CN113284554A - 一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤dna检测系统及应用 - Google Patents

一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤dna检测系统及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种筛查结直肠癌患者术后微小残留病灶的存在、预测复发风险的循环肿瘤DNA检测系统。该检测系统包括结直肠癌组织基因突变筛查模块、血浆游离DNA基因突变分析模块和循环肿瘤DNA状态判断模块。该系统利用同样的下一代测序基因组合面板对原发肿瘤组织和血浆游离DNA进行检测，并考虑患者原发肿瘤组织中检测到的所有突变，而不是局限于个别基因突变，更加全面。该系统可应用于对循环肿瘤DNA的动态、实时监测，可用于评估结直肠癌根治术后微小残留病灶的残留情况，预测复发风险并指导术后治疗决策。

Description

一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环 肿瘤DNA检测系统及应用
技术领域
本发明属于肿瘤预后评估技术领域，具体涉及循环肿瘤DNA检测及其应用。
背景技术
结直肠癌是全球第三大常见癌症，每年新发病例超过1900万。结直肠癌也是癌症相关死亡的第二大主要原因，其五年死亡率约为40％。通过基于血清癌胚抗原和结肠镜的筛查，现如今越来越多的患者可以在出现远处转移之前即被诊断，对于这些患者，手术切除是最佳的治疗方式。但是，相当一部分患者在根治性切除后仍会复发。微小残留病灶(Minimal residual disease，MRD)被认为是疾病复发的主要来源，但是微小残留病灶往往是影像学上不可见的，因此，临床上广泛采用“具有临床病理高危因素(包括三期，分化不良，淋巴血管浸润，神经浸润等)”作为结直肠癌患者术后是否需要进行三到六个月的术后辅助化疗的判断标准。但是，并非所有具有这些高危因素的患者在手术后均存在微小残留病灶，因此在现有技术当中有相当多的患者不得不在无临床获益的情况下承受辅助化疗的不良反应。另外，对于没有高危因素的患者，微小残留病灶可能仍然存在，因此其中一些患者仍应当可以从辅助化疗中受益。此外，接受辅助化疗的患者中，仍有20-30％的患者会出现疾病复发，但是目前尚无可用的工具来评估辅助化疗的疗效并指导辅助化疗后的患者管理。
直接和实时检测微小残留病灶可为结直肠癌患者术后管理决策难题提供理想的解决方案。检测循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)在直接和实时检测微小残留病灶方面具有非常好的应用前景。肿瘤细胞死亡、破碎后，其 DNA会被释放入血，形成ctDNA，因此，从理论上讲，我们可以通过探测血液中ctDNA的方法来捕捉影像学上不可见的微小残留病灶的踪迹，从而识别具有高度复发风险的患者，实现精准治疗。
中国发明专利，公开号为CN112236535A，公开了用于借助于循环肿瘤DNA 的个人化检测的癌症检测和监测的方法。但它需要获取患者原发肿瘤组织进行全外显子测序，挑选8个或16个特征性突变位点设计PCR引物，进而基于多重PCR方法检测血液cfDNA中所挑选的8～16个特征性突变。
发明内容
本发明的目的是解决现有结直肠癌患者根治术后风险分层工具评估效果不佳，难以发现结直肠癌根治术后的微小残留病灶，无法精准指导辅助化疗的难题，以及现有技术当中检测ctDNA技术的不足。对此，我们开发了一套新的检测结直肠癌根治术后循环肿瘤DNA的检测系统。本发明的检测系统，可以实时、动态检测循环肿瘤DNA，通过该检测系统反映、评估患者的微小残留病灶，从而识别具有高度复发风险的结直肠癌患者，指导精准治疗。
