CN118147310A - 用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合及其应用，所述用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合包括SMAD4、TP53、AKT1、APC、BRAF、CTNNB1、ERBB3、FBXW7、HRAS、KRAS、NRAS、PIK3CA、PPP2R1A、RNF43和POLE。本发明的基因Panel试剂盒通过对结直肠癌术后患者的ctDNA样本持续检测分析，能准确反映微小残留肿瘤状态，对患者的肿瘤发生发展的分子状态进行持续跟踪，相比于常规的影像学、CEA癌胚抗原指标能提前预测复发，对结直肠癌患者的术后临床管理和及时干预治疗具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合及其应用。
背景技术
MinimalResidual Disease(MRD)微小残留病灶是指癌症患者在治疗中或治疗后体内仍有残留的恶性肿瘤细胞存在，细胞坏死或凋亡过程中释放出肿瘤循环DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）。在NCCN指南和欧洲专家共识中，MRD即指可测量残留病灶，即Measurable Residual Disease。MRD阳性患者通常比阴性患者预后更差、复发更早、死亡更早。
检测循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)在直接和实时检测MRD方面具有非常好的应用前景。肿瘤细胞死亡、破碎后，其DNA会被释放入血，形成ctDNA，因此，从理论上讲，可以通过探测血液中ctDNA的方法来捕捉影像学上不可见的微小残留病灶的踪迹，从而识别具有高度复发风险的患者，对评估疾病状态、判断疗效、预测复发、指导治疗具有重要的临床意义。MRD监测的时间点及检测灵敏度对于复发预测尤为重要。
目前对于基于血浆中肿瘤游离核酸ctDNA的MRD检测，主流的检测技术包括肿瘤知情分析（Tumor-informed）和肿瘤不知情分析（Tumor-agnostic）两种路线。肿瘤知情分析路线通常先进行组织全外显子WES检测，用配对血检测精准地排除非肿瘤来源的变异，然后针对组织检测结果定制个性化的基因组合（panel）进行超高深度测序进行肿瘤变异的监控；肿瘤不知情分析路线一般是对血液进行固定基因组合检测，仅凭血液检测获得最高的敏感性。其中，肿瘤知情分析路线需要针对每个患者设计个性化的追踪基因组合，但难以解决肿瘤发生发展过程中的时空异质性问题，无法追踪新发突变，并且很难标准化，且成本较高。与之相对比的是，肿瘤不知情分析路线通常采用已经设计好的固定化基因组合来进行检测，可以获取更多变异信息，流程可标准化，同时可研究克隆演化。但固定化基因组合的难点在于靶标集合针对哪些位点，将直接影响到可追踪的患者比例，并且对检测技术灵敏度要求较高。
因此，有必要开发一种固定化panel，不需要根据每个患者进行定制，开发成本低，能够提供一种覆盖患者比例最大化的固定化基因组合用于结直肠癌样本的微小残留病灶MRD监测，同时控制基因组合大小，压缩测序量，降低患者的检测经济负担，并达到较高的灵敏度，对结直肠癌患者的术后临床管理具有重大意义。
发明内容
本发明目的是提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合及其应用，通过对ctDNA（循环肿瘤DNA）靶标集合的高深度测序和分析能够覆盖99.6%的II、III期结直肠癌患者，对其术后5个月复发风险检测灵敏度达99%，特异性达94%。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一组用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合，所述用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合包括以下目标编码区域：
AKT1中如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的目标编码区域，
APC中如SEQ ID NO.3所示的目标编码区域，
BRAF中如SEQ ID NO.4所示的目标编码区域，
CTNNB1中如SEQ ID NO.5所示的目标编码区域，
ERBB3中如SEQ ID NO.6所示的目标编码区域，
HRAS中如SEQ ID NO.7所示的目标编码区域，
KRAS中如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10所示的目标编码区域，
NRAS中如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示的目标编码区域，
PIK3CA中如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.18所示的目标编码区域，
POLE中如SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20所示的目标编码区域，
PPP2R1A中如SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.24所示的目标编码区域，
RNF43中如SEQ ID NO.25所示的目标编码区域，
SMAD4中如SEQ ID NO.26-SEQ ID NO.36所示的目标编码区域，
TP53中如SEQ ID NO.37-SEQ ID NO.42所示的目标编码区域，
FBXW7中如SEQ ID NO.43-SEQ ID NO.44所示的目标编码区域。
在本发明的第二方面，提供了用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的产品包括针对所述的的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合进行ctDNA高通量测序检测丰度水平的产品。
