ES2315255T3 - Utilizacion de trombopoyetina como medicamento para la terapia y la prevencion de trombocitopenia. - Google Patents
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Abstract
Uso de una trombopoyetina para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un mamífero que padece trombocitopenia o que está en riesgo de padecerla, caracterizado porque el medicamento se administra en forma de dos dosis terapéuticas en un único día, en donde la citada dosis terapéutica oscila entre 0,5 y 1,5 mug/kg cada una, en una administración en dos dosis, sin tratamiento suplementario con trombopoyetina, o en forma de una única dosis terapéutica, sin tratamiento suplementario con trombopoyetina, en donde la trombocitopenia es generada por quimioterapia o radioterapia.
Description
Utilización de trombopoyetina como medicamento
para la terapia y la prevención de trombocitopenia.
La presente solicitud, y la materia contenida en
la misma, está relacionada con la siguiente solicitud de patente y
con su contenido: solicitud de patente internacional PCT/US94/14550,
depositada el 28 de diciembre de 1994 (publicada bajo número
WO95/18858, el 13 de julio de 1995).
La presente solicitud está relacionada con un
nuevo uso para la trombopoyetina y con los isoformos y derivados
biológicamente activos de la misma, en la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento de la trombocitopenia. Se
contempla la co-administración de los citados
materiales, conjuntamente con una citoquina, en especial, con un
factor estimulador de colonia o con una interleukina. El medicamento
va destinado al tratamiento de un mamífero que padece, o que esta
en riesgo de padecer, trombocitopenia, mediante la administración
de una cantidad terapéuticamente eficaz del(de los)
citado(s) material(es) al mamífero que precise del
citado tratamiento.
El sistema hematopoyético produce las células
sanguíneas maduras altamente especializadas, conocidas por resultar
necesarias para la supervivencia de los mamíferos. Entre las citadas
células maduras se incluyen los eritrocitos, especializados en el
transporte de oxígeno y dióxido de carbono, los linfocitos T- y B-,
responsables de las respuestas inmunes mediadas por anticuerpo y por
célula, las plaquetas o trombocitos, especializados en la formación
de coágulos sanguíneos, y los granulocitos y los macrófagos,
especializados como barredores y como células accesorias para
combatir la infección. La totalidad de estas células sanguíneas
maduras especializadas proceden de un único tipo de células
primitivas comunes, identificadas como las células madres
pluripotentes, encontradas principalmente en la médula ósea.
Las células sanguíneas altamente especializadas
maduras tienen que ser producidas en grandes cantidades de forma
continua, a lo largo de toda la vida del mamífero. La inmensa
mayoría de estas células sanguíneas especializadas están destinadas
a permanecer funcionalmente activas durante un período de tiempo que
oscila entre tan solo unas horas y semanas. Por consiguiente, la
renovación continua de estas células sanguíneas maduras, la de las
propias células madre primitivas, al igual que la de cualquier
intermedio o linaje, la de las líneas celulares de progenitor
comprometidas, alineadas entre las células maduras y las maduras,
resulta necesaria con vistas a mantener las necesidades normales
continuas de células sanguíneas para la continuidad de la vida del
mamífero.
En el corazón del sistema hematopoyético se
encuentran las células madre pluripotentes. Estas células resultan
ser relativamente pequeñas en número y sufren una
auto-renovación a través de la proliferación, para
generar células madre hijas, o las mismas se transforman, en una
serie de pasos de diferenciación, en células progenitoras
restringidas por linaje maduras, formando en última instancia
la(s) célula(s) madura(s) altamente
especializada(s).
El principio subyacente del sistema celular
hematopoyético normal parece residir en la reducida capacidad para
la auto-renovación a medida que se pierde la
multipotencia y se adquiere madurez y restricción por linaje. Por
consiguiente, en un extremo del espectro celular hematopoyético se
encuentra la célula madre pluripotente, que posee la capacidad de
auto-renovación y de diferenciación en la totalidad
de las diversas células progenitoras comprometidas, de linaje
específico. En el otro extremo del espectro se encuentran los
progenitores de linaje altamente restringido y su progenie, los
cuales ha perdido la capacidad de auto-renovarse,
pero han adquirido la actividad funcional madura.
La proliferación y el desarrollo de células
madre y de células progenitoras restringidas por linaje se controla
a través de una diversidad de factores de crecimiento o citoquinas.
Por consiguiente, los factores de crecimiento hematopoyéticos
pueden influir en el crecimiento y en la diferenciación de uno o más
linajes, pueden solaparse con otros factores de crecimiento,
afectando a una única línea general o pueden actuar sinérgicamente
con otros factores.
Se apreciará, a partir de lo indicado
anteriormente, que podría resulta interesante disponer de factores
de crecimiento que afecten a la supervivencia, a la proliferación, a
la diferenciación o a la maduración de cualquiera de las células
madres de los predecesores de las mismas, especialmente cuando se
trata de ayudar al restablecimiento de un sistema hematopoyético
reducido, provocado por enfermedad o después de terapia de radiación
o de quimioterapia.
