KR100399499B1

KR100399499B1 - 항종양성반응을자극하기위한구강점막투여용인터페론조성물

Info

Publication number: KR100399499B1
Application number: KR10-1998-0709024A
Authority: KR
Inventors: 마이클 제라드 토베이; 토마스 제임스 카이도
Original assignee: 파마 퍼시픽 프로프라이어테리 리미티드
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 2003-12-18
Also published as: EP0956040B1; NZ332688A; JP3806444B2; AUPN976596A0; AU729514B2; WO1997041883A1; AU2399297A; EP0898478A1; ATE316791T1; JP2000504027A; TW528599B; CN1218409A; BR9709223A; EP0898478A4; ES2260794T3; ZA973988B; JP3806446B2; AR007058A1; BR9709066A; EP0898478B1

Abstract

본 발명은 치료 효과량의 인터페론을 포함하는, 포유동물에서 항종양 반응을 자극하기 위한 구강점막 투여용 인터페론 조성물에 관한 것이다. 인터페론의 상기 치료 효과량은 비경구 투여시 병리학적 반응을 유도하지 않는 양이다.

Description

항종양성 반응을 자극하기 위한 구강점막 투여용 인터페론 조성물{INTERFERON COMPOSITION FOR OROMUCOSAL ADMINISTRATION TO STIMULATE AN ANTINEOPLASTIC RESPONSE}

α-인터페론은 모발상세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저급 림프종 및 피부 T-세포 림프종을 포함하는 다수의 혈액학적 악성 종양, 및 신장 세포암, 흑색종, 카르시노이드 종양 및 후천성 면역결핍증(AIDS)-관련된 카포시 육종과 같은 충실성 종양의 치료에 널리 사용된다(구터만(Gutterman J. U.)의 문헌 ["Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 1994,91:1198-1205] 참조). 항종양 효과는 통상적으로 높은 투여량, 종종 수 천만 단위의 투여량의 인터페론-α(IFN-α)를 비경구적으로 주사하는 경우에 나타난다. 인터페론-α는 인터페론-β 및 인터페론-ω가 또한 포함되는 I형 인터페론이다. 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 국소적 주사 및 병변내주사를 비롯한 다수의 투여 경로가 I형 인터페론의 투여에 통상 사용되지만, 일반적으로 경구 투여 경로는 사용되지 않는데, 이는 인터페론이 단백질로서 단백질분해 효소에 의해 불활성화될 것으로 생각되며, 또한 위장관내에서 그의 천연(native) 형태로는 잘 흡수되지 않기 때문이다. 실제로, 경구 투여후 혈액에서 인터페론을 검출하려는 다수의 연구가 실패하였다(칸텔(Cantell) 및 피핼라(Phyhala)의 문헌 ["J. Gen. Virol." 1973,20:97-104]; 윌스(Wills) 등의 문헌 ["J. IFN Res.", 1984,4:399-409]; 길슨(Gilson) 등의 문헌 ["J. IFN Res.", 1985,5:403-408] 참조).

다수의 증상들, 특히 인플루엔자의 치료시 비측 스프레이 또는 경구 투여용 액체 제형으로서 적은 투여량으로 투여된 인터페론의 효능에 대한 일화가 많이 보고되어 왔다. 일련의 특허원에는 소의 감염성 비기관염("선적 열병")의 치료, 고양이의 백혈병 치료 및 또한 기타 증상들의 치료를 위해; 백신의 효능 향상을 위해; 식품 이용 효율의 개선을 위해; 그리고 소의 타일레리아증(theileriosis)의 방지를 위해, 이종성 기원의 인터페론을 적은 투여량으로 경구 투여하여 사용함이 기재되어 있다. 미국 특허 제 4,462,985 호, 오스트레일리아 특허 제 608519 호, 오스트레일리아 특허 제 583332 호 및 미국 특허 제 5,215,741 호를 각각 참조한다. 또한, 미국 특허 제 5,017,371 호에는 암의 화학 치료법 또는 방사선 치료법의 부작용을 치료하기 위해 상기 방식으로 인터페론을 사용함이 개시되어 있다. 이들 특허 명세서에서 사용된 인터페론은 인산염-완충된 식염수에 용해되어 체중 1파운드당 0.01 내지 5 국제 단위(IU)의 투여량으로 투여된, 칸텔의 방법에 의해 제조된인간 인터페론-α였다. 이들 명세서에는 구강인두 점막에, 바람직하게는 구강점막과 장기간 접촉되도록 채택된 형태로 투여된 이러한 적은 투여량의 인터페론이 암을 비롯한 매우 다양한 증상의 치료에 효과적일 수 있는 것으로 제안되어 있는데, 선적 열병, 고양이 백혈병, 개의 파라보바이러스증 및 타일레리아증 이외의 기타 증상에 대한 실험적 증거는 대부분 일화에 불과하다. 특히, 인간 암을 위한 임의의 동물 모델에서 이러한 치료가 적절하게 조절되어 시도된 적도 없다.

대조적으로, 본원에 개시된 발명은 종양성 질환을 치료하기 위해 구강점막으로 투여된 인터페론의 효능을 측정하기 위한 동물 모델에서 최초로 조절되어 수행된 실험을 기초로 하고 있다.

발명의 요약

본 발명은 치료 효과량의 인터페론을 구강점막 접촉을 통해 포유동물에게 투여함으로써 포유동물에서 종양성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 인터페론의 투여량은 비경구적으로 투여될 때 병리학적 반응을 유도하지 않는 양이다. 특히, 본 발명은 다발성 골수종, 모발상 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저급 림프종, 피부 T세포 림프종, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 카포시 육종을 비롯한 육종, 신장 종양, 암종(예를 들어, 신장 세포암, 간 세포암, 비인두 암종), 혈액학적 악성 종양, 결장직장암, 신경 교아 세포종, 후두 유두종, 폐암, 결장암, 악성 흑색종, 및 악성 뇌종양을 비롯한 뇌종양을 치료하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 이 방법은 비-바이러스성 병인의 종양을 치료하는데 일반적으로 적용될 수 있다.

구강점막 투여는 효과량의 인터페론이 단일 투여량으로 투여되거나, 또는 단일 투여량으로 투여되는 경우의 숙주 방어 자극과 동등한 숙주 방어 자극을 유도하기에 충분하도록 일정 시간에 걸쳐 보다 적은 투여량으로 나뉘어 다수회 투여됨을 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 효과량의 인터페론을 단일 투여량으로 투여되는 경우의 숙주 방어 자극과 동등한 숙주 방어 자극을 유도하기에 충분하도록 일정 시간에 걸쳐 연속적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 방법은 약 1500 IU, 바람직하게는 5000 IU 내지 약 20 ×10⁶IU, 더욱 바람직하게는 약 1 ×10⁴IU 내지 약 20 ×10⁶IU, 가장 바람직하게는 약 1 ×10⁴IU 내지 약 1 ×10⁶IU의 인터페론을 투여함으로써 실행할 수 있으나, 단 선택된 투여량은 본원에서 정의한 바와 같이 비경구 투여시 병리학적 반응을 유도하지 않는 투여량이거나, 또는 비경구 투여시 병리학적 반응을 유도하는 양보다 적은 양이어야 한다. 이러한 투여량 범위는 일반적으로 인간에서 동종 인터페론-α에 대한 것이다. 또다른 유형의 인터페론의 경우, 병리학적 반응을 유도하는 투여량은 인간에서 동종 인터페론-α에 의해 유도된 양과 상이할 수 있다. 특정 유형의 인터페론으로 환자를 치료하는 의사는 치료할 환자에게 적합한 투여량 범위를 쉽게 결정할 수 있을 것이다.

또다른 양태에서, 본 발명은 치료 효과량의 하나 이상의 인터페론을 포함하는 구강점막 투여용 약제학적 조성물을 제공한다. 이 조성물은 용액, 정제, 로젠지(lozenge), 겔, 시럽, 페이스트, 또는 제어-방출성 구강점막 전달 시스템으로서제공될 수 있다. 선택적으로, 이 조성물은 완충제, 안정화제, 농후제, 흡수제 및 증점제 등을 함유할 수 있다.

한 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 약 1500 IU, 바람직하게는 5000 IU 내지 약 20 ×10⁶IU, 더욱 바람직하게는 약 1 ×10⁴IU 내지 약 20 ×10⁶IU, 가장 바람직하게는 약 1 ×10⁴IU 내지 약 1 ×10⁶IU의 인터페론을 포함하는 단위 투여형으로 제공된다.

