CN104470534A - 用于治疗退变性病症的ledgf肽及其制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有抗蛋白质聚集活性的LEDGF肽和使用方法。本文公开的LEDGF肽显示治疗退变性疾病和具有包括氧化应激和蛋白质聚集应激的各种细胞应激的疾病的能力。此外，本发明提供延长释放制剂，包括适于眼部施用的制剂。

Description

用于治疗退变性病症的LEDGF肽及其制剂
相关申请
本申请要求2012年5月21日提交的美国临时专利申请号61/649,847和2012年11月16日提交的国际专利申请号PCT/US2012/065620的优先权。以上确认的优先权申请的内容据此以引用的方式完全并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及用于治疗退变性疾病和具有包括氧化应激和蛋白质聚集应激的各种细胞应激的疾病的新型晶状体上皮源性生长因子(LEDGF)肽及其组合物。更具体来说，本发明涉及具有增强的稳定性和持续的递送分布的新型LEDGF1-326制剂和它们治疗蛋白质聚集介导的疾病、老年性疾病和退变性疾病的用途。
背景
在美国，包括老年性黄斑变性(AMD)和视网膜色素变性(RP)的眼后段疾病是致盲的主要病因。(Jager等，N ENGL J MED，2008.358(24)：2606-17)。当前，在美国约800万个体正罹患AMD，并且截至2020年，预期这个数目会达到1200万。(Jager等；Friedman等ArchOphthalmol，2004.122(4)：第564-72页)。与慢性氧化应激和炎症相关的干性形式的AMD(干性AMD)占AMD病例的90％。(Libby等AdvExp Med Biol，2010.664：第403-9页；Stuen.Generations，2003.27：第8-14页)。另一方面，RP是一种由超过50个不同基因突变引起的遗传疾病。(Ohguro，H.等，Nihon Ganka Gakkai Zasshi，2002.106(8)：第461-73页；Dryja，，等，Nature，1990.343(6256)：第364-6页。)全世界约150万人当前罹患RP。(Hartong等，Lancet，2006.368(9549)：第1795-809页)。
眼的独特解剖结构和生理机能是针对眼背面(包括视网膜退变性疾病)的药物治疗剂进步的主要障碍。(Kompella等，Ther Deliv.1(3)：第435-56页)。由于存在各种静态屏障(角膜、结膜和巩膜以及其它组织)和动态屏障(眨眼、泪膜、泪翻转和诱发的流泪)，表面施用途径在向眼背面递送药物方面是低效的。(Gaudana，R.等，Ocular drugdelivery.Aaps J，2010.12(3)：第348-60页；Thrimawithana等DrugDiscov Today，2011.16(5-6)：第270-7页)。另一方面，血液视网膜屏障(BRB)、全身性降解、全身性副作用和在靶标部位处浓度较低是静脉内途径的主要挑战。如前眼房内、眼周、视网膜下的其它途径具有它们自身的一小组问题，所述问题与表面和全身性施用途径共有一些争论点(Baid等Drug Development and the back ofthe eye.KompellaUB编.2010，第409-448页：Springer)。如玻璃体内注射的局部递送将药物放置在紧密邻近视网膜(视网膜退变性疾病的靶标组织)处且因此是向视网膜递送药物的最有效途径。然而，频繁玻璃体内注射药物会导致各种并发症，如视网膜脱离、视网膜出血、眼内炎、眼内压增加，而更不必提及患者顺应性和感染。(Peyman等Retina，2009.29(7)：第875-912页.；Wu等Semin Ophthalmol，2009.24(2)：第100-5页)。因此，对可延长药物在眼中的保留的组合物和递送系统存在需要。
新型药物递送系统已赢得较大关注，其可持续延长时期来持续或控制释放药物以及增加如蛋白质、基因和其它小分子的治疗剂的稳定性和生物可用度。生物可降解(PLGA、PCL)和非生物可降解(例如维曲赛特(Vitraset)和莱替舍特(Retisert))植入物提供用于历经数月至数年持续释放药物的平台。然而，生物可降解植入物的不稳定药物释放分布以及要求高度侵袭性眼手术是少许缺点。微米颗粒和纳米颗粒持续数周至数月提供囊封的分子的持续释放。然而，在制备期间使用如二氯甲烷的有机溶剂会使蛋白质变性且降低蛋白质功效，从而导致治疗无效。此外，囊封效率、控制的颗粒尺寸和制备期间的无菌性是其它障碍。也已尝试基于离子电渗、微针、超声的眼部递送，然而，主要进步是就小分子药物而言，且仍然处于探究阶段并且需要验证以确定它们的功效和安全性。因此，随着涌现的用于视网膜变性的疗法获得不断提高的进步，向后段的非侵袭性或最小侵袭性控制和持续递送正变得极其重要。
概述
本发明涉及可以高数量、高纯度或两者产生的LEDGF生物活性肽。举例来说，如通过SDS-PAGE和SEC-HPLC所定量，本发明涉及可在每升培养物20mg或大于20mg下且在90％或大于90％纯度下产生的LEDGF肽。在一个示例性实施方案中，肽是约40kDa单体，其可以80kDa二聚体形式存在。在另一示例性实施方案中，肽主要具有无规卷曲结构且包括N末端应激相关的结合结构域和任选TAT结合结构域。
在另一示例性实施方案中，肽包含LEDGF的氨基酸1-326(LEDGF1-326)。在另一示例性实施方案中，肽包含SEQ ID NO：2。在另一示例性实施方案中，肽包含与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。此外，本发明包括编码SEQ ID NO：2的核酸序列或编码与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。本发明还包括含有所述核酸序列的载体。在一个示例性实施方案中，载体是pET-28a(+)载体。
在另一方面，本发明包含含有LEDGF肽的组合物。在一个示例性实施方案中，组合物包含LEDGF肽与药物载体、稀释剂、赋形剂或其组合的组合。在另一示例性实施方案中，组合物包含与如锌的胶态金属颗粒缔合或结合以形成纳米装配体的LEDGF肽。在另一示例性实施方案中，组合物包含囊封或结合于装载至多孔外部颗粒中的内部颗粒的LEDGF肽。在某些示例性实施方案中，用于以上组合物中的LEDGF肽是LEDGF1-326。
在另一方面，本发明涉及通过向有需要的患者施用以上LEDGF肽组合物来治疗蛋白质聚集介导的疾病的方法。在某些示例性实施方案中，蛋白质聚集介导的疾病是视网膜变性疾病。示例性视网膜变性疾病包括但不限于老年性黄斑变性(AMD)、视网膜色素变性(RP)和糖尿病性视网膜病变(DR)。在另一示例性实施方案中，蛋白质聚集介导的疾病是神经退变性疾病，包括但不限于阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)、帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)、亨廷顿氏病(HD)、肌萎缩性侧索硬化或朊病毒疾病。
附图简述
图1是纯化全长LEDGF的免疫印迹，其指示试图纯化全长LEDGF会产生不稳定和片段化产物。
图2是比较全长LEDGF与LEDGF1-326的图。
图3是琼脂糖凝胶的图片，其显示编码LEDGF1-326的核酸序列被成功克隆至pET-28a(+)中。PCR扩增Ledgf1-326基因且接着连接至pET-28a(+)载体中。泳道1：PCR扩增的Ledgf1-326基因，泳道2：未切割环状pET-28a(+)，泳道3：线性化BamHI消化的pET-28a(+)，泳道4：未切割环状pLEDGF1-326(连接有Ledgf1-326的pET-28a(+))，泳道5：线性化BamH1消化的pLEDGF1-326，泳道6：线性化HindIII消化的pLEDGF1-326，泳道7：BamHI和HindIII双重消化的pLEDGF1-326，泳道8：自pLEDGF1-326PCR扩增Ledgf1-326基因。
图4A至4C是一组显示成功表达和纯化LEDGF1-326的图：A)SDS-PAGE-泳道1蛋白质标记(Fermentas，Glen Burnie，MD)，泳道2未诱导的细胞溶解产物，泳道3IPTG诱导的细胞溶解产物，泳道4溶解产物的可溶性部分，泳道5由FPLC-阳离子交换管柱获得的LEDGF1-326，泳道6由FPLC-凝胶过滤管柱获得的LEDGF1-326；B)FPLC-阳离子交换色谱图；C)FPLC-凝胶过滤色谱图。
图5A至5D是一组显示LEDGF1-326的某些物理特征的图。A)SEC-HPLC：使用含有1mM CaCl2的25mM Tris-HCL缓冲液(pH 7.0)在Agilent Bio-SEC管柱上按尺寸分离LEDGF1-326。LEDGF1-326主要洗脱为在11.5分钟时的单峰，伴有约5％较高分子量物质。B)MALDI-TOF：LEDGF1-326具有分子量40kDa，并且可以二聚体形式存在。C)DLS：使用Nano ZS在25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中分析LEDGF1-326尺寸。LEDGF1-326具有直径约10nm的单分散群体，不存在聚集体。D)SDS-PAGE：在4-15％SDS-PAGE胶凝上在还原性(β-巯基乙醇且煮沸)和非还原性(无β-巯基乙醇且不煮沸)条件下按尺寸分离LEDGF1-326。非还原性胶凝指示存在LEDGF1-326的二聚体。
图6A至6B是一组代表关于LEDGF1-326的预测结构特征的其它数据的图。A)圆二色性：使用Chirascan分析25mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的500μg/ml LEDGF1-326的二级结构。未获得α-螺旋或β-折叠的特征峰。此外，在200nm下存在强烈阴性信号指示LEDGF1-326主要是无规卷曲蛋白质。B)LEDGF1-3263-D模型：通过I-Tasser蛋白质建模服务器基于LEDGF1-326的氨基酸序列和与结构可在蛋白质数据库中获得的蛋白质的同源性来预测LEDGF1-3263-D结构。根据3-D模型，LEDGF1-326是无规卷曲蛋白质。
图7A至7F提供代表关于LEDGF1-326的预测结构特征的其它数据的其它图。荧光光谱术-化学变性：A)在激发波长280nm下自300至400nm记录与含0-6M脲的25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)一起孵育的300μg/ml LEDGF1-326的荧光光谱。B)将340/356nm下的荧光强度比率相对于脲浓度绘图以确定构象稳定性参数。C)自220至260nm记录与含0-6M脲的25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)一起孵育的300μg/ml LEDGF1-326的CD光谱。D)将230nm下的CD信号相对于脲浓度绘图以确定构象稳定性参数。E)使用热使LEDGF1-326变性且自215至250nm记录相应CD信号变化。F)将222nm下的CD信号相对于温度绘图以确定LEDGF1-326的熔解温度。
图8A至8B是一组显示LEDGF1-326能够从聚集介导的应激中挽救ARPE-19细胞的图。ARPE-19细胞在A)不存在或B)存在聚集应激下用LEDGF1-326处理48小时。
图9A至9B是一组说明LEDGF1-326延迟RCS大鼠中的光受体功能性损失的图。A)使用0.4log cd-s/m2闪光记录暗视ERG，并且将暗视B波幅值相对于大鼠年龄绘图。对于明视ERG，使用30cd/m2背景光使大鼠适应光照3分钟，随后记录ERG。B)将明视B波幅值相对于大鼠年龄绘图。将个别大鼠的三个ERG平均化且接着将各组内的b波幅值平均化以得到平均值。数据代表N＝3的平均值±S.D.。*，相较于相应未处理组，p＜0.05。
图10是一组显示LEDGF1-326/锌纳米装配体在稀释之后稳定的图。
图11A至11C是一组显示在不存在或存在添加剂下的LEDGF1-326三级结构、二级结构和尺寸变化的图。
图12是在还原性条件下装载的LEDGF1-326的SDS-PAGE胶凝图片。
图13A至13B是一组显示在存在和不存在各种添加剂下LEDGF1-326的可溶性蛋白质和不溶性聚集体的量的图。
图13C是显示在存在各种添加剂下不存在LEDGF1-326的不溶性聚集体的微量离心管图片。
图14是描绘在存在和不存在各种添加剂下LEDGF1-326的免疫反应性的图。
图15A至15C是一组显示在添加剂存在下LEDGF1-326的结构完整性和构象稳定性的生物物理学表征的图。A)在各种添加剂存在下，在280nm激发下，LEDGF1-326在342nm下的随时间而变的荧光强度。B)LEDGF1-326在208nm下的随时间和添加剂而变的圆二色性(CD)。C)LEDGF1-326的随时间和添加剂而变的流体动力学尺寸。
图16是提供LEDGF1-326随时间而变的分子量分析的SDS-PAGE胶凝图片。
图17A至17D是一组显示在锌存在下的LEDGF1-326纳米装配体形成的图。A)动态光散射。LEDGF1-326在锌存在下形成纳米装配体。B)圆二色性。在锌存在下，LEDGF1-326的二级结构被改变。C)荧光光谱术。在锌存在下，LEDGF1-326荧光光谱被淬灭，从而指示疏水性残基暴露于极性更大环境。D)紫外光谱术：在0.1mM和1mM锌存在下而非在10mM锌下，LEDGF1-326紫外吸收被淬灭。
图18是LEDGF1-326锌纳米装配体的一组TEM图像。
