KR102025041B1

KR102025041B1 - 망막색소변성증의 진단에 이용 가능한 8개의 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자 돌연변이체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102025041B1
Application number: KR1020190012405A
Authority: KR
Inventors: 이종영; 오지희; 이은주; 이동우; 문태식; 이동희; 최정남
Original assignee: 이종영
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-09-24

Abstract

본 발명은 망막색소변성증의 진단에 이용가능한 8개의 EYS 유전자 돌연변이체, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체를 검출한는 방법, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체를 이용하여 망막색소 변성증을 진단하는 방법, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체의 존재 여보를 확인하는 제제를 포함하는 망막색소변성증 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 망막색소변성증 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

망막색소변성증의 진단에 이용 가능한 8개의 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자 돌연변이체 및 이의 용도 {Novel EYS gene mutants inducing Retinitis Pigmentosa and uses thereof}

본 발명은 망막색소변성증을 야기하는 EYS 유전자 돌연변이체에 관한 것으로, 망막색소변성증의 진단에 이용가능한 8개의 EYS 유전자 돌연변이체, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체를 이용하여 망막색소변성증을 진단하는 방법, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 망막색소변성증 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 망막색소변성증 진단용 키트에 관한 것이다.

망막색소변성증(Retinitis pigmentosa)은 가장 흔한 유전성 망막질환 중의 하나이며, 10대부터 야맹증이 시작되어 점차적인 시야협착 및 시력상실로 인해 결국에는 실명에 이른다. 발병률은 인종에 따라서 약간의 차이는 있지만, 세계적으로 약 3,000-4,000명 중 한명 비율로 환자가 나타나고 있으며, 상염색체 유전인 경우 성별에 따른 발병률의 차이는 거의 없는 것으로 알려져 있다.

망막색소변성증은 매우 다양한 유전자의 돌연변이에 의해 발생하게 되는데, 시각세포 내에서 빛을 전기 신호로 전환하는 기전에 관여하는 유전자의 결함이 원인인 경우가 많으며, 이들 유전자의 이상이 광범위한 망막의 변성을 일으키게 된다.

망막(retina)은 눈의 가장 안쪽에 위치하며 여러 가지 신경세포들로 이루어진 얇은 층이다. 망막은 눈으로 들어온 빛을 전기적 신호로 바꾸는 역할을 하며 이 신호가 시신경을 따라 뇌에 전달된다. 망막은 크게 시각세포와 신경교세포(glial cell)로 이루어진 감각신경 망막층(neurosensory retina)과 망막색소 상피층(retianl pigment epithelium; RPE)으로 구성되어 있다.

시각세포와 망막색소상피층은 밀접한 관계를 유지하는데, 망막색소 상피층은 시각세포들의 대사산물인 노폐물을 처리하여 혈관으로 배출하고 동시에 혈관으로부터 영양분을 시각 세포들에 공급해준다. 시각세포에는 막대세포(rod cell)와 원뿔세포(cone cell)가 있다. 막대세포는 주로 어두운 곳에서 명암을 구별하고 주변시야를 볼 수 있게 해주며, 원추세포는 밝은 곳에서 색을 구별하고 중심시야를 선명하게 볼 수 있게 한다.

막대세포는 망막의 전체 영역에 걸쳐 고르게 분포하는 반면, 원뿔세포는 주로 망막의 중심부인 황반부에 몰려있다. 망막색소변성증은 유전자 이상에 의해 막대세포와 원뿔세포가 점차적으로 파괴되어 망막에 색소가 침착되며, 막대세포가 원뿔세포 보다 먼저 손상을 입는 것으로 알려져 있다.

어두운 곳에서 시각을 담당하는 막대세포의 손실이 시작되면 야맹증이 나타나게 되며, 시야의 바깥 부분을 볼 수 없게 되므로 시야가 좁아져서 마치 작은 망원경으로 사물을 보는 것처럼 보인다. 시각세포의 파괴가 원뿔세포까지 진행되면 중심시야도 잃게되어 완전한 실명에 이르게 된다.

전형적인 망막색소변성증의 경우 대개 10-20세에 증상이 나타나며, 상염색체 열성으로 유전된 경우에는 10세, 상염색체 우성으로 유전된 경우에는 약 20-30세에 증상이 시작되는 것으로 알려져 있다. 유전의 형태에 따라 질병이 나타나는 시기와 증상은 다르지만, 60-80% 이상에서 보통 20세 이전에 야맹증이 나타나며, 그밖에 백내장, 녹내장, 원추각막, 근시, 유리체 혼탁 등이 동반되기도 한다.

망막색소변성증의 유전망막색소변성증 환자의 절반 이상은 가족력이 없는 단독 (sporadic) 환자이며, 이는 부모로부터 전달되는 유전성 돌연변이(germline mutation) 보다는 초기 수정시 체세포 돌연변이(somatic mutation)에 의해 발생하는 것으로 생각되고 있다.

망막색소변성증의 유전양식은 크게 상염색체 우성, 상염색체 열성, X-linked 그리고 de Novo 형태로 나타나는데, 망막색소변성증 질환가계 연구를 통해 발표된 것을 보면, 상염색체 열성유전이 전체의 50-60%로 가장 많은 비중을 차지하며, 상염색체 우성유전이 30-40%, X염색체 유전이 5-15%로 나타나고 있음을 보고하고 있다.

퇴행성망막질환과 관련하여 현재까지 269개의 유전자가 보고되고 있으며, 유전성망막질환의 원인 유전자로는 64개가 보고되고 있다. 이들 유전자들은 광수용체 세포중의 하나인 가늘고 긴 모양의 형태를 하고 있는 9천만개 이상의 막대세포내에서 약한 빛을 감지하는 광자전달(phototransduction), 비타민A 대사(vitamin A metabolism), splicing, 유전자조절(gene regulation) 그리고 약 600만개 이상의 원추세포에서 다양한 기능을 수행하고 있다.

망막색소변성증과 관련된 돌연변이는 인종에 상관없이 공통적으로 발견되는 것도 많지만 인종과 지역에 따라 유무 및 빈도가 다르게 나타나는 것도 있는데, 이러한 현상은 창시자효과(founder effect)에 의해 나타나게 되며, 유럽계 백인들에게서만 주로 발견되는 로돕신 유전자의 Pro23His 돌연변이가 대표적인 예라 할 수 있다.