본 발명의 방법은 유일한 치료 방법으로 단독으로 수행되거나 또는 방사선 치료법 또는 화학 치료법에 대한 보조 방법으로 수행되거나, 또는 인터류킨-2, 12 또는 15 등의 기타 사이토킨, 또는 IFN-유도물질과 함께 수행될 수 있다.

본 발명의 방법은 인터페론-α, β, γ, ω 및 콘센서스(consensus) 인터페론으로 구성된 군에서 선택된 I형 또는 II형 IFN을 사용하여 수행되고, 가장 바람직하게는 재조합 IFN-α를 사용하여 수행된다.

본 발명은 인터페론을 구강점막을 통해 투여함으로써 숙주 포유동물에서 항종양성 반응을 자극하기 위한 구강점막 투여용 인터페론 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 조성물은 종양성 질환을 치료하는 방법에 적용될 수 있다.

본 발명은 단지 참고할 목적으로 하기 정의 및 실시예를 사용하여 상세히 기술될 것이다. 본원에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본원에 참고로 명백히 인용되어 있다.

정 의

본원에서 "인터페론"이란 통상 α, β, γ 및 ω, 및 이들의 혼합물(콘센서스 서열을 포함함)로 통상 표시되는 인터페론을 포함하는 I형 또는 II형 인터페론을 지칭한다. 인터페론은 다양한 상업적인 출처로부터 입수할 수 있으며, 수많은 증상들의 치료에의 사용이 인가되어 있다. 인터페론은 천연 원료로부터 얻어질 수 있지만, 재조합 생성물이 바람직하다. 본 발명에 있어서, "인터페론"이란 용어는 인터페론 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 이들의 단편, 및 인터페론의 생물학적 활성의 성질에는 영향을 주지 않으면서 안정성을 향상시키기 위한 이유 등으로 서열을 변형시킨 인터페론의 키메라 또는 돌연변이 형태(예컨대, 미국 특허 제 5,582,824 호, 제 5,593,667 호 및 제 5,594,107 호에 개시된 형태)를 또한 포함한다.

선택적으로, 인터페론은 인터페론의 합성 및 방출을 유도하는 유도물질과 공동으로 투여될 수 있다. 유도물질은 인터페론과 함께 투여되거나, 또는 별도로 투여될 수 있다. 인터페론의 유도물질에는, 예컨대 폴리 I:C 등의 폴리뉴클레오티드가 포함되고, 바람직하게는 경구적으로 투여가능한 저분자량의 인터페론 유도물질이 사용된다. 적합한 유도물질은 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 틸로론(Tilorone)(미국 특허 제 3,592,819 호; 알브레츠트(Albrecht) 등의 문헌 ["J. Med. Chem.", 1974,17:1150-1156]) 및 퀴놀론 유도체인 이미퀴모드(Imiquimod)(새비지(Savage) 등의 문헌 ["Brit. J. Cancer", 1996,74:1482-1486])가 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은 선택적으로 특정 증상에 대한 하나 이상의 다른 치료제 및 치료 방법과 함께 사용될 수 있고, 담당의사 또는 수의사는 그 상황에적절할 수 있는 다른 치료제 및 치료 방법을 쉽게 선택할 수 있을 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 인터페론의 투여 단계를 포함하는, 포유동물에서 종양성 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 종양성 증상은 전이성 암일 수 있다.

본 발명의 방법은 다른 제제와의 공동 치료 방법으로 사용되지 않고 단독으로 사용될 수 있으며, 본 발명의 이러한 양태는 특히 하기의 경우에 유용할 것으로 생각된다:

a) 표준 프로토콜(protocol)에 의해 제공되는 수술, 화학 치료법 또는 방사선 치료법 이후의 보조 치료법으로서 이용된다;

b) 인터페론-감수성 종양 형성의 치료를 위해, 본 발명의 방법은 단독으로, 또는 통상의 화학 치료법 또는 방사선 치료법과 함께 이용된다.

c) 인터페론-내성 종양 형성의 치료를 위해, 본 발명의 방법은 단독으로, 또는 가장 바람직하게는 통상의 화학 치료법 또는 방사선 치료법과 함께 이용된다.

상기 방법은 질환의 완화를 유도하고/하거나 유지하는 것이다. "다른 치료와 함께"란 인터페론이 방사선 치료법 또는 다른 화학 치료법을 사용하기 전, 그 동안 및/또는 그 후에 투여됨을 의미한다. 가장 적합한 프로토콜은 후술되는 바와 같이 다양한 인자에 따라 달라진다.

특히, 본 발명의 방법은 바람직하게는 세포증식억제제, 하나 이상의 다른 사이토킨(이는 항암 활성을 갖지만 인터페론과는 상이한 기작을 갖는다), 혈관형성억제제, 및 인터페론의 활성을 강화시키는 제제를 사용하는 화학 치료법들로 구성된군에서 선택된 하나 이상의 다른 치료 방법과 함께 사용될 것이다. 부차적인 사이토킨으로는 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-12(IL-12) 또는 인터류킨-15(IL-15)가 바람직하고; 혈관형성억제제로는 AGM-1470[(클로로아세틸)-카밤산 (3R-(3α,4α(2R^*,3R^*),5β,6β))-5-메톡시-4-(2-메틸-3-(3-메톡시-2-부테닐)옥시라닐)-1-옥사스피로(2.5)옥트-6-일에스테르]이 바람직하고; 인터페론-강화 치료법 또는 치료제로는 온열요법 또는 아르기닌 부티레이트가 바람직하다.

인터페론과 함께 투여될 수 있는 바람직한 세포증식억제제로는 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 카르무스틴(BCNU; N,N-비스(2-클로로에틸)-N-니트로소우레아), 메토트렉세이트, 아드리아마이신, α-디플루오로메틸오르니틴 및 5-플루오로우라실이 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 영향을 받는 종양성 증상으로는 높은 투여량의 IFN-α의 비경구 투여에 반응하는 암, 예컨대 혈액학적 악성 종양(예컨대, 다발성 골수종, 모발상세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저급 림프종 또는 피부 T세포 림프종), 및 충실성 종양(예컨대, 신장 세포암, 흑색종, 카르시노이드 종양 또는 AIDS-관련된 카포시 육종), 특히 비바이러스성 병인의 종양이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물의 제조에 있어서, IFN를 위한 다양한 비히클 및 부형제가 사용될 수 있고, 이는 당해 분야의 숙련자에게는 자명할 것이다. 대표적인 제형 기법은 특히 문헌 [레밍턴(Remington), "The Science and Practice ofPharmacy", 제 19 판, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995] 및 그의 선행판에 교시되어 있다. IFN 제형은 미국 특허 제 4,496,537 호에 기술된 바와 같이 글리신 또는 알라닌 등의 안정성 증진제, 및/또는 담체 단백질 등의 하나 이상의 담체를 포함할 수 있다. 예컨대, 인체 치료시 통상적으로 약제학적 등급의 인간 혈청 알부민이 선택적으로 희석제로서 인산염-완충된 식염수와 함께 사용된다. IFN용 부형제가 인간 혈청 알부민인 경우, 인간 혈청 알부민은 인간 혈청으로부터 유래하거나, 또는 재조합체 기원일 수 있다. 혈청 알부민이 사용될 때, 이는 정상적으로는 동종 기원일 것이다.

IFN은 수용자의 구강점막 공동과 IFN의 접촉을 제공하는 임의의 수단에 의해 투여된다. 따라서, 본 발명이 임의의 특정 유형의 제형으로 한정되지 않음을 분명히 이해할 것이다. 본 명세서에는 구강점막 공동내로 IFN을 깊이 투여함이 기재되어 있으며; 이는 액체, 고체 또는 에어로졸(aerosol) 뿐만 아니라 비측 점적제 또는 스프레이로 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 액체, 스프레이, 시럽, 로젠지, 협측(頰側) 정제 및 분무 제형을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 당해 분야의 숙련가라면 에어로졸 또는 분무 제형의 경우, 제제의 입자 크기가 중요할 수 있음을 인식할 것이고, 이러한 입자 크기를 변형시킬 수 있는 적합한 방법을 잘 알 것이다.