图19A至19D是一组说明LEDGF1-326纳米装配体的可逆形成的图。
图20A至20D是说明LEDGF1-326纳米装配体的稳定性随时间增加的一组图和SDS-PAGE胶凝图像。
图21是说明ARPE-19细胞对LEDGF1-326纳米装配体的摄取增加的图。
图22是描绘MTT测定的结果的图，其说明LEDGF1-326纳米装配体能够从血清饥饿中挽救ARPE-19细胞。
图23A至23D是一组说明如使用视网膜电描记术所考查，LEDGF1-326纳米装配体能够降低视网膜变性的图。
图24A至24H是一组说明如通过检测正常SD大鼠中的Alexa-LEDGF1-326的荧光信号所测量，LEDGF1-326纳米装配体在玻璃体中持续至少14天的图。A)说明在玻璃体内注射SD大鼠眼之前，空白扫描的结果。B)和C)分别说明对照和LEDGF1-326装配体的标准曲线。D)和E)说明如由Flurotron扫描获得的在包括玻璃体、脉络膜-RPE和水状液的各种组织中的荧光信号；F)、G)和H)分别使以上测量的玻璃体、脉络膜-RPF和水状液的荧光信号转换成实际LEDGF1-326纳米装配体。
图25是说明纳米装配体能够保持LEDGF1-326的免疫反应性的图。
图26A至26B是A)用LEDGF1-326转染的ARPE-19细胞的细胞计数测定的一组图像以及B)说明细胞计数测定的结果随时间和LEDGF1-326浓度而变的图。
图27是说明测定结果的图，其指示用LEDGF1-326转染的ARPE-19细胞中的吞噬活性增加。
图28A至28D是一组说明对用LEDGF1-326注射的SD大鼠眼的组织学分析的结果的图像和图。A)是对眼垂直截面和玻璃体内注射部位的图示描绘。B)是正常SD、未处理RCS和LEDGF1-326处理的RCS视网膜的横截面的一组图像。C)和D)是分别描绘对照和LEDGF1-326处理的视网膜中的眼外核层和内核层的测量厚度的图。
图29是对照和LEDGF1-326处理的大鼠SD视网膜的免疫荧光图像的图面。
图30是显示His-LEDGF1-326自示例性PinP组合物累积释放的图
图31是显示在大鼠眼中用Alexa-His-LEDGF1-326进行玻璃体内注射之后的非侵袭性眼荧光光度法的结果的图。
详述
定义
如本文所用，“视网膜和视网膜性”是指视网膜以及邻近于视网膜的一般性眼后段两者。
如本文所用，“治疗”是指完全逆转或消除潜伏疾病、临时或持续防止疾病进展、临时或持续消退疾病、以及改善一种或多种与疾病相关的症状。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。除非另外指示，否则所述术语是指具有至少两个通过肽键连接的氨基酸的聚合物。因此，所述术语包括寡肽、蛋白质片段、类似物、衍生物、糖基化衍生物、聚乙二醇化衍生物、融合蛋白等。
如本文所用，“序列同一性/类似性”是指两个或更多个氨基酸序列的同一性、类似性。序列同一性可以同一性百分比来量度，百分比越高，序列越相同。比对方法和供比较的序列在本领域中是熟知的。各种程序和比对算法描述于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；Higgins和Sharp，Gene，73：237-44，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-3，1989；Corpet等Nuc.Acids.Res.16：10881-10，1990中，所述文献呈现对序列比对方法和同源性计算的详述考虑。
NCBI基本局部比对研究工具(BLAST)(Altschule等J.Mol.Biol.215：403-10，1990)可自若干来源，包括国家生物信息中心(NCBI，National Library of Medicine，Building 38A，Room 8N805，Bethesda，MD 20894)和在因特网上获得以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx关联使用。Blastp用于比较氨基酸序列。其它信息可见于NCBI网站。
一般来说，一旦对准，即通过对相同氨基酸残基存在于两个序列中所处的位置的数目计数来确定匹配的数目。同一性百分比是通过用匹配的数目除以鉴定的序列中阐述的序列长度或连贯长度(如来自鉴定的序列中阐述的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后用100乘以所得值来确定。
引言
全长LEDGF能够从P23H突变视紫红质(rhodopsin)聚集诱导的应激中挽救视网膜色素上皮细胞(Baid等，PLoS One.6(9)：第e24616页)。然而，由于要求蛋白质维持特定三维结构以保持生物活性，所以在蛋白质可用作治疗剂的水平上使基因翻译成蛋白质已始终具有挑战性。此外，由于在整个生物合成和纯化过程期间缺乏蛋白质稳定性，所以生产和生物合成常常失败。此外，为有效使用蛋白质治疗剂，常常必须达成数毫克产量以有效表征蛋白质性质。举例来说，每500ml仅产生0.9mg全长LEDGF，远低于为适当表征蛋白质所需的数十毫克，并且会产生片段化产物。
本发明提供维持全长蛋白质的细胞存活活性，同时允许以高数量和纯度产生和纯化LEDGF肽的LEDGF肽。此外，本发明的LEDGF肽具有抗蛋白质聚集活性。本发明的LEDGF肽显示治疗退变性疾病和与包括氧化应激和蛋白质聚集应激的各种细胞应激相关联的疾病的能力。因此，如本发明的LEDGF肽的分子可代表一种用于治疗多种蛋白质聚集介导的疾病，包括其它视网膜退变性和神经退变性疾病的通用治疗性蛋白质。本发明还包含适用于治疗以上疾病的延长释放LEDGF肽制剂。
LEDGF肽
本发明的LEDGF肽含有全长LEDGF的N末端肽。在一个示例性实施方案中，LEDGF肽包含LEDGF N末端应激相关的结合结构域。尽管不受以下理论限制，但LEDGF充当转录因子且启始其它应激反应基因的转录的能力可有助于LEDGF肽保护免遭蛋白质聚集介导的疾病的能力。或者，LEDGF肽可直接或通过其它中间蛋白质结合错误折叠的蛋白质，并且有助于正常折叠或错误折叠的蛋白质的泛素化以确保蛋白水解降解。在某些示例性实施方案中，LEDGF肽可还包含TAT结合结构域。
在一个示例性实施方案中，LEDGF肽是LEDGF1-326(SEQ ID NO：2)。LEDGF1-326被纯化至接近均质。LEDGF1-326主要具有无规卷曲结构，在室温下稳定，并且以40kDa单体和/或80kDa二聚体形式存在。如以下实施例章节中进一步详细所述，LEDGF1-326能够防止ARPE-19细胞中P23H突变视紫红质介导的聚集应激。单次玻璃体内注射LEDGF1-326使视网膜退变性大鼠模型中的光受体功能性损失降低超过八周。
本发明的LEDGF肽也包括与LEDGF1-326具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％序列同一性的LEDGF肽。在一个示例性实施方案中，LEDGF肽包括涵盖全长LEDGF的N末端应激相关的结合结构域且与LEDGF1-326具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％序列同一性的肽。在另一示例性实施方案中，LEDGF肽包括具有N末端应激相关的结合结构域和TAT结合结构域且与LEDGF1-326具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％序列同一性的肽。此外，本发明包括涵盖大于或小于SEQ ID NO：2的326个氨基酸的肽，其中较大或较小肽不导致在生物合成和纯化期间LEDGF生物活性或稳定性显著降低。LEDGF肽供与本发明一起使用的适合性可由本领域普通技术人员通过使用以下实施例章节中所述的测定评估推定肽与生物物理学和生物化学性质和生物活性的类似性来确定。普通技术人员可预测地认识到与LEDGF1-326具有类似生物物理学性质、生物化学性质和生物活性的LEDGF肽将具有类似效用且因此属于本发明的范围。
在某些示例性实施方案中，上述LEDGF肽是以合成方式制备。在某些其它示例性实施方案中，上述LEDGF肽是以重组方式制备。适于表达LEDGF肽的宿主包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、酵母属(Saccharomces)、毕赤酵母属(Picchia)、杆菌属(Bacillus)、CHO、BHK、COS和NSO细胞。
标准药物制剂
本文所述的LEDGF肽可使用已知技术提供为生理可接受的制剂。由E.W.Martin所著的Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPublishing Co.，Easton，PA，第19版(1995))描述适于药物递送本文公开的LEDGF肽的组合物和制剂。
本发明的制剂可以片剂、胶囊、糖锭、扁囊剂、溶液、混悬液、乳液、粉剂、气雾剂、栓剂、喷雾剂、软锭剂、软膏剂、霜剂、糊剂、泡沫剂、凝胶剂、棉塞、子宫托、颗粒剂、大丸剂、嗽口剂、植入物、装置、滴眼剂或经皮贴片形式施用。
制剂包括适于口服、经直肠、经鼻、吸入、表面(包括经皮肤、经皮、经颊和滴眼剂)、经阴道、胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、眼内、气管内和硬膜外)、眼部(眼周、眼内，包括脉络膜上、视网膜下和玻璃体内)或吸入施用的制剂。在一个示例性实施方案中，本发明的肽被配制来供经巩膜、脉络膜上、视网膜下或玻璃体内递送。经巩膜递送包括结膜下、眼球筋膜下和眼球后经巩膜递送。制剂可宜以单位剂型呈现且可通过常规医药技术来制备。所述技术包括使活性成分和药物载体或赋形剂缔合的步骤。一般来说，制剂是通过使活性成分与液体载体或微细固体载体或两者均一且精细缔合，并且接着必要时使产物成形来制备。
适于口服施用的本发明的制剂可呈现为个别单元，如胶囊、扁囊剂或片剂，各自含有预定量的活性成分；粉剂或颗粒剂；于水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液；或水包油液体乳液或油包水乳液等。
片剂可通过任选与一种或多种辅助成分一起压制或模制来制备。压制片剂可通过在适合机器中压制任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的呈自由流动形式(如粉剂或颗粒)的活性成分来制备。模制片剂可通过在适合机器中模制湿润粉剂状化合物与惰性液体稀释剂的混合物来制备。片剂可任选被包覆或划线且可被配制以便提供其中活性成分的缓慢或控制释放。
适于在口中进行表面施用的制剂包括糖锭，其包含活性剂于通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶的调味基质中；软锭剂，其包含活性成分于如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基质中；以及嗽口剂，其包含待施用的成分于适合液体载体中。
适于向皮肤进行表面施用的制剂可呈现为包含待施用的成分于药学上可接受的载体中的软膏剂、霜剂、凝胶剂、糊剂和滴眼剂。
用于经直肠施用的制剂可呈现为具有包括例如可可脂或水杨酸盐的适合基质的栓剂。
适于经鼻施用的其中载体是固体的制剂包括颗粒尺寸例如在20至500微米的范围内的粗粉，其是以进行鼻吸的方式施用；即通过鼻部通道自贴近鼻部固持的具有粉剂的容器快速吸入。适于施用的其中载体是液体的制剂(如例如鼻喷雾剂或如滴鼻剂)包括活性成分的水性或油性溶液。
适于经阴道施用的制剂可呈现为除活性成分之外也含有如本领域中已知为适当的成分(如载体)的子宫托、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。
适于吸入的制剂可呈现为除活性成分之外也含有如本领域中已知为适当的成分(如载体)的喷雾、粉尘、粉剂或喷雾制剂。
适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包括混悬剂和增稠剂；凝胶剂；和手术放置将植入物。
纳米装配制剂
在某些示例性实施方案中，本发明的LEDGF肽可通过使LEDGF肽与胶态金属颗粒结合或另外缔合来以纳米颗粒装配体形式递送。任何胶态金属都可用于本发明中。胶态金属包括任何水不溶性金属颗粒、分散在液体水中的金属化合物、水溶胶或金属溶胶。胶态金属颗粒可选自周期表的IA、IB、IIB和IIIB族中的金属以及过渡金属，尤其是VIII族的那些。示例性金属包括锌、金、银、铝、钌、铁、镍和钙。其它适合金属包括呈它们的所有各种氧化状态的以下金属：锂、钠、镁、钾、钪、钛、钒、铬、锰、钴、铜、镓、锶、铌、钼、钯、铟、锡、钨、铼、铂和钆。金属优选以离子形式自适当金属化合物获得，例如Al3+、Ru3+、Zn2+、Fe3+、Ni2+和Ca2+。
在一个示例性实施方案中，纳米颗粒是通过直接向含有LEDGF肽的溶液中添加胶态金属来形成。如本文所用，“纳米颗粒”是指一种或多种结合或吸附于单一胶态金属颗粒的表面的肽或结合或吸附于多个胶态金属颗粒的肽。举例来说，LEDGF/Zn纳米颗粒是通过在室温下以控制方式添加10mM Zn(II)来形成。此后，在37℃下历经24小时时期使纳米装配体形成。使用其它胶态金属来形成其它纳米装配体的条件可易于由本领域普通技术人员确定。
颗粒包颗粒制剂
在另一示例性实施方案中，LEDGF肽被配制成颗粒包颗粒延长释放制剂。本发明的延长释放组合物包含含有在较大多孔外部颗粒内的内部颗粒，包括各种构造，如纳米颗粒在多孔微粒中(PMP包NP)、小纳米颗粒在多孔大纳米颗粒中(PLNP包SNP)、以及小微粒在多孔大微粒中(PLMP包SMP)。相较于较大颗粒，内部颗粒较小且相对不可膨胀。外部颗粒是可膨胀的且在加工期间形成允许在外部颗粒的多孔结构内嵌入内部颗粒的显著多孔结构。
