KR102168332B1 - 망막색소변성증의 진단에 이용 가능한 15개의 ush2a 유전자 돌연변이체 및 이외 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 망막색소변성증의 진단에 이용가능한 15개의 USH2A 유전자 돌연변이체, 상기 USH2A 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법, 상기 USH2A 유전자의 돌연변이체를 이용하여 망막색소변성증을 진단하는 방법, 상기 USH2A 유전자의 돌연변이체의 존재 여보를 확인하는 제제를 포함하는 망막색소변성증 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 망막색소변성증 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

망막색소변성증의 진단에 이용 가능한 15개의 USH2A 유전자 돌연변이체 및 이외 용도 {Novel USH2A gene mutants inducing Retinitis Pigmentosa and uses thereof}

USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체에 관한 것으로, 망막색소변성증의 진단에 이용 가능한 15개의 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체, 상기 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법, 상기 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체를 이용하여 망막색소변성증을 진단하는 방법, 상기 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 망막색소변성증 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 망막색소변성증의 진단에 이용 가능한 15개의 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체 및 이외 용도에 관한 것이다.

망막색소변성증(Retinitis pigmentosa)은 가장 흔한 유전성 망막질환 중 하나로, 10대부터 야맹증이 시작되어 점차적인 시야협착 및 시력상실로 인해 결국에는 실명에 이르는 질환이다. 발병률은 인종에 따라서 약간의 차이는 있지만, 세계적으로 약 3,000-4,000명 중의 한명 비율로 환자가 나타나고 있으며, 상염색체 유전인 경우 성별에 따른 발병률의 차이는 거의 없는 것으로 알려져 있다.

망막색소변성증은 매우 다양한 유전자의 돌연변이에 의해 발생하게 되는데, 시각세포 내에서 빛을 전기 신호로 전환하는 기전에 관여하는 유전자의 결함이 원인인 경우가 많으며, 이들 유전자의 이상이 광범위한 망막의 변성을 일으키게 된다.

망막(retina)은 눈의 가장 안쪽에 위치하며 여러 가지 신경세포들로 이루어진 얇은 층이다. 망막은 눈으로 들어온 빛을 전기적 신호로 바꾸는 역할을 하며 이 신호가 시신경을 따라 뇌에 전달된다. 망막은 크게 시각세포와 신경교세포(glial cell)로 이루어진 감각신경 망막층(neurosensory retina)과 망막색소 상피층(retianl pigment epithelium; RPE)으로 구성되어 있다.

시각세포와 망막색소상피층은 밀접한 관계를 유지하는데, 망막색소 상피층은 시각세포들의 대사산물인 노폐물을 처리하여 혈관으로 배출하고 동시에 혈관으로부터 영양분을 시각 세포들에 공급해준다.

시각세포에는 막대세포(rod cell)와 원뿔세포(cone cell)가 있다. 막대세포는 주로 어두운 곳에서 명암을 구별하고 주변시야를 볼 수 있게 해주며, 원추세포는 밝은 곳에서 색을 구별하고 중심시야를 선명하게 볼 수 있게 한다.

막대세포는 망막의 전체 영역에 걸쳐 고르게 분포하는 반면, 원뿔세포는 주로 망막의 중심부인 황반부에 몰려있다. 망막색소변성증은 유전자 이상에 의해 막대세포와 원뿔세포가 점차적으로 파괴되어 망막에 색소가 침착되며, 막대세포가 원뿔세포 보다 먼저 손상을 입는 것으로 알려져 있다.

어두운 곳에서 시각을 담당하는 막대세포의 손실이 시작되면 야맹증이 나타나게 되며, 시야의 바깥 부분을 볼 수 없게 되므로 시야가 좁아져서 마치 작은 망원경으로 사물을 보는 것처럼 보인다. 시각세포의 파괴가 원뿔세포까지 진행되면 중심시야도 잃게 되어 완전한 실명에 이르게 된다.

전형적인 망막색소변성증의 경우, 대개 10-20세에 증상이 나타나며, 상염색체 열성으로 유전된 경우에는 10세, 상염색체 우성으로 유전된 경우에는 약 20-30세에 증상이 시작되는 것으로 알려져 있다. 유전의 형태에 따라 질병이 나타나는 시기와 증상은 다르지만, 60-80% 이상에서 보통 20세 이전에 야맹증이 나타나며, 그밖에 백내장, 녹내장, 원추각막, 근시, 유리체 혼탁 등이 동반되기도 한다.

망막색소변성증의 유전망막색소변성증 환자의 절반 이상은 가족력이 없는 단독 (sporadic) 환자이며, 이는 부모로부터 전달되는 유전성 돌연변이(germline mutation) 보다는 초기 수정시 체세포 돌연변이(somatic mutation)에 의해 발생하는 것으로 생각되고 있다.

망막색소변성증의 유전양식은 크게 상염색체 우성, 상염색체 열성, X-linked 그리고 de Novo 형태로 나타나는데, 망막색소변성증 질환가계 연구를 통해 발표된 것을 보면, 상염색체 열성유전이 전체의 50-60%로 가장 많은 비중을 차지하며, 상염색체 우성유전이 30-40%, X염색체 유전이 5-15%로 나타나고 있음을 보고하고 있다.

퇴행성망막질환과 관련하여 현재까지 269개의 유전자가 보고되고 있으며, 유전성망막질환의 원인 유전자로는 64개가 보고되고 있다. 이들 유전자들은 광수용체 세포중의 하나인 가늘고 긴 모양의 형태를 하고 있는 9천만개 이상의 막대세포내에서 약한 빛을 감지하는 광자전달(phototransduction), 비타민A 대사(vitamin A metabolism), splicing, 유전자조절(gene regulation) 그리고 약 600만개 이상의 원추세포에서 다양한 기능을 수행하고 있다.

