CN111690747A - 一种与早中期结肠癌相关的联合标记物、检测试剂盒以及检测系统 - Google Patents

一种与早中期结肠癌相关的联合标记物、检测试剂盒以及检测系统 Download PDF

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Abstract

一种早中期结直肠癌术后复发风险检测联合标志物方法及其用途，属于分子医学技术领域。结直肠癌术后复发风险检测联合标志物，包括如下所示的各标志物的组合：分期、APC、PTEN和术后7天血浆ctDNA检测结果。本发明具有以下优势：本发明能够将Ⅱ/Ⅲ期可手术结直肠癌患者术后复发风险情况加以区分，使用严谨的统计学方法筛选出单个预测因子之后，采用多个基因、分期和术后7天血浆DNA检测结果联合的评分模型来提高预测的敏感性与特异性，应用该评分可以用来指导Ⅱ/Ⅲ期可手术结直肠癌患者术后复发风险的评估。

Description

一种与早中期结肠癌相关的联合标记物、检测试剂盒以及检 测系统
技术领域
本发明涉及一种与早中期结肠癌相关的联合标记物、检测试剂盒以及检测系统，属于分子医学技术领域。
背景技术
结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤，高居恶性肿瘤发病率前五，严重威胁人们的健康[1]。目前早中期结直肠癌最主要的治疗方式是手术治疗。根治性手术治疗后的结直肠癌患者总体预后较好；然而，仍有大量患者在术后出现复发。目前尚无有效手段能够预测患者术后是否会复发，患者只能通过临床定期随访复查进行及时监测，从而希求复发后及时干预。目前的临床监测手段主要包括影像学检测和肿瘤标志物检测。长期监测可能影响患者生活质量，增加患者经济负担。而且，大量患者由于未能准时随访，导致未及时发现复发。因此临床亟待更有效可行的复发预测手段。
最新报道表明循环肿瘤DNA(ctDNA)可能成为潜在的复发风险预测和动态监测的新技术。ctDNA是循环游离DNA(ctDNA)中由肿瘤细胞释放的小片段DNA，片段大小约170bp左右，它的来源主要有以下几种：(1)肿瘤组织中凋亡或坏死的肿瘤细胞释放的小片段DNA进入血液系统；(2)血液中循环肿瘤细胞或微转移灶裂解释放的DNA；(3)肿瘤组织释放的外泌体等进入血液系统[2]。由于ctDNA来源于肿瘤细胞，因此携带肿瘤特有突变信息，目前已被广泛应用于特定肿瘤“液体活检”中。通过高通量测序能够确定肿瘤突变图谱，从而指导靶向治疗，成为肿瘤组织活检的有效补充，对于无法获取组织或治疗耐药的肿瘤患者来说，是一种无创的检测技术。
正常人血液中也会携带微量的ctDNA。而肿瘤病人病灶还可能释放携带肿瘤特有突变的ctDNA，ctDNA不仅携带肿瘤特有突变信息，其含量还与肿瘤负荷密切相关：肿瘤负荷越高、肿瘤越活跃，释放的ctDNA越多。因此通过肿瘤病人ctDNA含量的测定，可以间接反应肿瘤负荷的状态，实现肿瘤状态监测的目的。ctDNA的定量方法主要包括直接定量和间接定量两种方法：直接定量法是通过Qubit等荧光定量仪器直接对提取的ctDNA进行定量。然而由于目前提取技术中ctDNA和正常细胞的ctDNA无法进行有效分离，因此无法通过直接的ctDNA定量来确定ctDNA含量的高低；间接定量是通过对ctDNA进行测序，通过其中携带肿瘤特有突变的丰度进行定量，用肿瘤特有突变丰度的高低来反映ctDNA的含量，从而进一步反应肿瘤负荷，进而实现肿瘤监测作用。目前文献中通常采用间接定量的方法进行ctDNA定量。
ctDNA动态监测在肿瘤复发监测作用已经在肺癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中得到初步证实。2014年Nature Medicine发表的Newman等人研究结果显示在非小细胞肺癌中通过高通量测序检测的ctDNA含量与患者肿瘤负荷高度相关，通过ctDNA的定量监测可以有效监测肿瘤复发情况[3]。Isaac等人在乳腺癌中同样发现ctDNA含量与肿瘤负荷相关，且相对于肿瘤影像学检测，ctDNA定量检测可以更早的发现肿瘤复发趋势[4]。目前肿瘤复发监测主要通过影像学检测技术，ctDNA定量可能在影像学检测前提前发现肿瘤复发趋势，表明ctDNA定量相比于传统影像学检测为更灵敏的监测技术。
除用于肿瘤复发监测外，ctDNA还可用于肿瘤术后预后预测。2019年Thomas等人收集结直肠癌患者手术后30天时的血浆样本，进行ctDNA高通量测序。检出ctDNA和未检出ctDNA的患者RFS(Recurrence-free survival)存在显著差异。该研究初步证实了术后ctDNA检测对于预后的预测价值[5]。
不同于传统方法对于基因突变检测的局限，高通量测序技术(Next-generationsequencing，NGS)可以允许更高分辨率以及更全面分子图谱方面的研究，能够实现更有效、特异性更高的生物标记物筛查与探索，是开展个体化精准医疗的理想方法。早中期结直肠癌患者术后复发通常与患者所携带的预后相关的肿瘤特有突变或临床因素有关。这些预后因子决定着患者术后复发的可能性。因此，找到这些预后因子对于患者个性化治疗方案的选择尤为重要。
非专利文献：
[1]Guinney,Dienstmann,et al.The consensus molecular subtypes ofcolorectal cancer.Nature Medicine.2015；21(11):1350-1356.
