CN1106202C

CN1106202C - 抗爱滋免疫调节复合剂

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Publication number: CN1106202C
Application number: CN94190166A
Authority: CN
Inventors: 费尔南德·纳贝·托罗索昂
Original assignee: Fernande Nabel Toroso
Current assignee: Fernande Nabel Toroso
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-02-18
Publication date: 2003-04-23
Anticipated expiration: 2014-02-18
Also published as: PT644773E; CA2136870A1; ATE219680T1; ES2179067T3; EP0644773B1; US6503512B1; DK0644773T3; CN1106980A; EP0644773A1; WO1994022462A1; AU6110994A; MXPA94002284A; JPH08500846A; DE69430858T2; CA2136870C; FR2703252B1; DE69430858D1; FR2703252A1

Abstract

非特异性治疗免疫复合剂通过免疫调节起作用，提供调节机体的天然抵御能力。本发明的药物可以使爱滋的P24抗原呈阴性反应。它主要由核糖核酸，微生物膜的特定部分，尤其，氨基酸顺序，氯化钠和抗炎甾类药物按确定的比例组成。根据发明所言，此药物尤其适用于治疗后天免疫缺乏症。

Description

抗爱滋病免疫调节复合剂

本发明涉及抗爱滋病治疗性免疫复合剂，该制剂具有依赖于非特异性抗原的免疫能力。

众所周知，细菌学中的壁表面、膜表面或荚膜表面的抗原(以结合或游离方式溶于培养基)是糖蛋白、多肽或多糖类。

最近大量报道的疫苗皆属于结合于核糖核酸(源于核糖体)，诸如蛋白多糖或多糖类膜物质，以及致病菌的提取物。

这些疫苗利用特异性抗原，适应于确定的特异性，微生物感染。

然而，抗原能力主要取决于微生物细胞的核糖核酸(尤其核糖体)。竞争性免疫细胞直接利用核糖核酸作为活性载体。

为了建立我们新型的免疫复合剂，以便替代细菌血清型抗原，我们将核糖核酸(源于优选核糖体)与存在于III型胶原蛋白中的一个糖蛋白类的氨基酸序列(以共价键结合)偶联(人体中，胶原蛋白近似表示机体的蛋白层；III型被选用于它的氨基酸序列，同时由于它基本上存在于管壁和真皮中)。所形成的分子是双分子，该双分子是由确保与靶标结合的氨基酸功能臂与核糖核酸基因臂偶联而成，所述核糖核酸基因臂相应于由所述功能臂组成编码的描述。

另外，核糖核酸已被应用于非细胞疫苗的制备中(参见，Infect.andImmunity，1，574-82，1970)。这个核糖核酸被相连接的因子所稳定。

在我们的复合剂中，我们利用与用于建立核糖体核糖核酸相同的菌种作为细胞膜部分的稳定剂。

上述膜部分包含了全部的多糖肽物质。另外，此类物质作为其它通用免疫辅助剂已众所周知。

然而，这并不违背需要具有与那些通过提取其核糖体而获得相同微生物的相同膜部分(葡聚糖或多糖蛋白)。

本发明疫苗复合剂的组成

A.所应用的源于核糖体的核糖核酸可以通过提取如下菌种而获得。

如下列举有限的几个菌种：

-Klebsiella pneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)

-Streptococcus(pneumoniae和pyogenes)(肺炎链球菌和化脓链球菌)

-Staphilococcus aureus(金黄色葡萄球菌)

-Serratia marcescens(黏质沙雷氏菌)

-Escherichia coli(埃希氏大肠杆菌)

-Salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)

-Corynebacterium(granulosam，parvum，acnts)；(棒状杆菌)

-Mycobacterium(tuberculosis，smegmatis，chelonei)(结核分枝杆菌，解皂菌状杆菌，龟分枝杆菌)

-Hemophilus influenzae(流感嗜血菌)

-Pneumocoque type II(II型肺炎球菌)