망막색소변성증과 관련된 돌연변이는 인종에 상관없이 공통적으로 발견되는 것도 많지만 인종과 지역에 따라 유무 및 빈도가 다르게 나타나는 것도 있는데, 이러한 현상은 창시자효과(founder effect)에 의해 나타나게 되며, 유럽계 백인들에게서만 주로 발견되는 로돕신 유전자의 Pro23His 돌연변이가 대표적인 예라 할 수 있다.

또한, 유전성망막질환을 치료하기 위해서는 약물치료, 유전자치료, 줄기세포치료, 인공망막이식의 4가지 방법이 존재하는데, 이 가운데 근본적으로 병을 치료하는 방법은 유전자치료이다. 이러한 상황에 2017년 12월, 유전성 망막질환을 치료하는 유전자치료제가 유전자치료 분야에서 처음으로 미국 식약청 FDA에 의해 승인됐다. 보레티젠 네파보벡(상품명:룩스터나)이라고 불리는 이 치료법은 바이러스를 이용해 'RPE65' 유전자를 망막세포 내로 전달해 돌연변이된 'RPE65' 유전자를 보충하는 방식으로 작용한다.

본래 유전성 망막질환은 다양한 유전자들의 변이로 인해 발생하는데, 그 중 RPE65 유전자는 정상적인 시력을 위해 RPE65 효소를 생성시키는 필수적인 유전자로 알려져 있었고, RPE65 유전자에 돌연변이가 나타나면 망막세포내의 RPE65 단백질이 감소하고, 결국 망막세포가 파괴돼 시력이 소실되는 것이다.

FDA 승인을 받은 유전자치료는 정상적인 RPE65를 생성할 수 있는 DNA를 바이러스 안에 담아, 이 약물을 안구 내로 주입하는 방식으로, 정상적인 RPE65 생성용 DNA가 망막세포 안으로 들어가 작동하면서 결과적으로 망막세포의 파괴를 막고 시력을 회복시키는 방법으로 치료된다.

이는 유전자치료에 있어 획기적인 사건이지만 아직까지 치료받을 수 있는 환자가 제한될 뿐만 아니라 치료효과도 완벽한 상태가 아니고, 특히 치료제를 개발한 스파크사는 1회 치료에 85만불(한화 10억 원), 한 눈만 치료할 경우에는 42만 5000불(한화 5억원)의 비용이 필요하다.

눈은 유전자치료가 성공할 수 있는 가장 높은 가능성을 가진 최적의 장기이며, 유전성 망막질환의 원인유전자 중 현재 치료 가능한 유전자는 RPE65 하나 밖에 없기 때문에 다양한 유전자 변이를 치료할 수 있는 치료제가 추가로 개발될 것으로 기대된다.

즉, 유전성망막질환자에 빈발하는 돌연변이와 유전자 정보를 확보하고, 이러한 유전자의 기능이 망막에 미치는 영향을 연구함으로써, 유전자 치료의 타겟으로 선정될 가능성은 매우 높다.

2006년부터 질병관리본부와 서울대학교병원은 망막색소변성증 환자의 유전양식과 임상적 특징에 관한 보고서를 발표하였고, 보고서에서 365명의 망막색소변성증 환자를 분석한 자료를 보면, 가족력이 없는 단독환자가 62%로 가장 많은 수를 차지하였으며, 가족력이 있는 경우에서는 열성유전(17%), 우성유전(12%), X염색체유전 (9%) 순으로 보고하고 있었다.

망막색소변성증을 일으키는 대부분의 유전자들은 전체망막색소변성증의 발생원인 측면에서 보면 아주 작은 비중을 차지하고 있지만, USH2A(열성유전), 로돕신(우성유전, RHO), 그리고 RPGR(X염색체유전) 유전자는 전 세계 환자들에서 공통적으로 많이 발견되는 원인유전자로 보고하고 있다. 특히 로돕신 유전자는 우성유전되는 망막색소변성증의 약 25%를 차지하고 있으며, 열성유전되는 망막색소변성증에서도 보고되어 있으며, 현재까지 백개가 넘는 로돕신 유전자의 돌연변이가 망막색소변성증과 관련된 것으로 보고되어 있다.

한국인 망막색소변성증 환자에게서 자주 나타나는 로돕신 유전자의 돌연변이를 찾기 위해, 총 302개 질환가계에 대하여 염기서열분석을 통한 돌연변이 발굴연구를 수행하여, 6개 질환가계로부터 5 종류의 질병유발 돌연변이를 발굴하였고, 여러 종류의 망막색소변성증 돌연변이를 동시에 대량으로 분석하기 위하여, 96개의 돌연변이로 구성된 DNA 칩을 제작하였다.

한편, 이미 보고된 로돕신 유전자를 비롯한 5개의 유전자에서 9개의 질병관련 돌연변이가 확인되어(9.37%) 한국인 망막색소변성증 진단칩 개발 가능성을 보여주었다.

그러나, 한국인 망막색소변성증 환자에서, 로돕신 유전자를 비롯한 5개의 유전자에서 9개의 질병관련 돌연변이로 약 9% 정도의 진단율을 보이는 바, 로돕신 유전자보다 특이성 및 민감성이 높은 유전자 및 돌연변이를 발굴하고, 고효율의 한국인 망막색소변성증 진단칩 개발에 대한 연구가 필요하다.

이에 국내 공개특허공보 제10-2007-0029726호에는 망막색소변성증 치료용 키트에 관하여 게시하고 있고, 국내 공개특허공보 제10-2016-0147571호에는 망막색소변성의 치료에 관하여 게시하고 있으나, 본 발명의 USH2A 하나의 유전자에 15개 돌연변이에 대한 genotyping 만으로도 16.5% 정도의 망막색소변성증 조기 진단이 가능한 구성 및 효과는 상기 선행문헌에는 게시되지 않아 차이를 보인다.