本发明的目的是提供一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤DNA检测系统。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种循环肿瘤DNA检测系统，该检测系统包括(1)结直肠癌组织基因突变筛查模块、(2)血浆游离DNA基因突变分析模块和(3)循环肿瘤DNA状态判断模块；
(1)结直肠癌组织基因突变筛查模块：利用同一患者的结直肠癌肿瘤组织和配对的外周血白细胞的基因组DNA的高通量测序数据，以外周血白细胞DNA 基因序列为对照，进行对比识别结直肠癌肿瘤组织中的基因突变；
(2)血浆游离DNA基因突变分析模块：将上述(1)中识别出的结直肠癌肿瘤组织的基因突变作为该患者的一组特征性基因突变，并计算该患者血浆游离 DNA中这组特征性基因突变的校正P值，方法如下：
根据一组健康人的血浆游离DNA测序结果，计算该组特征性基因突变的背景等位基因频率分布；
利用同一患者的血浆游离DNA的高通量测序数据，采用血浆游离DNA中检测到的该基因突变的突变序列数目和正常序列数目，计算该组特征性基因突变中每一个基因突变相对于背景等位基因频率分布的校正P值；
对于该组特征性基因的每一个突变，当校正P值<0.01，认定该突变为存在于该患者的血浆游离DNA中的真实基因突变；
(3)循环肿瘤DNA状态判断模块：判断标准为：当血浆游离DNA真实基因突变数量≥在同一患者肿瘤组织中检测到的基因突变数量的5％时，该份血浆样品判定为循环肿瘤DNA阳性，否则判定为循环肿瘤DNA阴性。
其中，优选地，所述的高通量测序均采用相同的下一代测序基因组合面板。
其中，优选地，所述的结直肠癌肿瘤组织和外周血白细胞样本取样时间为结直肠癌根治术前，所述的血浆游离DNA提取自血浆，血浆取样时间为结直肠癌根治术后。
其中，优选地，所述的结直肠癌肿瘤组织中的基因突变还需满足如下所有情况：
(1)不存在于基于500名健康捐献者的外周血白细胞样本所构建的正常数据库，panel of normal；
(2)在1000Genomes Project，Exome Aggregation Consortium和GenomeAggregation Database数据库中的出现频率小于1％；
(3)在COSMIC数据库v92版本中记录频数≥20次的常见变异，要求变异等位基因频率VAF≥0.5％，支持该变异的测序读数reads≥3，该位点的检测深度≥30x；
(4)对于其他变异，要求变异等位基因频率VAF≥1％，支持该变异的测序读数reads≥6，该位点的检测深度≥30x。
其中，优选地，所述的P值经过Benjamini-Hochberg法进行多重检验校正。
其中，优选地，所述的血浆游离DNA真实基因突变的判断标准除了要满足校正P值<0.01外，还需满足以下条件：
对于在COSMIC数据库v92版本中记录频数≥20次的常见变异，要求支持该变异的测序读数reads≥3，该位点的检测深度≥100x；
对于其它变异，要求支持该变异的测序读数reads≥6，该位点的检测深度≥100x。
另外上述循环肿瘤DNA检测系统中，所述的真实基因突变还可以是，以同一患者的外周血白细胞DNA基因序列为对照，在肿瘤组织中没有检测到而在血浆中检测到的血浆游离DNA基因突变。即以同一患者的外周血白细胞DNA基因序列为对照识别血浆游离DNA中的那些在肿瘤组织中没有检测到的突变。
其中，优选地，所述的在肿瘤组织中没有检测到的血浆游离DNA基因突变需同时符合如下条件：
变异等位基因频率VAF≥1％，支持该变异的测序读数reads≥6，该位点的检测深度≥100x；不存在与克隆性造血基因变异数据库中；在同一患者来源的外周血白细胞DNA中的变异等位基因频率为0％或满足血浆游离DNA变异等位基因频率为外周血白细胞DNA相同位点变异等位基因频率的5倍及以上。
其中，优选地，所述的高通量测序数据进行生物信息学处理，包括：使用 Fastp软件进行测序数据的质量控制、接头去除，具体为删除低质量碱基(质量得分低于30)或N碱基，参考基因组比对，去除多聚酶链式反应(PCR)重复。