또한, 유전성망막질환을 치료하기 위해서는 약물치료, 유전자치료, 줄기세포치료, 인공망막이식의 4가지 방법이 존재하는데, 이 가운데 근본적으로 병을 치료하는 방법은 유전자치료이다. 이러한 상황에 2017년 12월, 유전성 망막질환을 치료하는 유전자치료제가 유전자치료 분야에서 처음으로 미국 식약청 FDA에 의해 승인됐다. 보레티젠 네파보벡(상품명:룩스터나)이라고 불리는 이 치료법은 바이러스를 이용해 'RPE65' 유전자를 망막세포 내로 전달해 돌연변이된 'RPE65' 유전자를 보충하는 방식으로 작용한다.

본래 유전성 망막질환은 다양한 유전자들의 변이로 인해 발생하는데, 그 중 RPE65 유전자는 정상적인 시력을 위해 RPE65 효소를 생성시키는 필수적인 유전자로 알려져 있었고, RPE65 유전자에 돌연변이가 나타나면 망막세포내의 RPE65 단백질이 감소하고, 결국 망막세포가 파괴돼 시력이 소실되는 것이다.

FDA 승인을 받은 유전자치료는 정상적인 RPE65를 생성할 수 있는 DNA를 바이러스 안에 담아, 이 약물을 안구 내로 주입하는 방식으로, 정상적인 RPE65 생성용 DNA가 망막세포 안으로 들어가 작동하면서 결과적으로 망막세포의 파괴를 막고 시력을 회복시키는 방법으로 치료된다.

이는 유전자치료에 있어 획기적인 사건이지만 아직까지 치료받을 수 있는 환자가 제한될 뿐만 아니라 치료효과도 완벽한 상태가 아니고, 특히 치료제를 개발한 스파크사는 1회 치료에 85만불(한화 10억 원), 한 눈만 치료할 경우에는 42만 5000불(한화 5억원)의 비용이 필요하다.

눈은 유전자치료가 성공할 수 있는 가장 높은 가능성을 가진 최적의 장기이며, 유전성 망막질환의 원인유전자 중 현재 치료 가능한 유전자는 RPE65 하나 밖에 없기 때문에 다양한 유전자 변이를 치료할 수 있는 치료제가 추가로 개발될것으로 기대된다.

즉, 유전성망막질환자에 빈발하는 돌연변이와 유전자 정보를 확보하고, 이러한 유전자의 기능이 망막에 미치는 영향을 연구가 필요하다. 2006년부터 질병관리본부와 서울대학교병원은 망막색소변성증 환자의 유전양식과 임상적 특징에 관한 보고서를 발표하였고, 보고서에서 365명의 망막색소변성증 환자를 분석한 자료를 보면, 가족력이 없는 단독환자가 62%로 가장 많은 수를 차지하였으며, 가족력이 있는 경우에서는 열성유전(17%), 우성유전(12%), X염색체유전 (9%) 순으로 보고하고 있었다.

망막색소변성증을 일으키는 대부분의 유전자들은 전체망막색소변성증의 발생원인 측면에서 보면 아주 작은 비중을 차지하고 있지만, USH2A(열성유전), 로돕신(우성유전, RHO), 그리고 RPGR(X염색체유전) 유전자는 전 세계 환자들에서 공통적으로 많이 발견되는 원인유전자로 보고하고 있다. 특히 로돕신 유전자는 우성유전되는 망막색소변성증의 약 25%를 차지하고 있으며, 열성유전되는 망막색소변성증에서도 보고되어 있으며, 현재까지 백개가 넘는 로돕신 유전자의 돌연변이가 망막색소변성증과 관련된 것으로 보고되어 있다.

한국인 망막색소변성증 환자에게서 자주 나타나는 로돕신 유전자의 돌연변이를 찾기 위해, 총 302개 질환가계에 대하여 염기서열분석을 통한 돌연변이 발굴연구를 수행하여, 6개 질환가계로부터 5 종류의 질병유발 돌연변이를 발굴하였고, 여러 종류의 망막색소변성증 돌연변이를 동시에 대량으로 분석하기 위하여, 96개의 돌연변이로 구성된 DNA 칩을 제작하였다.

한편, 이미 보고된 로돕신 유전자를 비롯한 5개의 유전자에서 9개의 질병관련 돌연변이가 확인되어(9.37%) 한국인 망막색소변성증 진단칩 개발 가능성을 보여주었다.

그러나, 한국인 망막색소변성증 환자에서, 로돕신 유전자를 비롯한 5개의 유전자에서 9개의 질병관련 돌연변이로 약 9% 정도의 진단율을 보이는 바, 로돕신 유전자보다 특이성 및 민감성이 높은 유전자 및 돌연변이를 발굴하고, 고효율의 한국인 망막색소변성증 진단칩 개발에 대한 연구가 필요하다.

이에 국내 공개특허공보 제10-2007-0029726호에는 망막색소변성증 치료용 키트에 관하여 게시하고 있고, 국내 공개특허공보 제10-2016-0147571호에는 망막색소변성의 치료에 관하여 게시하고 있으나 본 발명의 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 하나의 유전자에 9개 돌연변이에 대한 genotyping 만으로도 10% 정도의 망막색소변성증 조기 진단이 가능한 망막색소변성증의 진단에 이용 가능한 8개의 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자 돌연변이체에 관한 구성은 게시하고 있지 않아 차이를 보인다.