如本发明的上下文中所用，如果颗粒的初始表面积在约1.25倍至约100倍的范围内增加，那么颗粒被视为在超临界流体存在下膨胀。在某些示例性实施方案中，如果颗粒的初始表面积在约1.25至约5倍、约5至约25倍、约25至约50倍、约50至约75倍、或约75至100倍的范围内膨胀，那么颗粒被视为会膨胀。或者，如果颗粒的初始尺寸增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％，那么颗粒被视为会膨胀。
本发明的内部颗粒是使用在超临界流体存在下不膨胀的聚合或非聚合物材料制备。在某些示例性实施方案中，纳米颗粒材料是在超临界流体存在下将不膨胀的聚合物材料。在某些示例性实施方案中，聚合物材料是在超临界二氧化碳存在下将不膨胀的材料。可用于本发明中的适合聚合和非聚合物材料的实例包括聚交酯(PLA)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)、纤维素衍生物、壳聚糖、聚乙烯(PE)、聚丙烯、聚(四氟乙烯)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、氧化铁、氧化铈、氧化锌、金、银、其它生物相容性金属和晶体、以及二氧化硅。结晶材料或结晶区域较大的材料在超临界流体加工期间膨胀的可能性较小。聚合内部颗粒可使用常规乳化-溶剂蒸发方法或其它类似适合合成方法来制备。LEDGF肽可在形成期间囊封在内部颗粒中，或在内部颗粒形成之后装载在表面上。
本发明的外部颗粒是使用在超临界流体存在下膨胀的材料制备。在某些示例性实施方案中，微粒材料是在超临界流体存在下膨胀的聚合物材料。在某些示例性实施方案中，材料在超临界二氧化碳存在下膨胀。可用于本发明中的适合聚合物材料的实例包括丙交酯-共聚-乙交酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯及其共聚物。此外，适合聚合物材料也包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、纤维素聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡酪烷酮。一般来说，非晶材料或非晶区域较大的材料适于在超临界流体加工期间膨胀。聚合外部颗粒可使用常规乳化-溶剂蒸发或其它类似适合合成方法来制备。在某些示例性实施方案中，LEDGF肽可在形成期间囊封在外部颗粒中或在外部颗粒形成之后装载在表面上。
产生各种颗粒构造的方法是使用超临界流体流动技术来达成。所得无有机溶剂装载尤其非常适合于易经受聚集或降解的药物，如基于肽和核苷酸的药物。举例来说，LEDGF肽可被装载在内部颗粒、外部颗粒或两者的表面上；内部颗粒、外部颗粒或两者的基质中；存在于外部颗粒的孔中；或其组合。在某些示例性实施方案中，LEDGF肽可存在于内部颗粒的表面上。在另一示例性实施方案中，LEDGF肽可存在于内部和外部颗粒的表面上。在另一示例性实施方案中，LEDGF肽可存在于内部颗粒的基质中。在另一示例性实施方案中，LEDGF肽可存在于内部颗粒与外部颗粒两者的基质中。在另一示例性实施方案中，此外，治疗剂可存在于外部颗粒的多孔结构中。
使内部颗粒和外部颗粒混合在一起且在高压下暴露于超临界流体。在某些示例性实施方案中，超临界流体是二氧化碳。在暴露于超临界流体后，外部颗粒膨胀以在外部表面上产生多孔结构。超临界流体接着使内部颗粒注入外部颗粒中以形成颗粒包颗粒延长释放制剂。在一个示例性实施方案中，颗粒包颗粒延长释放制剂包含在直径约1μm至约100μm的外部微粒中并入直径约1nm至约900nm的内部纳米颗粒。在另一示例性实施方案中，颗粒包颗粒延长释放制剂包含在直径约10nm至约999nm的外部纳米颗粒中并入直径约1nm至约300nm的内部纳米颗粒。在另一示例性实施方案中，颗粒包颗粒延长释放制剂包括在直径约2μm至约500μm的外部微粒中并入直径约1μm至约100μm的内部微粒。对适当尺寸的内部和外部颗粒的选择将取决于构成颗粒的材料的类型、外部颗粒在所用超临界流体中的膨胀能力、以及待并入在外部颗粒内的内部颗粒的尺寸。这些是可易于由本领域普通技术人员选择的所有因素。一般来说，内部颗粒与外部颗粒之间的尺寸比率可自约1∶5至约1∶100变化。在一个示例性实施方案中，尺寸比率可为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85、1∶90、1∶95或1∶100。
PMP包NP的形成可通过在约1000psi至约1400psi下暴露纳米颗粒和微粒来达成。暴露时间可例如自约5分钟至约2小时变化。温度可在30℃至45℃的范围内。对适当压力和温度范围的选择是主要由接近给定超临界流体的超临界点的温度和压力范围决定。因此，本领域普通技术人员将能够选择基于所用超临界流体、所需外部颗粒膨胀的尺寸或量、以及所需外部颗粒中的孔隙度确定范围的适当时间、温度和压力。举例来说，持续较长时期和/或在较高压力下暴露继之以压力淬灭将导致膨胀和孔隙性大于较短暴露时间和/或压力。
在一个示例性实施方案中，内部颗粒和外部颗粒是在约1∶3的比率下混合。在一个示例性实施方案中，所用内部颗粒与外部颗粒的比率是约1∶9。这些比率将影响纳米颗粒并入和药物缓慢释放的程度。一般来说，内部颗粒相对于外部颗粒的量越大，外部颗粒中并入的内部颗粒的量越高，从而增加药物释放速率和剂量。内部颗粒相对于外部颗粒的量越小，爆发性释放越小。
蛋白质聚集介导的疾病和治疗方法
本发明的LEDGF制剂可用于治疗蛋白质聚集介导的疾病。可用本发明的LEDGF组合物治疗的蛋白质聚集介导的疾病包括视网膜退变性疾病和神经退变性疾病。视网膜退变性疾病包括老年性黄斑变性、视网膜色素变性和糖尿病性视网膜病变。神经退变性疾病包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)、亨廷顿氏病(HD)、肌萎缩性侧索硬化和朊病毒疾病。
在一个示例性实施方案中，本发明包含治疗视网膜退变性疾病的方法，其包括向患有视网膜退变性疾病的患者施用包含本发明的LEDGF肽的组合物。在某些示例性实施方案中，LEDGF肽是SEQ ODNO：2。在一个示例性实施方案中，LEDGF组合物是经巩膜递送。在另一示例性实施方案中，LEDGF组合物是以滴眼剂形式向眼进行表面施用。在另一示例性实施方案中，LEDGF组合物是以延长释放制剂形式植入或全身性施用。在一个示例性实施方案中，延长释放制剂是纳米装配延长释放制剂，如LEDGF/锌纳米装配制剂。在另一示例性实施方案中，延长释放制剂是颗粒包颗粒制剂，如纳米颗粒于多孔微粒中(PMP包NP)制剂。
在一个示例性实施方案中，本发明包含降低视网膜退变性疾病中蛋白质聚集的方法，其包括向患有视网膜退变性疾病的患者施用包含本发明的LEDGF肽的组合物。在某些示例性实施方案中，LEDGF肽是LEDGF1-326。在一个示例性实施方案中，LEDGF组合物是经巩膜递送。在另一示例性实施方案中，LEDGF组合物是以滴眼剂形式向眼进行表面施用。在另一示例性实施方案中，LEDGF组合物是以延长释放制剂形式植入或全身性施用。在一个示例性实施方案中，延长释放制剂是本发明的纳米颗粒延长释放制剂，如LEDGF/锌纳米颗粒制剂。在另一示例性实施方案中，延长释放制剂是颗粒包颗粒制剂，如纳米颗粒于多孔微粒中(PMP包NP)制剂。
在另一示例性实施方案中，本发明包含治疗神经退变性疾病的方法，其包括向患有神经退变性疾病的患者施用包含本发明的LEDGF肽的组合物。在某些示例性实施方案中，LEDGF肽是LEDGF1-326。在一个示例性实施方案中，LEDGF组合物是腹膜内递送。在另一示例性实施方案中，LEDGF组合物是口服施用。在另一示例性实施方案中，LEDGF组合物是以延长释放制剂形式全身性施用。在一个示例性实施方案中，延长释放制剂是本发明的纳米颗粒延长释放制剂，如LEDGF/锌纳米颗粒制剂。在另一示例性实施方案中，延长释放制剂是颗粒包颗粒制剂，如纳米颗粒于多孔微粒中(PMP包NP)制剂。
在另一示例性实施方案中，本发明包含降低神经退变性疾病中蛋白质聚集的方法，其包括向患有神经退变性疾病的患者施用包含本发明的LEDGF肽的组合物。在某些示例性实施方案中，LEDGF肽是LEDGF1-326。在一个示例性实施方案中，LEDGF组合物是腹膜内递送。在另一示例性实施方案中，LEDGF组合物是口服施用。在另一示例性实施方案中，LEDGF组合物是以延长释放制剂形式施用。在一个示例性实施方案中，延长释放制剂是本发明的纳米颗粒延长释放制剂，如LEDGF/锌纳米颗粒制剂。在另一示例性实施方案中，延长释放制剂是颗粒包颗粒制剂，如纳米颗粒于多孔微粒中(PMP包NP)制剂。
组合物和方法由以下非限制性实施例进一步说明，所述实施例无论如何都不应解释为对其范围施加限制。相反，应明确了解的是在不脱离本发明的精神下可采取其各种在读取本文描述之后可向本领域技术人员显现它们自身的其它实施方案、修改和等效物。
实施例
实施例1
1.材料
质粒pEGFP-LEDGF由Toshimichi Shinohara博士(University ofNebraska Medical Center，Omaha，NE)惠赠。正向和反向引物自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)获得。DNA聚合酶I、T4DNA连接酶和限制酶自New England Biolab Inc.(Ipswich，MA)获得。QIAquick胶凝提取试剂盒、QIAprep旋转小型制备试剂盒和QIAGEN质粒小型试剂盒自Qiagen(Valencia，CA)获得。XK 16/20管柱、S-200凝胶过滤管柱、SP琼脂糖珠粒自GE LifesciencesHealthcare(Piscataway，NJ)获得。ARPE-19细胞自ATCC(Manassas，VA)获得。DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、转脂胺2000、LB培养基和超纯琼脂糖自Invitrogen(Carsbad，CA)获得。除非指定，否则所有其它材料都自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得。
制备LEDGF1-326DNA构建体
将编码LEDGF1-326蛋白的基因克隆至pET-28a(+)载体(Novagen，Madison，WI)中。简要来说，使用由HindIII限制核酸内切酶位点组成的正向引物5`AGTAGTGGATCCATGACTCGCGATTTCAAAC3`(SEQ ID NO：3)和由BamHI限制核酸内切酶位点组成的反向引物5`AATAATAAGCTTTCACTGCTCAGTTTCCATTTGTTC`3(SEQ IDNO：4)，自pEGFP-LEDGF质粒PCR(聚合酶链反应)扩增Ledgf1-326基因。使用DNA聚合酶I用以下方案进行PCR扩增：在94℃下变性5分钟；继之以36个循环：在94℃下变性30秒，在50℃下退火45秒并在72℃下延伸2分钟；以及最终在72℃下进行延伸步骤5分钟。根据制造商方案，使用QIAquick胶凝提取试剂盒纯化扩增的Ledgf1-326基因。此后，分别使用HindIII和BamHI限制酶在5`和3`末端处连续消化纯化的Ledgf1-326基因插入物和pET-28a(+)载体。接着根据制造商方案使用QIAprep旋转小型制备试剂盒来纯化它们。在4℃下使用T4DNA连接酶将插入物和载体的粘末端连接过夜。根据制造商方案使用热激程序用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞。挑选十个菌落且使用QIAGEN质粒小型试剂盒扩增、提取和纯化质粒。通过三种不同方式确认Ledgf1-326插入pET-28a(+)载体中：首先通过PCR筛选，其次通过限制消化，并且最后通过DNA测序。使用2％琼脂糖凝胶分析重组DNA的纯度和尺寸。使用NanoDrop 1000(Thermoscientific，Wilmington，DE)进行DNA定量。进一步培养显示阳性PCR信号和正确测序结果的菌落，并且制备细菌甘油储备物并储存在-80℃下供所有未来使用。
生物信息学分析
将LEDGF1-326氨基酸序列提交至ExPASy生物信息学资源门户且计算LEDGF1-326的分子量、理论pI、氨基酸组成、原子组成、消光系数、估计半衰期。
表达和纯化LEDGF1-326
对于蛋白质生物合成，根据制造商方案使用QIAGEN质粒小型试剂盒自大肠杆菌DH5α菌落扩增和纯化pLEDGF1-326质粒。接着根据制造商方案将质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。此后，将含有质粒的细菌的单菌落接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB(鲁里亚(Luria)肉汤)培养基中过夜。添加1％过夜生长培养物接种物至一升含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中。使培养物在37℃下生长直至培养基的光密度(O.D.)达到0.6-0.8。通过添加IPTG(异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷)以达到最终浓度200μM来诱导蛋白质表达。此后，在37℃下再孵育细胞3小时且通过在4℃下在3000g下离心15分钟来收集。将收集的细胞再混悬于缓冲液A(25mM Tris-HCl(pH 7.0)、l mMEDTA、1mM PMSF和5％蔗糖)中。在70％输出(36瓦)5秒继之以冷却15秒下对细胞进行脉冲超声处理(Mesonix，Sonicator 3000，Farmingdale，NY)，持续总计30分钟。在4℃下在13000g下离心溶解的细胞20分钟以分离溶解产物的可溶性和不溶性部分。在SDS-PAGE上分析可溶性(上清液)和不溶性(离心块)部分的蛋白质含量且测定产生的蛋白质的可溶性/不溶性性质。