其中，优选地，所述的基因突变，包括单核苷酸变异及小片段插入/缺失突变。
另外，所述的循环肿瘤DNA检测系统，用于制备检测循环肿瘤DNA的设备。
本发明具有以下有益效果：
(1)不需全外显子检测，总体检测成本更低；
(2)利用同样的NGS大panel对原发肿瘤组织和血液cfDNA进行检测，可同步开展，一步到位，检测流程更为便捷，检测周期更短，不需经过检测原发肿瘤组织、挑选特征性突变位点设计PCR引物和多重PCR方法检测血液cfDNA；
(3)利用同样的NGS大panel对原发肿瘤组织和血液cfDNA进行检测，可考虑患者原发肿瘤组织中检测到的所有突变，而不是局限于个别突变，更加全面；
(4)利用同样的NGS大panel对原发肿瘤组织和血液cfDNA进行检测，可检测到原发肿瘤组织中因肿瘤异质性而未检出的突变，也可检测到因辅助治疗、免疫编辑等因素所产生的克隆性演化新突变，更加全面。
(5)可用于评估结直肠癌根治术后微小残留病灶的残留情况，进而预测术后复发风险，指导术后辅助治疗。
附图说明
图1为患者在根治术后3-7天、辅助化疗期间、辅助化疗后循环肿瘤DNA (ctDNA)检测反映微小残留病灶(MRD)的存在，提示复发风险的图。其中A 为根据术后3-7天的ctDNA状态评估ctDNA阳性和ctDNA阴性患者的无复发生存期(RFS)的差异图。B为由临床病理因素，频繁突变的基因和术后3-7天ctDNA 状态构建的用于预测1年和2年无复发生存期(RFS)的诺模图。C为展示在20 例ctDNA阳性(术后3-7天)的患者中，接受辅助化疗(ACT)的17例患者的临床病程以及ctDNA状态的动态变化图。D为137例患者在接受辅助化疗(ACT) 后有采集血浆样本，以ACT后第一个采样点的ctDNA状态分层评估ctDNA阳性和ctDNA阴性患者的无复发生存期(RFS)的差异图。
图2为患者在根治性治疗后，连续采血检测循环肿瘤DNA(ctDNA)可早期识别肿瘤复发的结直肠癌患者的图。其中A为125例具有连续采血及足够随访时长的患者中，依据监测期ctDNA转态分层评估ctDNA阳性和ctDNA阴性患者的无复发生存期(RFS)的差异图。B为展示在23例复发患者的的临床病程以及ctDNA状态的动态变化图。C为从手术到通过ctDNA或计算机断层扫描 (CT)识别肿瘤复发的时间示意图，其中虚线表示基于CT(13.70个月)和ctDNA (8.69个月)的平均复发时间。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：循环肿瘤DNA检测
一、样本来源：240位接受根治性手术治疗的结直肠癌患者，按照现行指南标准进行治疗和定期随访。
二、样本采集：收集患者手术切除肿瘤组织样本和外周血白细胞样本，术后 3-7天，术后6个月，术后9个月，术后12个月，术后15个月，术后18个月，术后21个月，术后24个月连续采取患者血浆样本。
三、检测方法：
1、高通量测序：获取结直肠癌患者手术切除肿瘤组织标本和外周血白细胞样本，分别进行细胞基因组DNA提取，测序文库构建，随后利用包含425个癌症相关基因的下一代测序基因组合面板(panel)进行靶向捕获，具体基因列表见表1，而后进行高通量测序。
表1：425Panel基因列表
Figure BDA0003045144930000051
Figure BDA0003045144930000061
Figure BDA0003045144930000071
结直肠癌组织基因突变筛查：该系统的结直肠癌组织基因突变筛查模块对高通量测序的数据进行生物信息学处理，包括：使用Fastp软件进行测序数据的质量控制、接头去除，具体为删除低质量碱基(质量得分低于30)或N碱基，参考基因组比对，去除多聚酶链式反应(PCR)重复。以同一患者来源的外周血白细胞DNA为对照，识别该患者肿瘤组织中的基因突变，包括单核苷酸变异及小片段插入/缺失突变。