국내 등록특허번호 제10-1863667호에는 망막질환 개선 또는 치료용 결합체는 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용하여 비교적 긴 시간동안 선택적으로 망막상피세포에서 활성산소 생성을 억제할 수 있어 망막질환의 치료 효능이 우수하고, 세포내 침투가 용이할 수 있다. 또한, 이와 같은 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 포함하는 망막질환 개선또는 치료용 조성물을 제공하는 히알루론산-탄소나노물질-광감각제 결합체를 이용한 망막색소변성증 치료에 관하여 게시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2007-0029726호에는 조효소 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADH), 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트(NADPH) 및 환원된 글루타치온을, 예정된 시간 순서에 따라 당해 효소들을 투여하기에 적절한 분획 및 상호작용성 양으로 포함하는 망막색소변성증 치료용 키트에 관하여 게시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2016-0147571호에는 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 망막색소변성의 치료에 관하여 게시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2018-0043373호에는 색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGRORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, RPGR ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열의 복제 정확도를 증가시키기 위해 코돈 최적화된 색소성망막염의 치료에 관하여 게시하고 있다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해서 망막세포변성증을 야기하는 USH2A(usherin) 유전자의 염기서열 분석을 통한 돌연변이 검출을 실시한 결과, 망막세포변성증의 진단에 유용한 15개의 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체를 발견하였고, 이 중 2개 변이는 USH2A(usherin) 돌연변이를 갖는 환자의 60%를 차지하며, 2개 변이를 포함한 15개 돌연변이는 USH2A(usherin)를 원인으로 하는 망막색소변성증 환자의 16.5%이상 발견 할 수 있는 분자생물학적 돌연변이를 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 USH2A(usherin) 유전자의 486-14번 위치의 염기가 G가 A로 치환되는 인트론 돌연변이체인 것일 수 있다.

상기 돌연변이체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 USH2A (usherin) 유전자 중에서, 820번 위치 및 8650번 위치의 염기 C가 T로 치환되는 종료 돌연변이체; 2802번 위치의 염기 T가 G로 치환되는 미스센스 돌연변이체; 4217번 위치의 염기 C가 A로 치환되는 종료 돌연변이체; 4732번 위치의 염기 C가 T로 치환되는 미스센스 돌연변이체; 5789번 위치와 8096번 위치 및 10613번 위치의 염기 G가 C로 치환되는 미스센스 돌연변이체; 8559-2번 위치의 A가 G로 치환되는 스플라이스 어셉터 돌연변이체; 11328번 위치의 T가 G로 치환되는 종료 돌연변이체; 12708번 위치의 T가 A로 치환되는 종료 돌연변이체; 13112번 위치와 13115번 위치 사이에 염기 AAAT가 결손(deletion)되는 프레임시프트 돌연변이체; 14243번 위치의 C가 T로 치환되는 미스센스 돌연변이체; 15233번 위치의 C가 G로 치환되는 미스센스 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법은 망막세포변성증 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 제1항 및 제2항의 어느 한 항의 돌연변이 부위의 유전자를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 유전자를 동정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa)의 진단용 조성물은 서열번호 1로 이루어진 USH2A(usherin) 유전자를 증폭할 수 잇는 서열번호 2 내지 31의 염기서열로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 돌연변이체는 망막세포변성증(Retinitis pigmentosa) 진단에 이용되는 것 및 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa)의 진단용 키트를 포함할 수 있다.

본 발명은 한국인에서 이제껏 보고되지 않은 15개의 새로운 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체를 발견하였고, 망막색소변성증을 진단할 수 있는 마커를 제공함으로서 유전자 돌연변이를 이용한 조기진단은 적합한 치료제 및 최적의 치료 효과를 달성할 수 있도록 지원할 수 있는 분자생물학적 지표를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 PCR증폭산물의 전기영동 결과를 나타낸다.

USH2A(usherin) 유전자는 염색체 1번 215,796,236-216,596,738 (GRCh37)에 위치하며, RP39, USH2라는 이름으로도 알려져 있다. 또한, USH2A(usherin) 유전자는 5,202개 아미노산과 72개의 엑손을 갖고 있으며, 3개의 ConA-like_lec_gl_sf, 28개의 EGF_laminin, 106개의 Fibronectin_type3, 1개의 LamG-like, 8개의 Laminin_G, 2개의 Laminin_N 도메인을 갖고 있으며, TCGA 체세포변이 데이터베이스에 1420개 missense, 115개의 stop gained, 66개의 frameshift, 1개의 start lost mutation을 포함하여 총 1602개의 체세포 돌연변이가 보고되고 있다.

USH2A(usherin)는 광수용체의 connecting cilium과 내이의 부동섬모 사이 기저에서 발현된다. 이 단백질은 망막과 내이의 발달에서 중요한 역할을 하는것으로 추정된다. zebrafish에서 USH2A(usherin) 결함은 포유 동물과 마찬가지로 청각 손상이 일어나고, 원뿔 세포 퇴행 이전에 막대 세포의 외절이 망가지면서 phototransduction cascade 단백질들의 down-regulation을 일으킨다. 망막의 기저막에서 fibronectin assembly가 붕괴되면서 세포 접착이 약해지는 결과가 나타났다. 이상의 결과로부터 막대 세포 외절과 내이 세포에서 중요한 역할을 하고 있는 USH2A(usherin) 유전자에 돌연변이가 생김으로써, photoreceptor의 생존에 치명적인 영향을 미치는 것으로 제시되었다.