所述丰度水平的测定可以利用本领域公知的方法进行，包括但不限于定量PCR、基因芯片、二代高通量测序、Panomics或Nanostring技术。
作为一种具体的实施方式，所述用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的产品包括：
检测AKT1中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示中的至少一种；
检测APC中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.47-SEQ ID NO.87所示中的至少一种；
检测BRAF中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89所示中的至少一种；
检测CTNNB1中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91所示中的至少一种；
检测ERBB3中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93所示中的至少一种；
检测HRAS中目标编码区域的探针，如SEQ ID NO.94所示；
检测KRAS中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.95-SEQ ID NO.97所示中的至少一种；
检测NRAS中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99所示中的至少一种；
检测PIK3CA中目标编码区域的探针，选自SSEQ ID NO.100-SEQ ID NO.110所示中的至少一种；
检测POLE中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.111-SEQ ID NO.113所示中的至少一种；
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检测SMAD4中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.121-SEQ ID NO.152所示中的至少一种；
检测TP53中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.153-SEQ ID NO.165所示中的至少一种；
检测FBXW7中目标编码区域的探针，选自SEQ ID NO.166-SEQ ID NO.168所示中的至少一种。
在本发明的第三方面，提供了一种所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合、所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的产品在建立预测用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统中的应用。
在本发明的第四方面，提供了一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统，所述预测系统包括：
测序模块，用于通过对待测样本提取的DNA中针对所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的ctDNA进行高通量测序，获得测序结果；
分析模块，用于对所述测序结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息；
对比模块，将突变信息与所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合进行比对，判断突变的致病性。
在本发明的第五方面，提供了一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统，所述系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述处理器含有所述的所述测序模块、分析模块和对比模块， 所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
测序模块对待测样本提取的DNA中针对所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的ctDNA进行高通量测序，获得测序结果；
分析模块对所述测序结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息；
对比模块将突变信息与所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合进行比对，判断突变的致病性。
在本发明的第六方面，提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时使用所述的步骤。
在本发明的第七方面，提供了一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的产品，包括：
所述用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的产品；
所述用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统或所述的计算机可读存储介质。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
