KR101863667B1 - 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용한 망막색소변성증 치료 - Google Patents

히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용한 망막색소변성증 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산 또는 이의 유도체; 상기 히알루론산 또는 이의 유도체와 공유결합으로 연결된 탄소나노물질; 및 상기 탄소나노물질과 결합된 광감각제;를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체가 제공된다. 본 발명의 망막질환 개선 또는 치료용 결합체는 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용하여 비교적 긴 시간 동안 선택적으로 망막상피세포에서 활성산소 생성을 억제할 수 있어 망막질환의 치료 효능이 우수하고, 세포내 침투가 용이할 수 있다. 또한, 이와 같은 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

Description

히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용한 망막색소변성증 치료{TREATMENT OF RETINITIS PIGMENTOSA USING HYALURONIC ACID-CARBON NANO MATERIAL-PHOTOSENSITIZER COMPLEX}
본 발명은 망막질환 개선 또는 치료용 결합체 및 그를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용하여 활성산소 생성을 억제할 수 있는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체 및 그를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
망막색소변성증(retina pigmentosa: RP)이라 함은 망막에 존재하는 광수용체의 문제가 생겨 시력에 영향을 주는 질환이다. 주로 이 질병은 망막색소상피 세포 및 광수용체에 영향을 주는 망막변성 질환이다. 대표적인 증상으로는 야맹증, 시야협착 및 시력 장애가 있다. 현재까지 망막색소변성의 근본적인 치료법은 없는 것으로 알려져 있으나 여러 가지 치료법이 연구 중에 있다. 유전자 치료나, 망막이식, 전기적 자극, 활성산소 억제 방법 등이 대표적인 예다.
피부나 눈 치료에 이용되어온 광감각제는 광동력학 치료에 사용하는 물질로서 빛을 받으면 주변 조직의 산소를 삼항 상태에서 일항 상태로 바꾸어 활성산소로 만들어주나, 상기 활성산소는 망막 세포의 퇴화에 영향을 끼치는 문제점이 있었다. 또한, 치료 후에도 오랜 기간 동안 피부와 눈 등에 광감각제가 잔존하므로 환자가 빛에 노출되는 경우에 피부 또는 눈의 정상세포를 죽이는 광민감성 부작용을 보이는 문제점이 있었다. 따라서, 환자는 치료 후 6주 이상 오랜 기간 동안 어두운 실내에서 머물러야 하는 불편함이 있었다.
상기 잔존하는 광감각제의 문제점을 해결하기 위해, 정상조직에 대한 비특이적 축적을 줄이기 위하여 친수성 특성을 나타내도록 개질된 광감각제의 경우에는 체내에서 보다 빠르게 배출이 된다는 장점이 있으나, 치료에 충분한 양이 전달되기 위해서는 용량을 높여서 투여해야 된다는 단점이 있으며, 세포내 침투도 어렵기 때문에 치료 효능이 낮아진다는 문제점이 있었다.
KR 2016-0003488 A
Effects of Chlorin e6 on Retinitis Pigmentosa Rhodopsin Mutants in vivo. ARVO Annual Meeting Abstract. (2012)
본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용하여 비교적 긴 시간 동안 선택적으로 망막상피세포에서 활성산소 생성을 억제할 수 있어 망막질환의 치료 효능이 우수하고, 세포내 침투가 용이한 망막질환 개선 또는 치료용 결합체를 제공하는 데 있다.
또한, 이와 같은 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
히알루론산 또는 이의 유도체; 상기 히알루론산 또는 이의 유도체와 공유결합으로 연결된 탄소나노물질; 및 상기 탄소나노물질과 결합된 광감각제;를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체를 제공된다.
상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체가 활성산소 생성을 억제할 수 있다.
상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체가 망막상피세포 또는 망막혈관의 활성산소 생성을 억제할 수 있다.
상기 망막질환이 망막색소변성증, 건식황반변성증 및 야맹증 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체를 이용한 치료가 빛이 없는 조건에서 수행될 수 있다.