이에 본 발명은 망막세포변성증을 야기하는 USH2A(usherin) 유전자의 염기서열 분석을 통한 돌연변이 검출을 실시하고, 망막세포변성증의 진단에 유용한 15개의 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체를 발견하였고, 이 중 2개 변이(표 1의 *)는 USH2A(usherin) 돌연변이를 갖는 환자의 60%를 차지하며, 2개 변이를 포함한 15개 돌연변이는 USH2A(usherin)를 원인으로 하는 망막색소변성증 환자의 16.5%이상 발견 할 수 있는 분자생물학적 돌연변이 제공한다.

본 발명은 망막색소변성증의 진단에 이용가능한 15개의 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체를 이용하여 망막색소변성증을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 망막색소변성증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 망막 색소 변성증 진단용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명의 망막색소 변성증의 진단에 이용 가능한 15개의 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체 및 이의 용도와 관련한 도면을 첨부하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 USH2A(usherin)유전자중에서,

486-14번 위치의 염기가 G가 A로 치환되는 인트론 돌연변이체;

820번 위치 및 8650번 위치의 염기 C가 T로 치환되는 종료 돌연변이체;

2802번 위치의 염기 T가 G로 치환되는 미스센스 돌연변이체;

4217번 위치의 염기 C가 A로 치환되는 종료 돌연변이체;

4732번 위치의 염기 C가 T로 치환되는 미스센스 돌연변이체;

5789번 위치와 8096번 위치 및 10613번 위치의 염기 G가 C로 치환되는 미스센스 돌연변이체;

8559-2번 위치의 A가 G로 치환되는 스플라이스 어셉터 돌연변이체;

11328번 위치의 T가 G로 치환되는 종료 돌연변이체;

12708번 위치의 T가 A로 치환되는 종료 돌연변이체;

13112번 위치와 13115번 위치 사이에 염기 AAAT가 결손(deletion)되는 프레임시프트 돌연변이체;

14243번 위치의 C가 T로 치환되는 미스센스 돌연변이체;

15233번 위치의 C가 G로 치환되는 미스센스 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 USH2A(usherin)유전자의 돌연변이체를 제공한다.

본 발명의 USH2A(usherin) 유전자의 돌연변이체 중, 486-14번 위치의 염기가 G가 A로 치환되는 인트론 돌연변이체는 인트론 2번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 3‘AG acceptor splice site가 생성되고 결과적으로 인트론 서열이 open reading frame에 들어가게 되면서 성숙 단백질의 162번 위치의 메티오닌이 이소류신으로 치환되고 162번과 163번 사이에 4개 아미노산이 추가되는 경우이다.

820번 위치의 염기 C가 T로 치환되는 종료 돌연변이체는 엑손 5번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 274번 위치의 아미노산이 아르기닌에서 종결 코돈으로 치환되는 경우이다.

2802번 위치의 염기 T가 G로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 13번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 934번 위치의 아미노산이 시스테인에서 트립토판으로 치환되는 경우이다.

4217번 위치의 염기 C가 A로 치환되는 종료 돌연변이체는 엑손 19번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 1406번 위치의 아미노산이 세린에서 종결 코돈으로 치환되는 경우이다.

4732번 위치의 염기 C가 T로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 22번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 1578번 위치의 아미노산이 아르기닌에서 시스테인으로 치환되는 경우이다.

5789번 위치의 염기 G가 C로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 29번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 1930번 위치의 아미노산이 아르기닌에서 프롤린으로 치환되는 경우이다.

8096번 위치의 염기 G가 C로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 41번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 2699번 위치의 아미노산이 아르기닌에서 프롤린으로 치환되는 경우이다.

8559-2번 위치의 A가 G로 치환되는 스플라이스 어셉터 돌연변이체는 인트론 42번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 스플라이싱 과정에서 43번 엑손을 건너뛰게 되며 결과적으로 성숙 단백질의 2854번 위치의 티로신과 2896번 아르기닌 사이에 41개의 아미노산이 결실(deletion)되는 경우이다.

8650번 위치의 염기 C가 T로 치환되는 종료 돌연변이체는 엑손 43번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 2884번 위치의 아미노산이 글루타민에서 종결 코돈으로 치환되는 경우이다.

10613번 위치의 염기 G가 C로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 54번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 3538번 위치의 아미노산이 아르기닌에서 프롤린으로 치환되는 경우이다.

11328번 위치의 T가 G로 치환되는 종료 돌연변이체는 엑손 58번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 3776번 위치의 아미노산이 티로신에서 종결 코돈으로 치환되는 경우이다.

12708번 위치의 T가 A로 치환되는 종료 돌연변이체는 엑손 63번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 4236번 위치의 아미노산이 시스테인에서 종결 코돈으로 치환되는 경우이다.

13112번 위치와 13115번 위치 사이에 염기 AAAT가 결손(deletion)되는 프레임시프트 돌연변이체는 엑손 63번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 4371번 위치의 아미노산이 글루타민에서 아르기닌으로 치환되면서 19번째 아미노산 합성이 종료 되는 경우이다.

14243번 위치의 C가 T로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 65번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 4748번 위치의 아미노산이 세린에서 페닐알라닌으로 치환되는 경우이다.

15233번 위치의 C가 G로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 70번 위치에 생긴 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 5078번 위치의 아미노산이 프롤린에서 아르기닌으로 치환되는 경우이다.