-Rothia dento cariosus

-Bacterium coli(肠细菌)

-Shigella dysentariae(痢疾志贺氏菌)

-Enterococcus(肠道球菌)

-Nocardia(asteroides[星型诺卡氏菌]，brasiliensis，rhodocrans，opaca[不透明诺卡氏菌]，rubra[红色诺卡氏菌])(诺卡氏(放线)菌)

-Bacille de Calmette和Guerin(结核菌苗)

这些核糖核酸的平均分子量介于5.104和108道尔顿之间。

有关此类核糖核酸的制备已有多种工业方法，作为一个例子我们引用发表在“Infect.and Immunity，1，574-82，1970”中有关核糖核酸的提取过程：将所用细菌磨碎后进行分段沉降，其间核糖体蛋白被溶解，而沉淀的核糖核酸用链霉蛋白酶处理，最后再用离子交换色谱纯化。

如果核糖核酸用酶学方法获得，最后的纯化可以用分子筛色谱进行纯化。重点参见如下文献：

-C.EHR SMAN(1972)-Biochimie，54，901

-H.KAGAWA(1972)-J.Biochem.，(1972)，827

-M.SANTER(1973)-J.Bact，116，1304

-NOMURA(1974)-Ribosomes，Ed.Cold Spring Harbor Laboratory

B.所用的细菌细胞膜部分可以通过提取如下菌种而获得，下表给出有限的几个菌种。

1-荚膜多糖

-Klebsiella pneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)

-Streptococcus pneumoniae(肺炎链球菌)

-Hemophilus influenzae(流感嗜血菌)

-Escherichia coli(埃希氏大肠杆菌)

肺炎克雷伯氏菌

-C.ERBING，L.KENNE，B.LINBERG，J.LONNGREN(1976)-Stmctural studies of the capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniaetype I(Carbohydr.Res.，50(1976)115-20).

-W.NIMMICH(1968)-Zur Isolierung und qualitativen Bausteianalyseder K.Angigen von Klebsiellen(Med.Mikrobio.und Immunol.，154，117，131).

-C.RICHARD(1973)-Etude antigenique et biochimique de 500souches de Klebsiella(Ann.Biol.Clin.，1973)

肺炎链球菌

-F.KAUFFMANN和E.LUND(1954)(Int.Bull.Bact.Nomencl.4，125-28)

-FELTON和OTTINGER(J.of Bacteriology，1942 43，94，105)

-M.COLIN，M.D.MACLEOD及同事-Prevention of pneumococcalpneumoniae by immunization with specific capsular polysaccharides(J.Exp.Med.，1945，82，445-64)

-A.R.DOCHEZ和O.T.AVERY-The elaboration of specific solublesubstance by Pneumocococcus during growth(1971)(J.Exp.Med.26，477-93).

-WEST PHAL和LUDERITZ(1952)(Z.Naturf.7B，148)

-C.P.J.GLAUDEMANS和H.P.TREFFERS-An improved preparationof the capsular polysaccharide from Diplococcus pneumoniae(Carbohydr.Res.1967，4，181-84)

流感嗜血菌(多核糖磷酸型荚膜多糖)

-P.ANDERSON及同事(1972)-Immunization of humans withpolyribosephosphate，the capsular antigen of Hemophilus influenzae type B(J.of Clin.Invest.，vol.51，1972，39-44)

-P.ANDERSON及同事(1977)-Isolation of the capsularpolysaccharide from supematant of Hemophilus influenzae type B(Infect.and Immun.，1977，15(2)，472-77).