（1）本申请提供的一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合，为筛选得到最简约的靶标区域，并通过实例验证证实该基因组合是有效的。由于治疗后ctDNA含量极低，按照相关检测指南，需要达到万分之二以上的精度才能反应出真实的病灶情况。只有用最精准且简约的靶标区域，才能在保持高精度的同时成本更低，推广性和可应用转化性更高。本发明所述靶标集合的区域精简，仅56kb，所需测序数据量相比其他类似产品要少的多，但是临床实例验证下来其精度能达到更高。并且成本低，推广性更强。
（2）本发明通过对ctDNA（循环肿瘤DNA）靶标集合的高深度测序和分析能够覆盖99.6%的II、III期结直肠癌患者，对其术后5个月复发风险检测灵敏度达99%，特异性达94%。适用性广。
（3）采用固定化基因组合实现对不同结直肠癌患者的微小残留病状态进行监测，能准确反映微小残留肿瘤状态，对患者的肿瘤发生发展的分子状态进行持续跟踪。相比常规CEA肿瘤标识物检测能提早100天预测肿瘤复发，并且不需要额外组织样本进行定制，适用性强。
（4）本发明检测灵敏度高，对微小残留病灶状态的检测灵敏度高达0.01%，能够准确反映微小残留病状态，应用前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明提供的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的对结直肠癌术后复发预测能力的验证结果。
图2为常规CEA肿瘤标识物检测影像确认复发的时间的结果以及本发明的ctDNA方法检测到影像确认复发的时间的结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例、比对例及实验数据对本申请的一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合及其在制备用于检测结直肠癌微小残留病灶的产品中的应用进行详细说明。
实施例1、用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合及其筛选方法
一、用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的筛选，具体步骤包括：
1、通过收集公共数据库(包括COSMIC，TCGA，NCBI,ONCOKB)中结直肠癌患者突变覆盖大于20人的位点（总患者样本大于300人），并结合结直肠癌驱动基因，驱动突变，高复发热点突变，预后基因位点，靶药相关位点等填充，获得起始靶标集合P0。
2、采用统计检验方法分析公共数据库中肿瘤样本与正常样本的突变位点的差异，过滤掉公共数据库中注释的所有的良性变异或疑似良性变异，从P0中剔除这些良性变异，获得特异靶标集合为P1，其中所述良性变异或疑似良性变异的数据库为Clinvar数据库和COSMIC数据库。
3、继续对P1中的克隆性造血基因突变进行过滤剔除，获得靶标集合为P2。
4、对P2进一步精简与结直肠癌复发无关的基因突变位点；最终获得了一个新的可用于结直肠癌术后复发风险预测，同时也有助于辅助治疗决策的靶标集合P3。
二、最后筛选得到用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合，所述用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合如表1所示，目标区域具体位置如表2所示：
表1
表2
实施例2、用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的产品
1、基于实施例1的结果，本发明实施例2开发了用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的探针，如表3所示：
表3
。
2、提取检测样本DNA；
具体提取步骤为：提取患者血液样本大于等于20ml，离心分离血浆和血细胞。
3、构建检测样本DNA测序文库获得DNA文库；具体包括：
（1）样本打断处理，获得处理后的DNA：样本DNA提取，不同样本提取的DNA主要分出：游离DNA（cfDNA）和完整基因组DNA（gDNA），其中cfDNA的片段大小一般在180bp左右，gDNA一般在5kbp以上。基于目前二代测序主流PE150的测序策略，一般我们将基因文库构建成300-500bp左右的大小。因此，cfDNA可直接进行文库构建，完整基因组DNA选择使用机械打断的方式，将大片段打断成小片段后再进行文库构建，一般使用cfDNA每个样本20ng，gDNA每个样本200ng。
（2）处理后的DNA进行末端修复和加A：将样本和末端修复反应缓冲液和末端修复酶按体系混匀后进行20℃ 30min，72℃ 30min进行末端修复反应，此过程主要先对样本的DNA序列进行修复，将DNA链缺失的地方进行填补，使其形成完整的双链结构，并将两端补成平末端，随后在双链DNA的3’端增加A碱基，用于后续带有T碱基尾的测序接头的连接。
（3）接头连接：在以上完成的末端修复体系中，加入接头、连接反应缓冲液和连接酶试剂，加入混匀后进行20℃ 15min的接头连接酶反应，将测序接头和样本DNA双链连接。
（4）连接后纯化：纯化磁珠吸附5min，后将连接产物中的DNA固定在磁珠上，将反应管置于磁力架上后，用80%无水乙醇溶液清洗磁珠两次，每次30s，最后将反应管中的80%无水乙醇溶液完全弃除，留下磁珠。
（5）产物富集扩增：将上一步的磁珠使用21ul水回溶，磁珠吸附后，将20ul上清液转入新管中，加入5ul扩增接头和25ul扩增酶混合液，扩增程序为：
表4
。
（6）产物纯化：向获得的扩增产物中加入1×50 ul的纯化磁珠，和连接后纯化一样，使用80%无水乙醇溶液清洗晾干后，使用31 ul水回溶，洗脱出磁珠上的基因文库，磁珠吸附后，将30ul上清液转入新管中。
（7）产物质检：将最终获得的产物进行qubit浓度检测和琼脂糖凝胶电泳的片段大小检测，完成后记录数据信息，将样本置于-20℃保存。
4、表3所示检测探针（该实施例包含表3中所有SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.168所示探针）与所述DNA文库杂交捕获，并测序。