본 발명의 용어, 결손(deletion) 돌연변이는 하나 이상의 염기가 제거되게 되는 경우이다. 본 발명의 용어, 미스센스(missense) 돌연변이는 DNA 사슬 위의 어떤 부위에 하나의 염기 치환이 일어나서 mRNA의 유전암호가 변해 본래의 것과는 다른 아미노산이 지정이 되어 단백질에 영향을 주게 되는 유전자 돌연변이를 지칭한다. 본 발명의 용어, 넌센스 돌연변이는 하나의 염기 치환으로 본래의 어느 한 아미노산을 암호화하는 코돈이 아미노산을 암호화하지 않는 종결코돈으로 변화되어 단백질의 합성이 그 코돈이 있는 곳에서 중단되는 유전자 돌연변이를 지칭한다. 본 발명의 용어, 염기삽입(insertion) 돌연변이는 하나 이상의 염기가 기존의 염기들 사이로 끼어들어 변화가 일어나는 유전자 돌연변이를 지칭한다. 본 발명의 용어, 프레임시프트(Frameshift) 돌연변이는 염기가 하나이상 삽입되거나 결실되어 3개의 염기를 모두 변화가 일어나는 유전자 돌연변이를 말한다. 인트론(intron) 돌연변이는 단백질을 암호화하고 있지 않은 염기서열 부위에서 염기가 변화하면서 단백질에 영향을 주는 유전자 돌연변이를 지칭한다. 본 발명의 용어, 스플라이스 어셉터(Splice acceptor) 돌연변이는 불필요한 인트론을 제거하고 단백질을 암호화하는 엑손 부분을 연결하는 스플라이싱 과정에 필요한 스플라이스 어셉터 부위의 염기가 변화하면서 단백질에 영향을 주는 유전자 돌연변이를 지칭한다.

본 발명의 15개의 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체는 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa) 진단에 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

<실시예 1: 연구 대상 및 DNA추출>

말초혈액 시료는 실명퇴치운동본부와 순천향대학교 병원에서 얻었다. 연구대상은 121명의 한국인 망막색소변성증 환자와 37명의 환자가족을 대상으로 하였다. 모든 환자는 충분한 상담을 하였고, 동의서를 작성하였다.

유전체 DNA는 진올 blood extraction kit (GeneAll Biotechnology, co., ltd.)를 사용하여 전혈 300 ul에서 5ug의 DNA를 분리하였고, 200ng의 DNA를 이용하여 HiSeq2500 NGS 장비로 Whole exome sequencing 데이터를 생산하였다.

<실시예 2: WES를 통한 돌연변이체 후보 확보>

인간 유전체의 1.22%에 해당하는 영역을 포함하고 있는 엑솜 영역 만을 시퀀싱하기 위하여, SureSelect Human All Exome Kits 를 사용하여 혈액에서 추출한 유전체 DNA를 150-200bp 단편으로 잘라 SureSelect library Prep Kit를 이용하여 라이브러리를 만들어 PCR 증폭후 HiSeq NGS 장비를 이용하여 시퀀싱을 수행하였다.

이러한 엑솜시퀀싱 결과인 인간유전체(hg19) FASTQ파일에 대해 BWA를 사용하여 시퀀싱 데이터를 참조 시퀀싱과 맵핑 한 후, GATK를 사용하여 리얼라이먼트를 수행하여 얼라인먼트 미스를 줄였다. 이 과정을 통해 확보한 BAM파일에 대해서 SAMtools로 필터링을 진행하면서 염기서열의 차이를 검출하였으며, Annovar를 이용하여 annotation을 수행하였으며, Picard로 맵핑 결과의 통계 정보를 확인하여 후보 돌연변이체를 확보하였다.

<실시예 3: 유전모드 및 germline mutation 데이터와 비교분석>

미국 RetNet 데이터베이스에 유전성망막질환의 22개의 autosomal dominant, 40개의 autosomal recessive, 2개의 X-linked 유전자가 보고되고 있으며, 퇴행성망막질환에 관여하는 269개 유전자에 대하여 정보를 보고하고 있다.

통상적으로 USH2A 유전자 하나에, ClinVar에 1023개 돌연변이 정보, EVS에 948개 돌연변이 정보, LOVD에 9452개 돌연변이 정보, dbSNP에 1204개 돌연변이 정보가 보고되고 있다. 따라서, 이렇게 많은 돌연변이를 유전성망막변성증 환자에게 스크리닝을 하는 것은 많은 시간과 비용을 초래한다.

이에 본 발명에 따른 USH2A 유전자의 15개 돌연변이 정보는 환자의 16.5% 정도가 상기 돌연변이를 보유하고 있음을 확인하였다. 하기의 표 1은 USH2A(usherin) 유전자 정보를 나타낸다.

하기 표 1의 아미노산의 번호는 다른 USH2A 유전자 연구에서 사용한 방법과 같이, 성숙 단백질(mature protein)을 나타낸다. 또한, p.Met162Ile에서 p.는 protein을 나타낸다.

USH2A(usherin) 유전자

No.	Cytoband	exon(or intron)	Variant description	Aminoacied chage	Variant type	Consequence	프라이머
1	1q41	intron 2	NM_206933.2:c.486-14G>A	p.Met162Ile	snv	intron_variant	2
2	1q41	5	NM_206933.2:c.820C>T	p.Arg274Ter	snv	stop_gained	1
3*	1q41	13	NM_206933.2:c.2802T>G	p.Cys934Trp	snv	missense_variant	4
4	1q41	19	NM_206933.2:c.4217C>A	p.Ser1406Ter	snv	stop_gained	6
5	1q41	22	NM_206933.2:c.4732C>T	p.Arg1578Cys	snv	missense_variant	14
6	1q41	29	NM_206933.2:c.5789G>C	p.Arg1930Pro	snv	missense_variant	13
7	1q41	41	NM_206933.2:c.8096G>C	p.Arg2699Pro	snv	missense_variant	8
8	1q41	intron 42	NM_206933.2:c.8559-2A>G	p.Y2854_R2896del41	snv	splice_acceptor_variant	7
9	1q41	43	NM_206933.2:c.8650C>T	p.Gln2884Ter	snv	stop_gained	3
10	1q41	54	NM_206933.2:c.10613G>C	p.Arg3538Pro	snv	missense_variant	10
11	1q41	58	NM_206933.2:c.11328T>G	p.Tyr3776Ter	snv	stop_gained	12
12	1q41	63	NM_206933.2:c.12708T>A	p.Cys4236Ter	snv	stop_gained	15
13	1q41	63	NM_206933.2:c.13112_13115delAAAT	p.Gln4371ArgfsTer19	deletion	frameshift_variant	5
14*	1q41	65	NM_206933.2:c.14243C>T	p.Ser4748Phe	snv	missense_variant	11
15	1q41	70	NM_206933.2:c.15233C>G	p.Pro5078Arg	snv	missense_variant	9