对上述识别到的单核苷酸变异及小片段插入/缺失突变进行进一步过滤，将过滤后的突变认定为该患者肿瘤组织中特异性的基因突变。过滤条件如下：(1) 不存在于基于500名健康捐献者的外周血白细胞样本所构建的正常数据库(panel of normal)；(2)在1000Genomes Project，Exome Aggregation Consortium和 Genome AggregationDatabase数据库中的出现频率小于1％；(3)对于癌症中常见突变(COSMIC数据库v92版本中记录频数≥20次)，要求突变等位基因频率 (VAF)≥0.5％，支持该突变的测序读数(reads)≥3，该位点的检测深度≥30x； (4)对于其他突变，要求突变等位基因频率(VAF)≥1％，支持该突变的测序读数(reads)≥6，该位点的检测深度≥30x。
2、血浆游离DNA基因突变分析：获取结直肠癌患者术后血浆样本，进行血浆游离DNA提取，测序文库构建，随后利用与上述相同的下一代测序基因组合面板(panel)进行靶向捕获，而后进行高通量测序。用同样的方式获取一组健康人的血浆样本，提取血浆游离DNA进行测序。
血浆游离DNA基因突变分析：该系统的血浆游离DNA基因突变分析模块对高通量测序的数据进行生物信息学处理，包括：包括：使用Fastp软件进行测序数据的质量控制、接头去除，具体为删除低质量碱基(质量得分低于30)或N 碱基，参考基因组比对，去除多聚酶链式反应(PCR)重复。该系统模块利用健康人的血浆样本的游离DNA测序数据，计算每个突变位点的背景等位基因频率分布，以进行后续“背景抛光”。
对同一来源(患者)的结直肠癌患者肿瘤组织中识别到的基因变异，使用血浆游离DNA中检测到的该基因突变的突变序列数目和正常序列数目来计算其相对于背景等位基因频率分布的P值，并且通过Benjamini-Hochberg法进行多重检验校正(FDR-corrected)，随后将FDR-corrected P值<0.01的基因突变认定为真实基因突变。
对于上述真实基因突变，我们还要求其满足以下条件：对于癌症中常见突变(COSMIC数据库v92版本中记录频数≥20次)，要求支持该突变的测序读数 (reads)≥3，该位点的检测深度≥100x；对于其他突变，要求支持该突变的测序读数(reads)≥6，该位点的检测深度≥100x。
此外，对于在相应原发肿瘤组织中没有检测到的血浆游离DNA基因突变，如果满足以下严格标准，则也将它们认定为真实基因突变并纳入分析，以弥补原发肿瘤组织的异质性和克隆进化所带来的影响。所述严格标准如下：(1)突变等位基因频率(VAF)≥1％，支持该突变的测序读数(reads)≥6，该位点的检测深度≥100x；(2)不存在于克隆性造血基因变异数据库中；(3)在同一患者来源的外周血白细胞DNA中的突变等位基因频率为0％或满足血浆游离DNA变异等位基因频率为外周血白细胞DNA相同位点变异等位基因频率的5倍及以上。
3、循环肿瘤DNA状态判断：该系统的循环肿瘤DNA状态判断模块采用如下标准给出结果：当血浆游离DNA真实基因突变数量≥在同一患者肿瘤组织中检测到的基因突变数量的5％时，该份血浆样品判定为循环肿瘤DNA阳性，否则判定为循环肿瘤DNA阴性。
四、结果：
(1)循环肿瘤DNA检测系统的判断结果及COX比例风险模型计算数据显示：在术后3-7天采血患者血浆样本进行循环肿瘤DNA检测，其中循环肿瘤DNA 阳性患者20位，循环肿瘤DNA阴性患者220位；基于COX比例风险模型计算风险比(HR)，基于240位患者的随访生存资料计算得到该模型参数为：风险比ln[h(t,X)/h0(t)]＝10.98*ctDNA。如图1A所示，循环肿瘤DNA(ctDNA)阳性患者相对于循环肿瘤DNA(ctDNA)阴性患者复发风险显著更高(HR,10.98； 95％CI,5.31-22.72；P<0.001)，两年的无肿瘤复发率为39.3％[95％CI, 21.5％-71.8％]。