국내 공개특허공보 제10-2007-0029726호에는 조효소 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADH), 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트(NADPH) 및 환원된 글루타치온을, 예정된 시간 순서에 따라 당해 효소들을 투여하기에 적절한 분획 및 상호작용성 양으로 포함하는 망막색소변성증 치료용 키트에 관하여 게시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2016-0147571호에는 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 망막색소변성의 치료에 관하여 게시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2018-0043373호에는 색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGRORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, RPGR ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열의 복제 정확도를 증가시키기 위해 코돈 최적화된 색소성망막염의 치료에 관하여 게시하고 있다. 국내 등록특허공보 제10-1863667호에는 히알루론산 또는 이의 유도체; 상기 히알루론산 또는 이의 유도체와 공유결합으로 연결된 탄소나노물질; 및 상기 탄소나노물질과 결합된 광감각제;를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체가 제공된다. 본 발명의 망막질환 개선 또는 치료용 결합체는 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용하여 비교적 긴 시간 동안 선택적으로 망막상피세포에서 활성산소 생성을 억제할 수 있어 망막질환의 치료 효능이 우수하고, 세포내 침투가 용이한 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용한 망막색소변성증에 관하여 게시하고 있다.

본 발명은 망막색소변성증의 진단에 이용가능한 8개의 EYS 유전자 돌연변이체, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체를 이용하여 망막색소변성증을 진단하는 방법, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 망막색소변성증 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 망막색소변성증 진단용 키트를 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 돌연변이체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 2528번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체인 것일 수 있다.

상기 돌연변이체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자 중에서, 1963번 위치의 염기가 G가 T로 치환되는 종료돌연변이체; 2522번 위치와 2523번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 종료, 프레임시프트 돌연변이체; 2697번 위치 및 8805번 위치의 염기 C가 A로 치환되는 종료 돌연변이체; 4957번 위치와 4958번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 프레임시프트 돌연변이체; 6557번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체; 9368번 위치의 염기 A가 결손(deletion)되는 프레임시프트 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 돌연변이체는 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa)의 진단에 이용되는 것인 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 돌연변이인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법은 망막색소변성증 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 상기 제1항 내지 제2항의 어느 한 항의 돌연변이 부위를 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 유전자를 동정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa)의 진단용 조성물은 서열번호 1로 이루어진 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 2 내지 17의 염기서열로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 조성물을 포함하는 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa)의 진단용 키트것일 수 있다.

유전성망막질환을 진단하는데 있어서, 가장 큰 문제점은 다양한 인종에서 발굴된 돌연변이가 한국인에서 나타나는 경우가 매우 낮다는 것이다. 이에 본 발명의 EYS 유전자에서 보고된 747개 변이는 다양한 인종에서 유래한 것으로, 한국인 환자에 빈발하는 돌연변이를 선택하여 유전성망막질환자의 조기 진단에 최적화된 돌연변이 6개를 제공함으로써 유전성망막질환자의 10%를 진단할 수 있는 키트를 제작이 가능하다.

또한, 본 발명은 가족 내 구성원 및 일반인 중에 본 돌연변이 보유 여부에 따라 유전성망막질환의 발생 위험을 예측 할 수 있으며, 유전성망막질환 치료분야에 유용하게 이용될 수 있다. 따라서, 한국인 유전성망막질환자에서 빈발하는 돌연변이를 확보함으로써, 치료제 및 치료법에 효능을 검사하는데 분자생물학적 지표로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 망막색소변성증 돌연변이의 분자지표 정보를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 PCR증폭산물의 전기영동 결과이다.

EYS(eyes shut homolog Drosophila) ddb전자는 염색체 6번 63,719,980-65,707,225 (GRCh38)에 위치하며, bA166p24.2, bA307F22.3, bA74E24.1, C6orf178, C6orf179, C6orf180, dJ1018A4.2, dJ303F19.1, EFGL10, EGFL11, RP25 그리고 SPAM이라는 이름으로 알려져 있다. 또한, EYS 유전자는 3,145개 아미노산과 44개의 엑손을 갖고 있으며, 21개의 epidermal growth factor (EGF)-like와 5개의 LamG 도메인을 갖고 있으며, TCGA 체세포변이 데이터베이스에 490개 missense, 49개의 stop gained, 34개의 frameshifr, 1개의 start lost mutation을 포함하여 총 574개의 체세포 돌연변이가 보고되고 있다.

EYS는 세포외기질 단백질로써 주로 광수용체의 connecting cilium/transition zone에 위치하지만, 영장류에선 광수용체의 CC/TZ외에 막대세포의 외절과 원뿔세포의 말단에서도 발견되었고, 사람 망막에서는 광수용체의 CC/TZ외에 원뿔세포의 외절에서 발견되었다. 이 단백질은 zebrafish에서 광수용체 생존과 ciliary pocket 형태 유지에 필수적이며, 막대세포 보다는 원뿔세포에서 두드러지게 나타났다. 이상의 결과로부터 원뿔세포 외절 형성에 중요한 역할을 하고 있는 EYS 유전자에 돌연변이가 생김으로써, 원뿔세포에서 ciliary pocket의 형태를 유지하지 못하며, photoreceptor의 생존에 치명적인 영향을 미치는 것으로 제시되었다.

이에 본 발명은 망막세포변성증을 야기하는 EYS 유전자의 염기서열 분석을 통한 돌연변이 검출을 실시하여 망막세포변성증의 진단에 유용한 8개의 EYS 유전자 돌연변이체를 발견하였고, 이중 2개 변이는 EYS 돌연변이를 갖는 환자의 56%를 차지하며, 2개 변이를 포함한 8개 돌연변이는 EYS를 원인으로 하는 망막색소변성증 환자의 10%이상 발견 할 수 있는 분자생물학적 돌연변이를 제공한다.

본 발명은 망막색소변성증의 진단에 이용가능한 8개의 신규한 EYS 유전자 돌연변이체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체를 이용하여 망막색소변성증을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 EYS 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 망막색소변성증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 망막색소변성증 진단용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명의 망막색소 변성증의 진단에 이용 가능한 8개의 EYS (eyes shut homolog Drosophila) 유전자 돌연변이체 및 이외 용도와 관련한 도면을 첨부하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자 중에서,

1963번 위치의 염기가 G가 T로 치환되는 종료돌연변이체;

2522번 위치와 2523번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 종료, 프레임시프트 돌연변이체;

2528번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체;

2697번 위치 및 8805번 위치의 염기 C가 A로 치환되는 종료 돌연변이체;

4957번 위치와 4958번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 프레임시프트 돌연변이체;

6557번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체;

9368번 위치의 염기 A가 결손(deletion)되는 프레임시프트 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 EYSEYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 돌연변이체를 제공한다.