<실시예 4: 염기서열 분석을 통한 돌연변이 검증>

이중 나선 구조인 DNA가 고열에 의해 두 가닥으로 분리되고 프라이머가 target sequence에 가서 붙은 이수 DNA polymerase가 dNTP를 사용하여 합성하게 된다. DNA 합성과정에 dNTP뿐만 아니라 소량의 ddNTP도 함께 사용되는데 dNTP가 삽입되면 DNA 합성이 진행되지만 ddNTP가 삽입되면 ddNTP의 ribose 구조의 3'에 OH 대신 H가 위치하고 있기 때문에 다음 순서의 새로운 염기가 와서 phosphodiester bond를 형성할 수 없게되어 DNA합성은 중단된다.

그리고 ddNTP에 사용된 ddATP, ddTTP, ddGTP와 ddCTP는 각각 다른 형광 물질로 표지되어 있다. 다양한 크기의로 새로 합성된 DNA 조각들은 capillary gel electrophoresis에 의해 DNA 조각의 크기에 따라 작은 염기서열을 가진 DNA는 빨리 이동하고 긴 염기서열을 가진 DNA는 느리게 이동한다. 이때 이동하는 DNA 조각의 형광을 검출기를 이용하여 염기서열을 읽을 수 있는 Sanger sequencing 방법을 이용하여 WES를 통하여 발굴된 돌연변이를 검증하였다.

상기 돌연변이를 중심으로 150-200 bp 길이의 염기서열이 증폭될 수 있도록, 프라이머를 제작하였고, PCR을 수행하여 싱글밴드가 증폭됨을 확인하였고, 증폭된 PCR 산물을 Veriti 96-well Thermal Cycler(ABI 9902)를 이용하여 염기서열 확인 및 분석하여 돌연변이 유무를 확인하였다.

USH2A 유전자 돌연변이체 부위 증폭용 프라이머 세트

프라이머	크기(bp)	정방향 프라이머 (서열번호)	역방향 프라이머 (서열 번호)
1	206	AGGTGAAGTTTGCCAAATGGT(2)	GCACATGTGTGTATTTGCAGGT(3)
2	182	TGCAAACCATTTACTGTGCGA(4)	ACACCACTGTAACTGCACAA(5)
3	260	TGCTGACTGTTACAGCTGGG(6)	GCCACTTGCATCAAATCCCC(7)
4	310	CGGCTGAGTTTTATCTAAAGTATCC(8)	ACCTGGGACCATTTGTGACC(9)
5	185	CTGAGAGTAAGGCTGCAGGTG(10)	CTCCATCAGAAGTCAGCCCTC(11)
6	240	TCCAAATGAAGCCCTAAGCCA(12)	TGTTCTCATTGATAGCACCTGT(13)
7	153	GGGGATTTGATGCAAGTGGC(14)	TCCACGCATATATCACACGCA(15)
8	267	CCAGGGTACATTCCTAAGTCTGC(16)	ACTACCCTGGTGACTCTCCC(17)
9	312	GGTTAGCCTCTCTTGGTCCC(18)	GTGTTAATGGCGATGCTGGG(19)
10	229	ACACTGAACCCCTTTTCCCAG(20)	TCAAATGCAGTCATTTTTCTGCT(21)
11	317	CCGTAGAGCAACTGAGAACAG(22)	CAGGAAAAGCCCCCAGTAGC(23)
12	316	CCAGGAGACCGACTATGTCTTT(24)	TGTGCATGGCCTTACCACAAT(25)
13	272	GGCATGCTCTGTCAGAAGACT(26)	CTGCCAGCCCCTCATTAATCT(27)
14	159	AAATAAAGACGTCCCTTCTTCAACT(28)	ACAAAACCCCAGCACTGATTTG(29)
15	204	GTGCTTGCAATGTCCTCACC(30)	GCTTCGAGGGAAAAGCTTGG(31)

상기의 표 2는 상기 실시예 3에 따른 USH2A 유전자 돌연변이체 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 나타낸다. 프라이머 1은 206bp, 프라이머 2는 182bp, 프라이머 3은 260bp, 프라이머 4는 310bp, 프라이머 5는 185bp, 프라이머 6은 240bp, 프라이머 7은 153bp, 그리고 프라이머 8은 267bp, 프라이머 9는 312bp, 프라이머 10은 229bp, 프라이머 11은 317bp, 프라이머 12는 316bp, 프라이머 13은 272bp 프라이머 14는 159bp, 프라이머 15는 204bp의 PCR 증폭산물을 확인한 것으로 양 끝의 레인은 100bp 크기 마커이다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 PCR증폭산물의 전기영동 결과를 나타낸다. PCR을 수행하여 싱글밴드가 증폭됨을 확인하였고 증폭된 PCR 산물을 96-well Thermal Cycler(ABI 9902)를 이용하여 염기서열 확인 및 분석하여 돌연변이 유무를 확인한 결과 100% 일치하였다.