한 양태에서, 인터페론은 1일 단일 투여량으로 투여된다. 다르게는, 인터페론은 보다 많은 단일 투여량의 투여에서 수득되는 효과와 동등한 순수 효과가 수득되도록 보다 적은 투여량으로 나뉘어 일정 시간에 걸쳐 다수회 투여된다. 상기 전달 방식에 대한 하나의 접근 방안은 구강점막 공동에 부착되거나 이에 이식되어, 높은 단일 투여량에 상응하는 양으로 일정 기간에 걸쳐 인터페론을 방출하도록 고안된 서방성 장치 또는 제어-방출성 장치를 사용하는 것이다.

구강점막으로 투여하기 위한 인터페론의 대표적인 제형은 다음과 같다(모든 %는 중량/중량이다):

(1) 정제: 인터페론 정제는 덱스트로즈 BP 45%; 젤라틴 BP 30%; 밀 전분 BP 11%; 카멜로즈 나트륨 BP 5%; 달걀 알부민 BPC 4%; 류신 USP 3%; 프로필렌 글리콜 BP 2%; 및 1 ×10⁶IU IFN-α2를 포함한다. 이러한 정제는 그대로 사용되어 구강내에서 천천히 용해되거나, 또는 물에 용해된 후 필요에 따라 구강내에 보유되어 구강점막과 접촉될 수 있다.

(2) 페이스트: 인터페론 페이스트는, 미국 특허 제 4,675,184 호에 기재된 바와 같이, 글리신 45%; 나트륨 CMC 2%; 시트레이트 완충액(pH 4.5) 25%; 100%가 되도록 하는 양의 증류수; 및 1 ×10⁶IU의 IFN-α2로 제조될 수 있다. 이러한 인터페론 페이스트는 구강내 협측 점막에 부착될 수 있다.

(3) 가글(gargle) 또는 시럽: 가글 또는 시럽은 원하는 양의 인터페론을 시판되는 구강세척액 또는 기침약 시럽 제형에 첨가함으로써 제조될 수 있다.

전술한 특정 투여량 범위내에서, 임의의 개별적인 경우에서의 최적 치료법은 관련된 증상 특성, 질환 단계, 이전의 치료법, 지속적으로 받고 있는 다른 치료법, 포유동물의 일반적인 건강 상태, 인터페론에 대한 개체의 감수성 등에 따라 달라질것이고, 따라서 의사 또는 수의사는 이러한 모든 상황을 염두에 두고 최적 치료법을 결정할 것이다. 치료 기간은 물론 치료될 증상에 따라 달라질 것이고, 예컨대 전립선암 등의 천천히 성장하는 암의 치료는 간 세포암 등의 급속하게 성장하는 암의 치료와는 상이한 치료 경로를 포함할 것으로 예상된다.

본원에 개시된 효과적인 투여량은 비경구적으로 투여될 때 포유동물에서 병리학적 반응을 발생시키지 않는 투여량이다. 병리학적 반응은 급성, 만성 또는 누적성일 수 있고, 예컨대 백혈구 감소증, 골수 기능억제 등의 혈액 화학적 변화나, 또는 기타 조직학적 변수에 의해 나타날 수 있다. 본원에서, 병리학적 반응으로는 발열, 권태감 또는 독감-유사 증후군 등의 부작용, 정맥염과 같은 혈관 반응, 및 주사 부위에서의 국부적 염증 반응이 포함된다. 이러한 반응은 인터페론에 대한 감수성이 개별적으로 차이가 있으므로 환자들 사이에서 상당히 다를 것이다. 투여할 인터페론의 양이 구강점막으로 투여할 수 있는 인터페론의 허용가능한 적은 투여량인지를 확인하기 위한 간단한 시험으로는 환자의 연령, 체중, 증후, 진행도 등을 고려하여 추정되는 허용가능한 투여량을 환자에게 주사한 후, 주사에 의해 본원에 정의된 바와 같은 병리학적 반응이 유도되었는지를 확인하는 것이다. 이때, 가장 쉽게 확인가능한 기준은 주사 부위에서의 국부 자극이다. 불리한 반응이 확인되지 않았다면, 이어서 동일한 투여량을 구강점막을 통해 투여할 수 있다. 만약 불리한 반응이 나타났다면, 병리학적 반응이 확인되지 않을 때까지 더 적은 투여량으로 이 과정을 반복한다.

많은 환자의 경우, 구강점막 투여량은 기존의 승인된 비경구적 프로토콜에서효과적이고도 내약성인 것으로 공지된 투여량과 대략 같을 것이다. 따라서, 특정하자면, 인터페론의 허용가능한 적은 투여량은 비경구 투여할 때 병리학적 반응을 유도하지 않는 한, 1일당 약 1500 IU, 바람직하게는 5000 IU 내지 약 20 ×10⁶IU일 수 있다. 더욱 바람직하게는 1일당 인터페론 약 1 ×10⁴IU 내지 약 20 ×10⁶IU의 투여량, 가장 바람직하게는 약 1 ×10⁴IU 내지 약 1 ×10⁶IU의 투여량이다. 한 양태에서, 총 투여량은 일정 시간에 걸쳐 보다 적은 투여량으로 수회 투여되거나, 또는 구강점막에 부착되거나 이에 이식된 제어-방출성 장치로부터 연속적으로 또는 박동적으로 전달될 수 있다.

인터페론 및 인터페론 제형

마우스 IFN-α/β

마우스 IFN-α/β(Mu IFN-α/β)를 이미 기재된 바와 같이 뉴캐슬(Newcastle) 질환 바이러스(NDV)에 의해 유도된 C243-3 세포의 배양물로부터 제조하고 정제하였다(토베이(Tovey) 등의 문헌 ["Proc. Soc. Exp. Biol. and Med.", 1974,146:809-815]). 이 연구에서 사용된 제제는, 이미 기재된 바와 같이(토베이 등의 문헌 ["Proc. Soc. Exp. Biol. and Med.", 1974,146:809-815]) 소포성 구내염 바이러스(VSV)로 항원투여된 마우스 929 세포에서 측정시 4 ×10⁶국제 단위(IU)/㎖의 역가 및 단백질 1㎎당 5 ×10⁷IU의 비활성을 가졌다. 상기 제제는 국립위생연구소(NIH)의 마우스 IFN-α/β의 국제 기준 제제(G-002-9004-5411)에대해 표준화되었다.

인간 IFN-α1-8

재조합 인간 IFN-α 1-8[Hu IFN-α 1-8; BDBB 제품 번호: CGP 35269-1, 스위스 바젤 소재의 시바 가이기(Ciba-Geigy) 제품]을 이전에 기재된 바와 같이 제조하고 정제하였다[마이스터(Meister) 등의 문헌 ["J. Gen. Virol.", 1986,67:1633-1643]). 이 연구에서 사용된 제제는, 이미 기재된 바와 같이(토베이 등의 문헌 ["Nature", 1977,267:455-457]) VSV로 항원투여된 동종 인간 WISH 세포에서 70 ×10⁶IU/㎖의 역가를 가졌고, 이종 마우스 L929 세포에서 1 ×10⁶IU/㎖의 역가를 가졌다. 상기 제제는 NIH 인간 IFN-α 국제 기준 제제(G-023-901-527) 및 NIH 마우스 IFN-α/β 표준(G-002-9004-5411) 둘다에 대해 표준화되었다. IFN 제제의 비활성은 단백질 1mg당 2 ×10⁸IU였다.

재조합 마우스 인터페론-α

재조합 마우스 인터페론-α는 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(Life Technologies Inc.)로부터 구입하였다. 이 연구에서 사용된 제제(제품 번호: HKK 404)는 VSV로 항원투여된 마우스 L929 세포에서 측정시 6 ×10⁶IU/㎖의 역가 및 단백질 1mg당 6 ×10⁸IU의 비활성을 가졌다(토베이 등의 문헌 ["Proc. Soc. Exp. Biol Med.", 1974,146:406-415]).

재조합 마우스 인터페론-β

재조합 마우스 인터페론-β는 알 앤드 디 시스템즈 인코포레이티드(R&D Systems Inc.)로부터 구입하였다. 이 연구에서 사용된 제제(제품 번호: 1976-01S)는 VSV로 항원투여된 마우스 L929 세포에서 측정시 3.2 ×10⁴IU/㎖의 역가 및 단백질 1mg당 8 ×10⁶IU의 비활성을 가졌다(토베이 등의 문헌 ["Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", 1974,146:406-415]).