[2]Rolfo,Castiglia,et al.Liquid biopsies in lung cancer:the newambrosia of researchers.Biochim Biophys Acta.2014；1846(2):539-546.
[3]Newman AM1,Bratman SV,et al.An ultrasensitive method forquantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.NatureMedicine.2014；20(5):548-554.
[4]Garcia-Murillas I,Schiavon G,et al.Mutation tracking incirculating tumor DNA predicts relapse in early breast cancer[J].ScienceTranslational Medicine,2015.26；7(302):302ra133.
[5]Reinert T1,Henriksen TV1,et al.Analysis of Plasma Cell-Free DNA byUltra deep Sequencing in Patients With Stages I to III Colorectal Cancer[J].JAMA Oncol.2019；5(8):1124-1131.
发明内容
本发明对可以作为手术后复发风险评估的关键标志物进行了筛选及综合评分，提供了一种与早中期结肠癌相关的联合标记物，通过上述的标志物，能够基于评分结果的不同，提示患者术后复发风险的高低。
本发明的第一个方面，提供了：
一种早中期结直肠癌术后复发风险评估的标志物，包括：结直肠癌分期(Stage)、APC基因、PTEN基因、血浆ctDNA的突变。
在一个实施方式中，结直肠癌分期是指II期或者III期。
本发明的第二个方面，提供了：
一种用于检测上述早中期结直肠癌术后复发风险评估的标志物的试剂盒，包括：
第一检测试剂盒，用于肿瘤组织中的APC基因和PTEN基因的突变进行检测；
第二检测试剂盒，用于对血浆样本中的ctDNA中的突变进行检测。
在一个实施方式中，还包括：用于对结直肠癌分期进行判定时所用的试剂。
本发明的第三个方面，提供了：
一种早中期结直肠癌术后复发风险评估的检测系统，包括：
组织样本测序模块，用于对APC基因和PTEN基因的突变进行检测；
血浆ctDNA样本测序模块，用于对待测对象的血浆ctDNA中的基因突变进行检测；
结直肠癌分期确定模块，用于确定待测对象的结直肠癌分期；
判定模块，用于执行以下判定公式：
Risk score＝1.28×Stage-1.90×AAPC+2.65×APTEN+3.03×Plasma ctDNA；
其中，Risk score是风险值；
Stage是指结直肠癌分期，如果分期是Ⅲ期，则取值为1，Ⅱ期为0；
AAPC是指APC基因是否发生了突变，如果存在突变，则取值为1，否则为0；
APTEN是指APC基因是否发生了突变，如果存在突变，则取值为1，否则为0；
Plasma ctDNA指待测对象在手术后血浆ctDNA检测的结果，如果血浆ctDNA检测结果为阳性则Plasma ctDNA取值为1，否则为0；
并且判定模块根据Risk score的数值来对待测对象的术后复发风险进行确定。
在一个实施方式中，判定模块当判定Risk score≥1时，诊断为手术后复发高风险人群；当Risk score＜1时，诊断为手术后低复发风险人群。
在一个实施方式中，所述的Plasma ctDNA阳性结果是指术后7天血浆ctDNA检测到肿瘤特有突变的最大突变丰度≥0.6％定义为阳性，术后7天血浆ctDNA检测到肿瘤特有突变的最大突变丰度＜0.6％定义为阴性。
在一个实施方式中，所述的特有突变是指ctDNA的单核苷酸变异(SNV)和插入缺失突变(Indel)。
本发明第四个方面，提供了：
一种计算机可读取介质，其中记载有可以运行对早中期结肠癌的术后复发风险评估步骤的程序；
所述的评估步骤包括：
获得患者的结肠癌分期结果；
获得患者肿瘤组织中APC基因和PTEN基因的突变情况；
获得患者在术后的血浆中ctDNA的突变情况；
计算以下联合标志物的数值：
Risk score＝1.28×Stage-1.90×AAPC+2.65×APTEN+3.03×Plasma ctDNA；