본 발명은 본 발명은 한국인에서 이제껏 보고되지 않은 15개의 새로운 USH2A 유전자 돌연변이체를 발견하였고, 망막색소변성증을 진단할 수 있는 마커를 제공하여 유전자 돌연변이를 이용한 조기진단이 가능하고, 본 발명에 따른 진단 키트는 다양한 유전자에 의해 발생되는 유전성망막질환자의 약 16.5%이상 발견할 수 있는 저비용 고효율 키트로서 자가 조기 진단을 통하여 적합한 치료제 및 개별 환자 최적의 맞춤형 치료에 따른 치료 효과를 달성할 수 있으며, 시각의 소실을 최소화하여 건강한 삶을 연장하는 데 기여할 수 있으므로 산업상이용가능성이 있다.

<110> LEE, Jongyeng <120> Novel USH2A gene mutants inducing Retinitis Pigmentosa and uses thereof <130> p19-0390725 <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18883 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 1 tgtttgctct gcagaatact ttacctgggc acccaagtct tccttccagc attcctgctg 60 ctacagccta tttgctgagt aaccaggggt tacagcagcg ttgccaggca acgagggaca 120 gcggtcctgt tgaagagcca tttgtcacac tgaggggact ggttgaaatg caataaagaa 180 atgataccag cagctactca tgtcttcgcc attgctaaga acgtcgttgg tattacctta 240 ctctgagaac gtgtctgcag tttccagaaa atggagtatc gcaacatcac ttaaagtacc 300 ctgcttcaaa gtattgctgg caagtggcgt gggcctgatt atttatttag aaatgcttta 360 tcaggaggag aatgcttttt tgtaaacatg aattgcccag ttctttcatt gggctctggc 420 ttcttgtttc aggtcattga aatgttgatc tttgcctatt ttgcttcaat atccttgact 480 gagtcacgag gtcttttccc aaggctggag aacgtgggag ctttcaagaa agtttccatc 540 gtgccaaccc aagcagtatg tggactccca gaccgaagca ctttttgtca cagctctgct 600 gctgctgaaa gtattcagtt ctgtacccag cggttttgta ttcaggattg cccatacaga 660 tcttcacacc ctacctacac tgcccttttc tcagcaggcc tcagtagctg catcacacca 720 gacaagaatg atctgcatcc taacgcccat agcaattctg caagttttat ttttggaaat 780 cacaagagct gcttttcttc tcctccttct ccaaagctga tggcatcatt taccttagct 840 gtatggctga aacctgagca acaaggtgta atgtgtgtta tagaaaagac agtagatggg 900 cagattgtgt tcaaacttac aatatctgag aaagagacca tgttttatta tcgcacagta 960 aatggtttgc aacctccaat aaaagtaatg acactgggga gaattcttgt gaagaaatgg 1020 attcatctta gtgtgcaggt gcatcagaca aaaatcagct tctttatcaa tggcgtggag 1080 aaggatcata cacctttcaa tgcaagaact ctaagtggtt caattacaga ttttgcatct 1140 ggtactgtgc aaataggaca gagtttaaat ggtttagagc agtttgtcgg aagaatgcaa 1200 gattttcgat tataccaagt ggcacttaca aacagagaga ttctggaagt cttctctgga 1260 gatcttctca gattgcatgc ccaatcacat tgccgttgcc ctggcagcca cccgcgggtc 1320 caccctttgg cacagcggta ctgcattcct aatgatgcag gagacacagc tgataataga 1380 gtgtcacggt tgaatcctga agcccatcct ctctcttttg tcaatgataa tgatgttggt 1440 acttcatggg tttcaaatgt gtttacaaac attacacagc ttaatcaagg agtgactatt 1500 tcagttgatt tggaaaatgg acagtatcag gtgttttata ttatcattca gttctttagt 1560 ccacaaccaa cggaaataag gattcaaagg aagaaggaaa atagtttaga ttgggaggac 1620 tggcaatatt ttgccaggaa ttgtggtgct tttggaatga aaaacaatgg agatttggaa 1680 aaacctgatt ctgtcaactg tcttcagctt tccaatttta ctccatattc ccgtggcaat 1740 gtcacattta gcatcctgac acctggacca aattatcgtc ctggatacaa taacttctat 1800 aataccccat ctcttcaaga gttcgtaaaa gccacgcaaa taaggtttca ttttcatggg 1860 cagtactata caactgagac tgctgttaac ctcagacaca gatattatgc agtggacgaa 1920 atcaccatta gtgggagatg tcagtgccat ggtcatgccg ataactgcga cacaacaagc 1980 cagccatata gatgcctctg ctcccaggag agcttcactg aaggacttca ttgtgatcgc 2040 tgcttgcctc tttataatga caagcctttc cgccaaggtg atcaagttta cgctttcaat 2100 tgtaaacctt gtcaatgcaa cagccattcc aaaagctgcc attacaacat ctctgtagac 2160 ccatttcctt ttgagcactt cagaggggga ggaggagttt gtgatgattg tgagcataac 2220 actacaggaa ggaactgtga gctgtgcaag gattactttt tccgacaagt tggtgcagat 2280 ccttcggcca tagatgtttg caaaccctgt gactgtgata cagttggcac tagaaatggt 2340 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aatcagtgtc aaccaggttt ttatatttct ccaggcaatg ccactggctg cctgccatgc 3240 tcatgccata caactggtgc agttaatcac atctgtaata gcctgactgg tcagtgtgtt 3300 tgccaagatg cttccattgc tgggcaacgt tgtgaccaat gcaaagacca ttactttgga 3360 tttgatcctc agactggaag atgtcagcct tgtaattgtc atctctcagg agccttgaat 3420 gaaacctgtc acttggtcac aggccagtgt ttctgtaaac aatttgtcac tggctcaaag 3480 tgtgatgctt gtgttcccag tgcaagccac ttggatgtca acaatctatt gggttgcagc 3540 aaaactccat tccagcaacc tccgcccaga ggacaagttc aaagttcttc tgctatcaat 3600 ctctcctgga gtccacctga ttctccaaat gcccactggc ttacttacag tttactcagg 3660 gatggttttg aaatctacac aacagaggat caatacccat acagtattca atacttctta 3720 gacacagacc tgttaccata taccaaatat tcctattaca ttgagaccac caatgtgcat 3780 ggttcaacaa ggagtgtagc tgtcacttac aagacaaaac caggggtccc agagggaaac 3840 ttgactttaa gttatatcat tcctattggc tcagactctg tgacacttac ctggacaaca 3900 ctctcaaatc aatctggtcc catagagaaa tatattttgt cctgtgcccc tttggctggt 3960 ggtcagccat gtgtttccta cgaaggtcat gaaacctcag ctaccatctg gaatctggtt 4020 ccatttgcca agtacgattt ttctgtacag gcgtgtacta gcgggggctg tttacacagc 4080 ttgcccatta cagtgaccac agcccaggcc cctccccaaa gactaagtcc acctaagatg 4140 cagaaaatca gttctacaga acttcatgta gaatggtctc caccagcgga actaaatgga 4200 ataattataa gatatgaact atacatgaga agactgagat ctactaaaga aaccacatct 4260 gaggaaagtc