재조합 마우스 인터페론-γ

재조합 마우스 인터페론-γ는 알 앤드 디 시스템즈 인코포레이티드로부터 구입하였다. 이 연구에서 사용된 제제(제품 번호: 2580-03SA)는 VSV로 항원투여된 마우스 L929 세포에서 측정시 2 ×10⁵IU/㎖의 역가 및 단백질 1mg당 1 ×10⁷IU의 비활성을 가졌다(토베이 등의 문헌 ["Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", 1974,146:406-415]).

모든 인터페론 제제는 동일한 분석 방법에서 동시에 역가를 측정하였고, 미국의 국립위생연구소의 마우스 인터페론 α/β의 국제 기준 제제(G-002-9004-5411)에 대해 표준화되었다.

마우스 인터페론 α/β 및 재조합 마우스 인터페론 둘다는 투여 전에 페리뮨(Ferimmune, 상표명) 부형제에 용해시켰다.

부형제

인터페론 제제는 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 인산염-완충된 식염수(PBS)내에서 희석되었다. 소혈청 알부민 분획 V(RIA 등급; 면역글로불린이 없음; 목록번호 A7888; 미국의 시그마(Sigma) 제품)를 PBS(pH 7.4) 1㎖당 100㎍의 최종 농도로 용해시키고, 여과하여 멸균시켰다(0.2μ, 밀렉스(Millex)-GV, 미국의 밀리포어(Millipore) 제품 사용).

본원에 기재된 실험에서, 인터페론 제제는 시판중인 부형제내에 희석되었다. 사용된 부형제는 하기와 같이 정제 형태로 공급되었다(페리뮨, 파마 퍼시픽(Pharma Pacific) 제품):

	중량/중량%	mg/정제
덱스트로즈(글루코즈)BP^**	44.67^***	55.84
젤라틴 BP^**	30.06	37.58
밀 전분 BP^**	11.31	14.14
카멜로즈 나트륨 BP^**	4.96	6.20
달걀 알부민 BPC^**	4.03	5.04
류신 USP	3.00	3.75
프로필렌 글리콜 BP	1.88	2.35
덱스트란 40^**(덱스트란 40 주사 BP로서)	0.06	0.08
인산나트륨 BP	0.03	0.04
염화나트륨 BP	0.01	0.01
인산나트륨 산 BP	0.01	0.01
총계	100.02	125.04
무수물을 기준으로 계산됨* 하기로부터 유도됨:덱스트로즈(글루코즈) BP (무수물) 44.64%글루코즈 BP(덱스트란 40 주사 BP로서) 0.03%

단일 정제를 1.5㎖ 인산염-완충된 식염수에 용해시키고, 16,000g에서 15분 동안 원심분리한 후, 이어 멸균 여과(0.2μ, 밀렉스-GV, 미국의 밀리포어 제품)하고, 사용 전에 4℃에서 보관하였다. 부형제는 매일 사용 전에 제조하였다.

인터페론 전달 시스템

예비 실험으로부터, P20 에펜도르프 마이크로피펫(Eppendorf micropipette)을 사용하여 다 자란 정상 마우스의 각각의 외비공(外鼻孔)에 크리스탈 바이올렛 5㎕를 투여한 결과 구강인두 공동의 전체 표면에 걸쳐 염료가 거의 즉시 분포함을 알 수 있었다. 구강인두 공동의 염색은 염료를 적용한 후 거의 30분째에도 분명하였다. 동일한 방식으로¹²⁵I-표지된 재조합 인간 IFN-α 1-8을 투여하여 본질적으로 유사한 결과를 얻었다. 따라서, 이러한 투여 방법을 모든 후속적인 실험에서 사용하였다.

본원에 기재된 동물 실험에 있어서, IFN의 투여 경로에 관한 "구강점막" 또는 "구강인두" 또는 "비측내/구강내" 또는 "비측내 및 구강내"란 표현은, IFN 제제가 투여받을 포유동물의 구강점막 공동, 즉 구강 및 인후내로 신속하게 분포되어 구강점막 공동을 둘러싼 점막과 접촉되도록 IFN 제제를 비측 공동내로 깊게 투여함을 의미하는 것으로 분명히 이해될 것이다.

프렌드(friend) 적백혈병 세포

프렌드 적백혈병 세포(FLC)의 IFN-α/β-내성 클론인 3Cl8을 로마의 아파브리스(E. Affabris) 박사로부터 얻었고, 이는 아파브리스 등의 문헌 ["Virology",120:441-452(1982)]에 상세히 기재되어 있다. 이후, 이들 세포를 생체내에서 계대접종하여 보유하였다. 간단히, DBA/2 마우스에 3Cl8 세포를 약 100의 50% 치사량(LD₅₀)으로 복강내 주사하여 접종하고, 1주 후 종양 세포를 마우스의 복막으로부터 수거하여, 계수한 후, 다른 마우스에 다시 3Cl8 세포를 100의 LD₅₀으로 접종시켰다. 이러한 계대접종 절차를 60 내지 100회 반복하였다. 60번째 내지 100번째 계대접종에 사용된 3Cl8 세포는 간 및 비장에 매우 전이성이 높은 것으로 나타났다(그리서(Gresser) 등의 문헌 ["Int. J. Cancer", 1987,39:789-792]). IFN 내성의 표현형은 IFN-α/β의 존재하에 생체내 계대접종된 세포를 시험관내에서 배양함으로써 통상적으로 확인되었다(벨라르델리(Belardelli) 등의 문헌 ["Int. J. Cancer", 1982,30:813-820]).

본 발명의 인터페론 조성물은 또한 본 발명자들의 실험실에서 단리된 L1210 림프종 세포의 L1210R6 클론(그리서 등의 문헌 [Interferon and cell division. IX. Interferon-resistant L1210 cells: Characteristics and Origin., "J. Nat. Cancer Inst.", 1974,52:553-559]) 및 화학 발암물질인 1,2-디메틸 벤즈안트레인을 접종한 마우스로부터 유도된 EL4 이식가능한 종양(고러(Gorer, P.A.)의 문헌 ["Br. J. Cancer", 1950,4:372-381])에 대해서도 활성이 있다.

동 물

본 연구에 사용된 마우스는 특정 병원체가 없는 콜로니로부터 수득되었다[프랑스의 이파 크레도(IFFA CREDO) 제품]. 이들은 EEC 표준 방법에 따라 빌레주이프 소재의 인스티튜트 페데라티프 CNRS(Institut Federatif CNRS)에서 특정 병원체가 없는 동물 사육 장치내에서 사육되었다.

인터페론의 생물학적 분석

인터페론은 통상의 방법에 따라 분석되었다. 간단히, 샘플(20㎕)을 2% 열-불활성화된 송아지 태아 혈청(FCS)(프랑스의 기브코(Gibco) 제품)이 함유된 이글의 최소 필수 배지(Eagle's Minimal Essential Medium; MEM)(프랑스의 기브코 제품) 80㎕내에 희석시키고, 다중채널 마이크로피펫(랩시스템(Labsystem)의핀피펫(Finnpipette), 50-300㎕)을 사용하여 마이크로적정 플레이트(팔콘(Falcon) 제품, 목록 번호: 3072)의 각 웰에 첨가하였다. WISH 또는 L929 세포(2 ×10⁴세포수/웰)를 2% FCS가 함유된 MEM 배지 100㎕에 첨가하고, 공기중 5% CO₂분위기하에 37℃에서 하룻밤 배양하였다(포마(Forma) 3029 CO₂항온 배양기). 이어, 10배 대물렌즈가 구비된 올림푸스(Olympus) IM GLDW 도립 현미경을 사용하여 세포를 임의의 독성 표시에 대해 검사하였다. 이어, 검출가능한 독성을 나타내지 않은 샘플을, 2% FCS가 함유된 이글의 MEM 배지에서 200㎕의 총 체적로 초기에 1:10의 희석배율로부터 출발하여 희석시킨 후, 희석된 물질 100㎕를 다중채널 마이크로피펫으로 2% FCS가 함유된 신선한 이글의 MEM 배지 100㎕를 각 웰당 함유한 마이크로플레이트에 넣음으로써, 연속으로 2배 희석시켰다. NIH 인간 IFN-α 기준 표준물(G-023-901-527) 또는 NIH Mu IFN-α/β 기준 표준물(G-002-9004-5411)의 적절한 연속적인 2배 희석물을 또한 제조하였다. 이어, 2% FCS가 함유된 이글의 MEM 배지 100㎕중 WISH 또는 L929 세포(2 ×10⁴세포수/웰)를 적절하게 각각의 플레이트에 첨가하고, 공기중 5% CO₂의 분위기하에 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이어, 임의의 독성 표시를 나타내는지에 대해 세포 단층을 검사한 후, 임의의 뚜렷한 독성이 없는 배양물을 흡인하여, VSV의 100 TCID₅₀(WISH 세포의 경우 2 ×10⁴VSV₂₃, 또는 L929 세포의 경우 10^-5VSV₂₃)을 포함한, 2% FCS가 함유된 이글의 MEM 배지 200㎕로 대체하였다.이어 플레이트를 공기중 5% CO₂의 분위기하에 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이어, 올림푸스 IM ULWD 도립 현미경을 사용하여 특정 바이러스성 세포변성 효과에 대하여 세포 단층을 검사하였다. 인터페론 역가는 특정 바이러스성 세포변성 효과에 대해 50% 보호하는 희석치 역수로부터 결정되었고, 이는 국제 기준 단위/㎖(IU/㎖)로 표시된다.