본 발명의 EYS 유전자의 돌연변이체 중, 1963번 위치의 G가 T로 치환된 종료 돌연변이체는 엑손 12번에서 생긴 것으로, 상기 종료에 의해 성숙 단백질의 655번 위치의 아미노산이 글리신에서 종결코돈으로 치환된 경우이다.

2522번 위치와 2523번 위치 사이에 염기A가 삽입된 종료, 프레임시프트 돌연변이체는 엑소 16번 위치에 생긴 것으로, 상기 삽입에 의해 성숙 단백질의 841번 위치의 아미노산이 티로신에서 종결코돈으로 치환된 경우이다.

2528번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 16번 위치에 생긴것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 843번 위치의 아미노산이 글리신이 글루탐산으로 치환된 경우이다.

2697번 위치의 염기 C가 A로 치환되는 종료 돌연변이체는 엑손 17번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 899번 위치의 아미노산이 시스테인에서 종결코돈으로 치환되는 경우이다.

4957번 위치와 4958번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 프레임시프트 돌연변이체는 엑손 26번 위치에 생긴것으로, 상기 삽입에 의해 성숙 단백질의 1653번 위치의 아미노산이 세린에서 리신으로 치환되면서 2번째 염기에서 프레임시프트가 되는 경우이다.

6557번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 32번째에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해성숙 단백질의 2186번 위치의 아미노산이 글리신이 글루탐산으로 치환되는 경우이다.

8805번 위치의 염기 C가 A로 치환되는종료 돌연변이체는 엑손43번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 2935번 위치의 아미노산이 티로신에서 종료코돈으로 치환되는 경우이다.

9368번 위치의 염기 A가 결손되는 프레임시프트 돌연변이체는 엑손43번 위치에 생긴 것으로, 상기 결손에 의해 성숙 단백질의 3132번 위치의 아미노산이 아스파라긴에서 트레오닌으로 치환되면서 프레임시프트가 생겨 4번째 염기에서 종료코돈으로 되는 경우이다.

본 발명의 용어, 결손(deletion) 돌연변이는 하나 이상의 염기가 제거되게 되는 경우이다.

본 발명의 용어, 미스센스(missense) 돌연변이는 DNA 사슬 위의 어떤 부위에 하나의 염기 치환이 일어나서 mRNA의 유전암호가 변해 본래의 것과는 다른 아미노산이 지정이 되어 단백질에 영향을 주게 되는 유전자 돌연변이를 지칭한다.

본 발명의 용어, 넌센스 돌연변이는 하나의 염기 치환으로 본래의 어느 한 아미노산을 암호화하는 코돈이 아미노산을 암호화하지 않는 종결코돈으로 변화되어 단백질의 합성이 그 코돈이 있는 곳에서 중단되는 유전자 돌연변이를 지칭한다.

본 발명의 용어, 염기삽입(insertion) 돌연변이는 하나 이상의 염기가 기존의 염기들 사이로 끼어들어 변화가 일어나는 유전자돌연변이를 지칭한다.

본 발명의 용어, 프레임시프트(Frameshift) 돌연변이는 염기가 하나이상 삽입되거나 결실되어 3개의 염기를 모두 변화가 일어나는 유전자 돌연변이를 지칭한다.

본 발명의 신규한 8개의 EYS 유전자의 돌연변이체는 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa) 진단에 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

<실시예 1: 연구 대상 및 DNA추출>

말초혈액 시료는 실명퇴치운동본부와 순천향대학교병원에서 얻었다. 연구대상은 121명의 한국인 망막색소 변성증 환자와 37명의 환자가족을 대상으로 하였다. 모든 환자는 충분한 상담을 하였고, 동의서를 작성하였다.

유전체 DNA는 진올 blood extraction kit (GeneAll Biotechnology, co., ltd.)를 사용하여 전혈 300 ul에서 5ug의 DNA를 분리하였고, 200ng의 DNA를 이용하여 HiSeq2500 NGS 장비로 Whole exome sequencing 데이터를 생산하였다.

<실시예 2: WES를 통한 돌연변이체 후보 확보>

인간 유전체의 1.22%에 해당하는 영역을 포함하고 있는 엑손 영역만을 시퀀싱하기 위하여, SureSelect Human All Exome Kits (http://www.genomics.agilent.com) 와 CCDS(Consensus CDS, NCBI, EBI, UCSC, Wellcome Trust Sanger Institute가 참여하여 정의한 인간 유전체의 유전자 세트) 엑손을 기초로 제작되었으며, 인간유전체의 1.22%에 해당하는 영역을 포함하고 있다.

상기 실시예 1에 따라 혈액에서 추출한 genomic DNA 3 μg을 shearing하여 150-200bp 단편으로 잘라 SureSelect library Prep Kit를 이용하여 Adapted-tagged DNA 라이브러리를 제작한 후, PCR 증폭을 통하여 DNA 라이브러리를 준비하였다.

한편, 준비된 SureSelect Capture 라이브러리를 혼합하여 Capture Library/prepared DNA library hybrids를 만든 후, magnetic beads를 사용하여 Captured libraries를 확보한다. 확보된 Caputred libraries를 대항으로 indexing primers를 사용하여 PCR 증폭 후, Indexed, target-enriched libray amplicons을 만들어 HiSeq NGS 장비를 이용하여 시퀀싱을 수행하였다.

상기 엑손 시퀀싱 정보를 대상으로 다양한 오픈 소스 소프트웨어와 in house 프로그램을 제작하여 엑솜시퀀싱 FASTQ 파일의 인간유전체(hg19) 매핑이나 데이터 해석을 실시하여 후보 변이를 확보하였다.

입력으로 주어진 FASTQ파일에 대해 BWA를 사용하여 시퀀싱 데이터를 참조 시퀀싱 배열에 맵핑 한 후, GATK를 사용하여 리얼라이먼트를 수행하여 얼라인먼트 미스를 줄였다.

상기 과정을 통해 확보한 BAM파일에 대해서 SAMtools로 필터링을 진행하면서 염기서열의 차이를 검출하였으며, Annovar를 이용하여 annotation을 수행하였으며, Picard로 맵핑 결과의 통계 정보를 확인하여 후보 돌연변이체를 확보하였다.

