL)-CCCGTCGCTATCAAGTAATTAAGAGAAGCAACA : 서열 번호35)을 사용했다. F프라이머(포워드 프라이머)로서는, 서열 번호1의 54?73번째의 서열에 대응하는 EGFR-EX19-F2(TCTCTCTGTCATAGGGACTC : 서열 번호33)를 사용하고, R프라이머(리버스 프라이머)로서는, 서열 번호1의 155?175번째의 염기에 대응하는 EGFR-EX19-R1(GAAACTCACATCGAGGATTTC : 서열 번호34)을 사용했다. 주형 핵산 서열로서는, 1×10³copy/㎕의 정제 인간 게놈(Roche사제) 및, 야생형의 유전자 서열(서열 번호1)과 변이형의 유전자 서열(서열 번호36, 표 2의 No.2에 상당)을 10:990의 비율(변이형 혼합비 1%)로 혼합한 1×10³copy/㎕의 플라스미드(Genescript사제)를 사용했다.

또, 각 서열은 표 6에 기재 대로이다.

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광값의 변화량을 나타내는 그래프를 얻었다.

결과를 도 2?도 4에 나타낸다. 또, 도 2(A), 도 3(A) 및 도 4(A), 및 도 2(C), 3(C) 및 도 4(C)는 게놈 DNA만을 주형 핵산 서열로서 사용했을 경우(야생형 100%)를 나타내고, 도 2(B), 도 3(B) 및 도 4(B), 및 도 2(D), 3(D) 및 도 4(D)는 야생형의 유전자 서열과 변이형의 유전자 서열을 소정 비율로 혼합한 플라스미드 DNA를 주형 핵산 서열로서 사용했을 경우를 나타낸다. 또한, 각 도면에 있어서, 도 2(A), 도 3(A) 및 도 4(A), 및 도 2(B), 도 3(B) 및 도 4(B)는 WI핵산 농도 0.2μM의 경우를 나타내고, 도 2(C), 3(C) 및 도 4(C), 및 도 2(D), 3(D) 및 도 4(D)는, WI핵산 농도 0.4μM의 경우를 나타낸다. 도면 중, 가로축이 온도(℃), 세로축이 형광값의 변화량을 나타낸다.

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

도 2 및 도 3에 나타나 있는 바와 같이, 게놈 DNA만의 핵산 시료(야생형 100%)에서는 66℃ 부근에밖에 피크가 인정되지 않고, 플라스미드 DNA를 포함하는 핵산 시료(변이형 1%)에서는 51℃ 부근의 피크를 명료하게 확인할 수 있었다. 이 경향은, WI핵산의 농도를 변경해도 마찬가지이고, WI핵산의 농도를 늘리는 것에 의해, 변이형 핵산 서열을 보다 감도 좋게 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.

또한, 도 4에 나타나 있는 바와 같이, DNA 폴리머라제의 농도를, 실시예1 및 2에 대해서 5할 이하인 0.16U로 한 실시예3에서는, 변이형 핵산의 피크가 실시예1 및 실시예2의 경우보다도 보다 명료하게 되는 것을 알 수 있었다.

이상의 실시예로부터, 사용한 프로브와 WI핵산 서열의 중복 염기 서열수가 각각, 33mer(Cmp-1, 100%), 29mer(Cmp-2, 87.9%), 22mer(Cmp-2, 66.7%)이었다. 이 결과에서, 프로브와 WI핵산 서열의 중복하는 염기수의 비율이 66.7% (22mer/33mer) 이상인 경우에는, 변이형 핵산을 감도 좋게 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.

[비교예1?비교예4]

비교예1에서는, WI핵산 서열로서, 서열 번호1의 123번째?151번째와 동일한 서열을 갖는 Cmp-C1(서열 번호32, 표 6 참조)을 사용한 이외는, 실시예1과 같이 하여 다형 검출을 행했다. 결과를 도 5에 나타낸다.