FPLC：LEDGF1-326仅在可溶性部分中表达，如通过SDS-PAGE所确定。使用快速蛋白质液相色谱(FPLC)技术分两步，首先基于电荷(阳离子交换)且接着基于尺寸(凝胶过滤)来纯化LEDGF1-326。简要来说，将阳离子交换SP琼脂糖珠粒装填在XK 16/20管柱中且使用缓冲液A在2ml/min流速下进行平衡。此后，在流速1ml/min下将可溶性部分装载在管柱上。管柱接着用五管柱体积的缓冲液A在2ml/min流速下洗涤。使用尖锐梯度的氯化钠(0至28％电导)洗脱大多数非特异性以及松散结合的杂质。在移除显著比例的管柱结合杂质之后，使用在40分钟内电导自28％至40％的第二梯度的NaCl达成LEDGF1-326的进一步洗脱。通过使用嵌入紫外检测器测量280nm下的吸光度来监测蛋白质洗脱曲线。在洗脱过程期间收集2.5ml洗脱份且在SDS-PAGE上分析以测定纯度。将含有高蛋白质量的洗脱份汇合在一起。使用透析缓冲液(25mM Tris(pH 7.0)和0.1％蔗糖)透析汇合的洗脱份且接着冻干48小时。将冻干蛋白质溶解于2ml去离子水中。对于下一纯化步骤，使用平衡缓冲液B(25mM Tris-HCl(pH 7.0)和100mMNaCl)在流速1ml/min下使预装填的S-200凝胶过滤管柱平衡。接着将来自阳离子交换的LEDGF1-326浓缩溶液装载于S-200管柱上。使用缓冲液B在流速1ml/min下洗脱LEDGF1-326。在约100分钟时获得尖锐峰，收集1ml洗脱份。使用SDS-PAGE分析收集的洗脱份。将含有纯LEDGF1-326的洗脱份汇合在一起。接着在4℃下以三次缓冲交换在透析缓冲液(25mM Tris-HCl(pH 7.0)和0.1％蔗糖)中充分透析纯化LEDGF1-32648小时以移除过量盐和其它杂质。在-80℃下冷冻并冻干透析的LEDGF1-32648小时。将冻干的LEDGF1-326等分且储存在-80℃下以达成所有未来目的。
紫外光谱术：准确称重12mg冻干的LEDGF1-326且接着溶解于1ml去离子水中。使用Spectramax M5(Molecular Devices，Downingtown，PA)自200nm至400nm记录紫外吸收光谱。使用去离子水连续稀释样本直至获得280nm下的吸光度小于1。这个吸光度用于基于摩尔消光系数计算样本中存在的纯化蛋白质的量。
物理表征
通过SDS-PAGE、SEC-HPLC和MALDI-TOF来测定LEDGF1-326蛋白的分子量和纯度。
SDS-PAGE：简要来说，将5μg LEDGF1-326于SDS-PAGE样本缓冲液(含有β-巯基乙醇)中煮沸10分钟。将蛋白质样本装载于4-15％SDS-PAGE胶凝(Bio-Rad，Hercules，CA)上且在30mA下进行电泳90分钟。胶凝接着用考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)染色且使用GelDocTM XR(Biorad，Hercules，CA)在白光下观察。对于非还原性SDS-PAGE，将LEDGF1-326稀释于非还原性样本缓冲液(无β-巯基乙醇)中且避免煮沸。
SEC-HPLC：将冻干蛋白质溶解于去离子水中以达到最终浓度500μg/ml且经0.22um(PVDF)过滤器过滤。利用Agilent Bio SEC-3管柱，在25℃下使用25mM含有1mM CaCl2的Tris缓冲液(pH 7.0)以流速1ml/min评估蛋白质。用分子量标准物(Invitrogen)校正管柱。在214nm下测量紫外吸光度。
MALDI-TOF：通过用4800Plus MALDI TOF/TOFTM(AB Sciex，Framingham，MA)测定分子量来确认蛋白质均质性和身份。将蛋白质样本溶解入标准MALDI基质芥子酸的溶液中，点样且干燥于金属靶板上。自5900强度的1000次激光照射以总离子流(TIC)形式收集数据。
DLS：使用zetasizer Nano ZS(Malvern，Westborough，MA)分析LEDGF1-326蛋白的均质性和尺寸。简要来说，将冻干蛋白质样本溶解于去离子水中以得到最终蛋白质浓度2.5mg/ml。使用动态光散射技术，在173°反向散射角下进行数据收集来以数目、强度和体积平均值量度尺寸。测量结果是13次扫描的平均值。
生物物理学表征
对于生物物理学表征，在25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中充分透析蛋白质以移除Tris-HCl和蔗糖，并且经0.22μm PVDF注射器过滤器过滤。使用8.5(OriginLab Corp.，Northampton，MA)或SigmaPlot 11.0(Systat Software，Inc，Chicago，IL)分析获得的光谱。使用如下由Scholtz等定义的等式1和2拟合数据以确定ΔG、m值和[脲]1/2[62]。
ΔG＝ΔG(H2O)-m[脲]
其中yF°和yU°是截距，其中和是截距，mF和mU是过渡期前和过渡期后基线的斜率，并且m值是过渡期的斜率。ΔG是在任何特定脲浓度下的自由能变化且它与脲浓度呈线性变化，并用于估计ΔG(H2O)。ΔG(H2O)被定义为在25℃下在不存在脲下，蛋白质的构象稳定性。R是通用气体常数且T是样本温度。[脲]1/2是LEDGF1-32650％折叠且50％展开所处的脲浓度。
CD：为测定LEDGF1-326的二级结构以及确定它的构象稳定性参数，记录透析的蛋白质的远紫外CD光谱。简要来说，将500μg/ml蛋白质样本放置在1mm石英比色皿中且使用CD仪器(Applied Photophysics Ltd，UK)在每个时间点0.5秒的扫描速度、1nm步长和自200至280nm的4nm带宽下记录光谱。所有扫描都一式三份进行。使用CDNN 2.1CD光谱去卷积软件(Gerald Bohm博士，Martin-Luther-University，Halle，Wittenberg，Germany，UK)使由此获得的天然LEDGF1-326光谱去卷积以得到天然LEDGF1-326蛋白中存在的各种二级结构的百分比。对于LEDGF1-326的构象稳定性，在各种脲浓度下进行化学变性。简要来说，使300μg/ml蛋白质与0至6M脲一起在25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中孵育24小时。如上所提及来记录CD信号。通过绘制230nm下的随脲浓度而变的CD信号来确定LEDGF1-326的构象稳定性参数以获得在这个波长下折叠蛋白质光谱与展开蛋白质光谱之间的最大CD信号差异。类似地，为探究LEDGF1-326的热稳定性，以平滑匀变模式在每分钟1℃的匀变速率下使500μg/ml LEDGF1-326经受自25℃至90℃的热变性。222nm下的CD信号用于测定熔点(Tm)。
荧光光谱术：进行稳态荧光光谱术以测定三级结构扰动。使蛋白质样本(最终浓度300μg/ml)与各种浓度的脲溶液(0至6M)一起在25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中孵育24小时。使用SpectramaxM5(Molecular Devices，Downingtown，PA)，在280nm激发波长下以1nm增量自300nm至400nm记录内在色氨酸荧光光谱。通过绘制340/356nm下的随脲浓度而变的荧光强度比率来确定LEDGF1-326的构象稳定性参数。所有强度值都作缓冲效应和内滤效应方面的校正。
细胞活力测定
ARPE-19细胞用于确定在聚集介导的应激存在下LEDGF1-326的细胞存活功能。简要来说，如早先所述(Baid等，.PLoS One.6(9)：第e24616页)维持ARPE-19细胞。对于细胞活力测定，将10,000个细胞涂铺在96孔板中且孵育24小时。在24小时之后，吸出含有血清的培养基。根据制造商方案使用1∶3比率的含转脂胺2000的无血清培养基，用pP23H-Rho质粒(1μg/ml)短暂转染测试组(pP23H-Rho+LEDGF1-326)。在转染六小时之后，吸出培养基且细胞用浓度范围是0.001μg/ml至50μg/ml的递增量的LEDGF1-326处理48小时。无细胞(仅培养基)、不具有转脂胺2000的细胞和具有转脂胺2000的细胞也作为对照加以维持。在48小时之后，吸出培养基且添加200μl新鲜无血清培养基。添加20μl MTT试剂(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四钠，5mg/ml于PBS(pH 7.4)中)至各孔中且在37℃下再进行孵育3小时。吸出含有MTT的培养基且将形成的甲臜晶体溶解于200μl DMSO中。使用Spectramax M5在570nm下测量显现的颜色的吸光度。关于含有不具有转脂胺2000的细胞的对照组来计算各组的活力百分比。所有组都以n＝4加以重复。
动物维持
RCS大鼠群体维持在科罗拉多大学安舒茨医学校区(University ofColorado Anschutz Medical Campus)的动物设施中且经IUCAC核准。根据关于眼科和视力研究中使用动物的ARVO声明进行实验。
视网膜电描记术
在4周龄时，使大鼠适应黑暗30分钟。此后，使动物准备好在昏暗红光下进行ERG。简要来说，用腹膜内注射80mg/kg氯胺酮(ketamine)和12mg/kg甲苯噻嗪(xylazine)的混合物使大鼠麻醉。接着用一滴0.5％托吡卡胺(tropicanamide)(Akorn，Lake Forest，IL)使瞳孔扩张且使用一滴2.5％羟丙基甲基纤维素(Akorn，Lake Forest，IL)保持湿润。此后，将动物放置在稳定在37℃下的加热的水夹套上。将参比电极(LKC Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)插入动物的尾部和面颊中。将DTL plus电极(LKC Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)跨越各眼的角膜进行放置。使各动物暴露于0.4log cd-s/m2的简短闪光，其中在各闪光之间间隔10秒且记录暗视ERG。此后，使用30cd/m2的背景光，使动物适应光照3分钟。在相同强度闪光但开启背景光下记录明视ERG。将至少三个ERG平均化以得到各大鼠的单一ERG。此后，在一只眼中在玻璃体内给与无菌过滤的2μl 0.25、0.5或2.5mg/ml LEDGF1-326，而在对侧眼中给与媒介物。在玻璃体内注射之后每两周记录ERG，持续8周，即直至大鼠的12周龄。
统计分析
数据表示为平均值±SD。进行独立样本学生t检验(student's t-test)或单因子ANOVA继之以杜凯氏事后分析(Tukey's post hocanalysis)(SPSS，11.5版；SPSS，Chicago，IL)以分别在两个或多个实验组之间进行比较。在p≤0.05时，差异被视为统计显著。
2.结果
LEDGF1-326克隆至pET28a(+)中
由聚合酶链反应(PCR)自pEGFP-LEDGF质粒扩增Ledgf1-326基因(图3，泳道1)来获得约1000个碱基对的DNA片段。未消化的pET-28a(+)载体(泳道2)显示在约4.5kb处的阳性条带，当使用BamHI消化时，所述条带变为线性且向上在5kb与6kb DNA标记之间移动(泳道3)。当将Ledgf1-326基因连接在pET-28a(+)载体中时(如此获得的所述质粒将从此处开始被指定为pLEDGF1-326)，存在等于约1000bp的向上条带移动，从而指示Ledgf1-326基因成功插入pET28a(+)载体中(泳道4)。为确认连接，pLEDGF1-326用BamHI(泳道5)或HindIII(泳道6)单一消化。通过两个限制酶消化反应使pLEDGF1-326线性化且在约6.4kb处观察到DNA条带，其比pET28a(+)载体大1000bp。使用BamHI和HindIII双重消化pLEDGF1-326产生两个片段，即约5.4kb的较大片段(上部条带，泳道8)和约1000bp的较小片段(下部条带，泳道7)。自pLEDGF1-326PCR扩增Ledgf1-326基因产生约1000个碱基的阳性DNA条带(泳道8)，从而指示LEDGF1-326被成功插入pET-28a(+)载体中。
对LEDGF1-326的生物信息学分析
使用SIB ExPASy(Gasteiger等，Nucleic Acids Res，2003.31(13)：第3784-8页)对LEDGF1-326序列的生物信息学分析指示它的理论分子量是36.9kDa。LEDGF1-326的计算的等电点(pI)是9.23，具有73个带正电荷氨基酸残基(精氨酸和赖氨酸)和63个带负电荷氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)。在280nm下在水中的理论摩尔消光系数是15470M-1cm-1。基于它的N末端氨基酸甲硫氨酸，预测它在哺乳动物细胞中的半衰期是30小时。
大量纯化的LEDGF1-326