상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체가 초자체내 주사(intravitreous injection), 안약 투여 및 정맥내 주사 중에서 선택된 1종 이상의 방법으로 투여될 수 있다.
상기 히알루론산의 유도체가 하기 화학식 1의 구조를 갖는 시스타민으로 치환된 히알루론산일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016027684211-pat00001
상기 화학식 2에서,
x 및 y는 각각 독립적으로 16 내지 2,500 중에서 선택된 정수이다.
상기 시스타민이 상기 히알루론산에 대해 10 내지 30%의 치환율로 치환될 수 있다.
상기 탄소나노물질이 탄소양자점, 탄소나노튜브, 산화그래핀, 그래핀 및 플러린 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 광감각제가 클로라인 e6(Ce6), 포르피린 기재 광감각제 및 비포르피린 기재 광감각제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 탄소나노물질이 탄소양자점이고, 상기 광감각제가 Ce6일 수 있다.
상기 탄소양자점 1 중량부에 대해 상기 Ce6가 1 내지 2 중량부로 결합될 수 있다.
상기 Ce6가 결합된 탄소양자점과 상기 히알루론산 또는 이의 유도체의 중량비가 4:1 내지 2:1일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,
(a) 히알루론산 또는 이의 유도체에 광감각제가 결합된 탄소나노물질을 공유결합시키는 단계를 포함하는 결합체의 제조방법이 제공된다.
상기 공유결합시키는 단계가 (a') 상기 히알루론산 또는 이의 유도체와 상기 광감각제가 결합된 탄소나노물질을 서로 혼합 또는 용해시킨 후, 촉매로서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride, EDC)를 첨가하여 반응시키는 단계일 수 있다.
상기 단계 (a') 이후에 (b) EDC를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 반응이 빛이 없는 조건에서 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,
상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체를 유효성분으로 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 망막질환 개선 또는 치료용 결합체는 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용하여 비교적 긴 시간 동안 선택적으로 망막상피세포에서 활성산소 생성을 억제할 수 있어 망막질환의 치료 효능이 우수하고, 세포내 침투가 용이할 수 있다.
또한, 이와 같은 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 망막질환 개선 또는 치료용 결합체를 눈에 투여하는 개략도이다.
도 2는 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6-HA), 탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6) 및 Ce6의 활성산소 억제 가능성을 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3은 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6를 망막색소상피 세포에 처리하고 24시간 동안 배양한 후 MTT assay를 통하여 세포 독성을 조사한 결과이다.
도 4는 0, 2.5, 5 mM의 요오드산나트륨을 망막색소상피 세포에 처리하고 24시간 배양(incubation)한 후 세포 생존율을 비교한 결과이다.
도 5는 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6를 처리한 망막색소상피 세포에 5 mM 요오드산나트륨을 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 비교한 결과이다.
도 6은 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6를 2시간 동안 처리한 망막색소상피 세포에 요오드산나트륨을 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate) assay를 통해 활성산소 변화를 측정한 결과이다.
도 7은 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6를 처리한 망막색소상피 세포에 요오드산나트륨을 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 GSH-400 kit를 통해 글루타치온 농도를 측정한 결과이다.
도 8은 망막색소상피 세포에 다양한 처리를 하고 24시간 동안 배양한 후 공 초점 레이저 주사 현미경을 통해 세포 섭취를 확인한 결과이다.
도 9은 망막색소상피 세포에 다양한 처리를 하고 24시간 동안 배양한 후 F-actin assay를 진행하여 공 초점 레이저 주사 현미경을 통해 액틴의 모양 및 농도를 확인한 결과이다.
도 10은 망막색소상피 세포에 다양한 처리를 하고 24시간 동안 배양한 후 CellROXTM green agent를 처리하여 공 초점 레이저 주사 현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 11은 정상 토끼 눈에 PBS(Phosphate buffer saline, None), Ce6, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 각각 초자체내 주사를 하여 망막에 전달하고 망막색소 상피 세포 섭취 및 잔류 시간을 공 초점 레이저 주사 현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 12는 정상 토끼 눈에 PBS, Ce6, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 각각 초자체주사 한 뒤 망막 전기 측정기(electroretinography: ERG)를 이용하여 전기 신호의 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하도록 한다.