当判定Risk score≥1时，诊断为手术后复发高风险人群；当Risk score＜1时，诊断为手术后低复发风险人群。
有益效果
本发明能够将早中期结直肠癌患者手术后高复发风险人群和低复发风险人群加以区分，使用严谨的统计学方法筛选出单个复发相关因子之后，采用多个标志物联用的评分模型来提高预测的敏感性和特异性，应用该评分可以用来指导早中期结直肠癌患者术后复发风险的预测，从而对其后续治疗进行提示作用。
附图说明
图1早中期结直肠癌患者术后复发风险预测模型中各标志物对其预后影响
图2 199例早中期结直肠癌患者应用术后复发风险预测模型预测高风险人群和低风险人群的中位DFS(无病生存期)
图3应用复发风险预测模型评估真实世界手术后18个月内未复发患者与复发患者Risk score评分
具体实施方式
本发明的目的是提供一种用于指导早中期结直肠癌术后复发风险评估预测模型，其联合分期(Stage)、基因标志物和术后7天血浆ctDNA检测结果及其研究方法建立。本发明基于一项临床研究，即ctDNA动态监测预测早中期结直肠癌根治术后复发(一项随机、单盲、前瞻性、多中心临床研究)中的199个结直肠癌手术组织样本和199个术后7天血浆样本，从组织样本中提取肿瘤细胞中的遗传物质，通过NGS技术，获得患者的基因突变图谱，筛选出对其预后影响的基因标志物。从术后7天血浆样本中提取ctDNA，通过NGS技术，获得术后7天血浆ctDNA检测结果。分期联合筛选出的基因标志物以及术后7天血浆ctDNA检测结果联合建立复发风险因素评分，Risk score，将早中期结直肠癌患者手术后复发风险根据评分区分为高复发风险组和低复发风险组。
名词和术语：
本发明中所述的“Stage”定义是指：按改良RECIST 1.1定义的Ⅱ期和Ⅲ期结直肠癌患者。
本发明中所述的“突变”包含以下两种情况：
单核苷酸变异(SNV)：单个碱基置换引起，导致编码氨基酸发生变化。
插入缺失突变(Indel)：多个碱基插入或缺失导致编码氨基酸的增加或减少，这些类型的突变可能是“蛋白编码框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少；或可导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短。
各指标的初步筛选：
本发明的样本来源于一项临床研究，即ctDNA动态监测预测早中期结直肠癌根治术后复发(一项随机、单盲、前瞻性、多中心临床研究)中199例II～III期结直肠癌患者的手术组织和对应的术后7天血浆样本；其中98人是II期患者，101人是III期患者。
临床相关指标如下：
临床指标(状态)或基因(突变类型)
性别：男或女
年龄：≥60岁或＜60岁
家族史：有或无
MS状态：MSI或MSS
辅助化疗：有或无
分期：II期或III期
术后7天血浆ctDNA检测结果：阳性或阴性
从199例研究对象的肿瘤组织中提取DNA，使用由425个基因构成的靶向测序panel建立了富集文库，对DNA进行NGS测序，并对NGS检测产生的数据进行基因突变分析，得到每例患者的肿瘤特有变异。同时，从199例研究对象的术后7天血浆样本中提取ctDNA，使用由425个基因构成的靶向测序panel建立了富集文库，对ctDNA进行NGS测序，并对NGS检测产生的数据进行基因突变分析，得到每例患者术后7天血浆中的肿瘤特有变异及其最大突变丰度。
本发明中所使用的检测Panel参阅CN109880910A专利，其可以用于检测425个基因。
所涉及到的基因如下：
Figure BDA0002568295660000061
Figure BDA0002568295660000071
对于以上的Panel中的基因，可以通过现有技术中的已知试剂盒产品进行检测，例如世和基因世和一号等。
标志物筛选过程如下：
本发明首先筛选在研究对象人群各临床指标、在样本中突变频率满足≥8％的基因以及术后7天血浆ctDNA检测结果作为初始基因标志物(本专利中将425个基因检测结果中满足以下指标的基因纳入初始研究基因：任何一个突变被检出，并达到设定的阈值(本专利中设定的阈值是最大突变丰度≥0.6％)，并对每个患者该标志物的情况进行判定。
基于以上的初步筛选标准，得到如下的基因，下表为初始标志物的名称与全称，共20个：
Figure BDA0002568295660000072
Figure BDA0002568295660000081