Las plaquetas son elementos críticos del
mecanismo de formación de coágulos en la sangre. La reducción del
nivel de plaquetas en circulación, denominada trombocitopenia, tiene
lugar y se manifiesta por medio de diversas dolencias y trastornos
clínicos. La trombocitopenia clínica se define habitualmente como
una dolencia en la que el contaje de plaquetas está situado por
debajo de aproximadamente 150 x 10^{9} por litro. Las principales
causas de trombocitopenia pueden ser ampliamente divididas en tres
categorías, en base a la duración de la vida de la plaqueta. En
particular: 1) producción dificultada de plaquetas por parte de la
médula ósea, por ejemplo, trombocitopenia generada por terapia de
radiación o quimioterapia (2) secuestro de plaquetas en el bazo
(esplenomegalia) y 3) destrucción incrementada de plaquetas en la
circulación periférica, por ejemplo, trombocitopenia provocada por
trastornos autoinmunes. Adicionalmente, en pacientes que reciben
grandes volúmenes de productos sanguíneos pobres en plaquetas,
administrados de forma rápida, se puede desarrollar la
trombocitopenia debido a factores de dilución. En Schafner.
"Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Disfunction",
Internal Medicine, John J. Hutton et al., Eds. Little, Brown
& Co., Boston/Toronto/Londol, Third Ed. (1990), al igual que en
la solicitud de de patente Nº. PCT/US94/14553 (publicación
internacional Nº PCT/US94/14553 (Publicación Internacional Nº.
WO95/18858, mencionada anteriormente.
El planteamiento terapéutico para el tratamiento
de pacientes con trombocitopenia es el que dicta la gravedad y la
urgencia de la situación clínica. El tratamiento es similar tanto
para la trombocitopenia relacionada con HIV, como para la no
asociada con HIV y, a pesar de que se han utilizado un número
diferente de planteamientos terapéuticos, la terapia permanece
clínicamente controvertida.
De acuerdo con lo indicado anteriormente, los
expertos en la materia valorarán el hecho de que una de las vías
para tratar la trombocitopenia pasaría por obtener un agente que
fuese capaz de acelerar la diferenciación y la maduración de
megacariocitos, o de precursores de los mismos, hacia la forma
productora de plaquetas. Se han efectuado esfuerzos considerables
para identificar tales agentes. Uno a los que se hacen continuas
referencias es la trombopoyetina (TPO), el objeto de la presente
solicitud. Entre la relación de otros nombres encontrados
habitualmente en la literatura se incluyen: el factor estimulador de
trombocitopoyesis (TSF); el factor estimulador de colonias de
megacariocitos (MK-CSF); el factor de desarrollo y
de crecimiento de megacariocitos, el factor estimulador de
megacariocitos, el factor potenciador de megacariocitos y el ligando
mpl.
La ya citada solicitud de patente PCT/US94/14553
describe la identificación, el aislamiento, la producción y el uso
de una proteína que favorece la maduración y la proliferación
megacariocitopoyética en mamífero aislada, denominada el "ligando
MPL" (ML) o, más habitualmente, "trombopoyetina" (TPO),
acerca de la cual se ha averiguado que resulta capaz de estimular
la proliferación, la maduración y/o la diferenciación de
megacariocitos hacia la forma madura productora de plaquetas.
La atención se dirige también hacia las
solicitudes de patente WO95/26746, WO95/21919 y WO95/21920.
La solicitud PCT/US94/14553 incluye diversos
aspectos de realizaciones asociadas con TPO, incluyendo un
procedimiento para el tratamiento de un mamífero que padece, o que
está en riesgo de padecer, un trastorno hematopoyético,
especialmente trombocitopenia, que comprende la administración al
mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de materiales TPO.
Opcionalmente, la TPO es administrada como tal o en combinación con
una citoquina, especialmente con un factor estimulador de colonias o
interleukina. A los efectos descritos en la citada solicitud de
patente internacional, la TPO se define de forma amplia, incluyendo
la propia TPO o diversas variantes, derivados o isoformas de la
misma, incluyendo fragmentos que comparten al menos una propiedad
biológica en común con la TPO intacta, para el tratamiento de la
trombocitopenia. El término "propiedad biológica", cuando se
utiliza conjuntamente con la definición de los diversos materiales
TPO útiles, tal y como se describe en la citada solicitud,
significa que existe actividad trombocitopénica o una función
efectora o una actividad antigénica in vivo, provocada, o
llevada a cabo, directa o indirectamente, por el material TPO.
En relación con el uso terapéutico de materiales
trombopoyetina, tal y como se describe en la citada solicitud de
patente internacional PCT/US94/14553, los materiales TPO se
describen en la misma para la administración, en mezcla con un
soporte farmacéuticamente aceptable, a través de cualquiera de
diversos modos de administración. El régimen diario es descrito
como oscilante entre aproximadamente 0,1 y 100 \mug/kg de peso
corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y 50 \mug/kg
de peso corporal, preferiblemente a una dosis inicial que oscila
entre aproximadamente 1 y 5 \mug/kg por día. De forma implícita
dentro de lo que se describe en la citada solicitud, se hace
referencia a un régimen de administración de la citada dosis a lo
lago de un periodo que oscila entre diversos y muchos días, con
posterioridad a un estado proyectado o real de contaje reducido de
plaquetas.
Estudios clínicos publicados de trombopoyetina
administrada clínicamente indican una dosis y un régimen de
administración que comprende la administración de trombopoyetina, de
forma subcutánea, a dosis de entre 0,03 y 5,0 \mug/kg de peso
corporal, por día, a lo largo de un período de diez días, para una
dolencia marcada por la trombocitopenia. Ver Abstract 1977, Blood
(1995). Ver también Abstracts 1012, 1014 y 1978, Blood 86
(1995).