5、对测序结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息。
6、将突变信息与实施例1所述的基因组合进行比对，判断突变信息的致病性。
分析原则为：
ctDNA中测序结果中，只要发现靶标集合范围内的突变≥1（即含有1个及以上的突变），可判定为阳性，即当前具有直肠癌微小残留病灶风险，存在复发风险；
如果ctDNA中未发现靶标集合范围内的突变（即突变=0），可判定为阴性，即当前不具有直肠癌微小残留病灶风险，复发风险较低。
实施例3、实施例1的基因组合建立用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统
一、基于实施例1的结果，本发明实施例2开发了结直肠癌预后评分系统。我们应用逐步的典型判别分析（canonical discriminant analysis）来识别能够以100%的准确性鉴别病人预后的基因标记物，最后确定了一组由15个特定的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合（具体见表3）构成的评分系统，获得了100%的预后预测准确率。
所述预测系统包括：
测序模块，用于对待测样本提取的DNA中针对所述的基因组合的ctDNA进行高通量测序，获得测序结果；
分析模块，用于对所述测序结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息；
对比模块，将突变信息与所述的基因组合进行比对，判断突变的致病性。
实施例4、用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统
本发明实施例提供了一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统，所述系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
测序模块对待测样本提取的DNA中针对所述的基因组合的ctDNA进行高通量测序，获得测序结果；
分析模块对所述测序结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息；
对比模块将突变信息与所述的基因组合进行比对，判断突变的致病性。
实施例5、计算机可读存储介质
本发明实施例提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现实施例4所述方法的步骤。
当然，本发明实施例所提供的一种包含计算机可执行指令的存储介质，其计算机可执行指令不限于如上所述的方法操作，还可以执行本发明任意实施例所提供的方法中的相关操作。
通过以上关于实施方式的描述，所属领域的技术人员可以清楚地了解到，本发明可借助软件及必需的通用硬件来实现，当然也可以通过硬件实现，但很多情况下前者是更佳的实施方式。基于这样的理解，本发明的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品可以存储在计算机可读存储介质中，如计算机的软盘、只读存储器 (Read-Only Memory，ROM)、随机存取存储器(RandomAccess Memory， RAM)、闪存(FLASH)、硬盘或光盘等，包括若干指令用以使得一台电子设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行本发明各个实施例所述的方法。
值得注意的是，上述实施例中，所包括的各个单元和模块只是按照功能逻辑进行划分的，但并不局限于上述的划分，只要能够实现相应的功能即可；另外，各功能单元的具体名称也只是为了便于相互区分，并不用于限制本发明的保护范围。
应用例1、预测临床结直肠癌患者的预后效果
1、靶标集合的适用性
本发明为验证靶标集合的适用性，跟踪招募了231名II、III期合格患者，收集了他们的原发肿瘤组织和共计1047份血浆样本。首先采用实施例2中的探针，对原发肿瘤组织DNA建库后，采用聚合酶链反应（PCR）扩增，再进行靶向大规模平行测序。在231例符合条件的病例中，有230例（99.6%）在原发肿瘤组织中至少发现了一个突变，验证了靶标集合对结直肠癌患者的适用性。随后持续收集术后血浆样本，并基于上述靶标集合进行ctDNA测序检测。
结果如图1所示，发现在未接受辅助化疗的患者中，178例患者中有14例（7.9%）术后检测到ctDNA阳性（发现靶标集合范围内的突变），其中11例（79%）在中位随访27个月时复发；而164例术后ctDNA阴性（未发现靶标集合范围内的突变）患者中只有16例（9.8 %）复发，其中，危险比（HR）为18；95%置信度下置信区间（CI）是7.9至40；P< 0.001，这些结果验证了本发明的基于靶标集合检测循环肿瘤DNA（ctDNA）可以识别出复发风险最高的患者，并预测II、III期结肠癌患者的复发。
基于影像学证据，通过时间依赖性ROC曲线分析，术后ctDNA在预测5、6、12、18 、18、24、36和40个月的准确性如表5所示：
表5
| 时间 (月) | 5 | 6 | 12 | 18 | 24 | 36 | 40 |
| 样品大小（例） | 178 | 178 | 178 | 178 | 178 | 178 | 178 |
| 灵敏度% | 0.99 | 0.59 | 0.43 | 0.45 | 0.48 | 0.48 | 0.37 |
| 特异性% | 0.93 | 0.94 | 0.97 | 0.98 | 1 | 1 | 1 |
由表5可知，用于检测结直肠癌微小残留病灶的产品对术后5个月复发风险检测灵敏度达99%，特异性达93%。
3、和已发表研究的结直肠癌基因标志物比较
为与常规CEA标志物检测进行比较。我们在随访期间进行了连续3个月的ctDNA和CEA值追踪，34例复发患者中，有27例有连续记录3个月的ctDNA和CEA值。