그러나, 이하의 설명은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 망막질환 개선 또는 치료용 결합체를 눈에 투여하는 개략도이다. 여기서, 망막질환 개선 또는 치료용 결합체는 히알루론산과 탄소양자점 및 클로라인 e6(Ce6)이 결합된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6-HA)이고, 초자체내 주사(intravitreous injection)를 통해 투여되는 것으로 예시하였으나 본 발명이 이에 한정되는 않는다.
이하, 도 1을 참조하여, 본 발명의 망막질환 개선 또는 치료용 결합체에 대해 상세히 설명하도록 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 망막질환 개선 또는 치료용 결합체는 히알루론산 또는 이의 유도체; 상기 히알루론산 또는 이의 유도체와 공유결합으로 연결된 탄소나노물질; 및 상기 탄소나노물질과 결합된 광감각제;를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 결합은 화학적 결합 또는 물리적 결합, 바람직하게는 화학적 결합일 수 있고, 구체적으로는 공유결합, 이온결합 또는 배위결합, 바람직하게는 공유결합일 수 있다.
상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체는 활성산소 생성을 억제할 수 있으며, 바람직하게는 망막상피세포 또는 망막혈관의 활성산소 생성을 억제할 수 있다.
상기 망막질환은 망막색소변성증, 건식황반변성증, 야맹증 등이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 망막색소상피 세포의 활성산소에 의한 퇴화로부터 유발되는 망막질환은 어느 것이든 가능하다.
상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체를 이용한 치료는 빛이 없는 조건에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체는 초자체내 주사(intravitreous injection), 안약 투여, 정맥내 주사 등의 방법으로 투여될 수 있다.
상기 히알루론산의 유도체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 시스타민으로 치환된 히알루론산일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016027684211-pat00002
상기 화학식 1에서,
x 및 y는 각각 독립적으로 16 내지 2,500 중에서 선택된 정수이다.
바람직하게는, 상기 화학식 1에서 x 및 y는 치환율에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 치환율이 각각 30%, 20%, 10%인 경우, x:y는 각각 7:3, 8:2, 9:1의 비율로 존재하는 정수일 수 있다.
상기 시스타민은 상기 히알루론산에 대해 10 내지 50%의 치환율로 치환될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 30%. 더욱 바람직하게는 10%의 치환율로 치환될 수 있다.
상기 탄소나노물질은 탄소양자점, 탄소나노튜브, 산화그래핀, 그래핀, 플러린 등이 가능하나, 바람직하게는 탄소양자점일 수 있다.
상기 광감각제는 클로라인 e6(Ce6), 포르피린 기재 광감각제, 비포르피린 기재 광감각제 등이 가능하나, 바람직하게는 클로라인 e6일 수 있다.
상기 광감각제는 특정 파장의 빛에 의해서 강한 형광신호를 주로 발생하거나, 또는 형광신호와 반응성 산소종을 모두 생성시킬 수 있는 화학물질을 의미하며, 탄소나노물질과의 거리가 일정 수준으로 가까운 경우에는 상호간의 에너지 전달 현상에 의해서 형광신호 및/또는 반응성 산소종의 생성이 억제될 수 있다.
상기 탄소양자점 1 중량부에 대해 상기 Ce6가 1 내지 2 중량부로 결합될 수 있다.
상기 Ce6가 결합된 탄소양자점과 상기 히알루론산 또는 이의 유도체의 중량비가 4:1 내지 2:1일 수 있고, 바람직하게는 3:1일 수 있다.
이하, 본 발명의 결합체의 제조방법을 설명하도록 한다.
본 발명의 결합체는 히알루론산 또는 이의 유도체에 광감각제가 결합된 탄소나노물질을 공유결합시켜 제조할 수 있다(단계 a).
상기 공유결합시키는 단계가 상기 히알루론산 또는 이의 유도체와 상기 광감각제가 결합된 탄소나노물질을 서로 혼합 또는 용해시킨 후, 촉매로서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride, EDC)를 첨가하여 반응시키는 단계일 수 있다(단계 a').