De forma similar, el compuesto epoetina alfa, el
cual corresponde a un nombre otorgado a la eritropoyetina
(comercializada como Epogen por Amgen, Inc.), es una glicoproteína
indicada para la estimulación de la producción de glóbulos rojos.
Se hace referencia a una dosis y a un régimen de administración que
comprende dosis de partida a lo largo de la banda comprendida entre
150 y 300 unidades por kg, tres veces por semana durante un período
de muchas semanas, con vistas a estimular la proliferación de
glóbulos rojos en pacientes que sufren de una reducción de los
mismos, sin importar como la misma se haya generado.
El filgastrim, comercializado por Amgen Inc como
Neupogen, es un factor estimulador de colonias de granulocitos
(G-CSF). Su régimen indicado es la administración de
entre 5 a 10 \mug/kg, por vía subcutánea, diariamente durante dos
semanas.
En base a esta evidencia anecdótica, el régimen
convencional en la administración de materiales para la
proliferación de glóbulos rojos u otras células sanguíneas para
invertir los efectos de la trombocitopenia, se basa en la
administración de cantidades terapéuticamente eficaces del material
biológico diariamente, durante un período de muchos días, a
pacientes que precisan de la citada terapia, después de un episodio
que ha dado lugar a una trombocitopenia.
Para la conveniencia de los doctores, y en
especial de los pacientes, existe un objetivo de desarrollar
regímenes de dosificación/administración alternativos de los citados
materiales biológicos, los cuales resulten ventajosa y
terapéuticamente equivalentes o superiores a la hora de invertir los
efectos de la trombocitopenia.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se basa en el sorprendente
e inesperado descubrimiento de que materiales trombopoyetina
biológicamente activos pueden producir efectos terapéuticos mediante
la administración de una dosis única, o de múltiples dosis bajas,
de una cantidad terapéuticamente eficaz a un paciente que padezca o
que tenga necesidad de tratamiento frente a trombocitopenia.
La presente invención va dirigida a la materia
definida en las reivindicaciones. En su aspecto preferido, la
presente invención va dirigida a la administración única de una
cantidad terapéuticamente eficaz.
A través del término
"múltiple-baja", en conexión con la
dosificación, se quiere dar a entender la administración de
múltiples dosis de cantidades terapéuticamente eficaces a lo largo
de un corto período de tiempo, el cual se ha averiguado en el
presente documento, resulta independiente del inicio de la respuesta
terapéutica, a saber, incrementa los niveles de producción de
plaquetas. Por consiguiente, como práctica fundamental, la presente
invención se dirige a la mera administración única de una cantidad
terapéuticamente eficaz de una trombopoyetina. Se ha averiguado que
el referido régimen de administración produce un efecto terapéutico
equivalente al realizado cuando una cantidad terapéuticamente eficaz
del mismo material es administrada a lo largo del régimen de
administración múltiple convencional de muchos días de duración
sugerido y descrito en el estado de la técnica
existente.
existente.
Se da por entendido el hecho de que se ha
averiguado que una administración única de una trombopoyetina a un
paciente resulta terapéuticamente eficaz para el tratamiento de la
trombocitopenia. En el presente caso, se ha averiguado que una
dosis única estimula el inicio de la respuesta terapéutica.
Se ha averiguado, de acuerdo con la presente
invención, que el régimen de administración única de la presente
invención resulta eficaz a dosis relativamente bajas del orden de
aproximadamente 0,1 a 10, preferiblemente de aproximadamente 0,3 a
10, más preferiblemente de entre aproximadamente 0,5 y 10, todavía
mas preferiblemente de entre aproximadamente 0,5 y 5 \mug/kg de
peso corporal del paciente. En régimen de dosificación única,
resultaría preferida la administración de entre aproximadamente 2
\pm 1,5 \mug/kg de peso corporal. En un régimen de dosificación
múltiple baja de dos dosis terapéuticas en un único día, resultaría
preferida la administración de entre aproximadamente 0,5 y 1,5
\mug/kg de peso corporal, por dosis. Las dosis indicadas
anteriormente pueden ser predicadas en la administración intravenosa
preferida. En administración a través de la ruta subcutánea, la
cantidad total administrada estaría comprendida en la banda de entre
uno y tres veces la cantidad administrada a través de la ruta
intravenosa, preferiblemente aproximadamente 2 veces.
La frecuencia de dosis y el régimen óptimos
serán determinados por el médico presente, tomando en consideración
diversos factores conocidos por modificar la acción de fármacos,
incluyendo la gravedad y el tipo de enfermedad, el peso corporal,
el sexo, la dieta, la hora y vía de administración, otras
medicaciones y otros factores clínicos relevantes. De acuerdo con
la presente invención, el régimen de la presente invención
comprenderá la administración única de un material trombopoyetina
en la banda amplia que oscila entre aproximadamente 0,1 y 100
\mug/kg de peso corporal, preferiblemente una dosis dentro de la
banda comprendida entre aproximadamente 0,1 y 50 \mug/kg de peso
corporal. Muy preferiblemente, la presente invención se basa en el
inesperado resultado de que una administración única de una dosis
que oscila entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,0, más
preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5
\mug/kg, produce un efecto terapéutico que resulta
terapéuticamente equivalente a la administración de la misma
cantidad de material o de una cantidad superior a lo largo de un
régimen que conlleva la administración diaria a lo largo de varios
días, por encima de una semana o más.