본 발명에 따른 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자는 EYS 유전자는 염색체 6번 63719980-65707225 (GRCh38)에 위치하며, bA166P24.2, bA307F22.3, bA74E24.1, C6orf178, C6orf179, C6orf180, dJ1018A4.2, dJ303F19.1, EGFL10, EGFL11, RP25 그리고 SPAM라는 이름으로도 알려져 있다.

EYS 유전자는 3145개 아미노산과 44개의 엑손을 갖고 있으며, 21개의 epidermal growth factor (EGF)-like와 5개의 LamG 도메인을 갖고 있으며, 다양한 정상 조직, 망막 및 인간 망막 아세포 세포주에서 EYS를 검출 하였다. 성숙한 돼지 망막의 면역 조직 화학적 분석을 통하여 photoreceptor 층에서 EYS가 발현됨을 확인 하였다.

도 1에 도시된 바와 같이, TCGA 체세포변이 데이터베이스에 490개 missense, 49개의 stop gained, 34개의 frameshift, 1개의 start lost mutation을 포함하여 총 574개의 체세포 돌연변이가 보고되고 있다.

<실시예 3: 유전모드 및 germline mutation 데이터와 비교분석>

미국 RetNet 데이터베이스에 유전성 망막질환의 22개의 autosomal dominant, 40개의 autosomal recessive, 2개의 X-linked 유전자가 보고되고 있으며, 퇴행성망막질환에 관여하는 269개 유전자에 대하여 정보를 보고하고 있다.

통상적으로 보고된 EYS 유전자 하나에, ClinVar에 319개 돌연변이 정보, EVS에 258개 돌연변이 정보, LOVD에 952개 돌연변이 정보, dbSNP에 523개 돌연변이 정보가 보고되고 있으며, 이들 데이터베이스 정보를 비교하면, 중복되지 않는 747개 독립적인 돌연변이 정보가 존재한다. 따라서, 이렇게 많은 돌연변이를 유전성 망막변성증 환자에게 스크리닝을 하는 것은 많은 시간과 비용이 소요된다.

이에 본 발명에 따른 EYS 유전자의 6개 돌연변이 정보는 망막색소 변성증 환자의 10% 정도가 보유하고 있음을 확인하였다.

따라서, 이러한 photoreceptor의 구조와 생존에 많은 영향을 미치는 EYS 유전자에는 수많은 돌연변이가 산발적으로 나타나지만, 본 출원은 산발적으로 일어나는 돌연변이 중, 다발적으로 발견되는 9개 변이를 확보하였고, 이중 2개 변이는 EYS 돌연변이를 갖는 환자의 56%를 차지하며, 2개 변이를 포함한 9개 변이는 EYS를 원인으로하는 유전성망막질환자의 10% 이상 발견할 수 있는 분자생물학적 지표이다. 또한, 5개의 새로운 돌연변이를 발굴함으로써, EYS에 의한 유전성망막질환을 조기 발견하는데 중요한 정보를 제공한다.

하기의 표 1은 EYS 유전자의 돌연변이체 정보를 나타낸다. 하기 표 1의 아미노산의 번호는 다른 EYS 유전자 연구에서 사용한 방법과 같이, 성숙 단백질(mature protein)을 나타낸다. 이 중 4개의 돌연변이는 본 발명에서 새롭게 확인 검증된 것이다. 이러한 새로운 돌연변이는 NM_001142800.1:c.1963G>T (p.Gly655Ter), NM_001142800.1:c.2697C>A (p.Cys899Ter) 에서의 종결돌연변이, NM_001142800.1:c.2522dupA (p.Tyr841Ter)에서의 종결돌연변이와 프레임시프트 돌연변이, NM_001142800.1:c.9368delA (p.Asn3123ThrfsTer4) 에서의 프레임시프트 돌연변이를 포함한다. 또한, P.Gly655Ter에서 p.은 protein을 나타낸다.

서열번호 1은 돌연변이체 정보를 포함하는 EYS 유전자를 나타내며 이를 기준으로 살펴보면 새로운 돌연변이의 위치는 1963번째 염기서열(G>T)로 655번째 아미노산(Gly655Ter), 2697번째 염기서열(C>A)로 899번째 아미노산(Cys899Ter), 2522번째 염기서열의 중복(dupA)으로 841번째 아미노산(Tyr841Ter)의 종결돌연변이, 9368번째 염기서열의 결실(delA)로 3123번째 아미노산(Asn3123ThrfsTer4)의 프레임시프트에 의한 종결 돌연변이를 포함한다.

EYS 유전자의 돌연변이체 정보

No.	Locus	Exon	Variant description	Amino-acid change	Variant type	Consequence	Novel
1	6q12	12	NM_001142800.1:c.1963G>T	p.Gly655Ter	snv	stop_gained	Yes
2	6q12	16	NM_001142800.1:c.2522dupA	p.Tyr841Ter	Insertion	stop_gained, frameshift_variant	Yes
3	6q12	16	NM_001142800.1:c.2528G>A	p.Gly843Glu	snv	missense_variant
4	6q12	17	NM_001142800.1:c.2697C>A	p.Cys899Ter	snv	stop_gained	Yes
5	6q12	26	NM_001142800.1:c.4957dupA	p.Ser1653LysfsTer2	Insertion	frameshift_variant
6	6q12	32	NM_001142800.1:c.6557G>A	p.Gly2186Glu	snv	missense_variant
7	6q12	43	NM_001142800.1:c.8805C>A	p.Tyr2935Ter	snv	stop_gained
8	6q12	43	NM_001142800.1:c.9368delA	p.Asn3123ThrfsTer4	deletion	frameshift_variant	Yes

<실시예 4: 염기서열 분석을 통한 돌연변이 검증>

이중 나선 구조인 DNA가 고열에 의해 두 가닥으로 분리되고 프라이머가 target sequence에 가서 붙은 이수 DNA polymerase가 dNTP를 사용하여 합성하게 된다. DNA 합성과정에 dNTP뿐만 아니라 소량의 ddNTP도 함께 사용되는데 dNTP가 삽입되면 DNA 합성이 진행되지만 ddNTP가 삽입되면 ddNTP의 ribose 구조의 3'에 OH 대신 H가 위치하고 있기 때문에 다음 순서의 새로운 염기가 와서 phosphodiester bond를 형성할 수 없게 되어 DNA합성은 중단된다.