当在特定条件下在BL21(D3B)细胞中表达LEDGF1-326时，在约40kDa处出现新的强烈阳性条带，从而指示LEDGF1-326蛋白质表达(图4A，泳道3)。在细菌细胞溶解之后，这个条带在上清液部分中出现，从而指示LEDGF1-326在细菌培养物中以可溶性蛋白质形式表达(泳道4)。使用快速蛋白质液相色谱(FPLC)系统自粗细胞溶解产物纯化LEDGF1-326。在第一纯化步骤中，使用阳离子交换管柱(图4B)。在管柱洗涤阶段期间(100-280ml)，未结合蛋白质和包括脂质的其它细胞杂质被洗脱。此后，当使用尖锐氯化钠(NaCl)梯度使流动相的电导自0增加至28％时(280-400ml)，松散结合于管柱的其它细胞蛋白质被洗脱出。当使NaCl的梯度历经40分钟进一步缓慢增加以达到40％电导时，LEDGF1-326被洗脱(400-450ml)。当使用SDS-PAGE分析收集的洗脱份时，连同其它较低分子量条带一起在约40kDa处观察到LEDGF1-326的强烈条带(图4A，泳道5)。在使用凝胶过滤管柱进一步纯化时，LEDGF1-326作为第一峰(收集的洗脱份)被洗脱，继之以分子量较小的其它蛋白质的峰(图4C)。在SDS-PAGE中，自凝胶过滤管柱汇合的洗脱份指示约40kDa的强烈阳性条带以及极微弱低分子量条带，从而指示LEDGF1-326几乎完全纯化(图4A，泳道6)。蛋白质估计指示每升振荡烧瓶培养物获得约20mg蛋白质。
LEDGF1-326被纯化至接近均质性
通过尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)来测定LEDGF1-326蛋白的纯度(图5A)。观察到两个峰，第一峰具有保留时间10.5分钟而第二峰具有保留时间约11.5分钟。当将曲线下面积积分时，第一峰仅5％而第二峰是95％，从而指示LEDGF1-326蛋白的纯度是约95％。通过基质辅助激光解吸/离子化(MALDI-TOF)来确认LEDGF1-326的分子量。在MALDI-TOF光谱中获得的主要峰处于40314.32和80663.19m/z(质量相对于电荷)比率下(图5B)。MALDI-TOF指示LEDGF1-326具有分子量40kDa，此等于理论分子量。也观察到在80663m/z下的第二峰，此指示LEDGF1-326可以二聚体形式存在。为探究二聚体的存在性，在还原性和非还原性条件下操作LEDGF1-326的SDS-PAGE(图5D)。在非还原性条件下，存在LEDGF1-326条带向上移动至95-105kDa大小，从而指示LEDGF1-326可以二聚形式存在。在还原性/变性条件下，二聚体解离成单体。
为进一步探究LEDGF1-326是否自缔合以形成任何较高分子量寡聚物，进行动态光散射(DLS)(图5C)。获得具有单峰的同质群体(100％分布)以得到颗粒的强度或数目或体积尺寸分布。所有三个峰都呈狭窄尺寸分布，从而指示尺寸范围极其接近。不存在较高尺寸的其它峰，从而指示不存在任何种类的寡聚物。由DLS获得z平均直径11.32nm和多分散性指数0.15。
LEDGF1-326是无规卷曲的
为探究LEDGF1-326的二级结构，分析天然LEDGF1-326的远紫外圆二色性(CD)光谱(图6A)。自280至200nm，CD信号保持阴性。在220nm之后，CD信号存在陡峭下降。在222nm和208nm下不存在特征性阴性条带，接近200nm也不存在任何特征性阳性条带，从而指示LEDGF1-326不主要具有α-螺旋或β-折叠。实际上，高于210nm时的极低椭圆率和低于200nm时的阴性条带指示LEDGF1-326可主要由无规卷曲组成。
为进一步剖析LEDGF1-326的二级结构，使用CDNN 2.1软件使CD光谱去卷积。假定获得的光谱是组成二级结构元件的个别光谱和归因于芳族发色团和辅基的噪声的线性组合，预测LEDGF1-326具有45.1％无规卷曲。β-转角是约21.2％，存在15％平行β-折叠和16％反平行β-折叠。来自α-螺旋的影响是仅约16％。
使用I-Tasser(迭代穿线装配细化)蛋白质建模服务器预测LEDGF1-326天然蛋白的三维结构(图6B)。LEDGF1-326预测模型具有置信度计分(C计分)-3.18，模板建模(TM计分)0.36±0.12，并且均方根差(RMSD)等于从而指示预测的模型是可靠的。根据预测模型，LEDGF1-326主要是无规卷曲蛋白质。
LEDGF1-326是构象稳定的
为了解LEDGF1-326在水中的构象稳定性，通过测量LEDGF1-326中存在的色氨酸分子的内在荧光来测定归因于化学变性的三级结构扰动(图7A和7B)。在不存在脲下，天然LEDGF1-326蛋白的发射光谱在340nm下具有λ最大且具有Δλ1/2(Δλ的半宽度)56nm(图7A)。当脲的浓度自0增加至5M时，观察到荧光信号淬灭以及红移(最大荧光向右移动)。信号缓慢降低直至达到0.9M脲浓度。此后，荧光信号存在尖锐降低直至达到2.3M脲浓度。在超出这个浓度时，荧光信号降低是最小的。在5M脲下，LEDGF1-326的λ最大移动至356nm且Δλ1/2是71nm。当绘制340nm相对于356nm的随脲浓度而变的LEDGF1-326荧光信号比率时，获得s形曲线(图7B)。自0-1M脲存在荧光信号缓慢下降(过渡期前)，并且接着自1-3M脲存在荧光信号陡峭下降(过渡期)，继之以自3-5M的缓慢下降期(过渡期后)。使用等式1和2(在方法中描述)，估计LEDGF1-326的ΔG(H2O)是3.24±0.48kcal mol-1，m值是1.70±0.22kcal mol-1M-1，并且[脲]1/2是1.81±0.02M，从而指示LEDGF1-326是稳定蛋白质。
进行远紫外CD光谱术以探究在脲存在下LEDGF1-326的二级结构的扰动(图7C和7D)。在各脲浓度下相对于波长追踪LEDGF1-326的CD信号(图7C)。当脲浓度增加时，CD信号连续变得更具阴性。当绘制230nm下的随脲浓度而变的CD信号时(图7D)，获得s形曲线。将数据拟合于等式1和2中，指示LEDGF1-326的ΔG(H2O)是3.28±0.40kcal mol-1，m值是1.90±0.19kcal mol-1M-1，并且[脲]1/2是1.61±0.02M。
LEDGF1-326是热稳定的
使用远紫外CD光谱术测定LEDGF1-326的热稳定性(图7E和7F)。自215-250nm测量在作为变性剂的热存在下的CD信号(图7E)。当LEDGF1-326溶液的温度增加时，观察到在约235nm下获得的负性倾斜增加。CD信号遵循与化学变性相同的样式，即在约30-35℃之间的过渡期前，继之以在约35-55℃之间的过渡期，继之以自约55-70℃的过渡期后(图7F)。当使用整体拟合分析拟合这个数据时，获得的LEDGF1-326Tm(熔解温度)是44.82±0.17℃，从而指示LEDGF1-326将可能在25℃(室温)下稳定。
LEDGF1-326从聚集介导的应激中挽救ARPE-19细胞
通过细胞活力测定来测量LEDGF1-326从蛋白质聚集介导的应激中挽救ARPE-19细胞的活性(图8)。最初，探究在不存在任何应激下LEDGF1-326增加ARPE-19细胞的活力的能力(图8A)。在处理48小时之后，在未处理细胞和0.001至50μg/ml LEDGF1-326处理的细胞中，细胞活力不存在显著差异。在LEDGF1-326的最高剂量(50μg/ml)下，相较于未处理细胞的100±13.19％(最左柱条)，细胞活力是108.14±5.63％(最右柱条)，此不具有显著性。在pP23H-Rho转染的ARPE-19细胞中，LEDGF1-326的表现具有差异性(图8B)。表达P23H突变视紫红质的细胞显示细胞活力下降至48.25±5.62％(柱条2)。细胞活力的这个损失可归因于倾向于聚集的P23H突变视紫红质蛋白在细胞内表达和累积的毒性作用。当表达P23H突变视紫红质的细胞(柱条3-9)用递增量的LEDGF1-326处理时，观察到细胞活力增加。在低至0.001μg/ml的浓度下，LEDGF1-326使ARPE-19细胞的细胞活力自48.25±5.62％增加至77.02±10.20％。在超出这个点时，细胞活力保持显著高于未处理的pP23H-Rho转染组(柱条2)。
LEDGF1-326延迟光受体的功能性损失
通过监测视网膜电流图(ERG)来探究LEDGF1-326在RCS大鼠中延迟光受体的视觉功能损失的功效。在黑暗适应(暗视)ERG中，在施用玻璃体内注射之前，在4周龄时，未处理和处理的大鼠的b波幅值在180.17±27.42至216.60±35.30μV的范围内(基础ERG)(图9A)。在玻璃体内注射之后两周时，在所有组中b波幅值都存在尖锐下降，值在65.80±15.44至91.13±13.94μV的范围内。在未处理和LEDGF1-326处理的组中不存在显著差异。然而，在超出两周时，在所有组中b波幅值都存在连续下降，其中LEDGF1-326处理的组中的下降较慢。在玻璃体内注射之后八周时，未处理、0.5、1.0和5μg LEDGF1-326处理的组的b波幅值分别是9.40±4.57、32.43±10.34、37.93±0.60和57.63±8.81μV。LEDGF1-326处理的组的b波幅值显著(p＜0.05)高于未处理组。观察到LEDGF1-326处理的组的b波幅值下降呈剂量依赖性延迟。随着LEDGF1-326的剂量增加，b波幅值的损失降低。
在光照适应(明视)ERG中，在第4周时在玻璃体内注射之前的基础b波幅值在69.83±16.49至80.97±8.60μV的范围内，其中在未处理组与LEDGF1-326处理的组之间无显著差异(图9B)。未处理组的b波幅值自80.97±8.60下降至10.90±5.64μV，而0.5、1.0和5.0μgLEDGF1-326处理的组的下降分别是自79.63±20.30至41.33±9.20μV、自69.83±16.49至28.00±7.23μV、以及自68.75±15.93至45.78±15.18μV。类似于暗视ERG，在单次玻璃体内注射LEDGF1-326八周之后，LEDGF1-326处理的组的b波幅值显著(p＜0.05)高于未处理组。
实施例2
1.材料和方法
材料-异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、吐温20、蔗糖、叠氮化钠购自Sigma-Aldrich()。AKTA FLPC用于蛋白质纯化。所有色谱图都使用UNICORN软件分析。除非指定，否则所有化学品都自Sigma Aldrich获得且是试剂等级或更高等级。
使用分别含有NcoI和HindIII位点的5’AGCAAGCCATGGGCATGACTCGCGATTTCAAACCTGGA3’(SEQ ID NO：5)和5’AGCAAGAAGCTTCTACTGCTCAGTTTCCATTTGTTCCTC3’(SEQ ID NO：6)引物自pLEDGF1-326质粒扩增His标签移除-LEDGF1-326基因。此后，在用Nco1和HindIII酶消化之后，将LEDGF1-326基因连接至pET-28a(+)中。根据使用者手册将连接的产物转化于感受态大肠杆菌DH5α细胞中。通过PCR、限制消化和测序方法确认基因的插入。
LEDGF1-326生物合成和纯化：如先前所述(参考JBC)生物合成和纯化LEDGF1-326(无His标签)。简要来说，使用1mM IPTG在大肠杆菌BL21(DE3)中表达LEDGF1-326。使用两步快速蛋白质液相色谱(FPLC)，首先基于电荷(阳离子交换)且接着基于尺寸(凝胶过滤)来自细胞溶解产物纯化LEDGF1-326。在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中充分透析纯化LEDGF1-326，浓缩且储存在-80℃下直至进一步使用。
制剂制备：制备LEDGF1-326(1或0.5mg/ml)于柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的pH在6至7.5的范围内的制剂。添加添加剂吐温20、EDTA和蔗糖以分别达到最终浓度0.1％(w/v)、1mM、10％(w/v)。测试含有0.02％叠氮化钠的制剂的可能由于微生物生长而发生的任何降解。所有制剂一旦制备即在温度控制的孵育器中储存在25℃下，并且采取足够措施以避免任何蒸发。
荧光光谱术：进行稳态荧光光谱术以确定三级结构变化。使用Spectramax M5(Molecular Devices，Downingtown，PA)，以每1nm增量在280nm激发下自300至400nm记录制剂的内在色氨酸(Trp)荧光光谱。为测量荧光变化，绘制各pH和各时间点对应的342nm下的荧光强度。所有荧光值都作缓冲效应和内滤效应方面的校正。
圆二色性(CD)：通过远紫外CD光谱确定LEDGF1-326的二级结构变化。简要来说，将制剂放置在1mm石英比色皿中且使用CD仪器(Applied Photophysics Ltd，UK)在每个时间点0.5秒的扫描速度、1nm步长和自200至280nm的4nm带宽下记录光谱。
动态光散射(DLS)：使用Nano ZS(Malvern，Westborough，MA)监测LEDGF1-326蛋白的尺寸。简要来说，将100μl制剂放置在低体积玻璃比色皿中。使用动态光散射，在173°反向散射角下收集LEDGF1-326颗粒散射数据。对于各次测量，记录13次扫描的平均值。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：在75℃下将LEDGF1-326制剂样本(10μg)连同10μl 2x装载缓冲液一起煮沸10分钟。将样本装载在4-15％小型PROTEAN TGx凝胶上且按尺寸分离蛋白质。根据使用者方案使用考马斯蓝染色来观察蛋白质。
蛋白质估计：对于蛋白质估计，在10000g下短暂离心LEDGF1-326制剂5分钟且收集上清液。根据使用者手册使用BCA测定试剂盒对上清液进行蛋白质估计。对于不溶性聚集体估计，自相应制剂的第0天蛋白质水平减去在各时间点测量的可溶性蛋白质。