바람직하게는 히알루론산에 시스타민을 치환시킨 히알루론산 유도체를 광감각제로서 Ce6가 결합된 탄소양자점-Ce6 결합체를 서로 혼합하여 시스타민기 중 히알루론산에 결합되지 않은 나머지 하나의 아민기와 광감각제로서 Ce6이 결합된 탄소양자점-Ce6 결합체 중 Ce6의 카르복실기를 아마이드 반응시키는 것에 의해 본 발명에 따른 결합체를 제조할 수 있다.
상기 반응은 빛이 없는 조건에서 수행될 수 있다.
상기 단계 (a') 이후에 EDC를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다(단계 b).
또한, 본 발명은 망막질환 개선 또는 치료용 결합체를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 광역학 치료용 조성물은 약제학적으로 유효량의 히알루론산-탄소나노물질 접합체와 함께, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 희석제일 수 있고, 나아가, 상기 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제, 및 분산제 등의 보조제를 더 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 조화되도록 제형화될 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 설명하도록 한다. 그러나 이는 예시를 위한 것으로서 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 다이아미노헥산이 치환된 히알루론산의 제조
히알루론산 210kDa 를 5mg/mL 수용액에 히알루론산 단위체의 20 몰배 이상의 다이아미노 헥산을 첨가하고 pH를 5.5로 내린후 EDC와 sulfo-NHS(sulfo-N-Hydroxysuccinimide)를 이용하여 10분 동안 반응시킨 뒤, pH를 7.4로 올려 반응을 종결 시키고 투석(dialysis)을 통해 정제한 뒤, 동결건조 시켜 다이아미노헥산이 치환된 히알루론산을 얻었다.
제조예 2: 탄소양자점 - Ce6 결합체의 제조
Ce6 1mg/mL DMSO 용액에 같은 몰 수의 NHS와 EDC를 넣어 30분 동안 카복실 그룹을 활성화 시킨 뒤 탄소양자점 2 mg/mL 인산 완충액 (phosphate buffer) 용액을 섞어 암실에서 12시간 반응시키고, 정제한 후 동결건조 시켜 탄소양자점-Ce6 결합체를 얻었다.
실시예 1: 히알루론산- 탄소양자점 - Ce6 결합체의 제조
제조예 1에 따라 제조된 다이아미노헥산이 치환된 히알루론산과 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체를 5:2 비율로 섞고 암실 상태에서 EDC를 이용하여 18시간 동안 반응시켜 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 제조하였다. 이후 촉매인 EDC를 제거하기 위해 인산 완충액(Phosphate buffer)과 증류수에서 하루씩 정제하였다.
[시험예]
시험예 1: 활성산소 억제 분석
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6-HA), 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6) 및 Ce6(Santa Cruz Biotechnology)의 활성산소 억제 가능성을 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 이용하여 분석하여 도 2에 나타내었다.
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6는 Ce6 기준 0, 20, 40, 60, 80, 100 ㎍/mL 농도의 수용액으로 시험하였다.
도 2를 참조하면, 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체의 활성산소 억제 능력이 Ce6가 60 %인데에 비해 80 %로 확인 되었다. 또한 탄소양자점-Ce6 결합체의 활성산소 억제능력보다 약간 더 높은 것으로 보아 히알루론산 자체에도 활성산소 억제 능력이 있는 것으로 판단된다.
시험예 2: 세포독성 분석
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6-HA), 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6) 및 Ce6를 망막색소상피 세포(ARPE-19, ATCC® CRL-2302TM)에 처리하고 24시간 동안 배양(incubation)한 후 MTT assay를 통하여 세포 독성을 조사하여 도 3에 나타내었다.
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6는 Ce6 기준 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ng/mL 농도의 수용액으로 시험하였다.
도 3을 참조하면, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체는 Ce6 100 ng/mL 기준까지는 독성을 나타내지 않았지만, Ce6나 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체에 비해 비교적 높은 독성을 나타내었다.