埃希氏大肠杆菌(荚膜多糖)

-LUDERITZ及同事(1977)-Somatic and capsular antigens of gram-negative bacteria(Compr.Biochem.26 A，105-228)

2-膜脂多糖(LPS)

-Corynebacterium(avidum，bovis，diphteriae，enzymicum，equi，fascians，flaecum，facients，flavidum，fusiforme，granulosum，helvolum，hypertrophicans，insidiosum，liquefaciens，parvum，paurometabolum，pyogenes，rumescens，xerosis)(棒杆菌)

-和les gram-moins(革兰氏阴性菌)

-Klebsiella(pneumoniae和rhinoscleromatis)(肺炎克雷伯氏菌和鼻硬结克雷伯氏菌)

-Salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)

-Serratia(marcescens，corralina，indica，plymuthica，kiluea)(沙雷氏菌)

-Neisseria meningitidis(脑膜炎奈瑟氏球菌)

-Escherichia coli(埃希氏大肠杆菌)

-C.ERBIN及同事(1977)-Strictual studies on the Klebsiella LPS(Carbohydr.Res.，56，377-81).

-C.B.CASTOR及同事(1971)-Characteristics of a highly purifiedpyrogenic LPS of Klebsiella pneumoniae(J.of Pharm.Sci.，60，(10)，1578-80)

-K.FUKUSHI(1964)-Extraction and purification of endotoxin fromEnterobacteriaceae：a comparison of selected methods and sources(J.ofBacteriol.87，(2)，391-400).

-G.A.LIMJUCO-Studies on the chemical composition of LPS fromNeisseria meningitidis group B(J.of Gen.Microbiol.1978，104，187-91).

-G.A.ADAMS(1967)-Extraction of LPS from gram-negative bacteriawith DMSO(Canad.J.Biochem.，45，422-26).

-K.G.JOHNSON(1976)-Improved techniques for the preparation ofbacterial LPS(Canad.J.Microbiol.(22)，29-34).

-Y.B.KIM及同事(1967)-Biologically active endotoxins fromSalmonella mutans(J.of Bacteriol.，94，(5)，1320-26).

3-膜蛋白

-Escherichia coli(埃希氏大肠杆菌)

-Serratia marcesens(黏质沙雷氏菌)

-Streptococcus pyogenes(化脓链球菌)

-Salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)

埃希氏大肠菌

-S.F.STIRM及同事(1967)-Episome，carried surface antigen K 88 ofEscherichia coli(J.of Bacteriol.，93，(2)，731-39).

-S.J.BETZ及同事(1977)-Chemical and biological properties of aprotein rich fraction of bacterial LPS(J.of Immunol.，119，(4)；1475-81).

黏质沙雷氏菌

-W.WOBER(1971)-Studies on the protein moiety of endotoxin fromgram-negative bacteria，characterisation of the protein-moieting isolatedbyacetic acid hydrolysis of endotoxin ofSerratia marcescens.

化脓链球菌

-M.K.WITTNER(1977)-Homologous and heterologous protection ofmice with group-A Streptococcal M protein vaccine(Infect.and Immun.，1977，15，(1)，104-8).

鼠伤寒沙门氏菌

-N.KUUSI及同事(1979)-Immunization with major outer membraneprotein in expetimental salmonellosis of mice(Infect.and Immun.，1979，25，(3)，857-62).

-C.BARBER及同事(1972)-The protective role of proteins fromSalmonella thyphimurium in infection of mice with their natural pathogen(Rev.Immunol.，36，77-81).

-G.DELORD(1979)-Etude d′un antigenevaccinant contenu dans lesumageant de culture de Salmonella thyphimurium，souche M-206，these demedecine de Lyon no.428，1979.

-G.W.GOODMAN(1979)-Characterization of the chemical andphysical properties of a novel B-lymphocyte activator endotoxin protein(Infect.and Immun.，1979，24(3)，685-96).

4-磷壁质和脂磷壁质

链球菌、葡萄球菌和乳杆菌(革兰氏阳性菌)，表面由磷壁质构成，此类物质是由磷酸二酯桥连接的甘油聚合体)。

如下文章阐述获取过程：

-M.M.BURGER(1966)-Teichoic acids：antigenicdeterminants，chainseparation，and their loca-tion in the cell wall(Microbiology 56，910-17).