ELISA：开发间接ELISA方法以测定制剂中免疫反应性LEDGF1-326的百分比。简要来说，在4℃下一式三份将100μl标准LEDGF1-326(新鲜纯化)或制剂样本在96孔板中涂布过夜。在各步骤之后，各孔用洗涤缓冲液(含0.1％w/v吐温20的PBS，pH 7.0)洗涤三次。非特异性结合位点用阻断溶液(含0.5％牛血清白蛋白和0.1％吐温20的PBS，pH 7.0)阻断4小时。用小鼠抗LEDGF抗体(BD Biosciences，San Diego，CA)检测LEDGF1-326，所述抗体用HRP缀合的抗小鼠二级抗体(来源)交叉检测。在将板彻底洗涤之后，最后添加3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)。在蓝色显现后，通过650nm下的比色吸光度来定量免疫反应性LEDGF1-326。
统计分析：所有数据都表示为平均值±SD。对于多组之间的比较，已合并所有pH对应的数据，平均化且与相应含添加剂制剂进行比较。通过单因子ANOVA，继之以杜凯氏事后分析(SPSS，11.5版；SPSS，Chicago，IL)进行统计。p≤0.05被视为统计显著。
2.结果
无His标签LEDGF1-326克隆和纯化
PCR扩增产生LEDGF1-326的1000bp条带。限制消化、连接和随后自LEDGF1-326基因插入的质粒的PCR扩增指示LEDGF1-326的阳性条带。LEDGF1-326蛋白的纯化指示40kDa单体条带以及极微弱小分子量条带，从而指示LEDGF1-326可能已在纯化过程期间经受某一降解。
添加剂使LEDGF1-326稳定性增加
在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，在pH 6.0-7.5之间监测添加剂吐温20、EDTA和蔗糖对LEDGF1-326稳定性的影响。通过测量LEDGF1-326中的色氨酸(Trp)的荧光特性来监测LEDGF1-326中的三级结构扰动(图11A)。LEDGF1-326制剂(0.5mg/ml)指示342nm下的荧光强度就缓冲液的pH而言无显著差异(图11A(i))。在第0天，LEDGF1-326的单纯缓冲液制剂指示在6.0-7.5pH范围内，342nm下的初始荧光强度是5163±302R.F.U.。在第1天，荧光强度存在增加至6198±102，截至第3天，其显著降低至3518±305R.F.U.，从而指示相较于第1天，信号强度损失约43％。截至第14天，信号强度存在87％损失。荧光光谱指示在第3天、在第7天以及超出光谱的最大荧光强度红移几乎是平坦的。
添加剂不改变初始LEDGF1-326荧光强度且在第0天，有添加剂的制剂或无添加剂的制剂的荧光强度不存在显著差异(图11A(ii))。对于所有pH范围，直至第60天，荧光信号都不存在显著损失且最大荧光都不存在移动。
通过CD监测LEDGF1-326中的二级结构扰动。图11B指示pH6.0-7.5的各种制剂随时间而变的208nm下的LEDGF1-326椭圆率。CD指示LEDGF1-326的二级结构主要是无规卷曲。LEDGF1-326指示在第0天的椭圆率是-17.5±0.1mDeg，截至第3天，其显著降低至-13.9±0.8mDeg(图11B(i))。CD信号存在进一步下降且截至第7天，椭圆率是-3.4±2.3mDeg。在第0天，有或无添加剂的制剂的CD信号不存在显著差异(图11B(ii))。对于所有含有添加剂的制剂，在第0天和第60天的CD信号分别是-17.9±0.3和-19.1±1.4mDeg，从而指示不存在显著变化。
在所有有或无添加剂的制剂中，在第0天，LEDGF1-326的流体动力学(颗粒)尺寸是7±1nm(图11C(i))，如通过DLS所指示。截至第3天，pH 6-7.5的单纯缓冲液制剂中的LEDGF1-326的颗粒尺寸增加至200-700nm。在添加剂存在下，在第0天，LEDGF1-326指示尺寸是约1nm且直至第60天，指示尺寸无变化(图11C(ii))。
SDS-PAGE指示LEDGF1-326是40kDa蛋白质。在第0天，在所有制剂中都存在小分子量蛋白质的极微弱条带。在单纯缓冲液制剂中，较低分子量片段早在第1天即加强(图12(i))。截至第3天，存在大量可见较低分子量条带。截至第7天，40kDa条带和其它片段完全损失。添加剂延迟较低分子条带强化直至第60天(图12(ii))。在第60天，在含添加剂制剂中，不管缓冲液pH如何，较低分子条带连同40kDa条带一起是可见的。
添加剂降低LEDGF1-326的不溶性聚集体
pH 6.0-7.5的LEDGF1-326单纯缓冲液制剂在第0天的可溶性蛋白质含量是417.8±21.3μg/ml(图13A)。截至第7天，可溶性蛋白质含量存在显著降低至142.5±60.7μg/ml。此后，在不同pH下的单纯缓冲液制剂中的蛋白质含量存在高度变化，然而，不存在明确趋势。平均来说，截至第60天，总可溶性蛋白质含量是316.2±140.0μg/ml。含添加剂制剂指示在第0天，蛋白质含量是470.5±17.3μg/ml，并且甚至直至第60天仍然是469.0±33.4μg/ml。
由可溶性蛋白质含量计算制剂中存在的聚集体百分比(图13B)。单纯缓冲液制剂指示早在第3天即出现不溶性聚集体，并且截至第7天，存在64.6±14.0％聚集体(图13B)。在超出第7天时，制剂中的聚集体含量存在不可预测变化，然而，在所有pH范围内，聚集体的存在都保持显著较高。在添加剂存在下，对于直至第60天的所有天，聚集体百分比都保持低于检测限，例外之处是在第30天，存在22.3±9％聚集体(图13B)。
在单纯缓冲液制剂中可见制剂中沉降的颗粒(图13C)，而含添加剂制剂澄清直至第60天。
在添加剂存在下LEDGF1-326保持免疫反应性
使用间接ELISA定量LEDGF1-326免疫反应性(图14)。在pH6.0-7.5的单纯缓冲液制剂中，在第0天，ELISA指示76.9±4.8％免疫反应性LEDGF1-326。在第14天，当测试免疫反应性时，发现LEDGF1-326丧失它的几乎所有免疫反应性，仅剩余3.1±2.4％。截至第60天，不可检测免疫反应性LEDGF1-326。另一方面，含添加剂制剂指示在第0天、第14天和第60天，免疫反应性LEDGF1-326分别是74.8±7.7％、66.2±2.8％和70.4±24.5％。观察到免疫反应性具有pH依赖性，而在第60天，pH 6和7.5指示30±4和58±1％免疫反应性LEDGF1-326，pH6.5、6.75、7.0和7.25指示78±15、78±45、76±9和102±13％免疫反应性LEDGF1-326。
个别添加剂在增加LEDGF1-326稳定性方面的有效性较小
为了解个别添加剂对LEDGF1-326稳定性的影响，一次在pH 7.0的LEDGF1-326(1mg/ml)制剂中仅测试一种添加剂(图15和16)。对于单纯柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液制剂，截至第30天，LEDGF1-326在342nm下的荧光强度自8410±116降低至2178±22R.F.U(图15A)。而对于含有0.01％吐温20、1mM EDTA和10％蔗糖的制剂，在第30天，荧光强度分别是4925±1249、4056±979和6370±592R.F.U.。用作对照以监测微生物污染的叠氮化钠指示荧光强度是9136±241R.F.U.。在不存在添加剂下，损失的LEDG1-326荧光信号是第0天信号的75％，吐温20、EDTA和蔗糖分别使荧光信号保留在约59、48和76％。类似于荧光，CD信号也指示LEDGF1-326不稳定(图15B)。
在第30天，相较于第0天信号，所有制剂都指示208nm下的椭圆率存在显著差异。存在巨大背景信号噪声，从而指示存在非天然结构。
对于除含有蔗糖的制剂之外的所有制剂，在第0天，LEDGF1-326指示平均流体动力学尺寸是7±1nm(图15C)。在蔗糖存在下，LEDGF1-326指示流体动力学尺寸是1nm。截至第30天，对于含有单纯缓冲液、吐温20、EDTA和蔗糖的制剂，颗粒尺寸分别显著增加至578±366、726±444、490±423和1052±125nm。对于叠氮化钠组，替代尺寸增加，存在尺寸自7nm降低至4nm。
通过SDS-PAGE监测单体天然LEDGF1-326(图16)。最初，在第0天，在所有组中，LEDGF1-326在40kDa处的条带强度都类似。截至第7天，存在40kda条带变淡，从而指示LEDGF1-326单体损失。在第14天，相较于第0天，在所有组中的较低分子量条带出现都更显著。
实施例3
1.材料和方法
ARPE-19细胞自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)获得。细胞培养材料、试剂和转脂胺2000自InvitrogenCorporation(Carlsbad，CA)获得。铬酸、HCl、NaOH和用于圆二色性的其它供应物自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)获得。Tris碱、ZnCl2、EDTA(乙二胺四乙酸)自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得。
制备纳米装配体
将冻干的LEDGF1-326在4℃下在25mM Tris-HCl、100mMNaCl(pH 7.4)中充分透析过夜。在相同缓冲液中制备ZnCl2储备溶液(100mM)。对于纳米装配体制备，使用25mM Tris-HCl、100mMNaCl(pH 7.4)将锌储备溶液稀释至最终浓度0.1mM、1mM和10mM，并且向其中添加LEDGF1-326(最终浓度1mg/ml)并在37℃下孵育24小时。在类似条件下无锌的LEDGF1-326作为对照保存。在制备制剂之前，所有溶液都用0.2μm过滤器过滤。纳米(xx)装配体指示用xx mM Zn(II)制备的LEDGF1-326纳米装配体。
动态光散射
使用zeta sizer Nano ZS(Malvern，Westborough，MA)基于动态光散射(DLS)测量纳米装配体均质性和尺寸分布。简要来说，将样本放置在150μl石英比色皿中且在173°反向散射角下收集数据，其中将11次扫描平均化以将最终尺寸分布绘图。通过测量不同时间点的数目尺寸分布曲线来监测这些纳米装配体的尺寸和它们的稳定性的时间依赖性变化。
荧光
通过测量色氨酸的稳态内在荧光来确定LEDGF1-326的三级结构变化。将样本放置在150μl石英比色皿中，并且使用SpectramaxM5(Molecular Devices，Downingtown，PA)，以1nm增量在280nm激发波长下自300至400nm记录发射光谱。每个数据点的扫描数是6。
圆二色性
为确定LEDGF1-326中的二级结构变化，记录制剂的远紫外CD光谱。简要来说，将样本放置在1mm石英比色皿中且使用CD仪器(Applied Photophysics Ltd，UK)在每个时间点0.5秒的扫描速度、1nm步长和自200至280nm的4nm带宽下记录光谱。所有扫描都一式三份进行。减去对缓冲液组分的扫描。
细胞活力测定
ARPE-19细胞用于确定在聚集介导的应激存在下LEDGF1-326的细胞存活功能。简要来说，如早先所述(Baid等PLoS One.6(9)：e24616)维持ARPE-19细胞。对于细胞活力测定，将10000个细胞于含有血清的DMEM-F12培养基中接种于96孔板中。在24小时之后，吸出培养基且细胞用100μl无血清培养基洗涤。此后，细胞用200μl单独LEDGF1-326或LEDGF1-326+10mM锌纳米装配体处理48小时。无细胞(仅培养基)、具有作为单独LEDGF1-326的对照的25mM Tris缓冲液的细胞、具有25mM Tris+10mM锌的细胞(等效于含有最高量的锌的组)作为对照加以维持。将细胞孵育24和48小时。此后，吸出培养基且添加200μl新鲜无血清培养基。添加20μl MTT试剂(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四钠，5mg/ml于PBS(pH 7.4)中)至各孔中且在37℃下再进行孵育3小时。吸出含有MTT的培养基且将形成的甲臜晶体溶解于200μl DMSO中。使用Spectramax M5在570nm下测量显现的颜色的吸光度。关于含有不具有转脂胺2000的细胞的对照组来计算各组的活力百分比。所有组都以n＝3加以重复。
细胞摄取
将ARPE-19(50,000)细胞于含有血清的DMEM-F12培养基中接种于24孔板中。在24小时之后，吸出培养基且细胞用100μl无血清培养基洗涤。此后，细胞用200μl LEDGF1-326或纳米(10)装配体处理1和6小时。具有作为单独LEDGF1-326的对照的25mM Tris缓冲液的细胞、具有25mM Tris+10mM锌的细胞(等效于含有最高量的锌的组)作为对照加以维持。在2或6小时之后，细胞用500μl冷PBS(pH7.4)洗涤两次，随后用500μl酸PBS(pH 5)洗涤2次。此后，细胞在室温下用1％曲通-x溶解20分钟且打碎并收集。在488nm激发和519nm发射下测量荧光。
螯合
对于探究在螯合剂存在下，纳米装配体的形成是否可被逆转，如上所述使纳米装配体在37℃下形成24小时。使用25mM Tris-HCl和100mM NaCl(pH 7.4)制备EDTA 500mM储备溶液。向LEDGF1-326或纳米装配体中添加EDTA以达到最终浓度50mM。在室温下将它孵育4小时，此后，如上所述进行紫外、荧光和CD测定。
2.结果
在ZnCl2存在下LEDGF1-326经受结构和构象变化
通过动态光散射(DLS)、内在trp荧光、远紫外CD和紫外可见光谱监测在Zn(II)存在下的纳米装配体形成(图17)。LEDGF1-326指示流体动力学直径是9±1nm，其在24小时时期内不显著改变，如通过DLS所监测(图17A)。与不同浓度的Zn(II)一起孵育的LEDGF1-326经受尺寸变化，从而指示形成纳米装配体。就0.1mM ZnCl2而言，无尺寸变化直至24小时。在1mM和10mM Zn(II)存在下，LEDGF1-326指示在37℃下孵育30分钟内发生尺寸增加。在24小时孵育下，LEDGF1-326指示对照、纳米(0.1)、纳米(1)和纳米(10)装配体的尺寸分别是7±1、22±5、26±5和28±5nm。