비교예2에서는, WI핵산 서열 및 프로브를 포함하고 있지 않는 반응액을 사용하고, PCR 반응 후에 프로브를 1μM의 종(終)농도가 되도록 각 시료에 첨가한 이외는, 실시예1과 같이 하여 다형 검출을 행했다. PCR 반응용 시약의 각 성분을 표 7에 나타낸다. 결과를 도 6에 나타낸다.

비교예3에서는, WI핵산 서열로서, 서열 번호1의 123번째?151번째와 동일한 서열을 갖는 Cmp-C1을 사용하고, DNA 폴리머라제를 0.16U로 변경한 이외는 실시예1과 같이 하여 다형 검출을 행했다. 결과를 도 7에 나타낸다.

비교예4에서는, DNA 폴리머라제를 0.16U로 사용한 이외는, 비교예2와 같이 하여 다형 검출을 행했다. 결과를 도 8에 나타낸다.

도 5?도 8에 있어서, 도 5(A), 도 6(A), 도 7(A) 및 도 8(A), 및 도 5(C), 도 6(C), 도 7(C) 및 도 8(C)는 게놈 DNA만을 주형 핵산 서열로서 사용했을 경우(야생형 100%)를 나타내고, 도 5(B), 도 6(B), 도 7(B) 및 도 8(B), 및 도 5(D), 도 6(D), 도 7(D) 및 도 8(D)는 야생형의 유전자 서열과 변이형의 유전자 서열을 소정 비율로 혼합한 플라스미드 DNA를 주형 핵산 서열로서 사용했을 경우를 나타낸다. 또한, 각 도면에 있어서, 도 5(A), 도 6(A), 도 7(A) 및 도 8(A), 및 도 5(B), 도 6(B), 도 7(B) 및 도 8(B)는 WI핵산 농도 0.2μM의 경우를 나타내고, 도 5(C), 도 6(C), 도 7(C) 및 도 8(C), 및 도 5(D), 도 6(D), 도 7(D) 및 도 8(D)는, WI핵산 농도 0.4μM의 경우를 나타낸다. 도면 중, 가로축이 온도(℃), 세로축이 형광값의 변화량을 나타낸다.

[표 7]

도 5에 나타나 있는 바와 같이, 서열 번호1의 제115번째?제123번째의 증폭 억제 표적 핵산에 대응하는 서열을 포함하지 않는 WI핵산 서열을 사용했을 경우에는, 주형 핵산 서열로서 게놈 DNA의 경우와 플라스미드 DNA의 경우의 쌍방에서 변이형을 나타내는 61℃의 피크가 인정되어, 판정 불가능했다.

또한, 비교예1에 사용된 비교용 WI핵산 서열 Cmp-C1과, 다형 검출 프로브의 중복 염기 서열수가 14mer이며, 다형 검출 프로브와 WI핵산 서열의 중복하는 염기수의 비율이 42.4%(14mer/33mer)이었다. 이 결과에서, WI핵산 서열과 다형 검출 프로브의 중복 염기 서열수의 비율이, 42.4%(14mer/33mer)인 경우에는, 야생형을 나타내는 피크가 인정되지 않는 것을 알 수 있었다.

또한, 도 6에 나타나 있는 바와 같이, WI핵산을 존재시키지 않고 PCR 반응을 행했을 경우에는, 변이형을 나타내는 피크가 인정되지 않고, 변이형의 검출을 할 수 없었다.

이러한 경향은, DNA 폴리머라제의 양을 줄인 경우에도 같았다(도 7 및 도 8 참조).

[실시예4]

전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여 PCR 반응 및 Tm 해석을 행함과 함께, 주형 핵산 서열의 종류를 표 8에 나타낸 바와 같이 변경한 시료A?J(변이형 플라스미드의 서열은 표 8 참조, 야생형 플라스미드의 서열은 서열 번호1)를 사용하고, PCR 반응액의 각 성분을 표 9에 나타나 있는 바와 같이 변경한 이외는, 실시예1과 같이 하여, 다형 검출을 행했다. 또, 사용한 폴리머라제는, Taq 폴리머라제이다.