실시예 1

프렌드 적백혈병 세포를 항원투여한 마우스에서 구강점막 투여된 인터페론-α의 항종양 활성

비측내/경구 경로로 투여된 IFN-α가 고도의 전이성 FLC 세포로 항원투여된 마우스의 생존율을 증가시키는지 여부를 확인하기 위해, 6 마리의 7 내지 8주된 수컷 DBA/2 마우스로 이루어진 군에 0일째에 1 ×10⁵FLC를 정맥내로 항원투여했다.

각각의 마우스 군에 10㎕의 BSA-PBS중 복합 마우스 IFN-α 서브타입들의 천연 혼합물(Mu IFN-α) 10⁴IU, 또는 바이러스 유도물질을 포함하지 않음을 제외하고는 IFN 제제와 동일한 방식으로 생산되고 정제된 동일한 체적의 모의 IFN 제제를 비측내/경구 경로로 10일간 연속해서 1일당 2회씩 처리했다. 모의 IFN 제제는 정제된 Mu IFN-α 제제와 비교 분석할 때 검출가능한 IFN 활성을 나타내지 않았다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다:

군	처 리	사망일	평균 사망일± 표준편차
1	모의 Mu IFN-α	9,9,10,10,10,10	9.6±0.2
2	Mu IFN-α10⁴IU	28,31,36〉100〉100	31.7±2.3^**
^**사망한 동물만을 계산함

1일당 2회씩 Mu IFN-α 10⁴IU를 구강점막 투여한 결과, FLC를 주입한 마우스의 생존 시간이 크게 증가하였다. 실제로 5 마리의 마우스중 2 마리는 효과적으로 치료되었는데, 이들은 단지 20일 후에 IFN-α 처리를 중단했음에도 불구하고, FLC 2 ×10⁴LD₅₀을 항원투여한지 100일 후에도 건강하게 생존했다. FLC 2 ×10⁴LD₅₀로 감염되고, 재조합 마우스 IFN-β 10³IU 또는 재조합 마우스 IFN-γ 10³IU로 구강점막 처리된 10 마리의 성숙한 DBA/2 마우스 군에 대한 조절된 시험에서도 유사한 결과가 수득되었다.

실시예 2

프렌드 적백혈병 세포를 주사한 마우스에서 적은 투여량으로 구강점막 투여된 인터페론-α의 항종양 활성에 대한 대규모 시험

실시예 1의 결과를 확인하기 위해, 대규모의 시험을 수행했다. 150 마리의 8주된 암컷 DBA/2 마우스에게 0일째에 1 ×10⁵FLC(2 ×10⁴FLC LD₅₀)를 정맥내로 투여했다. 이들 마우스를 지정된 유형 및 투여량의 IFN으로 처리하고, 10일간 연속해서 1일당 2회씩 10㎕ 체적을 비측내/경구 경로로 투여했다. 각각의 처리 군에는 10마리의 마우스가 할당되었다. 결과를 하기 표 2에 나타냈다:

군	처 리	투여량	부형제	평균 사망일± 표준편차
1	하지 않음	-	없음	9.5±0.2
2	모의 Mu IFN-α	-	BSA/PBS	9.6±0.2
3	Mu IFN-α	10⁴IU	BSA/PBS	29.4±25.6%^*
4	Mu IFN-α	10³IU	BSA/PBS	11.6±0.2
5	Mu IFN-α	10²IU	BSA/PBS	10.3±0.2
6	Hu IFN-α 1-8	10⁴IU	BSA/PBS	18.2±0.8
7	Hu IFN-α 1-8	10³IU	BSA/PBS	13.1±0.8
8	Hu IFN-α 1-8	10²IU	BSA/PBS	11.4±0.5
IU : 국제 단위BSA/PBS : PBS중의 BSA 100㎍/㎖(pH 7.4)Mu IFN-α : 마우스 IFN-α 서브타입의 천연 혼합물Hu IFN-α : 단일 재조합 인간 IFN-α 아이소타입(isotype)^*: 이 군의 동물중 일부가 처리후 100일째에 여전히 생존했다.

비측내/경구 경로로 투여한 IFN-α는 FLC를 정맥내로 항원투여한 마우스에서 현저한 항종양 활성을 나타냈다. 실제로, 4 내지 5개의 FLC 세포가 동물을 사멸시키기에 충분한 시스템에서 100,000개의 FLC를 접종한 후에도 100 일이상 여전히 마우스가 생존해 있기 때문에, IFN-처리된 일부 마우스는 치료된 것으로 간주할 수 있다.

단일 재조합 IFN-α 서브종(IFN-α 1-8), 복합 IFN-α 서브타입들의 천연 혼합물(Mu IFN-α), 재조합 마우스 IFN-β 및 재조합 마우스 IFN-γ의 순수한 제제는 비측내/경구 경로로 투여될 때 상기 모델에서 현저한 항종양 활성을 나타내었으며, 이것은 구강점막 투여된 IFN 제제에서 관측된 항종양 활성이 사실상 이들 제제의IFN 성분에 기인함을 강력히 시사하는 것이다.

실시예 3

항종양 활성에 대한 인터페론의 투여 경로 효과

비측내/경구 경로로 투여된 IFN의 효과를 통상적인 경로로 투여된 IFN의 효과와 비교했다. 8주된 암컷 DBA/2 마우스에 0일째에 1 ×10⁵FLC(2 ×10⁴FLC LD₅₀)를 정맥내로 항원투여했다. 마우스에게 Mu IFN-α 10⁴IU(실시예 2에서 결정한 바와 같은 최적 투여량)를 지정한 경로로 10일간 연속해서 1일당 2회씩 처리했다. 각각의 처리 군에는 6마리의 마우스가 있으며, 각각의 경우에 Mu IFN-α에 대한 부형제는 PBS중 BSA였다. 결과를 하기 표 3에 요약했다:

군	처리	경로	평균 사망일± 표준편차
1	하지 않음		9.6 ± 0.2
2	Mu IFN-α	비측내/경구	30 ± 25.85 %^*
3	Mu IFN-α	경구	18.5 ± 2.0
4	Mu IFN-α	위내	13.5 ±1.3
5	Mu IFN-α	피하	23.5 ± 1.6
6	Mu IFN-α	근육내	23.7 ± 1.8
7	Mu IFN-α	정맥내	25.0 ± 1.2
8	Mu IFN-α	복강내	26.7 ± 4.1
IU : 국제 단위BSA/PBS : PBS중의 BSA 100㎍/㎖(pH 7.4)^*: 이 군의 동물중 일부가 FLC 세포를 접종한후 100일째에 여전히 생존했다.

구강점막(또는 비측내/경구) 투여 경로는 더 효과적이지는 않더라도 적어도 정맥내, 근육내 및 피하 주사와 같은 통상의 비경구 경로 만큼은 효과적이다. 비측내/경구 경로는 사실상 FLC를 정맥내 항원투여한 마우스에서 가장 효과적인 경로로 간주되는 복강내 주사만큼 효과적이었다. 이와는 대조적으로, 동일한 투여량의 IFN을 입으로 직접 투여한 경우는 비측내 투여와 경구 투여를 조합하여 투여한 경우보다 덜 효과적인 것으로 나타났으며, 한편 관을 통해 동물의 위장에 직접 IFN을 도입하는 경우는 상당히 덜 효과적이었다.