(2)基于术后3-7天循环肿瘤DNA(ctDNA)检出与否，联合现有临床病例危险因素，包括SMAD4基因的突变状态，PTEN基因的突变状态，PKHD1 基因的突变状态，原发肿瘤病理分期(Pathological stage)，脉管癌栓 (Lymphovascular invasion)，神经侵犯(Nerveinvasion)这些因素，通过COX比例风险模型构建预后模型(Nomogram)；基于240位患者的随访生存资料计算得到该模型参数为：风险比ln[h(t,X)/h0(t)]＝2.43*SMAD4+2.19*PTEN+0.33*PKHD1+1.14*Pathological stage+1.59*Lymphovascular invasion+ 1.61*Nerveinvasion+8.27*ctDNA。如图1B所示，该模型具有十分优越的结直肠癌术后复发预测性能(Harrell’s C-index，0.802[95％CI,0.727-0.882])。
(3)如图1C所示，在17位术后循环肿瘤DNA阳性并且接受术后辅助化疗的患者中，循环肿瘤DNA的动态变化与患者的临床病程(是否复发)呈现高度的一致性，具体而言，在接受辅助化疗后，如循环肿瘤DNA(ctDNA)仍持续阳性，则患者具有极高复发风险，如循环肿瘤DNA(ctDNA)由阳性转为阴性(表明微小残留病灶被辅助化疗所清除)，则患者复发风险极低。
(4)在结直肠癌患者完成辅助化疗后采集血浆样本，通过循环肿瘤DNA 检测系统检测循环肿瘤DNA。基于COX比例风险模型计算检出循环肿瘤DNA 的患者相比于未检出循环肿瘤DNA的患者的复发风险(HR)，以及两年无肿瘤复发率。基于患者的随访生存资料计算得到该模型参数为：风险比ln[h(t,X)/h0(t)] ＝12.76*ctDNA。
如图1D所示，检出循环肿瘤DNA(ctDNA)的患者相比于未检出循环肿瘤 DNA(ctDNA)的患者具有极高的肿瘤复发风险(HR,12.76；95％CI,5.39-30.19； P<0.001)，两年的无肿瘤复发率为25.0％[95％CI,9.4％-66.6％]。
综上所述，患者在根治术后3-7天、辅助化疗期间、辅助化疗后，采用本发明的检测系统检测循环肿瘤DNA，其系统的判断结果ctDNA阳性可反映微小残留病灶(MRD)的存在，提示极高的癌症复发风险。
实施例2：连续采血检测循环肿瘤DNA识别肿瘤复发
基于实施例1，纳入其中具有连续术后血浆样本(≥3)及足够随访时长(≥24 个月或肿瘤复发)的结直肠癌患者分析连续采血检测循环肿瘤DNA是否能够早期识别肿瘤复发。
随访观察本发明的检测系统判定的ctDNA阳性患者最终是否出现肿瘤复发，计算从首次ctDNA检测呈阳性到肿瘤复发的时间，即为ctDNA检测相较于常规影像学手段在预示肿瘤复发上所提前的时间。
如图2A所示，基于患者的随访生存资料计算得到COX比例风险模型参数为：风险比ln[h(t,X)/h0(t)]＝32.02*ctDNA，该系统检测出循环肿瘤DNA阳性的患者相比于未检出循环肿瘤DNA的患者具有极高的肿瘤复发风险(HR,32.02； 95％CI,10.79-95.08；P<0.001)，两年的无肿瘤复发率仅为24.0％[95％CI, 11.9％-48.2％]。
如图2B所示，连续循环肿瘤DNA(ctDNA)检测识别肿瘤复发的准确率可达到92.0％(敏感性82.6％，特异性94.1％)。
如图2C所示，定期循环肿瘤DNA(ctDNA)检测可比常规影像学检测平均提前5.01个月预示肿瘤复发。
综上所述，在结直肠癌患者完成根治性治疗后，定期采血检测循环肿瘤DNA 检测系统检测ctDNA，能够更早地、准确地识别出存在微小残留病灶的患者，提示极高的复发风险。并且，早期发现肿瘤复发，可为治疗提供时间窗，提高二次切除率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种循环肿瘤DNA检测系统，其特征在于，该检测系统包括(1)结直肠癌组织基因突变筛查模块、(2)血浆游离DNA基因突变分析模块，和(3)循环肿瘤DNA状态判断模块；