Los materiales trombopoyetina biológicamente
activos de la presente invención pueden ser administrados, de
acuerdo con lo que se indica en el presente documento, a través de
diversas rutas, incluyendo la vía nasal o la pulmonar, la
subcutánea y, preferiblemente, la intravenosa. En todos los casos,
en función de cual sea la ruta de administración, los materiales
trombopoyetina biológicamente activos son preferiblemente
administrados en combinación con un soporte o excipiente
farmacéuticamente aceptable. Cuando se administra de modo
sistemático, la composición terapéutica debe estar exenta de
pirógenos y en forma de solución parenteralmente aceptable, habida
cuenta de la isotonicidad a pH fisiológico y la estabilidad. Estas
condiciones resultan ser generalmente bien conocidas y aceptadas por
los expertos en la materia.
Brevemente, formulaciones en dosis de los
materiales de la presente invención se preparan para almacenamiento
o administración mediante el mezclado del compuesto que presenta el
grado de pureza deseado con soportes, excipientes y/o
estabilizadores fisiológicamente aceptables. Los citados materiales
son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones
utilizadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, acetato
y otras sales de ácido orgánico; antioxidantes, tales como ácido
ascórbico; péptidos de bajo peso molecular, tales como
poliarginina, proteínas tales como sueroalbúmina, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido
glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y
otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa,
manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes
azucarados , tales como manitol o sorbitol;
contra-iones tales como sodio y/o tensoactivos no
iónicos, tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol.
Los materiales trombopoyetina biológicamente
activos del presente documento pueden ser administrados en forma de
ácido libre, en forma de base o como sus sales farmacéuticamente
aceptables y son formulados con un vehículo, soporte, excipiente,
aglutinante, conservante, estabilizador, agente aromatizante, etc.,
de acuerdo con lo que se describe en la práctica farmacéutica
aceptada.
Las composiciones estériles para inyección
pueden ser formuladas según la práctica farmacéutica o farmacológica
convencional. Por ejemplo, puede desearse la disolución o la
suspensión del material activo en un vehículo tal como agua, o
aceite vegetal de origen natural, como aceite de sésamo, de
cacahuete, de semilla de algodón, o un vehículo graso sintético,
tal como etiolato o similar. De nuevo, tampones, conservantes,
anti-oxidantes y similares pueden ser incorporados
según la práctica farmacéutica aceptada. Los materiales
trombopoyetina biológicamente activos de la presente invención
pueden ser utilizados en solitario o ser administrados en
combinación con otras citoquinas, hematopoyetinas, interleukinas,
factores de crecimiento, o anticuerpos, en el tratamiento de los
trastornos y dolencias identificadas anteriormente, marcadas por la
trombocitopenia. Por lo tanto, los presentes materiales activos
pueden ser utilizados en combinación con otras proteínas o péptidos
marcados por la trombocitopenia. Por lo tanto, los actuales
materiales activos pueden ser utilizados en combinación con otras
proteínas o péptidos que tienen actividad trombopoyética,
incluyendo: G-CSF, GM-CSF, LIF,
M-CSF, IL-2, IL-3,
eritropoyetina (EPO), kit de ligando, IL-6,
IL-11, ligando FLT-3 y etcétera.
Entre los ejemplos de preparaciones de
liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de
polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, las
cuales se presentan en forma de artículos con forma, por ejemplo,
películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de
liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles [por
ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
tal y como se describe en Langer et al., J. Biomed., Mater.
Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tec.., 12:
98-105 (1982) o poli(vinilalacohol)],
poliactidas (patente US nº. 3.779.919, EP 58.481), copolímeros de
ácido L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (Sidman et
al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]),
etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer
et al., supra), copolímeros ácido láctico-ácido glicólico
degradables, tales como Lupron-Depot® (microesferas
inyectables compuestas de copolímero ácido láctico-ácido glicólico
y acetato de leuprolida) y
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(EP 133.988).
Si bien los polímeros tales como
etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido
glicólico permiten la liberación de moléculas a lo largo de 100
días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante períodos de
tiempo más cortos. Cuando proteínas encapsuladas permanecen en el
organismo durante un largo período de tempo, las mismas pueden ser
desnaturalizadas o acumuladas como resultado de la exposición a la
humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de la actividad biológica
y a posibles cambios en la inmunogenecidad. Pueden diseñarse
estrategias racionales para la estabilización de proteínas, en
función de cual es el mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se
descubre que el mecanismo de acumulación reside en la formación de
enlaces S-S intermoleculares a través de
intercambio disulfuro, la estabilización puede ser lograda mediante
la modificación de los restos sulfidrilo, liofilización a partir de
soluciones ácidas, control del contenido en humedad, utilizando
aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matriz
polimérica en desarrollo.
Las composiciones de proteína trombopoyética de
liberación sostenida incluyen también proteína megacariocitopoyética
atrapada en liposomas. Los liposomas que contienen proteína
megacariocitopoyética se preparan a través de procedimientos
conocidos per se: DE 3.218.121; Epstein et al. Proc.
Natl. Acad. Sci.. USA, 82: 3688-3698 [1985]: Hwang
et al. Proc. Natl. Acad. Ci. USA, 77:
4030-4034 [1980]; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046;
EP 143.949; EP 142.641; solicitud de patente japonesa
83-118008; patentes US nºs. 4.485.045 y 4.544.545, y
EP 102.324. Ordinariamente, los liposomas son de tipo unilamelar
pequeño (aproximadamente entre 200 y 800 Angstroms), en los cuales
el contenido en lípidos es superior a aproximadamente 30% mol. de
colesterol, siendo la proporción correcta ajustada para la óptima
terapia de proteína megacariocitopoyética.