또, 각 시료 중의 주형 핵산 서열은, 야생형의 유전자 서열(서열 번호1)과 표 8에 나타내는 변이형의 각 유전자 서열을, 표 8에 나타내는 혼합비가 되도록 혼합한 1×10³copy/㎕의 플라스미드(Genescript사제)를 사용했다. 표 8에 기재된 변이 종류에 대해서는, No.2 및 No.3은 E746_A750del, No.4는 L747_E749del, A750P, No.6은 L747_S752del, P753S를 나타낸다(표 2 참조).

야생형의 유전자의 경우에는 66℃ 부근, 변이형의 유전자의 경우에는, 변이형의 종류에 따라 51℃ 부근 및 66℃ 부근에 각각 피크가 인정되는 것을 알 수 있다.

결과를 도 9 및 도 10에 나타낸다.

[표 8]

[표 9]

도 9에 나타낸 바와 같이, 야생형만을 포함하는 시료A에 대해서는 66℃ 부근의 피크만이 인정되고(도 9(A) 참조), 한편, 각 변이형을 포함하는 시료B?E(도 9(B)?도 9(E))에 대해서는, 66℃ 부근의 피크에 더하여 각 변이형을 나타내는 51?54℃의 명료한 피크가 인정되어, 변이형의 종류에 상관없이, WI핵산 서열을 사용하는 것에 의해 변이형을 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.

또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 변이의 혼합비를 0.1%, 1%, 5%, 10% 및 50%로 변경해도, 혼합비에 따른 크기의 피크로서, 변이형을 혼합비 의존적으로 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다(도 10(A)?도 10(E) 참조).

[실시예5 및 비교예5]

전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여 PCR 반응 및 Tm 해석을 행함과 함께, WI핵산의 농도를 0.03μM, 0.06μM, 0.12μM 또는 0.18μM으로 변경한 PCR 반응액(시료5-1?5-4, 실시예5) 또는, WI핵산을 포함하지 않는 PCR 반응액(시료5-5, 비교예5)을 사용하고, PCR 반응 후에 프로브를 시료당 1μM의 종농도가 되도록 첨가한 이외는, 실시예1과 같이 하여 다형 검출을 행했다. 또, 시료 핵산으로서는, 변이형(No.2)과 야생형을, 1%의 변이형 혼합율로서 포함하는 플라스미드 DNA를 사용했다. 각 시료의 처방은, 표 10에 나타낸다.

결과를 도 11에 나타낸다. 도 11(A)는 WI핵산의 농도가 0.03μM의 시료5-1, 도 11(B)는 WI핵산의 농도가 0.06μM의 시료5-2, 도 11(C)는 WI핵산의 농도가 0.12μM의 시료5-3, 도 11(D)는 WI핵산의 농도가 0.18μM의 시료5-4, 도 11(E)는 WI핵산의 농도가 0의 시료5-5의 결과를 나타낸다.

[표 10]

도 11(A)?(D)에 나타낸 바와 같이, 다른 농도의 WI핵산을 포함하는 시료5-1?5-4에서는, 야생형의 66℃ 부근의 피크와 변이형의 51℃ 부근의 피크의 쌍방이 인정된다. 변이형의 피크는, WI핵산의 농도에 따라 커지고 있는 것을 알 수 있다.

이에 대해서, 도 11(E)에 나타낸 바와 같이, WI핵산을 포함하지 않는 시료5-5에서는, 변이형을 나타내는 51℃ 부근의 피크는 명료하지 않았다.