상기 ddNTP에 사용된 ddATP, ddTTP, ddGTP와 ddCTP는 각각 다른 형광 물질로 표지되어 있다. 다양한 크기로 새로 합성된 DNA 조각들은 capillary gel electrophoresis에 의해 DNA 조각의 크기에 따라 작은 염기서열을 가진 DNA는 빨리 이동하고 긴 염기서열을 가진 DNA는 느리게 이동한다. 이때 이동하는 DNA 조각의 형광을 검출기를 이용하여 염기서열을 읽을 수 있는 Sanger sequencing 방법을 이용하고, WES를 통하여 상기 돌연변이를 검증하였다.

상기 돌연변이를 중심으로 150-200 bp 길이의 염기서열이 증폭될 수 있도록 본 발명의 프라이머를 제작하였고, PCR을 수행하여 싱글밴드가 증폭됨을 확인하였고, 증폭된 PCR 산물을 ABI3700 시퀀싱 장비를 이용하여 염기서열을 결정하였고, 결정된 염기서열을 분석하여, 돌연변이 유무를 확인하였다. 하기의 표 2는 상기 실시예 3 따른 EYS 유전자 돌연변이체 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 나타낸다.

EYS 유전자 돌연변이체 부위를 증폭용 프라이머 세트

프라이머	크기(bp)	정방향 프라이머 (서열번호)	역방향 프라이머 (서열번호)
1	281	ACAGTTGATTCCCCGTAAGC(2)	GGCATTTGTTATCTAGGGGGCT(3)
2	369	ACCTCAGTGGGTCCCATAGT(4)	AGCCAGCTGGTATGCACTAA(5)
3	219	GCCATCATCCCATAGGCACA(6)	GTCTGTGCCCACCCCTTTAT(7)
4	221	ACAATACCTTCCCACCCAACC(8)	ATGGGACAGCCTGTGGGTA(9)
5	343	AGGTTATAGCGTTGGTGGCA(10)	CTGTCACAGGAAATTAGGCAAACA(11)
6	272	AATCCTGGGACACACTTGCG(12)	TTCATTTCTCTGTGTTTCAGATGC(13)
7	297	TCCTGTTTGTAAGTCACGTTCC(14)	TGAAGTTTGTCCTGGAGAAGGA(15)
8	266	TCAACTAATTGTAGCATGGCAAGT(16)	ACAAGGATTGCTCATCCATACTCA(17)

프라이머 1은 281bp, 프라이머 2는369 bp, 프라이머 3은 219bp, 프라이머 4는 221bp, 프라이머 5는 343bp, 프라이머 6은 272bp, 프라이머 7은 297bp, 그리고 프라이머 8은 266bp의 PCR 증폭산물을 확인한 것으로 양 끝의 레인은 100bp 크기 마커이다.

발굴된 돌연변이를 검증하기 위하여 PCR 증폭을 위한 한 쌍의 primer와 TaqMan probe를 제작하였다. TaqMan probe는 5‘말단에는 reporter dye가, 3’말단에 quencher dye가 공유결합 되어있어, 돌연변이 부위와 상보적으로 일치하는 TaqMan probe는 PCR의 annealing 단계에서 결합되고 extension 단계에서 Taq 중합효소의 5‘활성에 의하여 5’말단부의 reporter dye가 quencher dye로부터 분리되어 형광을 발하게 된다. 리얼타임 PCR인 QuantStudio5를 이용하여 타겟 돌연변이의 염기서열을 확인하였다. 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 PCR증폭산물의 전기영동 결과이다. PCR을 수행하여 싱글밴드가 증폭됨을 확인하였고, 증폭된 PCR 산물을 Veriti 96-well Thermal Cycler(ABI 9902)를 이용하여 염기서열 확인 및 분석하여 돌연변이 유무를 확인한 결과 100% 일치하였다.

유전성망막질환에 대한 진단 방법으로, 현재 진단에 사용되고 있는 EYS 유전자의 747개 변이는 다양한 인종에서 유래한 것이나 본 발명에 따른 EYS 유전자 돌연변이는 한국인 환자에서 빈발하는 것으로 유전성망막질환자의 조기 진단에 최적화된 돌연변이 9개를 발굴하고, 유전성망막질환자의 최소 10% 이상을 조기 진단할 수 있는 키트를 제공한다.

유전성망막질환의 원인 돌연변이는 가족단위로 원인 변이가 다양하여 환자 가족을 통해서만이 정확한 환자의 돌연변이를 확인할 수 있으나, 한국인에 최적화된 본 발명에 따른 9개의 돌연변이는 시간과 비용이 저렴한 지노타이핑을 통하여 탐침자(proband)에서만 발견되어도 유전성망막질환의 원인 유전자로서 진단이 가능하다.

본 발명은 한국인 유전성망막질환자에서 빈발하는 8개의 새로운 EYS 유전자 돌연변이체와 망막색소변성증을 진단할 수 있는 마커를 제공함으로서 유전자 돌연변이를 이용한 조기진단은 적합한 치료제 및 최적의 치료 효과를 달성할 수 있도록 지원할 수 있는 분자생물학적 지표를 제공할 수 있다.

본 발명은 한국인 유전성망막질환자에서 빈발하는 돌연변이를 확보함으로써, 지금까지 사용되어 온 환우가족 등을 대상으로 한 EYS 유전자 747개 변이 스크리닝과 비교하여, 9개 변이 스크리닝으로 유전성망막질환 조기 진단할 수 있고, 본 발명의 진단 키트는 다양한 유전자에 의해 발생되는 유전성망막질환자의 약 10%를 진단할 수 있는 저비용 고효율 키트로서 자가 조기 진단을 통하여 적합한 치료제 및 개별 환자 최적의 맞춤형 치료에 따른 치료 효과를 달성할 수 있도록 하며, 시각의 소실을 최소화하여 건강한 삶을 연장하는데 기여할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.