-K.W.KNOX(1973)-Immunological propertiesof teichoic acids(Bacteriol.Reviews，37，21，215-57).

-G.A.MILLER(1976)-Effects of streptococcal lipoteichoic acid onhost response in mice(Infect.and Immun.，1976，13，(5)，1408-17).

-A.J.WICKEN及同事(1975)-Lipoteichoicacids：a new class ofbacterial antigens(Science，187，1161-67).

不同的可行剂量

核糖核酸

^*FISKE和SUBBAROW-Dosage de phosphore.ChromatographieHPLC sur colonne echangeuse d′ions pour le controle qualitatif(J.Biol.Chem.(1926)，66，375).

蛋白质

^*LOWRY(J.Biol.Chem.(1951)，193，265-75).

己糖

^*T.A.SCOTT-Dosage colorimetr.a l′anthrone(Anal.Chem.(1953)，25，1956-61).

己糖胺

^*L.A.ELSON(Biochem.J(1953)，27，1824-28).

脂多糖

^*J.JANDA和E.WORK(Febs Letters，1971，16(4)，343-45).

C-其它免疫辅助因子，除膜部分之外有：

-III型胶原蛋白

-氯化钠

所用III型胶原蛋白特征如下：

a-如下顺序相连的氨基酸序列(浓度以克/千克表示)：

-天冬氨酸 AA 51.5

-羟基脯氨酸 HP 107.0

-苏氨酸 TH 16.1

-色氨酸 SE 27.8

-谷氨酸 AG 95.9

-脯氨酸 PR 124.0

-甘氨酸 GL 149.0

-丙氨酸 AL 87.9

-缬氨酸 VA 23.3

-蛋氨酸 ME 7.5

-异亮氨酸 IL 14.4

-亮氨酸 LE 27.8

-酪氨酸 TY 6.7

-苯丙氨酸 PA 14.4

-赖氨酸 LY 28.6

-组氨酸 HI 5.5

-精氨酸 AR 73.0

b-性状分析如下：

-颜色浅黄白色

-表观密度 250克/升

-湿度 6％

-10％溶液pH 6.9

-40℃时Engler粘度 2.5

(17.75％溶液)

-脂肪含量 0.9％

-灰分含量 2.2％

-铁+铜+钙含量 462毫克/千克

-重金属弧光发射光谱下未检测出

-元素分析 C 46.80％

H 7.10％

N 14.96％

有关所发明免疫复合剂的组成：由核糖核酸或核糖体核糖核酸片段，膜部分(例如肺炎克雷伯氏菌的蛋白多糖)和III型胶原蛋白相结合，再加上氯化钠和一个抗炎剂，可以通过施用微剂量而不产生任何毒性，而获得一个高水平保护和痊愈作用。

优先选用的剂型是上述成分的注射剂，然而在附有一个药物使用说明情况下，采用其他剂型和/或其他支持剂或可兼容的添加剂也是可行的。免疫复合剂作用机制

具文献报道，上述免疫治疗复合剂具有淋巴激活素的特性，可以固定在巨噬细胞上而抑制病毒在细胞内的生长。

1974-75 A.S.和G.P.YOUMANS证实应用不同的抑制剂可以对核糖核酸的免疫反应起抑制作用。

我们发现所发明的免疫复合剂恰恰对HIV逆转录病毒的复制产生相同的抑制作用。

YOUMANS一直从事于一个只能寄生在细胞内的细菌菌株的研究。

自从1972年VENNEMAN和同事阐述真正的抗原可能是结合在核糖核酸上而作为它的一个辅助因子。他们用核糖体核糖核酸免疫小家鼠，此核糖核酸由苯酚在65℃下提取取鼠伤寒沙门氏菌一菌株的核糖体而获得。免疫三十天后的动物比用活菌株疫苗保护效果更好(减缓的)。