이와 같이 본 발명에 의하면, 간편하고 고감도로 EGFR 엑손 19에 있어서의 다형을 간편하고 감도 좋게 검출할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, INC. <120> OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION TEST OF POLYMORPHISM OF EGFR EXON 19 AND USE THEREOF <130> P1360A <150> JP2011-103818 <151> 2011-05-06 <150> JP2012-094081 <151> 2012-04-17 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 287 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tcactgggca gcatgtggca ccatctcaca attgccagtt aacgtcttcc ttctctctct 60 gtcataggga ctctggatcc cagaaggtga gaaagttaaa attcccgtcg ctatcaagga 120 attaagagaa gcaacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180 tgctgtgtgg gggtccatgg ctctgaacct caggcccacc ttttctcatg tctggcagct 240 gctctgctct agaccctgct catctccaca tcctaaatgt tcacttt 287 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-1 <400> 2 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga 40 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-2 <400> 3 cccgtcgcta tcaagtaatt aagagaagc 29 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-3 <400> 4 caaggaatta agagaagcaa catctccg 28 <210> 5 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-4 <400> 5 gagaaagtta aaattcccgt cgctatcaag gaattaagag aagcaacat 49 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-5 <400> 6 cccagaaggt gagaaagtta aaattcccgt cgctatcaag gaattaa 47 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-6 <400> 7 gtcgctatca aggaattaag agaagcaaca tctccg 36 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-7 <400> 8 cccgtcgcta tcaaggaatt 20 <210> 9 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-8 <400> 9 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 60 gatgtgagtt tctgctttgc 80 <210> 10 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-9 <400> 10 catagggact ctggatccca gaaggtgaga aagttaaaat tcccgtcgct atcaaggaat 60 taagagaagc aacatctccg 80 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-10 <400> 11 ccgtcgctat caaggaatta agagaagcaa catctccga 39 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-11 <400> 12 cgtcgctatc aaggaattaa gagaagcaac atctccga 38 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-12 <400> 13 ctatcaagga attaagagaa gcaacatctc cga 33 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-13 <400> 14 caaggaatta agagaagcaa catctccga 29 <210> 15 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-14 <400> 15 caaggaatta 10 <210> 16 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-15 <400> 16 cgtcgctatc aaggaattaa gagaagcaac atctccgaaa gccaacaagg aaatcctcga 60 tgtgagtttc tgctttgc 78 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaac 48 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gccgtcgcta tcaaaacatc tccgaaagcc aac 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gccgtcgcta tcaagacatc tccgaaagcc aac 33 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gccgtcgcta tcaaggaaca acatctccga aagccaac 38 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gccgtcgcta tcaaggaatc tccgaaagcc aac 33 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gccgtcgcta tcaaggaatc gaaagccaac 30 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gccgtcgcta tcaaggaacc atctccgaaa gccaac 36 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gccgtcgcta tcaaggaacc gaaagccaac 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gccgtcgcta tcaaggttcc gaaagccaac 30 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gccgtcgcta tcaaggaatc atctccgaaa gccaac 36 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gccgtcgcta tcaaggaaca gaaagccaac 30 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gccgtcgcta tcaaggtatc tccgaaagcc aac 33 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gccgtcgcta tcaaggttcc gaaagccaac 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gccgtcgcta tcaaaattcc gaaagccaac 30 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gccgtcgcta tcaaggaaca accgaaagcc aac 33 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cmp-C1 <400> 32 taagagaagc aacatctccg aaagccaac 29 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EGFR-EX19-F2 <400> 33 ctctctgtca tagggactc 19 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EGFR-EX19-R1 <400> 34 gaaactcaca tcgaggattt c 21 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5FP-EGFR-EX19-WT-FW-3 <400> 35 cccgtcgcta tcaagtaatt aagagaagca aca 33 <210> 36 <211> 287 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EGFR exon19 del mutant No.2 <400> 36 taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60 cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120 cgtcgctatc aaaacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180 tgctgtgtgg gggtccatgg ctctgaacct caggcccacc ttttctcatg tctggcagct 240 gctctgctct agaccctgct catctccaca tcctaaatgt tcacttt 287 <210> 37 <211> 287 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EGFR exon19 del mutant No.3 <400> 37 taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60 cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120 cgtcgctatc aagacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180 tgctgtgtgg gggtccatgg ctctgaacct caggcccacc ttttctcatg tctggcagct 240 gctctgctct agaccctgct catctccaca tcctaaatgt tcacttt 287 <210> 38 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EGFR exon19 del mutant No.4 <400> 38 ccacccagat cactgggcag catgtggcac catctcacaa ttgccagtta acgtcttcct 60 tctctctctg tcatagggac tctggatccc agaaggtgag aaagttaaaa ttcccgtcgc 120 tatcaaggaa ccaacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180 tgctgtgtgg gggtccatgg ctctgaacct caggcccacc ttttctcatg tctggcagct 240 gctctgctct agaccctgct catctccaca tcctaaatgt tcactttc 288 <210> 39 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EGFR exon19 del mutant No.6 <400> 39 tggtaacatc cacccagatc actgggcagc atgtggcacc atctcacaat tgccagttaa 60 cgtcttcctt ctctctctgt catagggact ctggatccca gaaggtgaga aagttaaaat 120 tcccgtcgct atcaaggaat cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180 tgctgtgtgg gggtccatgg ctctgaacct caggcccacc ttttctcatg tctggcagct 240 gctctgctct agaccctgct catctccaca tcctaaatgt tcactttc 288