<110> SNPmedicine Inc <120> Novel EYS gene mutants inducing Retinitis Pigmentosa and uses thereof <130> p19-0080129 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10529 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(10529) <223> EYS gene <400> 1 agaaacaaag tgatacacgc taggcatgtc cagacattaa ccgtaatcag aagcctccta 60 gggttgcaag cctccttggc taatggttgg gctttgtgcc tcactcttct cttacacctg 120 gggagtcaag tctggatcct ctgctccata tttatttagc aaataaaaca ctgatctcaa 180 acagcaacgg aacctgtgta cttgaggtgt tttttgaaaa ctaatcagaa gaggaatgct 240 tatctcccaa gaaaattgaa accatctgta aaagaatctt ggctgtgctg tgttttgatt 300 agattgaagc ttggtgtaaa gagaaaacac aaaagaccgc agaatattta caacatttga 360 attcctgttt ctccatcaaa gcacattgtc atcaaagcta ctttgggtat agaaaaaagg 420 taaaacacca ttttgcagca attctttatg ataaactgta aaatacagct acccgaaaat 480 gactgacaaa tcaatcgtca ttctgagcct gatggttttt cacagctctt tcataaatgg 540 aaaaacatgt agacggcaat tggtggaaga atggcatcca caaccctcat catatgtggt 600 aaattggaca ctaacagaaa acatctgctt ggacttctac agagattgct ggtttttggg 660 tgtaaacact aaaatagata cttcaggcaa tcaagctgtt ccccagattt gccctttgca 720 aattcaatta ggagatatcc ttgtaatttc ttctgaacca tctcttcaat ttccagaaat 780 aaatttgatg aatgtttctg aaacatcttt cgttggctgt gtgcaaaata ccacaacgga 840 agatcagtta ctttttggct gcagactaaa aggaatgcac actgttaatt ctaagtggct 900 gagtgttggg acacattatt ttatcacagt tatggcaagt ggtccatcac cttgtccact 960 gggacttcga ctaaatgtga cagtgaaaca gcagttctgc caggaatctc tgagttcaga 1020 attttgctct ggtcatggta aatgtcttag tgaagcttgg agcaagacat atagctgcca 1080 ttgccagcct ccattttctg gaaaatactg ccaggaactt gatgcatgtt cttttaaacc 1140 atgtaaaaat aatggcagtt gcattaataa aagagaaaat tgggatgagc aagcatatga 1200 atgtgtctgt cacccaccat ttacaggaaa gaattgctca gaaataattg gccagtgtca 1260 accacatgtc tgtttccatg gaaactgcag caatattact tcaaatagtt tcatttgtga 1320 atgtgatgag caattttcag gtccattctg tgaggtgtca gcaaaacctt gtgtttctct 1380 gcttttttgg aaaagaggaa tttgcccaaa tagcagttct gcttatactt atgaatgccc 1440 aaaaggatct tccagccaaa atggtgaaac tgatgtcagt gagttttcat tagtaccatg 1500 tcagaatggt actgactgca tcaaaatatc aaatgatgtt atgtgcatct gttcaccaat 1560 atttacagat ttgctttgta agagcattca aacatcatgt gagtcatttc ctttgaggaa 1620 taatgctaca tgtaagaaat gtgagaaaga ttatccttgc agctgtatat caggatttac 1680 tgaaaaaaac tgtgagaaag caattgacca ctgtaaactg ctcagcatca actgtctgaa 1740 tgaagaatgg tgtttcaata taattggaag attcaaatat gtatgcattc cagggtgcac 1800 aaaaaatcca tgttggtttt tgaagaatgt ttacctaatt catcaacacc tctgctactg 1860 tggagtcacc ttccatggta tttgccaaga taaaggtcct gctcaatttg aatatgtgtg 1920 gcaattggga tttgcaggat ctgaaggcga aaagtgccaa ggggttattg atgcctattt 1980 ctttctggct gcaaactgca ctgaagatgc aacctatgtg aacgatcctg aagataataa 2040 ttcttcatgt tggttcccac atgaaggcac aaaagagatt tgtgcaaatg gatgcagttg 2100 tttgagtgaa gaagacagtc aggaatatcg gtatctatgt tttctcagat gggctggcaa 2160 catgtatctg gaaaatacaa ctgatgatca agaaaatgag tgtcaacatg aagctgtttg 2220 taaagatgaa attaatagac ccagatgcag ctgttctctt agttacattg gcagattgtg 2280 tgttgtcaat gttgactatt gcttagggaa ccacagtata tcagtgcatg gcctctgcct 2340 ggccctttcg cacaattgta actgtagcgg tctgcaaaga tatgaaagga acatctgtga 2400 gatagatact gaagactgca aatctgcgtc ctgcaaaaat ggaacaacta gtacacattt 2460 aaggggatat ttcttccgca agtgtgtccc aggatttaaa ggtacgcaat gtgaaattga 2520 tatagatgag tgtgcttcac atccctgcaa aaatggagcc acctgcattg accaacctgg 2580 taattacttc tgccagtgtg tgcctccatt taaagtggtt gatggctttt cctgcttatg 2640 caatccaggc tatgttggga taagatgtga acaggacatt gatgactgca tcctgaatgc 2700 ctgtgagcac aattctacct gcaaagacct gcatctcagc taccagtgtg tgtgcctatc 2760 tgattgggaa ggaaattttt gtgaacaaga atccaatgag tgtaaaatga atccttgcaa 2820 gaacaattcc acctgtactg acctttacaa aagctatcga tgtgagtgta catctggatg 2880 gactggacag aactgtagtg aagaaataaa tgaatgcgac tctgatccat gcatgaatgg 2940 aggtctttgt catgaatcta ccatccctgg acaatttgta tgtctgtgcc caccccttta 3000 tactggacaa ttttgccacc aacgctataa cctttgtgac ctacttcata acccttgcag 3060 aaacaactca acatgcttag ctttggtaga cgcaaatcag cattgtattt gtagagaaga 3120 atttgaaggt aaaaactgtg aaattgatgt gaaagactgc ctcttccttt cctgccagga 3180 ttatggtgac tgtgaagata tggtcaacaa tttcaggtgt atttgcagac ctgggttttc 3240 tggatctctg tgtgaaattg aaattaatga atgttcctct gaaccttgca aaaataatgg 3300 aacatgtgtg gatctgacaa acagattttt ttgtaattgt gaacctgagt accatgggcc 3360 cttctgtgaa cttgatgtaa ataaatgtaa aatctcacct tgtctagatg aagaaaattg 3420 tgtctacagg actgatggat acaactgcct ctgtgcccct ggttatacag gcatcaactg 3480 tgaaataaat ctagatgaat gcctatcaga gccctgtctc catgatggag tttgtatcga 3540 tggcatcaat cattatacct gtgactgcaa gagtgggttt tttggaacac actgtgaaac 3600 aaacgccaat gattgccttt caaatccttg tctacatgga aggtgcacag aacttattaa 3660 tgaatatcca tgttcatgtg atgcagatgg gactagcaca caatgtaaga tcaaaattaa 3720 tgactgcaca tcaatccctt gtatgaatga aggcttctgt cagaagtcag cacatggatt 3780 