실시예 4

세포 단백질 발현에 대한 구강점막으로 투여된 인터페론의 효과

IFN-α는 다수의 세포 단백질을 이들의 세포 표면 수용체에 결합시킨 후 이들의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이들 단백질은 IFN 작용의 유용한 표지를 제공하는 것으로 생각된다.

본 발명자들은 3개의 IFN으로 유도되는 단백질인 MHC 유형 I 항원, Ly 6A/E 항원 및 2', 5'-올리고아데닐레이트 신타제의 발현에 대한, 비측내/경구 경로로 투여된 IFN-α의 효과를 평가했다.

20 IU 만큼 소량의 Mu IFN-α를 복강내로 투여하여 DBA-2 마우스(H-2-K^d)를 처리한 경우 말초 혈액 단핵구 및 과립구 둘다에서 H-2-K^d항원의 발현이 현저히 증가되었으나, 동일 조건하에서 20,000 IU 이하의 Mu IFN-α를 비측내/경구 경로로 투여한 경우에는 말초 혈액 림프구, 단핵구 또는 과립구에서 H-2-K^d의 발현이 크게 증가되지 않았다.

유사하게, 20,000 IU 이하의 IFN-α를 비측내/경구 경로로 투여하여 마우스를 처리한 경우는 Ly6 A/E 항원의 발현에 상당한 효과를 미치지 못했으나, I형 IFN을 비경구 투여한 후에는 다양한 림프양 세포 표면에서 상기 항원의 발현이 현저히 증대되었다(더몬트(Dumont) 등의 문헌 [J. Immunol, 1986,137:201-210] 참조). 200 또는 20,000 IU의 Mu IFN-α 또는 Hu IFN-α 1-8을 비측내/경구 경로로 투여한 경우에도 유사한 결과가 수득되었다.

20 IU 만큼 소량의 Mu IFN-α를 복강내 주입하여 스위스(Swiss) 또는 DBA/2 마우스를 처리하면 말초 혈액 단핵 세포 및 비장세포 둘다에서 2',5'-올리고아데닐레이트 신타제 활성이 현저히 증가되었다. 이와는 대조적으로, 20,000 IU 이하의 Mu IFN-α를 비측내/경구 경로로 투여하여 마우스를 처리하는 동일한 실험에서는 2',5'-올리고아데닐레이트 신타제의 발현이 크게 증가되지 않았다. 또한, 200 또는 20,000 IU의 Mu IFN-α 또는 Hu IFN-α 1-8을 비측내/경구 경로로 투여하여 처리했을 때 IFN 처리를 시작한지 10일까지 시험한 시점중 어느 시점에서도 2',5'-올리고아데닐레이트 신타제 활성에 상당한 영향을 미치지 않았다.

실시예 5

구강점막 투여후 인터페론의 생체이용률

IFN의 생체이용률 및 약동학을 조사하기 위해, 이 연구에 가장 바람직한 약물-혈액 체적비를 갖는 마우스를¹²⁵I로 표지될 수 있는 최고 특이적 방사성까지 표지된 단일 고 투여량의 재조합 IFN-α로 처리했다.

70 ×10⁶IU의 Hu IFN-α 1-8의 순수한 제제를 PBS 1.4㎖에 용해시키고, 헌터(Hunter) 및 그린우드(Greenwood)의 문헌 [Nature, 1962,194:495-496]에 개시된 클로르아민-T 방법의 변형된 방법을 이용하여 모겐센(Mogensen) 등의 문헌 [Int. J. Cancer, 1981,28: 575-582]에 개시된 바와 같이 요오드화시켰다.

¹²⁵I-표지된 Hu IFN-α 1-8(제품 번호 CGP35269-1)은 VSV로 항원투여된 인간 WISH 세포에서 분석했을 때 2 ×10⁷IU/㎖ 및 VSV로 항원투여된 마우스 L929 세포에서 분석했을 때 1 ×10⁶IU/㎖의 생물학적 활성을 나타냈다.

6 내지 7주된 암컷 스위스 마우스에게 2 ×10⁷IU의¹²⁵I Hu IFN-α 1-8(1 ×10⁶마우스 IU에 상응함)을 정맥내 주입하거나, 복강내 주입하거나 또는 비측내/경구 처리했다(1.0369 ×10⁷cpm/마우스). 일정한 시점에서, 군당 3마리의 마우스를 죽이고, 혈액을 수거하여 체적을 측정했다. 신장, 간, 폐, 비장 및 위장/식도를 적출하여, 블롯팅(blotting)하고, ±1.0㎍의 정밀도로 칭량했다. 각 샘플의 방사성을 감마 카운터(gamma counter)를 사용하여 개별 측정했다. 이어서, 원심분리(800 g ×10분, 4℃)로 전혈을 분리하고, 혈청을 수확하고, 계수하여 -80℃에서 동결시켰다. 이어서, 전술한 바와 같은 인간 WISH 세포 및 마우스 L929 세포상에서 표준 생검을 이용하여 혈청의 IFN 함량을 분석했다. 이어서, 혈청 샘플에 존재하는 방사성 물질을 친화성 면역침전법으로 단리하여 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석했다.

¹²⁵I-표지된 Hu IFN-α 1-8을 1.0369 ×10⁷cpm/마우스로 정맥내 거환을 사용하여 주입한지 5분후 동물의 말초 혈액에서 매우 높은 방사성(〉2 ×10⁶cpm/ml)이 검출되었다. 이어서 전혈에 존재하는 방사성의 양은 15분 및 30분후에 점진적으로 감소했다. 1.0369 ×10⁷cpm의¹²⁵I Hu IFN-α 1-8을 복강내 주입한지 5분후 동물의 말초 혈액에서 검출된 방사성의 양은 정맥내 거환을 주입한 후 검출된 양보다 약 20 배 더 적었다. 이어서 방사성의 양은 주입한지 15분 및 30분후에 점진적으로 증가되었다.¹²⁵I IFN-α 1-8을 비측내/경구 투여한지 5, 10 또는 15분후 동물의 혈액에서 검출된 방사성의 양은 동량의 방사성 표지된 IFN을 복강내 주입한 후 일정 시간에 검출된 방사성의 양보다 상당히 적었다. 3가지 투여 경로 모두에서,¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8을 비측내/경구 투여한 후 전혈에서보다 혈청에서 더 많은 양의 방사성이 검출되었다. 동일한 체적의 혈청과 비교하여 전혈 1㎖당 검출된 방사성의 양이 적을수록 전혈의 세포 성분을 제거한 후 계수된 혈청의 체적이 효과적으로 더 크다는 것을 의미한다.

이 실험의 모든 마우스에서 얻은 혈청 샘플에 대해 전술한 바와 같은 표준 생검을 이용하여 생물학적으로 활성인 IFN의 존재에 대해 검사했으며,¹²⁵I Hu IFN-α 1-8을 정맥내 또는 복강내 주입한 모든 동물의 혈청에서는 시험한 모든 시점에서 쉽게 검출가능한 양의 생물학적으로 활성인 IFN이 나타났다. 이와는 대조적으로, IFN을 비측내/경구 투여한 동물의 혈청에서는 비교적 다량의 방사성이 존재함에도 불구하고, 투여한 후 시험한 시점중 어느 시점에서도 이들 동물의 혈청에서 생물학적으로 활성인 IFN은 검출되지 않았다.

¹²⁵I Hu IFN-α 1-8로 치료한 동물의 혈청에서 검출된 방사성 물질이 실제로 천연형 IFN을 나타내는지를 측정하기 위해, 샘플을 단백질 A-G 아가로즈로 면역침전시키고, 샘플에 존재하는 면역글로블린을 침전시키기 위해, 친화성으로 정제된 폴리클론 안티-IFN-α 항체로 처리하고, 더 나아가 면역침전시켰다. 이어서, 샘플을 전술한 바와 같이 SDS-PAGE 에 적용했다.