尤其证实了保护作用与注射的核糖核酸量有关。

迄今已知，从肺炎链球菌提取的核糖体核糖核酸可以诱导天然体液的免疫的保护作用，而从肺炎克雷伯氏菌提取的核糖体核糖核酸可以诱导天然细胞免疫的保护作用。

DUSSOURD d′HINTERLAND，FONTANCES及同事(法国里昂军事医学研究中心微生室)进行的初步实验已经表明，注入小鼠和豚鼠活体内的复合剂对肺泡的巨噬细胞可产生作用。

当用致溶血空斑的酸性磷酸酯与小鼠的脾细胞直接接触时重新发现了这一“短暂”效应。

在DUSSOURD d′HINTERLAND对核糖体疫苗进行的免疫学研究中，当此类疫苗在FREUND辅助剂(不完全)或克雷伯氏菌膜蛋白多糖存在下施用于动物体时，它们可以诱导O.F.品系雌性小鼠体内特异性抗体的产生。

对于我们的免疫复合剂过程而言，当体液和细胞免疫被激活以后，紧接着对HIV产生一个非特异性的但又极为重要的作用。由于恰恰是机体本身被激起而抵抗感染细胞(在此情况下，P24抗原血症有时在假完全态下减弱至零)，所以我们可以累积这一作用而产生一个“病毒坏死因子(VNF)。

S.ROSENBERG的治疗过程，尽管与我们的近似，但不完全一致。他将一个可以产生肿瘤坏死因子(TNF)的基因固定在人的脱氧核糖核酸上。此基因在埃希氏大肠杆菌克隆和繁殖后，借助一个病毒载体将其引入我们在肿瘤中遇到的T淋巴细胞(杀手)。

我们认为，在治疗机理中，由于所采用的辅助剂(膜蛋白多糖、III型胶原蛋白、氯化钠的结合体)对核糖核酸(非特异性细菌核糖体)产生调理素作用，产生一个天然克隆。

具体而言，此克隆不仅诱导对抗抗-HIV抗体之个体基因型的免疫作用，而且还产生对抗病毒在CD4分子上的连接部位的抗体。为了减弱或抑制抗CD4自动免疫反应(CD4淋巴起作用)，当用此免疫复合剂治疗时必须使用类皮质激素倍他米松二磷酸盐20-60mg溶液，静脉、肌肉注射。

此作用不仅伴随产生一个内源性干扰素，而且使天然杀伤(NK)细胞活化。

因此，我们的免疫调节复合剂的目标就是当一个病毒感染源带入机体内时，诱导一个免疫反应来阻抑或至少降低(直至可自动防御阈值)感染原的增值。

与其他治疗剂相比，我们的治疗剂的新颖就在于在感染之前减缓或消除已存在的抑制细胞剂而发生作用。

我们的治疗通过细胞和/或体液的防御机制而产生抗爱滋反应。

结论：

我们的治疗复合剂通过定向优化而产生核糖核酸分子，这些分子与病毒蛋白结合，而阻断爱滋逆转录病毒的感染。

免疫复合剂的给药途径：

此免疫复合剂可以口服，但首选方法是肠胃道外给药；或者静脉内直接注射；或者缓慢滴注；或者皮下注射。上述给药途径实验证明是有效的。

日服量和服用次数主要取决于患者的状况。由于复合剂的低毒性，高剂量不具有任何危险。

静脉注射方法，平均每月连续用药一周，此周的每一天同时滴注500毫升无菌溶液。

-0.9％氯化钠

-40微克膜糖部分(肺炎克雷伯氏菌的蛋白多糖)

-22微克核糖核酸(核糖体)：

^*肺炎双球菌 7微克

^*化脓链球菌 7微克

^*肺炎克雷伯氏菌 7微克

^*流感嗜血菌 1微克

-10微克上述III型胶原蛋白

-8毫克倍他米松二磷酸钠(或2毫升注射液)