이는 히알루론산에 의한 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체의 흡수(uptake) 차이에 의한 것으로, 본 발명에 따른 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체는 망막색소상피 세포에 선택적으로 작용하여 치료 효과를 효율적으로 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.
시험예 3: 요오드산나트륨 처리된 망막색소상피 세포의 MTT assay 분석
0, 2.5, 5 mM의 요오드산나트륨(sodium iodate: NaIO3)을 망막색소상피 세포에 처리하고 24시간 배양(incubation)한 후 세포 생존율을 비교하여 도 4에 나타내었고, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6-HA), 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6) 및 Ce6를 처리한 망막색소상피 세포에 5 mM 요오드산나트륨을 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 도 5에 나타내었다.
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6는 Ce6 기준 0, 25, 50, 100 ng/mL 농도의 수용액으로 시험하였다.
도 4를 참조하면, 요오드산나트륨 농도가 높을수록 낮은 생존율을 나타내었다. 따라서 망막색소변성증의 동물모델을 유도하기 위한 요오드산나트륨이 세포에서도 망막세포의 퇴화를 일으킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
도 5를 참조하면, 5 mM 요오드산나트륨이 처리된 망막색소상피 세포는 생존율이 40 %까지 떨어지고 Ce6, 탄소양자점-Ce6 결합체를 선처리한 세포는 요오드산나트륨이 처리된 망막색소상피 세포의 생존율에 떨어지는 데 반해, 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 선처리한 경우 Ce6 기준 50 ng/mL 농도일 때 망막색소상피 세포의 퇴화를 다른 물질에 비해 억제해주는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 4: 요오드산나트륨 처리된 망막색소상피 세포의 DCF -DA assay 분석
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6-HA), 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6) 및 Ce6를 2시간 동안 처리한 망막색소상피 세포에 요오드산나트륨을 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate) assay를 통해 활성산소 변화를 도 6에 나타내었다.
상기 망막색소상피 세포는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 mM의 요오드산나트륨을 처리하였고, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6는 Ce6 기준100 ng/mL 의 수용액으로 시험하였다.
도 6을 참조하면, 망막색소상피 세포에 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 선처리 한 후 5 mM 요오드산나트륨을 처리하고, 24h 배양(incubation) 하였을 때의 활성산소가 아무것도 처리하지 않고(Control) 5 mM 요오드산나트륨을 처리했을 때의 활성산소 농도보다 30 % 감소한 것으로 나타났다.
따라서, 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체가 요오드산나트륨에 의한 활성산소 생성을 억제하는 것을 알 수 있었다.
시험예 5: 요오드산나트륨 처리된 망막색소상피 세포의 글루타치온 농도 분석
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6-HA), 탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6) 및 Ce6를 처리한 망막색소상피 세포에 5 mM 요오드산나트륨을 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 GSH-400 kit를 통해 글루타치온 농도를 측정하여 도 7에 나타내었다.
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6는 Ce6 기준 100 ng/mL 의 수용액으로 시험하였다.
도 7을 참조하면, 망막상피세포에 요오드산나트륨을 처리하지 않은 것(Control)과 처리한 것(Sodium iodate)의 글루타치온 레벨의 차이는 없는 것으로 나타났다. 따라서, 활성산소와 글루타치온이 상관관계를 갖지 않는 것으로 판단된다.
시험예 6: 세포 섭취 확인
망막색소상피 세포에 다양한 처리를 하고 24시간 동안 배양한 후 공 초점 레이저 주사 현미경을 통해 세포 섭취를 확인하여 도 8에 나타내었다. 도 8의 a는 아무것도 처리하지 않은 세포, b는 Ce6, c는 탄소양자점-Ce6 결합체, d는 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, e는 망막색소상피 세포에 발현되는 히알루론산 수용체를 차단시킨 경우의 결과를 나타낸다. 윗 줄은 1X, 아랫줄은 3X로 확대하여 본 이미지이다.
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체, 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6는 Ce6 기준 100 ng/mL 의 수용액으로 시험하였다.