本发明使用一项临床研究，即ctDNA动态监测预测早中期结直肠癌根治术后复发(一项随机、单盲、前瞻性、多中心临床研究)研究中患者接受手术治疗后的无病生存数据(Disease free survival，DFS)。由于患者手术后复发风险不同，本发明严谨定义了复发风险标志物的意义：即，标志物在完全不同的背景下，高复发风险和低复发风险组的预后差异显著不同。相对应的在统计学上，预后标志物定义为“各标志物与无病生存数据的相互作用检验”测试下，结果达到统计学意义显著的标志物。对于初始各标志物，使用Cox比例风险模型对患者的DFS逐个进行相互作用检验分析，通过计算以下两个风险比的比例得到风险比(hazard ratio，HR)：HR＝标志物阴阳性患者术后复发风险比
Cox比例风险模型是生存分析中被广泛认可的半参数回归模型，以生存结局和时间为因变量，同时分析众多因素(例如分期和基因突变等)对患者无病生存期的影响。
下表列出了Cox比例风险模型单因素分析手术后复发相关因子对无进展生存期(DFS)影响的相互风险比(HR)和统计学显著性判断值(P值)，按照P值从低到高排列，如下所示：
Figure BDA0002568295660000091
Figure BDA0002568295660000101
根据单因素的分析结果，将单因素分析显著4个因素，即术后7天血浆ctDNA检测结果、PTEN突变、APC突变和分期(III期)进行多因素分析分析该因素对无进展生存期(DFS)影响的相互风险比(HR)、Cox模型回归系数的wald-z统计量检验值(z-score)以及z检验的统计学显著性判断值(P值)，按照P值从低到高排列，如下所示：
Figure BDA0002568295660000102
多因素分析结果的指标作为该模型中手术后复发相关的因子，它们的相互风险比(HR)、Cox模型回归系数的wald-z统计量检验值(z-score)以及z检验的统计学显著性判断值(P值)如上表所示。
对于单个标志物来说，HR大于1表示患者术后复发风险更高(术后7天血浆ctDNA检测阳性结果、PTEN突变、III期)；小于1表示患者术后复发风险更低(APC突变)。
其余各项指标未达到显著的统计学差异，认为这些指标实际对生存预后不造成影响，故未列入模型。
为了应对多种标志物同时出现所带来的影响，以相互检验结果中的z-score为依据构建了Risk score评分模型，来预测患者术后复发风险情况。对于每个患者，筛选出的4个预后标志物的情况已知。Risk score计算公式如下：
Figure BDA0002568295660000103
上式中zg为该标志物的z检验值；xi,g为患者该标志物的状态，1为上述标志物发生表中对应的状态，0为未发生该状态。g∈Ω表示筛选出的4个标志物。使用z-score(即z检验值zg)作为各标志物权重的优点体现在其为一个标化后的参数检验，计算方法为Cox回归模型的系数除以系数的标准差，以此减小偶然事件给HR及系数带来的偏差。
根据初步筛选，将得到的4个标志物构建出的回归模型如下所示：
Risk score＝1.28×Stage-1.90×AAPC+2.65×APTEN+3.03×Plasma ctDNA
其中，Stage是指每个患者的分期情况，如果分期是Ⅲ期，则取值为1，Ⅱ期为0；
A是指每个基因出现变化的情况，如果基因发生了变化则A取值为1，否则为0；所述的基因发生了变化是指基因发生了突变；
Plasma ctDNA是指手术后7天血浆ctDNA检测结果，如果术后7天血浆ctDNA检测结果为阳性则Plasma ctDNA取值为1，否则为0。
根据构建出的模型，对199例组织样本和术后7天血浆样本检测的数据联合患者分期进行Risk score评分，并根据患者DFS确定了最优的判定阈值为1。根据阈值将患者分为2组，其中Risk score≥1分为手术后复发高风险人群组，共40人；当Risk score＜1分为手术后低复发风险人群组，共159人。图2展示了最优判定阈值下，2组人群DFS生存曲线图。从图中可以看出，Risk score≥1组的患者相对于Risk score＜1组患者来说整体预后较差，且统计学达到显著，p＜0.0001。
模型中各个指标即Stage、2个基因(APC和PTEN)、术后7天血浆ctDNA结果(PlasmactDNA)，以及复发预测模型(Risk score)预测患者复发结果如下表所示
Figure BDA0002568295660000111