gagtttttca gagcagtggt tggctcagtc ctcattcatt tgtagaatcg 4320 gccaatgaaa atgcattaaa acctcctcaa acaatgacaa ccatcactgg cttggagcca 4380 tacaccaagt atgagttcag agtcttagct gtgaatatgg ctggaagtgt gtcttctgcc 4440 tgggtctcag aaagaacggg agaatcagca cctgtattca tgatccctcc ttcagtcttt 4500 cccctctctt cgtactctct caatatctcc tgggagaagc cagcagataa tgttacaaga 4560 ggaaaagttg tggggtatga catcaatatg ctttctgaac aatcacctca acagtctatt 4620 cccatggcgt tttcacagct gttgcacact gctaaatccc aagaactatc ttacactgta 4680 gaaggactga aaccttatag gatatatgag tttactatta ctctctgcaa ttcagttggt 4740 tgtgtgacca gtgcttcggg agcaggacaa actttagcag cagcaccagc acaactgagg 4800 ccacctctgg ttaaaggaat caacagcaca acaatccatc ttaagtggtt tccacctgaa 4860 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agagaagaac tctaagatgt tgctttgcta 18240 ctttaagtgg tattgcgtgc caagcctcta ttatacaaac catgcagact cgcctctaga 18300 gattctgatt cggttgatct ggggtgtgtg gctgaggcat cagtactttt taaagcttcc 18360 aggtgttcta atgttgagac ccactgatgt tccacaatct ggaagaaatc atgtacagga 18420 ataatatgct atgcacaggg actatgctcc ttggctcacc ccttctccct tataaacaat 18480 gagcagttct tgatgaacct ctttaaattt aaatctcctg actcacattt taccaattgt 18540 acatgccaca ttctcagctt acgaactacc atgttttgtt attcttaata tcaactgttt 18600 ggtaagagta cagttgtttt tatacactct aagaaatgtg tttataatct actgtaattt 18660 ccactaaatg gaacccaaat attaatgtta tggtaccata tactgatgta aaaatcatgc 18720 tggcatccat gaacacaccg gtaaataaaa catagtccaa gtggaagaat tcattaataa 18780 ggaactttta attatgtcac aaatgaatag ttggtttcca atgcacaaat atcatgtaaa 18840 ctaatctaaa gatggtttgc ttaataaata tttgaatgtg acc 18883 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 2 aggtgaagtt tgccaaatgg t 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 3 gcacatgtgt gtatttgcag gt 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foward primer <400> 4 tgcaaaccat ttactgtgcg a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 5 acaccactgt aactgcacaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 6 tgctgactgt tacagctggg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 7 gccacttgca tcaaatcccc 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 8 cggctgagtt ttatctaaag tatcc 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 9 acctgggacc atttgtgacc 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 10 ctgagagtaa ggctgcaggt g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 11 ctccatcaga agtcagccct c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 12 tccaaatgaa gccctaagcc a 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 13 tgttctcatt gatagcacct gt 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 14 ggggatttga tgcaagtggc 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 15 tccacgcata tatcacacgc a 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 16 ccagggtaca ttcctaagtc tgc 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 17 actaccctgg tgactctccc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 18 ggttagcctc tcttggtccc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 19 gtgttaatgg cgatgctggg 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 20 acactgaacc ccttttccca g 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 21 tcaaatgcag tcatttttct gct 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 22 ccgtagagca actgagaaca g 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 23 caggaaaagc ccccagtagc 20 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 24 ccaggagacc gactatgtct tt 22 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 25 tgtgcatggc cttaccacaa t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 26 ggcatgctct gtcagaagac t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 27 ctgccagccc ctcattaatc t 21 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 28 aaataaagac gtcccttctt caact 25 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 29 acaaaacccc agcactgatt tg 22 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 30 gtgcttgcaa tgtcctcacc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 31 gcttcgaggg aaaagcttgg 20

Claims (6)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 USH2A(usherin) 유전자 중에서, 5789번 위치의 염기 G가 C로 치환되는 미스센스 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 망막세포변성증(Retinitis pigmentosa) 진단용 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체
   
2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 USH2A (usherin) 유전자 중에서,
   8096번 위치의 염기 G가 C로 치환되는 미스센스 돌연변이체;
   8650번 위치의 염기 C가 T로 치환되는 종료 돌연변이체;
   10613번 위치의 염기 G가 C로 치환되는 미스센스 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 망막세포변성증(Retinitis pigmentosa) 진단용 USH2A(usherin) 유전자 돌연변이체
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