도 8을 참조하면, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체가 Ce6, 제조예 2에 따라 제조된 탄소양자점-Ce6 결합체에 비해 세포 섭취율이 높은 것으로 나타났다. 또한 고농도의 히알루론산을 선처리 한 후 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 처리하면 세포 내 섭취가 줄어드는 것으로 나타났다.
따라서, 망막색소상피 세포는 히알루론산 수용체를 가지며 그로 인해 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체의 세포 섭취가 잘 일어날 수 있음을 확인할 수 있었다.
시험예 7: 요오드산나트륨에 의한 세포 스트레스 및 액틴의 변화 확인
망막색소상피 세포에 다양한 처리를 하고 24시간 동안 배양한 후 F-actin assay를 진행하여 공 초점 레이저 주사 현미경을 통해 액틴의 모양 및 농도를 확인하여 도 9에 나타내었다. 도 9의 a는 아무것도 처리하지 않은 세포, b는 요오드산나트륨만 처리한 세포, c는 Ce6, d는 탄소양자점-Ce6 결합체, e는 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 처리한 후 요오드산나트륨을 처리한 세포를 나타낸다. 윗 줄은 1X, 아랫줄은 3X로 확대하여 본 이미지이다.
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체는 Ce6 기준 100 ng/mL 의 수용액으로 시험하였다.
도 9를 참조하면, 요오드산나트륨이 처리된 망막색소상피 세포는 세포 사이의 액틴이 거의 사라지고 세포 경계도 없어졌으며 세포의 수가 현저히 줄어든 것을 알 수 있었다. 이와는 달리, 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체가 선처리 되고서 요오드산나트륨을 처리하여 배양(incubation)된 망막색소상피 세포는 정상세포에 비해 세포수는 거의 줄지 않았으며 세포 사이의 액틴은 어느 정도 남아 있는 것으로 나타났다.
따라서, 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체는 요오드산나트륨에 의한 망막색소상피 세포의 변형 및 퇴화를 억제 시킬 수 있을 것으로 판단된다.
시험예 8: 히알루론산- 탄소양자점 - Ce6 결합체의 활성산소 억제 작용 과정 확인
망막색소상피 세포에 다양한 처리를 하고 24시간 동안 배양한 후 CellROXTM green agent를 처리하여 공 초점 레이저 주사 현미경을 통해 확인한 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10의 a는 아무것도 처리하지 않은 세포, b는 요오드산 나트륨, c는 Ce6, d는 탄소양자점-Ce6 결합체, e는 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 처리한 후 5 mM의 요오드산나트륨을 처리한 세포를 나타낸다. 윗 줄은 1X, 아랫줄은 3X로 확대하여 본 이미지이다.
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체는 Ce6 기준 100 ng/mL 의 수용액으로 시험하였다.
도 10을 참조한 결과, 요오드산나트륨만 처리 된 망막세포(도 10b)는 활성산소가 많이 발생하여 CellROXTM green agent와 반응해 강한 녹색 형광을 발현하였고, 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 선처리 한 망막색소상피 세포(도 10e)는 활성산소를 억제시켜 녹색 형광이 거의 나타나지 않았다.
따라서, 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체가 활성산소에 의한 망막색소상피 세포의 퇴화를 막을 수 있을 것으로 판단된다.
시험예 9: 토끼(in vivo )에서 히알루론산- 탄소양자점 - Ce6 결합체의 망막색소 상피 세포 섭취 및 잔류 시간 확인
정상 토끼 눈에 PBS(Phosphate buffer saline, None), Ce6, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6-HA)를 각각 초자체내 주사를 하여 망막에 전달하고 망막색소 상피 세포 섭취 및 잔류 시간을 공 초점 레이저 주사 현미경을 통하여 확인하여 도 11에 나타내었다. 도 11의 a는 초자체내 주사 후 6시간, b는 24시간 뒤의 망막조직을 나타낸다. DAPI는 망막 조직의 핵을 염색하기 위한 염색물질로 파란 형광을 가지고, Ce6는 초자체내 주사한 Ce6 물질을 보기 위한 것으로 빨간 형광을 가지며 Merge 이미지는 DAPI 이미지와 Ce6 이미지를 합친 것이다.