tacttgcatt tgcccacgtg gatacactgg tgcatactgt gaaaaaagca ttgataattg 3840 tgctgagcct gaacttaatt cagtcatctg tcttaatgga gggatctgtg ttgatgggcc 3900 tggacatact tttgactgca gatgtcttcc tggattttct ggtcaatttt gtgaaattaa 3960 tataaatgaa tgctcttcat caccatgtct acatggtgca gactgtgaag 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ttccagacct 6540 tcatgggaaa atccagatgc ctgtaccagt caagaatttt actggctgca tagaagttat 6600 agaaataaat aactggagat ctttcattcc atccaaggca gtgaaaaact atcacattaa 6660 caattgcaga tcccagggat ttatgctgtc tccaacagcc tcctttgttg atgcttctga 6720 tgtgacacaa ggggttgata ccatgtggac ttctgtcagc ccctctgttg cagcaccctc 6780 tgtgtgccag caggatgtat gccacaatgg aggcacatgc catgccatct tcctctccag 6840 tggcatagtg tcattccaat gtgactgtcc actacatttc actggccgct tctgtgaaaa 6900 agatgcaggt ttattctttc catctttcaa tgggaattcc tatttagaac tgcccttttt 6960 gaagtttgtc ctggagaagg aacataacag aactgttacc atctacttga ctataaaaac 7020 aaacagttta aatggaacta ttctttacag taatgggaat aattgtggaa agcagtttct 7080 tcatttattt cttgtggaag gaaggccatc agttaaatat gggtgtggaa attctcaaaa 7140 tattttgact gtttctgcta attacagcat taacacaaat gcattcaccc ctatcacaat 7200 acgctacaca acgcctgttg gcagccctgg agttgtttgt atgattgaaa tgactgcaga 7260 tggaaaacct ccagtacaga agaaagacac agagatttcc catgcctctc aggcatattt 7320 tgaatcaatg ttccttggcc atattcctgc aaatgttcaa attcataaga 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tcactcttca 8220 agttcgcact gagaaggatg gccatttcag aggactggga aatcctgagg gccacccaaa 8280 tgctggacgc agtgttggcc agtgtcatgc ttctccctgc agtttaatga aatgtggcaa 8340 tggtgggaca tgcatagaga gtggaactag tgtttactgc aattgtacca ctgggtggaa 8400 aggatcattc tgcacagaga cagtttctac ctgtgatcct gaacatgacc ctccacacca 8460 ctgtagcaga ggagcaacct gcatttcatt acctcatgga tacacctgtt tctgtcctct 8520 aggaaccact ggaatctact gtgaacaagc tttatccata agtgatccat ctttcagaag 8580 caatgagtta tcctggatgt cttttgcttc ctttcatgtt cgaaaaaaga cacatattca 8640 attgcagttt cagcctctcg ctgcagatgg tatcctattt tatgctgcac aacacttaaa 8700 agcccaatca ggtgattttt tatgcatctc tttagtaaat agttccgttc aacttcgcta 8760 caaccttggc gacagaacta tcattctaga aactctccaa aaagtaacta taaacggaag 8820 tacttggcat ataataaaag caggaagagt tggtgcagaa ggctacctgg atctagatgg 8880 gataaatgta acagaaaagg cctccactaa aatgagttct ctggacacaa atacagactt 8940 ctatattgga ggagtatctt ctttaaatct tgtaaatccc atggcaatag aaaatgaacc 9000 tgtaggtttt caaggctgta tccgacaagt tatcataaat aatcaagaat 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22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 4 acctcagtgg gtcccatagt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 5 agccagctgg tatgcactaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 6 gccatcatcc cataggcaca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 7 gtctgtgccc acccctttat 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 8 acaatacctt cccacccaac c 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 9 atgggacagc ctgtgggta 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 10 aggttatagc gttggtggca 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 11 ctgtcacagg aaattaggca aaca 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 12 aatcctggga cacacttgcg 20 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 13 ttcatttctc tgtgtttcag atgc 24 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 14 tcctgtttgt aagtcacgtt cc 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 15 tgaagtttgt cctggagaag ga 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 16 tcaactaatt gtagcatggc aagt 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 17 acaaggattg ctcatccata ctca 24

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 1963번 위치의 염기가 G가 T로 치환되는 종료돌연변이체인 것인 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 돌연변이체
제1항에 있어서, 상기 돌연변이체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자 중에서,
2528번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체;
2522번 위치와 2523번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 종료, 프레임시프트 돌연변이체;
2697번 위치 및 8805번 위치의 염기 C가 A로 치환되는 종료 돌연변이체;
4957번 위치와 4958번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 프레임시프트 돌연변이체;
6557번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체;
9368번 위치의 염기 A가 결손(deletion)되는 프레임시프트 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 돌연변이체
제1항에 있어서, 상기 돌연변이체는 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa)의 진단에 이용되는 것인 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 돌연변이체
망막색소변성증 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 상기 제1항 내지 제2항의 어느 한 항의 돌연변이 부위를 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 유전자를 동정하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제2항의 EYS(eyes shut homolog Drosophila) 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법
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