Un tipo de modificación covalente de TPO o de
ligando mpl comprende la unión de polipéptido TPO a uno de entre
una diversidad de polímeros no proteináceos, por ejemplo,
polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la
forma expuesta en las patentes US nºs. 4.640.835; 4.496.689;
4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Los polipéptidos TP
unidos covalentemente a los polímeros mencionados anteriormente son
identificados en el presente documento como TPO pegilada.
Se apreciaré el hecho de que para seleccionar la
variante óptima para la unión a un mpl y poder disponer de la
actividad biológica y/o inmunológica definida anteriormente hará
falta llevar a cabo algún tipo de cribado de la variante de TPO
recuperada. Se puede efectuar un cribado para determinar la
estabilidad en cultivo celular recombinante o en plasma (por
ejemplo, frente a la rotura proteolítica), la elevada afinidad para
un componente mpl, la estabilidad oxidativa, la capacidad de ser
secretada en rendimientos elevados y similares. Por ejemplo, un
cambio en el carácter inmunológico del polipéptido TPO, tal como la
afinidad para un determinado anticuerpo, se mide mediante a través
de un inmunoensayo de tipo competitivo. Otras potenciales
modificaciones de las propiedades de la proteína o del polipéptido,
tales como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobicidad o la
susceptibilidad frente a la degradación proteolítica son ensayadas a
través de procedimientos conocidos en el estado de la técnica.
Se da por entendido que la presente invención va
dirigida a todos los aspectos asociados y a las realizaciones
abarcadas dentro de la invención descrita en el presente documento.
Estos y otros detalles que les conciernen y la presente invención
en general, forman parte de la continua descripción de la presente
invención en la forma descriptiva más detallada que se muestra más
adelante.
Figura 1- Animales convertidos en
pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación
\gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía
subcutánea con 0,1 \mug rmTPO(335), durante 1, 2, 4 u 8
días. El panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los
regímenes de tratamiento, mientras que los paneles B y C
representan, respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de
los leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda
mostrada en el panel B se refiere a los tres paneles.
Figura 2- Animales convertidos en
pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación
\gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía
subcutánea con una dosis única, a varios niveles, de
rmTPO(335), 24 horas después del inicio del experimento. El
panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de
tratamiento, mientras que los paneles B y C representan,
respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los
leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada
en el panel B se refiere a los tres paneles.
Figura 3- Representaciones log. lineales de las
respuestas proporcionadas por las plaquetas (panel A) y por los
eritrocitos (panel B) frente a administraciones únicas de
rmTPO(335), proporcionadas ya sea por medio de vía subcutánea
o intravenosa, en animales convertidos en pancitopénicos, mediante
una combinación de 5,0 Gy de irradiación \gamma y carboplatino
(1,2 mg). Los números de células representadas gráficamente son los
que se han medido el día 14 después del inicio del experimento.
\Phi es el nivel cero de base.
Figura 4- Animales convertidos en
pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación
\gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía
subcutánea con una dosis única, a varios niveles, de
rmTPO(335), 24 horas después del inicio del experimento. El
panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de
tratamiento, mientras que los paneles B y C representan,
respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los
leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada
en el panel B se refiere a los tres paneles.
Figura 5- Animales convertidos en
pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación
\gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía
subcutánea con una dosis única, 24 horas después del inicio del
experimento, con varias formas de rmTPO(153) conjugada con
polietilenglicol (peg) de o bien 20K ó 40K de peso molecular. El
panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de
tratamiento, mientras que los paneles B y C representan,
respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los
leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada
en el panel B se refiere a los tres paneles.
Figura 6- Animales convertidos en
pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación
\gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía
subcutánea con una dosis única, 24 horas después del inicio del
experimento, con, o bien rmTPO(335) ó rmTPO(153),
conjugadas con polietilenglicol (peg) de 40K de peso molecular. El
panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de
tratamiento, mientras que los paneles B y C representan,
respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los
leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada
en el panel B se refiere a los tres paneles.
Figura 7- Animales convertidos en
pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación
\gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía
subcutánea con una dosis única, 24 horas después del inicio del
experimento, con, o bien rmTPO(335) ó rmTPO(153),
conjugadas con polietilenglicol (peg) de 40K de peso molecular. El
panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de
tratamiento, mientras que los paneles B y C representan,
respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los
leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada
en el panel B se refiere a los tres paneles.