对于应该采用急救方法的患者，缓慢静脉注射之后，紧接着进行皮下注射治疗。

-40微克膜糖部分(肺炎克雷伯氏蛋白多糖)

-22微克核糖核酸(核糖体)

^*肺炎双球菌 7微克

^*化脓链球菌 7微克

^*肺炎克雷伯氏菌 7微克

^*流感嗜血菌 1微克

-10微克上述III型胶原蛋白

-0.5毫升0.9％氯化钠

-4毫克(倍他米松二磷酸(或1毫升注射液)

此治疗可连续进行几个月，直至血清阳性完全呈阴性反应(即P24抗原＝0)

下述有限的几个病历，用来阐述我们治疗性免疫复合剂的具体效果。实施例1

J.A……先生，65岁，血友病，感染于八年前的一次输血。爱滋病和肝炎(组IV C2)。1991年9月出现严重代偿性失调。住院，虚弱无力，体重减轻，肠代谢失调，鼻窦炎，等，……AZT治疗无效。

1992年9月-接受我们免疫复合剂治疗：静脉注射几个疗程后，于1992年12月再进行皮下注射治疗。

目前，我们证实：

-整体状况良好

-体重增加

-P24抗原血清呈阴性反应实施例2

A.A……夫人，59岁，上述患者配偶，1992年5月出现严重代偿性失调，虚弱无力和体重减轻(组IVA)。

1992年9月-接受我们的免疫复合剂治疗：静脉注射几个疗程后，于1992年12月再进行皮下注射治疗。

目前，我们证明：

-整体状况良好

-增加至原来体重

-P24抗原血清呈阴性反应实施例3

E.C……先生，30岁，感染于六年前的性关系，1988年诊断为爱滋病(组IV C1)。1992年，患者虚弱无力，肺气肿(接受大剂量AZT+Bactrim治疗)。

1992年9月-接受我们的免疫复合剂治疗：只进行皮下注射几个疗程，同时停止所有其他治疗。

目前，我们确认

一整体状况极佳(已可以从事职业性活动)

-P24抗原血清呈阴性反应

根据患者的要求以及他们正在接受的治疗确实无效，应用我们的免疫复合剂已对其中各类患者进行了治疗。

Claims

1、抗爱滋免疫调节复合剂，其含有如下组分：

(a)从至少一种选自于以下组中的细菌提取的核糖核酸：结核菌苗、杆菌、棒状杆菌、肠道球菌、埃希氏杆菌、嗜血菌、克雷伯氏菌、分枝杆菌、诺卡氏菌、肺炎球菌、罗氏菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌；

(b)由至少一种选自于以下组中的细菌制得的糖肽和脂多糖细菌膜部分：棒状杆菌、埃希氏杆菌、嗜血菌、克雷伯氏菌、乳杆菌、奈瑟氏菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、葡萄球菌、链球菌；和

(c)III型胶原蛋白氨基酸。

2、根据权利要求1的免疫调节复合剂，其特征在其是双分子，该双分子是由确保与靶标结合的氨基酸功能臂与核糖核酸基因臂偶联而成，所述核糖核酸基因臂相应于所述功能臂组成的编码信息。

3、根据权利要求1或2的免疫调节复合剂，其特征在于产生抑御病毒结合部位的定向抗体以及产生内源性干扰素。

4、根据权利要求1至3之一的免疫调节复合剂，其特征在于，对于血清阳性的患者，该免疫调节复合剂诱导对抗抗-HIV抗体的个体基因型的抗个体基因型疫苗。

5、根据权利要求1至4之一的免疫调节复合剂，其特征在于，该免疫调节复合剂可以有如下不同的给药途径：滴注、静脉、皮下注射、经皮给药装置，同时，并用氯化钠。

6、根据权利要求1至5之一的免疫调节复合剂，其是用于制造包含该免疫调节复合剂作为药物成分以及至少一种作为免疫抑制剂的皮质激素类抗炎药的组合物。