(1)结直肠癌组织基因突变筛查模块：利用同一患者的结直肠癌肿瘤组织和配对的外周血白细胞的基因组DNA的高通量测序数据，以外周血白细胞DNA基因序列为对照，进行对比识别结直肠癌肿瘤组织中的基因突变；
(2)血浆游离DNA基因突变分析模块：将上述(1)中识别出的结直肠癌肿瘤组织的基因突变作为该患者的一组特征性基因突变，并计算该患者血浆游离DNA中这组特征性基因突变的校正P值，方法如下：
根据一组健康人的血浆游离DNA测序结果，计算该组特征性基因突变的背景等位基因频率分布；
利用同一患者的血浆游离DNA的高通量测序数据，采用血浆游离DNA中检测到的该基因突变的突变序列数目和正常序列数目，计算该组特征性基因突变中每一个基因突变相对于背景等位基因频率分布的校正P值；
对于该组特征性基因的每一个突变，当校正P值<0.01，认定该突变为存在于该患者的血浆游离DNA中的真实基因突变；
(3)循环肿瘤DNA状态判断模块：判断标准为：当血浆游离DNA真实基因突变数量≥在同一患者肿瘤组织中检测到的基因突变数量的5％时，该份血浆样品判定为循环肿瘤DNA阳性，否则判定为循环肿瘤DNA阴性。
2.如权利要求1所述的循环肿瘤DNA检测系统，其特征在于，所述的高通量测序均采用相同的下一代测序基因组合面板。
3.如权利要求2所述的循环肿瘤DNA检测系统，其特征在于，所述的结直肠癌肿瘤组织和外周血白细胞样本的取样时间为结直肠癌根治术前，所述的血浆游离DNA提取自血浆，血浆取样时间为结直肠癌根治术后。
4.如权利要求3所述的循环肿瘤DNA检测系统，其特征在于，所述的结直肠癌肿瘤组织中的基因突变还需满足如下所有情况：
(1)不存在于基于500名健康捐献者的外周血白细胞样本所构建的正常数据库，panelof normal；
(2)在1000Genomes Project，Exome Aggregation Consortium和Genome AggregationDatabase数据库中的出现频率小于1％；
(3)在COSMIC数据库v92版本中记录频数≥20次的常见变异，要求变异等位基因频率VAF≥0.5％，支持该变异的测序读数reads≥3，该位点的检测深度≥30x；
(4)对于其他变异，要求变异等位基因频率VAF≥1％，支持该变异的测序读数reads≥6，该位点的检测深度≥30x。
5.如权利要求1所述的循环肿瘤DNA检测系统，其特征在于，所述的P值经过Benjamini-Hochberg法进行多重检验校正。
6.如权利要求1所述的循环肿瘤DNA检测系统，其特征在于，所述的血浆游离DNA真实基因突变的判断标准除了要满足校正P值<0.01外，还需满足以下条件：
对于在COSMIC数据库v92版本中记录频数≥20次的常见变异，要求支持该变异的测序读数reads≥3，该位点的检测深度≥100x；
对于其它变异，要求支持该变异的测序读数reads≥6，该位点的检测深度≥100x。
7.如权利要求1所述的循环肿瘤DNA检测系统，其特征在于，所述的真实基因突变还可以是，以同一患者的外周血白细胞DNA基因序列为对照，在肿瘤组织中没有检测到的血浆游离DNA基因突变。
8.如权利要求7所述的循环肿瘤DNA检测系统，其特征在于，所述的在肿瘤组织中没有检测到的血浆游离DNA基因突变需同时符合如下条件：
变异等位基因频率VAF≥1％，支持该变异的测序读数reads≥6，该位点的检测深度≥100x；不存在与克隆性造血基因变异数据库中；在同一患者来源的外周血白细胞DNA中的变异等位基因频率为0％或满足血浆游离DNA变异等位基因频率为外周血白细胞DNA相同位点变异等位基因频率的5倍及以上。
9.如权利要求1所述的循环肿瘤DNA检测系统，其特征在于，所述的基因突变包括单核苷酸变异及小片段插入/缺失突变。
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