¹²⁵I Hu IFN-α 1-8을 정맥내 또는 복강내 주입한 후 혈청내의 방사성 물질을 SDS-PAGE 분석한 결과, 비주입된¹²⁵I Hu IFN-α 1-8과 동일한 전기영동 이동성으로 이동하는 단일 균질 띠가 나타났다. 이 물질의 겉보기 분자량은 약 20000 달톤으로 추정되었으며, 이것은 천연형 Hu IFN-α 1-8의 분자량에 정확히 상응한다. 이와는 대조적으로, 동량의 방사성 물질을 각각의 겔에 충진시켰음에도,¹²⁵I IFN-α 1-8로 비측내/경구 처리한 마우스에서 얻은 혈청 샘플중 어느 것도 천연형 IFN과 유사한 겉보기 분자량을 갖는 임의의 물질을 함유하지 않았다.

방사성 표지된 물질의 조직 분포를 분석한 결과,¹²⁵I IFN-α 1-8을 정맥내 주입한지 5분후에 동물의 신장에서 매우 다량의 방사성이 나타나며, 간, 폐 및 비장에서 다량의 방사성이 나타남이 확인되었다. 이들 4개의 기관 각각에 존재하는방사성의 양은 15분 및 30분후에 점진적으로 감소하는 것으로 밝혀졌다. 이와는 대조적으로, 위장에서의 방사성 수준은 15분 및 30분에 점진적으로 증가하여 정맥내 거환을 주입한지 30분후에 동물의 혈청에 존재하는 양에 필적할 만한 수준에 도달했다.

복강내 주입으로 투여한¹²⁵I IFN-α 1-8은 검사한 모든 조직에서 투여후 15분내에 최고 수준의 방사성을 나타냈으며, 30분후 감소되었다. 유사하게,¹²⁵I Hu IFN-α 1-8의 비측내/경구 투여는 투여한지 15분후 시험한 모든 조직에서 최고 수준의 방사성을 나타냈으며, 그후 30 분후에 존재하는 방사성 수준이 약간 감소되었다. 위장/식도에 존재하는 방사성의 양은¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8을 비측내/경구 투여후 임의의 다른 기관에서 검출된 양보다 한 자리수 범위내에서 더 많았으며, 이 양은 정맥내 또는 복강내 경로로 동량의 방사성 표지된 Hu IFN-α 1-8을 비경구 투여한 후 이들 조직내에 존재하는 양보다 현저히 많은 양이었다.

실시예 6

비측내/경구 투여후 인터페론의 약동학

Hu IFN-α 1-8의 약동학을 정밀 측정하기 위해,¹²⁵I-표지된 Hu IFN-α 1-8을 마우스에게 1.0369 ×10⁷cpm/마우스로 정맥내, 복강내 또는 비측내/경구 처리하고, 전혈 및 혈청 둘다에 존재하는 방사성의 양을 24시간동안 일련의 시점에서 측정했다.

정맥내 거환 투여후 마우스의 혈액에 존재하는¹²⁵I-표지된 Hu IFN-α 1-8의 약동학 프로파일은 대수 클리어런스(logarithmic clearance) 곡선에 밀접하게 따랐다. 이것은 밀접하게 연관된 분자인 재조합 인간 α A/D(Bgl)(보호슬라웨드(Bohoslawed) 등의 문헌 [J. IFN Res., 1986,6: 207-213] 참조)를 이용하여 마우스에서 수행한 이전의 연구 결과와 일치했다. 농도 대 시간의 곡선 아래 면적으로부터 계산한 생체이용가능한 물질의 양은 또한 인간 α A/D의 경우와 유사했다.¹²⁵I IFN-α 1-8의 정맥내 거환을 투여한 후 이상성 시간 소비 클리어런스 곡선(biphasic time-consuming clearance curve)이 관측되었으며, 이것은 신장을 통해 제거된 물질의 특징이며 실시예 4의 결과와 일치했다. 복강내 주입한¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8의 약동학은 근육내 투여한 IFN에 대해 앞서 보고된 약동학과 밀접하게 유사했다.

쉽게 검출가능한 양의 생물학적으로 활성인 IFN은¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8을 정맥내 거환 또는 복강내 주입한 후의 모든 동물의 혈청에 존재했다.

프렌드 적백혈병은 매우 악성이며, 정맥내로 주입할 때 간 및 비장 둘다에 전이되기 때문에, 프렌드 적백혈병 모델은 항종양 활성의 매우 엄격한 임상전 시험방법에 사용된다. 실제로, 상기 모델을 이용하여 얻은 결과는 인간 암 치료를 위해 IFN-α를 비경구 주입하는 방법을 채택하는 기준이 되었다. 따라서, 이 연구에서 수행한 모든 실험에서 비처리 동물 및 대조용 제제로 처리한 동물은 모두 10 내지 11일내에 죽었다. 치료를 받지 않으면, 4 또는 5개의 FLC 세포만을 주입하여도 마우스는 죽을 것이다. 이와는 대조적으로, 구강점막 경로에 의해 마우스 IFN-α로 처리한 동물중 일부는 10⁵FLC를 주입한 후 100일 이상까지도 여전히 생존해 있으며, 치료된 것으로 생각할 수 있다.

실제로, 앞선 시험으로부터 판단컨대, 구강점막 경로로 투여한 IFN-α는 FLC를 주입한 동물에서 단지 몇일간만 생존 시간을 증가시킨, 비경구 투여된 사이클로포스파미드, 5-플루오로우라실 또는 메토트렉세이트보다 더욱 효과적인 것으로 나타났다(그리서 등의 문헌 [J. Natl. Cancer Inst., 1988,80: 126-131] 참조). 시스플라틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 블레오마이신 또는 에토포사이드와 같은 기타 약물들은 이 종양에 비효과적이었다(그리서 등의 문헌 [J. Natl. Cancer Inst., 1988,80: 126-131] 참조).

유사하게, 구강점막 경로로 투여된 IFN-α는 전신 투여된 IL-1β, IL-2 및 TNF-α와 같은 기타 사이토킨보다 더 FLC에 대해 효과적인 것으로 나타났다(전신 투여된 IL-1β, IL-2 및 TNF-α는 상기 모델에서 거의 활성을 나타내지 못했다).

이전의 연구에 의하면 비경구적으로 투여된 IFN이 상기 모델에서 가장 활성인 항종양 약물중 하나이고, 이러한 IFN 치료법은 이미 간에서 종양 전이가 존재한 후 치료하기 시작할 때 조차도 효과적이라고 보고되었다(그리서 등의 문헌 [Intl. J. Cancer, 1987,39: 789-792] 참조). 본 발명 결과는 구강점막 경로로 투여된IFN이 비경구 투여된 IFN과 동등하거나 또는 더한층 효과적임을 보여준다.

림프종 진단후 치료하기 시작하였을때, 단일 투여량의 사이클로포스파미드와 함께 IFN-α를 매일 주입하면. 상기 제제중 하나만을 처리한 동물에 비해 림프종 함유 AKR 마우스의 생존율을 현저히 증가시켰다(그리서 등의 문헌 [Eur. J. Cancer, 1978,14:97-99] 참조). 또한 IFN-αZβ 및 BCNU, 시스-DDP(시스플라틴), 메토트렉세이트, 아드리아마이신 및 α-디플루오로메틸 오르니틴을 이용한 성공적인 복합 치료법이 다양한 임상전 동물 종양 모델에서 보고되었다. 5-(플루오로우라실)(5-FU) 및 IFN의 복합 치료법도 또한 인간의 전이성 결장암 치료에 유익한 것으로 보고되었다(에른스토프(Ernstoff) 등의 문헌 [Journal of Clinical Oncology, 1989,7: 1764-1765] 참조). 그러나, IFN 치료법을 사이클로포스파미드(마르퀘트(Marquet) 등의 문헌 [Int. J. Cancer, 1983,31:223-226]; 리(Lee) 등의 문헌 [Biochem, Pharmacol., 1984,33:4339-3443] 참조), 아드리아마이신(블랙윌(Blackwill) 등의 문헌 [Cancer Res., 1984,44: 904-908] 참조), 또는 5-FU(마르퀘트 등의 문헌 [1985,109: 156-158] 참조), 즉 정확하게는 비경구 IFN 치료법과 함께 사용할 때 유익한 효과를 발휘하는 것으로 알려진 약물들과 함께 사용할 때, 항종양 활성이 감소됨을 보고하는 다른 연구 결과도 있다. IFN과 기타 화학치료제와의 조합은 본원에 개시된 방법을 사용하여 쉽게 시험할 수 있다.