El término "citoquina" es un término
genérico para proteínas liberadas por una población celular que
actúa sobre otra célula como mediador celular. Constituyen ejemplos
de tales citoquinas las linfoquinas, las monoquinas y las hormonas
polipeptídicas tradicionales. Incluidas entre las citoquinas figuran
la hormona del crecimiento, los factores de crecimiento de tipo
insulina, la hormona del crecimiento humana, incluyendo la hormona
de crecimiento humana N-metionílica, la hormona del
crecimiento bovina, la hormona paratiroidea, la tiroxina, la
insulina, la proinsulina, la relaxina, la prorrelaxina, hormonas
glicoproteínicas, tales como la hormona estimuladora del folículo
(FSH), la hormona estimuladora de la tiroides (TSH) y la hormona
leutinizante (LH), el factor de crecimiento hematopoyético, el
factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento de
fibroblasto, la prolactina, el lactógeno placentario, el factor de
necrosis tumoral (TNF-\alpha y
TNF-\beta), la sustancia inhibidora mulleriana,
el péptido asociado a gonadotropina de ratón, la inhivina, la
activina, el factor de crecimiento endotélico, la integrina,
factores de crecimiento nervioso, tales como
NGF-\beta, factores I y II de crecimiento de tipo
insulina, la eritropoyetina (EPO), los factores osteoinductores, los
interferones (IFN), tales como el
interferon-\alpha, -\beta y -\gamma, los
factores estimuladores de colonias (CSFs), tales como el
macrófago-CSF (M-CSF), el
granulocito-macrófago-CSF
(GM-CSF) y el granulocito-CSF
(G-CSF), interleukinas (IL's), tales como
IL-1, IL-1\alpha,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-11,
IL-12 y otros factores polipeptídicos que incluyen
LIF, SCF, ligando FLT-3 y
ligando-kit (KL). Tal y como se utilizan en el
presente documento, los términos anteriores intentan incluir
proteínas procedentes de fuentes de tipo natural o procedentes de
cultivos celulares recombinantes. De forma similar, los términos
pretenden incluir equivalentes biológicamente activos, por ejemplo,
que difieren en la secuencia de aminoácidos en uno o más aminoácidos
o en el tipo o la extensión de la glicosilación.
El término "biológicamente activo", cuando
se utiliza conjuntamente con trombopoyetina (TPO) significa
trombopoyetina o un polipéptido trombopoyetina que muestra actividad
trombopoyética o comparte una función efectora del ligando mpl
aislado a partir de plasma porcino aplástico o expresado en cultivos
celulares recombinantes. Una función efectora principal conocida
del mpl y estimuladora de la incorporación de nucleótidos marcados
(^{3}H-timidina) en el DNA de células Ba/F3
dependientes de IL-3, transfectadas con mplP de
origen humano. Otra función efectora conocida del ligando mpl o del
polipéptido del presente documento, es la capacidad para estimular
la incorporación de ^{35}S en plaquetas circulantes, en un ensayo
rebote con plaqueta de ratón. Todavía otra función efectora del
ligando mpl es la capacidad de estimular la megacariocitopoyesis
humana in vitro, la cual puede ser cuantificada por medio de
la utilización de un anticuerpo monoclonal radiomarcado específico
para la glicoproteína megacariocito GPII_{b}III_{a}.
Los términos "ligando mpl", "polipéptido
ligando mpl", "ML", "trombopoyetina" o "TPO" se
utilizan de forma intercambiable en el presente documento y
comprenden cualquier polipéptido que posea la propiedad de unirse a
mpl, un miembro de la superfamilia de receptores de citoquina, y que
tenga una propiedad biológica de ML. Una de las propiedades
biológicas ejemplarizadas es la capacidad de estimular la
incorporación de nucleótidos marcados (por ejemplo,
^{3}H-timidina) en el DNA de células Ba/F3
dependientes de IL-3, transfectadas con mpl humano.
Otra propiedad biológica ejemplarizada es la capacidad para
estimular la incorporación de ^{35}S en plaquetas circulantes, en
un ensayo rebote con plaqueta de ratón. Esta definición abarca el
polipéptido aislado a partir de una fuente de ligando mpl, tal como
el plasma porcino aplástico descrito en el presente documento o a
partir de otras fuentes, tales como otra especie animal, incluyendo
humanos, o preparado por medio de procedimientos sintéticos o
recombinantes e incluye formas variantes que incluyen derivados
funcionales, fragmentos, alelos, isoformas y análogos de los
mismos.
Un "fragmento de ligando mpl" o un
"fragmento de TPO" es una parte de un ligando mpl de longitud
completa maduro de origen natural o una secuencia de TPO que tiene
uno o más restos aminoácido o unidades carbohidrato suprimidas. La
supresión del (de los) resto(s) aminoácido(s) puede
tener lugar en cualquier parte del péptido, incluyendo en la
posición N-terminal o C-terminal o
internamente. El fragmento compartirá al menos una propiedad
biológica con el ligando mpl. Los fragmentos de ligando mpl
contendrán habitualmente una secuencia consecutiva de al menos 10,
15, 20, 25, 30 ó 40 restos aminoácido que son idénticos a las
secuencias del ligando mpl aislado a partir de un mamífero,
incluyendo el ligando aislado a partir de plasma porcino aplástico o
el ligando humano o múrido, especialmente el dominio EPO de los
mismos. El hML_{153} o el TPO(Met^{-1}
1-153) constituyen ejemplos representativos de
fragmentos N-terminales.
Los términos "variantes TPO", "variantes
de ligando Mpl" o "variantes de secuencia de ligando mpl" o
"derivados", asociados a TPO, etc., tal y como se definen en el
presente documento, significan un material biológicamente activo,
tal y como se define más adelante, que tiene menos del 100% de
identidad de secuencia con el ligando mpl o la TPO aislada a partir
de cultivos celulares recombinantes o plasma porcino aplástico o el
ligando humano. Habitualmente, un ligando mpl biológicamente activo
o una variante TPO tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos aproximadamente el 70 de identidad de secuencia de aminoácido
con el ligando mpl/TPO aislado a partir de plasma porcino aplástico
o el múrido maduro o el ligando humano o fragmentos de los mismos,
preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, más preferiblemente
al menos aproximadamente el 80%, todavía más preferiblemente al
menos aproximadamente el 85%, incluso más preferiblemente al menos
aproximadamente el 90% y ,más preferiblemente, al menos
aproximadamente el 95% de identidad de secuencia.