为探究在Zn(II)存在下LEDGF1-326的二级结构变化，自200-260nm监测LEDGF1-326的远紫外CD光谱(图17B)。在37℃下孵育24小时之后，LEDGF1-326指示低于200nm的负性椭圆率以及在230nm下的负性倾斜。光谱的去卷积指示LEDGF1-326主要是无规卷曲结构。在Zn(II)存在下，指示CD光谱发生显著变化。在230nm下的负性倾斜向左移动(至较低波长)。LEDGF1-326的椭圆率指示阴性信号随Zn(II)浓度增加而增加。CD变化取决于Zn(II)浓度，其中对于0.1mM Zn(II)而言缓慢而对于10mM Zn(II)制剂而言最快(数据未显示)。在230nm下的负性倾斜存在以浓度依赖性方式向较低波长移动，从而指示可能形成α-螺旋。然而，低于200nm，负性信号也视Zn(II)浓度而增加。CD光谱的去卷积指示相较于对照，纳米(10)制剂中的α-螺旋增加2％。
LEDGF1-326的内在trp荧光光谱(图17C)指示在Zn(II)存在下，荧光信号的强度在Zn(II)存在下、在200-400nm之间降低。引起关注的是相较于10mM Zn(II)制剂，0.1mM Zn(II)制剂中的荧光信号降低更多。
LEDGF1-326显示在紫外吸收光谱中，A最大在276nm下。(图17D)。在Zn(II)存在下，0.1和1mm Zn(II)制剂的紫外信号存在降低，但观察到10mM锌制剂无变化。对于对照、纳米(0.1)、纳米(1)和纳米(10)装配体，276nm下的紫外信号(A最大)分别是0.47、0.33、0.32和0.46。
LEDGF1-326形成纳米结构
如图18中所示，当根据透射电子显微术(TEM)观察时，LEDGF1-326纳米(10)装配体(最右图面)指示存在松散形成的纳米结构，如通过密集负性染色所观察。一些纳米装配体彼此依附，而其它纳米装配体以个别颗粒形式存在。在不存在Zn(II)下，LEDGF1-326(中间图面)不指示存在任何所述结构。
纳米装配体历经稀释是稳定的
使用DLS研究纳米装配体历经稀释的稳定性(图10)。一旦形成，纳米(10)装配体在稀释2和4倍时不指示任何尺寸变化。此外，当这些稀释纳米(10)装配体在4℃下储存24小时且接着测量尺寸时，不存在尺寸变化。
纳米装配体的形成是可逆的
为探究LEDGF1-326与锌之间的相互作用的种类，我们监测EDTA对纳米(10)的影响(图19)。向对照LEDGF1-326中添加EDTA不指示任何显著尺寸变化且LEDGF1-326尺寸保持在约7-8nm(图19A)。在添加EDTA之前，纳米(10)装配体指示尺寸是25±4，其在添加EDTA后降低至9±2。由于形成纳米装配体而被淬灭的纳米装配体的荧光光谱得以回复(图19B)。在添加EDTA之后，对照和纳米(10)装配体指示类似荧光光谱。如通过CD光谱指示的所有二级结构变化都得以类似回复(图19C)。紫外可见光谱也指示由于装配体形成而发生的变化逆转(图19D)。
纳米装配体中的LEDGF1-326稳定性增加
使用DLS、SDS-PAGE、CD和荧光持续30天监测在25℃下纳米装配体中的LEDGF1-326的稳定性(图20)。在第3天，对照LEDGF1-326尺寸自8±1降低至5±1nm(图20A)。在第0天，纳米(1)装配体指示尺寸是27±1，其在第7天降低至4±3nm。另一方面，纳米(10)装配体指示尺寸无变化直至第30天。在第30天，纳米(10)装配体存在尺寸自27±1变化至8±2nm。
在第0天，在SDS-PAGE中指示对照LEDGF1-326、纳米(1)和纳米(10)装配体中存在40kDa条带(图20B)。截至第3天，对照LEDGF1-326中存在这个条带的完全损失。纳米(1)装配体在第7天丧失这个条带，而纳米(10)在第30天将它丧失。
对照LEDGF1-326的CD光谱指示从第1天开始负性椭圆率连续损失且信号在第30天完全损失(图20C)。纳米(1)装配体指示从第1天开始CD信号连续损失；然而直至第30天，存在CD信号。直至第14天，纳米(10)装配体不存在显著信号损失，在第30天，CD信号存在降低，然而，仍然明显观察到阴性信号。
对照LEDGF1-326的荧光光谱指示相较于第0天，在第7天，荧光强度显著降低，第30天荧光持续进一步损失(图20D)。另一方面，纳米(1)装配体指示相较于第0天信号，荧光信号无损失直至第7天，然而，在第14天且向前进，存在信号损失。最强力的纳米(10)指示相较于第o天信号，强度无损失直至第14天，并且相较于其它相应组，在第30天的强度降低极小。
ARPE-19细胞摄取较高量的纳米装配体
使用Alexa缀合的LEDGF1-326探究ARPE-19细胞中LEDGF1-326的细胞摄取(图21)。Alexa-LEDGF1-326的ARPE-19摄取具有剂量依赖性。当分别与2、10和25μg/ml Alexa-LEDGF1-326一起孵育时，在2小时内，0.5±0.1、1.0±0.3和1.4±0.2μg Alexa-LEDGF1-326(对照)由ARPE-19细胞摄取。当孵育时间增加至6小时时，Alexa-LEDGF1-326的摄取存在增加。对于2、10和25μg/ml Alexa-LEDGF1-326处理，在6小时内的LEDGF1-326摄取分别增加至1.2±0.2、1.2±0.2和1.9±0.2μg。
Alexa-LEDGF1-326纳米(10)装配体指示相较于相应对照组，在2和6小时下的摄取较高。在2小时下，对于2、10和25μg/ml纳米(10)装配体处理，分别存在0.7±0.08、1.0±0.2和2.2±0.5μg摄取。尽管相较于对照，纳米装配体摄取较高，但不存在显著差异。孵育时间自2小时增加至6小时使纳米(10)装配体摄取显著增加。对于2、10和25μg/ml纳米(10)装配体处理，在6小时下，摄取分别是2.0±0.09、2.9±0.5和2.9±0.2μg。
纳米装配体使ARPE-19细胞存活于血清饥饿
通过MTT测定来监测纳米装配体使ARPE-19细胞在血清饥饿下存活的功效。(图22)。相较于未处理组(100％活力)，LEDGF1-326处理的组指示活力以剂量依赖性方式增加。在用0.01、0.1和1.0μg/mlLEDGF1-326处理下，ARPE-19细胞活力分别增加至124±11、148±12和160±44％。相较于相应对照LEDGF1-326处理的组，纳米(10)装配体处理的组指示细胞活力较高。在用0.01、0.1和1.0μg/ml LEDGF1-326处理下，ARPE-19细胞活力分别增加至150±3、180±22和200±8％。
纳米装配体使LEDGF1-326延迟视网膜变性的功效增加
使用视网膜电描记术(ERG)，在RCS大鼠中测试纳米装配体防止视网膜功能性损失的功效(图23A)。在第4周，在向大鼠给与玻璃体内注射之前，b波幅值是313±32μV，在所有组中都无显著差异。历经随后10周的时期，即在14周，缓冲液和Zn(II)处理的组指示b波幅值分别自307±44降低至17±10μV以及自302±37降低至11±7μV。LEDGFl-326处理(对照)使b波幅值损失减缓且在第14周，b波幅值自337±30下降至42±15μV，然而，在14周内，缓冲液、Zn(II)和对照组b波幅值不存在显著差异。纳米(10)指示具有针对b波幅值损失的显著保护作用直至14周。在第14周，b波幅值自305±36下降至65±15μV，从而指示相较于相应缓冲液或Zn(II)组，b波显著较高。
在第4周，在明视ERG中，所有组的b波幅值都是105±23(图23B)。类似于暗视ERG，观察到b波幅值降低。缓冲液和Zn(II)处理的组指示b波幅值分别自94±26损失至12±7μV以及自109±23损失至11±7μV。对照LEDGF1-326和纳米(10)装配体处理的组延迟损失，并且b波幅值分别自100±28降低至22±5μV以及自113±23降低至40±10μV。纳米(10)装配体指示相较于相应缓冲液、Zn(II)和对照LEDGF1-326处理的组，b波显著较高。
此外，在第4周时，所有组中的振荡电势(OP)幅值都是91.8±11.5μV。(图23C)。在所有组中都观察到(OP)幅值存在降低。截至第14周，在缓冲液、Zn(II)、对照和纳米(10)装配体组中，OP幅值分别是32±5、33±8、36±8和36±9μV。在所有组中都不存在显著差异。
也测量30hz闪烁幅值。(图23D)。在第4周，所有组的闪烁幅值平均是10±2μV。如同任何其它ERG一样，所有组中的闪烁幅值都存在降低；然而，在第14周，纳米(10)装配体组的闪烁幅值显著高于缓冲液和Zn(II)组。在第14周，缓冲液、Zn(II)、对照和纳米(10)装配体的闪烁幅值分别是2±0.4、3.7±0.4、2.4±0.6、5.2±2.2μV。
纳米装配体使LEDGF1-326在眼组织中的持久性增加数日
使用Alexa-LEDGF1-326的荧光信号来量度LEDGF1-326在正常SD大鼠中的持久性(图24)。图24A指示在玻璃体内注射SD大鼠眼之前的空白扫描平均值(n＝7)。空白扫描指示脉络膜、晶状体和角膜分别在约24、50和88个数据点下的自身荧光。基于这个空白扫描，对各种眼组织指定数据点。指定的数据点是脉络膜-RPE-24，玻璃体液约40，晶状体-50，水状液约70，以及角膜-88。图24B和32C是对照和纳米(10)装配体的标准曲线。这用于将由Flurotron扫描以荧光素钠(NaF)浓度(ng/ml)获得的荧光信号转换成实际Alexa-LEDGF1-326浓度(μg/ml)。图24D和24E是对照和纳米(10)装配体组自玻璃体内注射之后2分钟至14天的Flurotron扫描(N＝4)。由Flurotron扫描获得玻璃体、脉络膜-RPE和水状液中的荧光信号(图24D和24E)且分别转换成图24F、24G和24H中的实际Alexa-LEDGF1-326浓度。图24C和24D中在注射2分钟时的玻璃体中的高峰值指示玻璃体内注射被恰当地进行。
在空白扫描中观察到在玻璃体中的荧光信号等于3±0.5ng/mlNaF(图24A)，其在转换时得到0μg/ml Alexa-LEDGF1-326作为基线。在玻璃体内注射2分钟之后，指示在对照的玻璃体中，Alexa-LEDGF1-326的峰值292±106μg/ml，其在30分钟内尖锐下降至127±74μg/ml(图24F)。截至第3天，对照组中的Alexa-LEDGF1-326峰值低于基线。另一方面，纳米(10)装配体指示持续数日。在注射2分钟之后，峰值浓度是321±54μg/ml Alexa-LEDGF1-326，在30分钟内存在初始快速下降至100±45μg/ml；此后，相较于对照，下降是缓慢的，并且指示纳米装配体在玻璃体中持续直至第14天。在第14天，在纳米(10)装配体组中，Alexa-LEDGF1-326浓度是0.7±0.1μg/ml，其显著高于对照组和基线。
对于纳米(10)装配体组，也指示Alexa-LEDGF1-326在脉络膜-RPE中以及在水状液中具有持久性。脉络膜RPE中的自身荧光指示10±4ng/ml NaF，其在转换成Alexa-LEDGF1-326浓度时是0.1μg/ml。因此，0.1μg/ml Alexa-LEDGF1-326被视为脉络膜-RPE的基线(图24G)。在玻璃体内注射之后不久，指示脉络膜-RPE中的ALexa-LEDGF1-326是13.2±10.8μg/ml，其在对照组中在30分钟内增加至30.0±22.6μg/ml。此后，Alexa-LEDGFl-326水平存在下降且截至第1天不可检测。另一方面，纳米(10)装配体指示在2分钟内Alexa-LEDGF1-326是14.3±9.8μg/ml，其在30分钟内增加至21.5±12.8μg/ml。截至第1天，Alexa-LEDGF1-326水平降至2.0±1.1μg/ml，然而它显著高于对照组基线。Alexa-LEDGF1-326水平保持显著较高直至第14天，并且在第14天被检测是0.6±0.2μg/ml。
在水状液中，由空白扫描计算的基线等于0μg/mlAlexa-LEDGF1-326(图24A)。在玻璃体内注射之后2分钟，对照和纳米(10)装配体组的Alexa-LEDGF1-326浓度是3.4±3和4.9±2.4μg/ml(图24H)。对照组的Alexa-LEDGF1-326在6小时内降至基线以下，而纳米(10)装配体指示存在Alexa-LEDGF1-326直至第14天，在这个时间点，Alexa-LEDGF1-326的浓度是0.6±0.1μg/ml。
当以纳米装配体形式给药时，LEDGF1-326在体内保持免疫反应性数日
在单次玻璃体内注射之后14天通过间接ELISA探究各种眼组织中和血液中的Alexa-LEDGF1-326免疫反应性(图25)。对于未注射的空白眼组织，在角膜、水状液、晶状体、玻璃体液、视网膜、脉络膜-RPE、巩膜和血液中不存在可检测水平的Alexa-LEDGF1-326，从而指示不存在任何可检测量的内源性LEDGF1-326。引起关注的是，对于对照与纳米(10)装配体组两者，在视网膜中均可检测到Alexa-LEDGF1-326，分别是每克组织重量0.2±0.2μg和1.3±0.4μg。在对照和空白组中不存在显著差异，而相较于对照或空白组，纳米(10)装配体具有显著较高量的Alexa-LEDGF1-326。
实施例4