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6는 Ce6 기준 100 ng/mL 의 수용액으로 시험하였다.
도 11을 참조하면, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 초자체주사한 경우에 망막상피 세포에 섭취가 잘 되고 24 시간 동안 남아있는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 10: 토끼에 히알루론산- 탄소양자점 - Ce6 결합체를 초자체 주사한 후 망막전기신호 변화 확인
정상 토끼 눈에 PBS(None), Ce6, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체(Cdot-Ce6-HA)를 각각 토끼의 체중 1kg당 5㎍을(수용액 농도 100 ng/mL) 초자체주사 한 뒤 망막 전기 측정기(electroretinography: ERG)를 이용하여 전기 신호의 변화를 확인하여 도 12에 나타내었다. 도 12의 a는 정상 망막, b는 Ce6, c는 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 처리 한 후 망막에서의 전기 측정 그래프이다.
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체 및 Ce6는 Ce6 기준 100 ng/mL 의 수용액으로 시험하였다.
도 12를 참조하면, PBS를 처리한 눈과 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체를 처리한 눈에서의 전기 신호 차이는 없는 것으로 나타났다. 이는 기능적인 퇴화나 소실은 없는 것을 의미할 수 있다.
따라서, 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-탄소양자점-Ce6 결합체는 정상 토끼 망막에서 독성이 없는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 히알루론산 또는 이의 유도체;
    상기 히알루론산 또는 이의 유도체와 공유결합으로 연결된 탄소나노물질; 및
    상기 탄소나노물질과 결합된 광감각제; 를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체이고,
    상기 히알루론산의 유도체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 시스타민으로 치환된 히알루론산의 유도체이고,
    상기 광감각제는 클로라인 e6(Ce6)이고,
    상기 망막질환은 망막색소변성증 또는 야맹증인 것인, 망막질환 개선 또는 치료용 결합체:
    [화학식 1]
    Figure 112017114930538-pat00016

    상기 화학식 1에서,
    x 및 y는 각각 독립적으로 16 내지 2,500 중에서 선택된 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체가 활성산소 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체가 망막상피세포 또는 망막혈관의 활성산소 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체를 이용한 치료가 빛이 없는 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 망막질환 개선 또는 치료용 결합체가 초자체내 주사(intravitreous injection), 안약 투여 및 정맥내 주사 중에서 선택된 1종 이상의 방법으로 투여되는 것을 특징으로 하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 시스타민이 상기 히알루론산에 대해 10 내지 30%의 치환율로 치환된 것을 특징으로 하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 탄소나노물질이 탄소양자점, 탄소나노튜브, 산화그래핀, 그래핀 및 플러린 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 탄소나노물질이 탄소양자점인 것을 특징으로 하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 탄소양자점 1 중량부에 대해 상기 Ce6가 1 내지 2 중량부로 결합되는 것을 특징으로 하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 Ce6가 결합된 탄소양자점과 상기 히알루론산 또는 이의 유도체의 중량비가 4:1 내지 2:1인 것을 특징으로 하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체.
  14. (a) 히알루론산 또는 이의 유도체에 광감각제가 결합된 탄소나노물질을 공유결합시키는 단계를 포함하는 결합체의 제조방법이고,
    상기 히알루론산의 유도체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 시스타민으로 치환된 히알루론산의 유도체이고,
    상기 광감각제는 클로라인 e6(Ce6)인, 결합체의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112017041172074-pat00017

    상기 화학식 1에서,
    x 및 y는 각각 독립적으로 16 내지 2,500 중에서 선택된 정수이다.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 공유결합시키는 단계가 (a') 상기 히알루론산 또는 이의 유도체와 상기 광감각제가 결합된 탄소나노물질을 서로 혼합 또는 용해시킨 후, 촉매로서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride, EDC)를 첨가하여 반응시키는 단계인 것을 특징으로 하는 결합체의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 단계 (a') 이후에 (b) EDC를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 결합체의 제조방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 반응이 빛이 없는 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 결합체의 제조방법.
  18. 제1항에 따른 결합체를 유효성분으로 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 조성물.
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