Un polipéptido "quimérico" es un
polipéptido que comprende un padre de longitud completa (TPO o
ligando mpl) o uno o más fragmentos de los mismos, fusionados o
unidos a un segundo polipéptido heterólogo o a uno o más fragmentos
de los mismos. La quimera compartirá al menos una propiedad
biológica en común. El segundo polipéptido será habitualmente una
citoquina, una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos.
El término "actividad biológica", cuando se
utiliza conjuntamente con cualquiera de los términos "ligando
mpl" o "ligando mpl Aislado" o "TPO" significa que
posee una actividad trombopoyética o que tiene una función efectora
o antigénica in vivo o una actividad provocada o generada,
directa o indirectamente, por un ligando mpl o ``TPO (ya sea en su
configuración natural o en la desnaturalizada) o un fragmento de los
mismos. Entre las funciones efectoras se incluyen la unión mpl y
cualquier actividad de unión a soporte, agonismo o antagonismo de
mpl, especialmente transducción de una señal proliferativa que
incluye replicación, función reguladora de DNA, modulación de la
actividad biológica de otras citoquinas, activación de receptores
(especialmente citoquina), desactivación, infra o
sobre-regulación, crecimiento o diferenciación
celular y similares. Una función antigénica significa la posesión
de un punto epítope o antigénico que es capaz de reaccionar
cruzadamente con anticuerpos generados contra el ligando mpl de
origen natural o la TPO. La principal función antigénica de un
ligando mpl o de un polipéptido TPO reside en la unión del mismo con
una afinidad de al menos aproximadamente 10^{6} l/mol con un
anticuerpo generado frente al ligando mpl o la TPO, aislado a partir
de plasma porcino aplástico. Habitualmente, el polipéptido se une
con una afinidad de al menos aproximadamente 10^{7} l/mol. Muy
preferiblemente, el ligando mpl antigénicamente activo o el
polipéptido TPO es un polipéptido que se une a un anticuerpo
generado contra el ligando mpl o la TPO, que tiene una de las
funciones efectoras descritas anteriormente. Los anticuerpos
utilizados para definir la "propiedad biológica" son
anticuerpos policlonales de conejo generados mediante la
formulación del ligando mpl o la TPO aislada a partir de cultivo
celular recombinante o plasma porcino aplástico en medio adyuvante
completo de Freund, inyectando subcutáneamente la formulación y
estimulando la respuesta inmune mediante inyección intraperitoneal
de la formulación hasta que el título de ligando mpl o de anticuerpo
TPO se estabiliza.
A través del término "polipéptidos TPO
pegilados" o variaciones gramaticales del mismo, se quiera dar a
entender un polipéptido TPO que ha sido modificado covalentemente
mediante unión del polipéptido TPO con uno de entre una diversidad
de polímeros no proteináceos, por ejemplo, con polietilenglicol,
polipropilenglicol, o polioxialquilenos, tal y como se ha indicado
anteriormente.
En humanos, el término "trombocitopenia" se
define como una dolencia en la que el contaje de plaquetas se sitúa
por debajo de 150 x 10^{9} por litro de sangre.
La "actividad trombopoyética" se define
como la actividad biológica que comprende la aceleración de la
proliferación, la diferenciación y/o la maduración de megacariocitos
o de precursores de megacariocitos hacia la forma productora de
plaquetas de estas células. Esta actividad pude ser medida en
diversos ensayos, incluyendo un ensayo de síntesis rebote en
plaqueta de ratón in vivo, inducción de ensayos de antígeno
en superficie celular de plaqueta, medido a través de un
inmunoensayo antiplaqueta (anti-GPII_{b}III_{a})
para una línea celular megacarioblástica de leucemia humana (CMK) e
inducción de poliploidización en una línea celular megacarioblástica
(DAMI).
La "trombopoyetina (TPO)" se define como un
compuesto que tiene actividad trombopoyética o que es capaz de
incrementar el contaje de plaquetas en suero en un mamífero. La TPO
resulta preferiblemente capaz de incrementar los contajes de
plaquetas endógenos en al menos un 10%, más preferiblemente en un
50% y, muy preferiblemente, de elevar el contaje de plaquetas en un
humano a niveles superiores a aproximadamente 150 x 10^{9} por
litro de sangre. También se hace referencia a otros nombres
presentes en la literatura para la TPO, tal y como se discutido
anteriormente en relación a los documentos de solicitud de patente
citados.
El término polipéptido "ligando mpl" o
"TPO" de esta invención presenta preferiblemente al menos el
70% de identidad de secuencia global con la secuencia de aminoácidos
del polipéptido ligando mpl porcino homogéneo sustancialmente
altamente purificado y al menos un 80% de identidad de secuencia con
el "dominio EPO" del polipéptido ligando mpl. Opcionalmente,
el ligando mpl (TPO) de esta invención es ligando mpl humano maduro
(hML), o una variante o una forma modificada
post-transcripcionalmente del mismo o una proteína
que tiene aproximadamente el 80% de identidad de secuencia con el
ligando mpl humano maduro. Opcionalmente, la variante de ligando
mpl es un fragmento, especialmente un aminoácido terminal o un
fragmento de "dominio-EPO", del ligando mpl
humano maduro (hML). Preferiblemente, el fragmento amino terminal
retiene sustancialmente la totalidad de la secuencia de ML de
origen humano entre el primer y el cuarto resto cisteína, pero puede
contener adiciones, supresiones o sustituciones sustanciales fuera
de esta región. Según esta realización, el polipéptido fragmento
puede ser representado a través de la fórmula:
X-hTPO(7-151)-Y
en la que
hTPO(7-151) representa la secuencia de
aminoácidos TPO (hML) humana desde Cys^{7} hasta Cys^{151},
inclusive; X representa el grupo amino de Cys^{7} o uno o más de
los restos aminoácido amino-terminales de la TPO
madura o extensiones de restos de aminoácido de las mismas, tales
como Met, Lys, Tyr o sustituciones de aminoácido de las mismas,
tales como arginina a lisina o secuencias líderes que contienen, por
ejemplo, puntos de rotura proteolíticos (por ejemplo, Factor Xa o
trombina); e Y representa el grupo carboxi terminal de Cys^{151} o
uno o más restos aminoácido carboxi-terminales de la
TPO madura o extensiones de la
misma.