活/死细胞计数测定-对于细胞计数测定，将10000个ARPE-19细胞涂铺在96孔板中且孵育24小时。(图26)。在24小时之后，吸出含有血清的培养基。根据制造商方案使用1∶3比率的含转脂胺2000(LP-2000)的无血清培养基，用pP23H-Rho质粒(1μg/ml)短暂转染测试组(pP23H-Rho+LEDGF1-326)。在转染六小时之后，吸出培养基且细胞用递增量的LEDGF1-326处理。无细胞(仅培养基)、不具有LP-2000的细胞和具有LP-2000的细胞也作为对照加以维持。在LEDGF1-326处理时期结束时，细胞用PBS洗涤。细胞用质膜渗透剂(Hoechst 33342)、质膜不可渗透分子(BOBOTM3)和核染料(4′，6-二-甲脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐；DAPI)的组合标记。Hoechst 33342标记细胞核，而BOBOTM3标记垂死细胞或死细胞。使用高通量成像系统观察细胞。使用仪器中的自动化软件获得细胞计数。通过自“所有细胞”计数减去死细胞计数来计算活细胞的数目和百分比。如图26中所示，LEDGF1-326使ARPE-19细胞活力增加。
免疫印迹：对于免疫印迹，替代P23H-Rho使用CFP标记的P23H-Rho(pP23H-CFP-Rho)进行转染。将ARPE-19细胞涂铺在60mm板中，转染和药物处理相对于96孔板研究成比例放大。在LEDGF1-326处理结束之后，细胞用冷PBS洗涤一次且通过在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中超声处理加以溶解。将等量上清液装载至SDS-PAGE胶凝中且进行免疫印迹以测定Hsp70、Hsp40、Hsp27、CFP(针对P23H-CFP-Rho)和LEDGF1-326和β-肌动蛋白(β-actin)。使用增强的化学发光ECLTM检测试剂盒(GE Healthcare，Piscataway，NJ)观察蛋白质条带。观察数据指示LEDGF1-326被内化。
吞噬测定-将ARPE-19细胞接种于24孔板中且使用siRNA转染剂(Santa Cruz Biotechnology Ine.，Dallas，TX)，用20pM/ml MERTKsiRNA(Santa Cruz Biotechnology Inc.，Dallas，TX)转染6小时。移除转染培养基且在无血清培养基中再孵育细胞24小时。仅用转染培养基而无MERTK siRNA转染的细胞作为对照加以维持。将细胞洗涤一次且用0.05、0.5或5μg/ml LEDGF1-326处理24小时，并且接着监测对2μm颗粒的吞噬。简要来说，使100μg/ml 2μm蓝色荧光球(LifeTechnologies，Grand Island，NY)与细胞一起孵育3小时。此后，细胞用冷PBS(pH 7.4)洗涤两次，随后用冷PBS(pH 5.0)洗涤两次以移除粘着荧光球。使用1％曲通-x使细胞溶解，并且使用350nm激发和430nm发射测量细胞溶解产物中的颗粒的荧光。仅用转染剂而无siRNA转染的细胞被视为颗粒摄取的对照。未进行颗粒处理的细胞用于测量背景荧光。如图27中所示，LEDGF1-326使吞噬活性增加。视网膜色素上皮细胞的吞噬作用降低是包括退变性疾病的若干视网膜疾病的标志。LEDGF1-326将适用于治疗吞噬作用受损的疾病。
组织学：在研究结束时，即在第12周，在ERG测量之后将眼摘出且在室温下固定在戴维森氏固定剂(Davidson's fixative)(2％的37-40％甲醛、35％乙醇、10％冰乙酸和53％蒸馏水)中24小时。接着将眼储存在70％乙醇中以进行随后连续脱水和石蜡包埋。在标准切片机上自鼻至视神经处的颞叶侧(相隔500μm)切割厚度6μm的三个垂直截面。在苏木精/伊红染液组织切片之后，通过光学显微镜评估总体视网膜形态。使用Aperio ImageScope软件v11.1.2.760有序测量外核层(ONL)和内核层(INL)的厚度。因为光受体细胞保护作用跨越视网膜可为不均匀的，所以各切片中自上边缘至下边缘每500μm即加以分析，并且各点采用三个切片的平均值。数据代表三个眼的平均值。如图28中所示，LEDGF1-326延迟两个视网膜核光受体损失。
免疫荧光：对于免疫荧光，在移除石蜡之后，除非另外指示，否则通过以下依序步骤在室温下处理眼切片。通过在80℃下煮沸切片15分钟来修复抗原。在阻断非特异性结合之后，使切片与小鼠抗视紫红质(1D4)一级抗体一起在4℃下孵育过夜，随后与Alexa594缀合的驴抗小鼠IgG和DAPI一起孵育30分钟。最后，洗涤眼切片且通过Supermount H(Biogenex，San Ramon，CA)封装介质封装以防止荧光快速损失。使用共焦显微镜(Nikon Eclipse C1)在20X光学变焦下观察荧光。用于DAPI和Alexa Fluor的激发-发射波长分别是408-450/35nm和637-605/75nm。使用3.40版Nikon EZ-C1软件捕集图像。如图29中所示，LEDGF1-326延迟杆外段损失。
实施例5
His-LEDGF1-326的体外累积释放
评估His-LEDGF1-326囊封的PMP包NP在PBS(pH 7.4)中的体外释放。将颗粒(2-3mg)称重且分散在1ml PBS(pH 7.4)中并在37℃下在200rpm振荡下孵育(Max Q振荡孵育器)。在预定时间点，在13,000g下离心混悬的颗粒15分钟且收集上清液。将包含颗粒的离心块再混悬于1ml新鲜PBS(pH 7.4)中并孵育。根据制造商说明书(PierceBiotechnology，IL，USA)使用微量BCA测定估计样本中的His-LEDGF1-326含量。体外累积数据显示His-LEDGF1-326持续自PMP包NP释放。如图30中所示，截至3个月结束，观察到His-LEDGF1-326累积释放60％。
在大鼠中体内递送His-LEDGF1-326
在大鼠模型中玻璃体内施用含Alexa Fluor 488缀合的His-LEDGF1-326的PMP包NP之后评估His-LEDGF1-326的体内递送。无未标记LEDGF1-326用于PMP包NP中。大鼠眼用Alexa-His-LEDGF1-326囊封的PMP包NP(6.0μg His-LEDGF1-326/5μl)注射，并且作为对照，注射相等浓度(1.5μg标记的蛋白质和4.5μg未标记蛋白质/5μl)的Alexa-His-LEDGF1-326。这个比率允许我们对于待开始的两个组以类似荧光强度起始。使用Fluorotron MasterTM(Ocumetrics，CA，USA)定期监测归因于Alexa-His-LEDGF1-326释放的眼荧光直至荧光达到检测下限或基线。在注射制剂之前监测眼的基线荧光值。在各时间点，进行三次荧光测定扫描且使用平均值。使用比色皿和采用大鼠晶状体适配器的眼荧光光度法获得不同浓度下Alexa-His-LEDGF1-326的标准曲线。标准曲线用于使由荧光光度计提供的荧光素等效浓度转换成实际Alexa-His-LEDGF1-326浓度。
在玻璃体内注射Alexa-His-LEDGF1-326囊封性PMP包NP和可溶性Alexa-His-LEDGF1-326之后，通过沿轴面测量alexa荧光强度分布(等效于荧光素钠浓度)曲线来间接测定His-LEDGF1-326沿眼光轴的浓度分布，指示为从前至后方向上的数据点。荧光扫描揭示相较于溶液，Alexa-His-LEDGF1-326持续自PMP包NP递送。使由Fluorotron Master报道的荧光素等效浓度转换成Alexa-His-LEDGF1-326浓度。将来自溶液和PMP包NP组的在不同时间点在玻璃体区域中的Alexa-His-LEDGF1-326浓度绘图。仅报道标记的贝伐单抗(bevacizumab)的浓度。在玻璃体内注射之前，获取正常眼的基线荧光读数，并且得知基线荧光浓度是2.03μg/ml。如图31中所示，Alexa-His-LEDGF1-326溶液注射的组显示在第1天，Alexa-His-LEDGF1-326浓度是2.02μg/ml，从而指示自玻璃体区域快速消除。在PMP包NP注射的组中，得知玻璃体中Alexa-His-LEDGF1-326初始浓度是18.23μg/ml，并且Alexa-His-LEDGF1-326浓度维持在基线以上直至第35天并截至50天结束达到正常基线水平。观察数据指示能够达成Alexa-His-LEDGF1-326自示例性PinP组合物持续体内释放。

Claims (33)

1.一种包含晶状体上皮源性生长因子(LEDGF)的氨基酸序列的肽，其中所述肽包含LEDGF N末端应激相关的结合结构域。
2.如权利要求1所述的肽，其中所述肽还包含TAT结合结构域。
3.如权利要求1所述的肽，其中所述肽具有约40kDa的分子量。
4.如权利要求1所述的肽，其中所述肽具有氨基酸序列SEQ IDNO：2，或与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
5.一种核酸序列，其编码如权利要求4所述的肽。
6.一种载体，其包含如权利要求5所述的核酸序列。
7.一种组合物，其包含如权利要求1至4中任一项所述的肽。
8.如权利要求7所述的组合物，其还包含药物载体、稀释剂、赋形剂或其组合。
9.如权利要求7所述的组合物，其中所述肽与胶态金属纳米颗粒结合或缔合。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述胶态金属纳米颗粒是金、银、铝、钌、锌、铁、镍、钙、锂、钠、镁、钾、钪、钛、钒、铬、锰、钴、铜、镓、锶、铌、钼、钯、铟、锡、钨、铼、铂或钆胶态金属纳米颗粒。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述纳米颗粒是锌纳米颗粒。
12.如权利要求9至11中任一项所述的组合物，其还包含药物载体、稀释剂、赋形剂或其组合。
13.如权利要求7所述的组合物，其中所述肽结合或囊封于内部颗粒中，并且其中所述内部颗粒被装载在多孔外部颗粒中。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述内部颗粒是由在超临界二氧化碳中不膨胀的颗粒材料制得。
15.如权利要求13所述的组合物，其中所述内部颗粒材料是聚合物材料。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述内部颗粒聚合物材料选自由以下组成的组：聚交酯(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)、纤维素衍生物和壳聚糖。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述内部颗粒聚合物材料是聚交酯(PLA)。
18.如权利要求13所述的组合物，其中所述外部颗粒是由在超临界二氧化碳中膨胀的颗粒材料制得。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述外部颗粒是聚合物材料。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述聚合物材料是选自以下的材料：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯及其共聚物、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、纤维素聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡酪烷酮。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述外部颗粒材料是丙交酯-共聚-乙交酯。
22.一种治疗蛋白质聚集介导的疾病的方法，其包括向有需要的患者施用如权利要求7至21中任一项所述的组合物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述聚集介导的疾病是眼病。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述眼病是视网膜变性疾病。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述视网膜变性疾病是老年性黄斑变性(AMD)或视网膜色素变性(RP)。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述聚集介导的疾病是神经退变性疾病。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述神经退变性疾病是阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)、亨廷顿氏病(HD)、肌萎缩性侧索硬化或朊病毒疾病。
28.一种降低蛋白质聚集介导的疾病中蛋白质聚集的方法，其包括向有需要的患者施用如权利要求7至21中任一项所述的组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中蛋白质聚集是由内质网应激、氧化应激或两者引起。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述患者患有视网膜变性疾病。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述视网膜变性疾病是AMD或RP。
32.如权利要求28所述的方法，其中所述患者患有神经退变性疾病。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述神经退变性疾病是AD、PH、HD、肌萎缩性侧索硬化或朊病毒疾病
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