如以上表所示，分别利用Stage、基因APC和PTEN、术后7天血浆ctDNA检测结果(Plasma ctDNA)和各个标志物联合建立的Risk score模型对真实世界中已复发患者和未复发患者进行评估，各个标志物联合建立的Risk score模型ROC曲线下AUC值达到最优，为0.75。因此，本研究中各个标志物联合建立的复发预测模型相对于其他单个标志物能更好的预测早中期结直肠癌术后患者的复发趋势。
根据构建出的模型，应用该模型预测199例患者是否在手术后18个月内复发；同时依据患者真实世界复发状态进行评估，验证该模型的准确性。如图3展示了真实世界手术后18个月内复发患者与未复发患者的Risk score，未复发组的Risk score小于复发组Riskscore，且统计学达到显著，p＜0.05。
该评分模型准确地对199例II/III期结直肠癌研究对象进行了进一步的区分及术后复发风险的预测：当评分≥1时，认为患者术后复发风险较高，患者整体预后较差；当评分＜1时，认为患者术后复发风险较低，患者整体预后较好。因此本评分可以用于指导II/III期结直肠癌患者术后复发风险的评估。

Claims (9)

1.一种早中期结直肠癌术后复发风险评估的标志物，其特征在于，包括：结直肠癌分期（Stage）、APC基因、PTEN基因、血浆ctDNA的突变。
2.根据权利要求1所述的早中期结直肠癌术后复发风险评估的标志物，其特征在于，在一个实施方式中，结直肠癌分期是指II期或者III期。
3.一种用于检测上述早中期结直肠癌术后复发风险评估的标志物的试剂盒，其特征在于，包括：
第一检测试剂盒，用于肿瘤组织中的APC基因和PTEN基因的突变进行检测；
第二检测试剂盒，用于对血浆样本中的ctDNA中的突变进行检测。
4.根据权利要求3所述的用于检测上述早中期结直肠癌术后复发风险评估的标志物的试剂盒，其特征在于，在一个实施方式中，还包括：用于对结直肠癌分期进行判定时所用的试剂。
5.一种早中期结直肠癌术后复发风险评估的检测系统，其特征在于，包括：
组织样本测序模块，用于对APC基因和PTEN基因的突变进行检测；
血浆ctDNA样本测序模块，用于对待测对象的血浆ctDNA中的基因突变进行检测；
结直肠癌分期确定模块，用于确定待测对象的结直肠癌分期；
判定模块，用于执行以下判定公式：
Risk score= 1.28×Stage-1.90×AAPC+2.65×APTEN+3.03×Plasma ctDNA；
其中，Risk score是风险值；
Stage是指结直肠癌分期，如果分期是Ⅲ期，则取值为1，Ⅱ期为0；
AAPC是指APC基因是否发生了突变，如果存在突变，则取值为1，否则为0；
APTEN是指APC基因是否发生了突变，如果存在突变，则取值为1，否则为0；
Plasma ctDNA指待测对象在手术后血浆ctDNA检测的结果，如果血浆ctDNA检测结果为阳性则Plasma ctDNA取值为1，否则为0；
并且判定模块根据Risk score的数值来对待测对象的术后复发风险进行确定。
6.根据权利要求5所述的早中期结直肠癌术后复发风险评估的检测系统，其特征在于，在一个实施方式中，判定模块当判定Risk score≥1时，诊断为手术后复发高风险人群；当Risk score＜1时，诊断为手术后低复发风险人群。
7.根据权利要求5所述的早中期结直肠癌术后复发风险评估的检测系统，其特征在于，在一个实施方式中，所述的Plasma ctDNA阳性结果是指术后7天血浆ctDNA检测到肿瘤特有突变的最大突变丰度≥0.6%定义为阳性，术后7天血浆ctDNA检测到肿瘤特有突变的最大突变丰度＜0.6%定义为阴性。
8.根据权利要求5所述的早中期结直肠癌术后复发风险评估的检测系统，其特征在于，在一个实施方式中，所述的特有突变是指ctDNA的单核苷酸变异（SNV）和插入缺失突变（Indel）。
9.一种计算机可读取介质，其特征在于，其中记载有可以运行对早中期结肠癌的术后复发风险评估步骤的程序；所述的评估步骤包括：
获得患者的结肠癌分期结果；
获得患者肿瘤组织中APC基因和PTEN基因的突变情况；
获得患者在术后的血浆中ctDNA的突变情况；
计算以下联合标志物的数值：
Risk score= 1.28×Stage-1.90×AAPC+2.65×APTEN+3.03×Plasma ctDNA；
当判定Risk score≥1时，诊断为手术后复发高风险人群；当Risk score＜1时，诊断为手术后低复发风险人群。
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