Claims

하기 (P1) 및 (P')로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종인 EGFR 엑손 19 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드:
(P1) 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 115번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 9?80의 염기 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
(P1') 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 115번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 9?80의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
하기 (P2) 및 (P2')로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종인 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드:
(P2) 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 104번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 20?80의 염기 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드.
(P2') 3' 말단측이 신장 저해 처리되고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 적어도 104번째?123번째의 염기를 포함하는 염기길이 20?80의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드.
제2항에 있어서,
상기 (P2) 또는 (P2')의 올리고뉴클레오티드는, 상기 104번째의 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어 1?3번째의 위치에 갖는 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.
제2항에 있어서,
상기 (P2) 또는 (P2')의 올리고뉴클레오티드는, 상기 104번째의 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖는 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 25?50인 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 26?42인 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 3' 말단측의 신장 저해 처리가 인산기의 부가인 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드가 형광 색소에 의해 표지되어 있는 염기를 포함하는, 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드를 적어도 1종 사용하여 EGFR 엑손 19의 다형을 검출하는 것
을 포함하는 EGFR 엑손 19의 다형을 검출하는 다형 검출 방법.
제9항에 있어서,
서열 번호1에 나타내는 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산을 포함할 수 있는 시료 핵산을 준비하는 것,
상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 상기 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 당해 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드 및 당해 1본쇄 핵산을 포함하고 또한 당해 1본쇄 핵산의 핵산 증폭이 억제되는 하이브리드를 얻는 것,
당해 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드와 당해 1본쇄 핵산의 접촉시 또는 접촉 후의 상기 핵산 시료에 대해서 핵산 증폭을 행하는 것
을 포함하는 다형 검출 방법.
제10항에 있어서,
상기 핵산 증폭을, 표적으로 하는 EGFR 엑손 19의 다형 부위를 포함하는 핵산에 하이브리다이즈 가능한 프로브의 존재 하에서 행하는 다형 검출 방법.
제11항에 있어서,
상기 프로브가, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기 서열에 대해서 45% 이상의 동일성을 갖는 다형 검출 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 프로브가, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때에 형광을 발하고, 당해 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는 프로브인 다형 검출 방법.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출 방법에 의해 EGFR 엑손 19에 있어서의 다형을 검출하는 것, 및,
상기 검출 결과에 의거하여 EGFR 티로신키나제 저해제에 대한 내성 또는 EGFR 티로신키나제 저해제의 약효를 판정하는 것
을 포함하는 EGFR 티로신키나제 저해제의 약효 판정 방법.
적어도 1종의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드
를 포함하는 EGFR 다형 검출 시험용 시약 키트.
제15항에 있어서,
표적으로 하는 EGFR 엑손 19의 다형 부위를 포함하는 핵산 서열에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 더 포함하는 EGFR 다형 검출 시험용 시약 키트.
제16항에 있어서,
상기 프로브가, 상기 다형 검출 시험용 올리고뉴클레오티드의 염기 서열에 대해서 45% 이상의 동일성을 갖는 EGFR 다형 검출 시험용 시약 키트.
제15항 내지 제17항에 있어서,
상기 표적으로 하는 EGFR 엑손 19 다형 부위를 포함하는 핵산 서열을 증폭 가능한 프라이머 세트를 더 포함하는 EGFR 다형 검출 시험용 시약 키트.