结果如图2所示，在放射学复发时，ctDNA阳性（27例中23例）例数高于CEA升高例数（27例中11例）（85%对41%；P= 0.002)。且本发明的ctDNA检测到放射复发的时间（中位数167天；IQR 81~279天）显著长于CEA升高到放射复发的时间（中位数61天；IQR0~207天；P=0.04）。
图2结果表明：与常规CEA肿瘤标识物检测相比，本发明的ctDNA检测方法到影像确认复发的时间显著长于CEA升高到影像确认复发的时间。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合，其特征在于，所述用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合包括以下目标编码区域：
AKT1中如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的目标编码区域，
APC中如SEQ ID NO.3所示的目标编码区域，
BRAF中如SEQ ID NO.4所示的目标编码区域，
CTNNB1中如SEQ ID NO.5所示的目标编码区域，
ERBB3中如SEQ ID NO.6所示的目标编码区域，
HRAS中如SEQ ID NO.7所示的目标编码区域，
KRAS中如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10所示的目标编码区域，
NRAS中如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示的目标编码区域，
PIK3CA中如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.18所示的目标编码区域，
POLE中如SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20所示的目标编码区域，
PPP2R1A中如SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.24所示的目标编码区域，
RNF43中如SEQ ID NO.25所示的目标编码区域，
SMAD4中如SEQ ID NO.26-SEQ ID NO.36所示的目标编码区域，
TP53中如SEQ ID NO.37-SEQ ID NO.42所示的目标编码区域，
FBXW7中如SEQ ID NO.43-SEQ ID NO.44所示的目标编码区域。
2.一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的产品，其特征在于，包括针对权利要求1所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合进行ctDNA高通量测序检测丰度水平的产品。
3.一种权利要求1所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合、权利要求2所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的产品在建立预测用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统以及制备用于检测结直肠癌微小残留病灶的产品中的应用。
4.一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统，其特征在于，所述系统包括：
测序模块，用于对待测样本提取的DNA中针对权利要求1所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的ctDNA进行高通量测序，获得测序结果；
分析模块，用于对所述测序结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息；
对比模块，将突变信息与权利要求1所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合进行比对，判断突变的致病性。
5.一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统，其特征在于，所述系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述处理器含有权利要求4所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统的所述测序模块、分析模块和对比模块，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
测序模块对待测样本提取的DNA中针对权利要求1所述用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的ctDNA进行测序文库构建并高通量测序，获得测序结果；
分析模块对所述测序结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息；
对比模块将突变信息与权利要求1所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合进行比对，判断突变的致病性。
6.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时使用权利要求5所述的步骤。
7.一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的产品，其特征在于，包括：
权利要求2所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的基因组合的产品；
和权利要求4-5任一所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的系统或权利要求6所述的计算机可读存储介质。
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