인터류킨-1(IL-1) 및 IFN-α/β의 복합 치료법은 FLC를 주입한 마우스에서 상승작용성 항종양 효과를 야기한다(벨라델리(Belardelli) 등의 문헌 [Int. J.Cancer, 1991,49:274-278)]. 이와 동일한 치료 방법은 또한 Eb 림프종의 전이성 변이종(p11-R-Eb)에 대해 현저한 항종양 효과를 발휘하는데, 이에 반해 상기 제제중 한 제제만을 사용하면 비효과적이다(가브리엘(Gabriele) 등의 문헌 [Invasion Metastasis, 1993,13:147-162] 참조). 시험한 모든 사이토킨중에서, IL-1이 비경구 I형 IFN 치료법과 조합할 때 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다.

IFN-α/β와 함께 사용된 혈관형성억제제 AGM-1470 [(클로로아세틸)-카밤산(3R-(3α,4α(2R^*,3R^*),5β,6β))-5-메톡시-4-(2-메틸-3-(3-메톡시-2-부테닐)옥시라닐)-1-옥사스피로(2.5)옥트-6-일 에스테르]의 복합 치료법은 이들 제제중 어느 한 제제만을 사용했을 때 관찰된 항종양 효과에 비해 현저하게 증가된 항종양 효과를 나타냈다(브램(Brem) 등의 문헌 [J. Pediatric Surgery, 1993,28:1253-1257] 참조).

온열요법은 루이스 폐암에 대한 IFN-α/β의 항종양 작용을 증대시키는 것으로 나타났다(예루살미(Yerushalmi) 등의 문헌 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1982,169:413-415] 참조). 알기닌 부티레이트는 또한 IFN-α의 항종양 작용을 강화시키는 것으로 나타났다(샤니(chany) 및 세루티(Cerutti)의 문헌 [Int. J. Cancer, 198230:489-493] 참조).

특정 유형 및 투여량의 IFN을 구강점막 경로로 투여할 때 얻은 보호 수준과 전신 투여(복강내 주입)후 얻은 결과를 비교한 결과, 몇몇 경우에 IFN의 비경구 투여가 구강점막 투여보다 약간 더 효과적이었으며, 다른 경우에서는 더 효과적이지않은 것으로 나타났다.

바이오마커 파일롯트(biomarker pilot) 실험 결과에 의하면 시험한 3가지 바이오마커(MHC 클라스 I 항원, Lys6 A/E 항원, 및 2',5'-올리고아데닐레이트 신타제 활성)중 어느 것도 구강점막 경로로 투여된 IFN-α에 의해 나타난 매우 현저한 항종양 활성을 적절히 나타내지 못함을 아주 분명하게 알 수 있다.

20 IU 만큼 소량의 IFN-α를 복강내 주입한 후 취한 모든 실험에서 IFN-유도성 단백질의 3가지 발현에서의 매우 현저한 증가가 관측되는데 반해, 20,000 IU 이하의 IFN-α를 구강점막 경로로 투여후에는 임의의 검출가능한 효과가 없다는 것은 놀라운 사실이다.

본 발명자들은 초기 또는 중기에 하나의 바이오마커 또는 다른 바이오마커에 대한 효과가 관측될 가능성을 배제할 수 없지만, IFN이 이들 단백질을 암호화하는 유전자의 전사에 작용하므로 IFN 처리후 여러 시간이 경과할 때까지 이들 바이오마커중 어느 한 마커에 대한 효과도 예상할 수 없기 때문에 그럴 가능성은 없는 듯하다.

다시 한번 언급하면, IFN-α를 구강점막 경로로 처리한 후 기타 수많은 IFN-유도성 단백질중 하나에 대한 전신적 효과가 관측될 가능성을 배제할 수 없지만, 그러한 효과는 특정 IFN-유도성 유전자들의 발현의 차별적인 조절이 수반되어야 하기 때문에 그럴 가능성은 없는 듯 하다. 그러나, IFN 바이오마커에 대한 효과가 구강점막 경로로 IFN-α을 투여한 후, 예를 들면 단지 비내 림프구내에서 국소적으로 관측될 수 있는 가능성은 있다.

실험한 바이오마커에 대한 검출가능한 효과가 없는 것과 일치하게, 20,000 IU 이하의 IFN-α를 처리한 동물에서조차도 구강점막 경로로 IFN 치료시에 관측된 혈액학적 또는 혈액 화학적 변수중 어느 것에 대해서도 일관된 효과가 관측되지 않았다.

¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8의 구강점막 투여후 동물의 전혈 및 혈청 둘다에서 쉽게 검출가능한 양의 방사성 표지된 물질이 발견되었다. 이 결과는, 다량의 비표지된 IFN을 경구 투여한 후에도 동물의 혈청에서 IFN을 검출하는데 실패한 이전 시험 결과는 반대되는 결과이다. 그러나, 구강점막 투여후 전혈 및 혈청 모두에서 검출된 방사성 물질은 생물학적으로 불활성이었다. 또한, SDS-PAGE 분석 결과는 상기 물질이 저 분자량을 가졌음을 나타냈으며, 아마도 위장 및 소장내에서 IFN이 소화된 후 분해 산물로 흡수되었음을 나타냈다. 구강점막 투여후 방사성 표지된 물질의 조직 분포 검사는 시험한 다른 기관중 어느 기관보다 위장에서 현저히 많은 양의 방사성이 나타남을 보여주었다. 이러한 실험 결과는 구강점막 투여후 생물학적 활성의 IFN이 관측되지 않더라도, 구강점막 경로에 의한 IFN의 치료법이 생체내에서 통계학적으로 유의적인 항종양 활성을 발휘함을 아주 분명하게 나타낸다.

관측된 유익한 효과에 대해 임의의 제안된 기작에 구속되길 원치 않지만, 본 발명자들의 실험 결과는 구강점막 투여된 IFN이, 외부에서 투여된 IFN의 직접 작용 또는 내인성 IFN의 유도를 포함하지 않는, 현재까지 정립되지 않은 새로운 기작을 통해 종양 세포에 대해 영향을 미침을 제안한다. 시험한 3가지 바이오마커 또는순환형 IFN이 검출가능한 양으로 존재하지 않는다는 사실이 상기 제안을 지지한다. 이 기작은 비인두 및 구강 공동을 둘러싸고 있는 풍부한 림프양 조직을 자극함으로써 적어도 부분적으로 작용할 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 구강점막 투여된 IFN이 전신 투여된 IFN과 적어도 효능면에서 필적할 만하다고 나타냈기 때문에, 이러한 실험 결과는 종양 질환 치료에 구강점막 경로로 IFN을 투여하기 위한 강력한 근거를 제공한다. 이것은 IFN의 임상 용도에 대한 중요한 암시가 될 수 있다.

명료함 및 이해를 위해 본 발명을 일부에서 상세하게 기술했지만, 당해 분야의 숙련자들은 본 명세서에 개시된 발명의 개념 범위에서 벗어나지 않고 본원에 기술된 실시양태 및 방법에 대해 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 사실을 알 것이다.

Claims

인터페론을 비경구 투여시 포유동물에서 병리학적 반응을 유도하지 않는 치료 효과량인 1500 국제 단위(IU) 내지 20 ×10⁶IU의 양으로 포함하는, 포유동물에서 항종양성 반응을 자극하기 위한 구강점막 투여용 인터페론 조성물.
제 1 항에 있어서,

인터페론 5000 IU 내지 20 ×10⁶IU 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
제 2 항에 있어서,

인터페론 1 ×10⁴IU 내지 1 ×10⁶IU를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

사이토킨을 추가로 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

세포증식억제제, 항암제 및 혈관생성억제제로 구성된 군에서 선택된 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

종양성 증상이 다발성 골수종, 모발상 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저급 림프종, 피부 T세포 림프종, 카르시노이드 종양, 신장 종양, 신장 세포암, 간 세포암, 결장직장암, 신경 교아 세포종, 폐암, 결장암 및 악성 뇌종양으로 구성된 군에서 선택된 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 5 항 및 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

효과량의 인터페론이 단일 투여량으로 투여되는 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 5 항 및 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

효과량의 인터페론이, 단일 투여량으로 투여되는 경우와 동등한 치료학적 반응을 유도하기에 충분하도록 일정 시간에 걸쳐 소량의 투여량으로 나뉘어 다수회로 투여되는 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 5 항 및 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

효과량의 인터페론이, 단일 투여량으로 투여되는 경우와 동등한 치료학적 반응을 유도하기에 충분하도록 일정 시간에 걸쳐 연속적으로 투여되는 조성물.