Clones de DNA genómico humano del gen de TPO
fueron aislados mediante cribado de una librería genómica humana en
\lambda-Gem12 con pR45, en condiciones de
restricción bajas o bajo condiciones de restricción altas, con un
fragmento correspondiente a la mitad 3' de cDNA humano que codifica
para el ligando mpl. Dos clones lambda que se superponen abarcando
35 kb fueron aislados. Dos fragmentos que se solapan (BamH1 y Ncori)
conteniendo el gen TPO completo fueron subclonados y
secuenciados.
La estructura del gen humano se compone de 6
exones dentro de 7 kb de DNA genómico. Los límites de todas las
uniones están en consonancia con el motivo consensuado establecido
para los genes de mamífero (Shapiro, M.B. et al., Nucl.
Acids, Res. 15: 7155 [1987]). El exón 1 y el exón 2 contienen la
secuencia 5' no traducida y los cuatro aminoácidos iniciales del
péptido señal. El resto de señal secretora y los primeros 26
aminoácidos de la proteína madura son codificados dentro del exón
3. El dominio carboxilo completo y el 3' no traducido, al igual que
aproximadamente 50 aminoácidos del dominio similar a la
eritropoyetina son codificados dentro del exón 6. Los cuatro
aminoácidos involucrados en la supresión observada dentro de
hML-2(hTPO-2) son codificados
en el extremo 5' del exón 6.
El análisis de DNA genómico humano por medio de
análisis Southern indicaba que el gen para TPO se encontraba
presente en una copia única. La localización cromosómica del gen
fue determinada por medio de hibridación fluorescente in situ
(FISH), la cual permitió mapear el cromosoma
3q27-28.
La preparación y purificación de ML o de TPO
procedente de células 293 se describe en detalle en el Ejemplo 1.
Brevemente, cDNA correspondiente al marco de lectura abierta
completa de TPO fue obtenido por medio de PCR, utilizando
pRK5-hmpl1. El producto PCR fue purificado y clonado
entre los puntos de restricción ClaI y XbaI del plásmido
pRK5tkneo.ORF (un vector que codifica para el marco de lectura
abierta completo).
Un segundo vector que codifica para el dominio
homólogo de EPO fue generado de igual manera, pero utilizando
cebadores PCR diferentes, para obtener la construcción final
denominada pRK5-tkneoEPO-D.
Estas dos construcciones fueron transfectadas en
células Kidney Human Embryonic, mediante el procedimiento
CaPO_{4} y los clones resistentes a la neomicina fueron
seleccionados y dejados crecer hasta confluencia. La expresión de
ML_{153} o de ML_{332} en el medio acondicionado a partir de
estos clones fue valorada utilizando el ensayo de proliferación
Ba/F3-mpl.
La purificación de rhML_{332} fue llevada a
cabo tal y como se describe en el Ejemplo 1. Brevemente, medio
acondicionado 293-rhML_{332} fue aplicado a una
columna Blue-Sepharose® (Pharmacia), la cual fue
subsiguientemente lavada con un tampón conteniendo urea 2M. La
columna fue eluida con un tampón conteniendo urea 2M y NaCl 1M. El
agrupado de elución con Blue-Sepharose® fue después
aplicado directamente a una columna de
WGA-Sepharose®, lavado con 20 volúmenes de columna
de tampón conteniendo urea 2M y NaCl 1M y eluido con el mismo tampón
conteniendo
N-acetil-D-glucosamina
0,5M. El eluido de WGA-Sepharose® fue aplicado a una
columna C4-HPLC (Synchrom, Inc.) y eluido con un
gradiente de propanol discontinuo. Por medio de
SDS-PAGE, el 293-fhML_{332}
purificado migra, en forma de banda amplia en la región
68-80 kDa del gel.
Se llevó también a cabo la purificación de
rhML_{153}, tal y como se describe en el Ejemplo 1. Brevemente,
medio acondicionado 293-rhML_{332} fue resuelto
sobre Blue-Sepharose®, tal y como se describe para
rhML_{332}. El eluido Blue-Sepharose® fue
aplicado directamente a una columna de afinidad mpl, tal y como se
ha descrito anteriormente. El eluido rhML_{153} procedente de la
columna de afinidad mpl fue purificado hasta homogeneidad
utilizando una columna Ca-HPLC, funcionando bajo las
mismas condiciones utilizadas para rhML_{332.} Por medio de
SDS-PAGE, el rhML_{153} se resuelve en 20 bandas
importantes y 2 bandas menores, con Mr de entre aproximadamente
18.000 a 22.000.
Los vectores de expresión utilizados para
transfectar células CHO se designan: pSV15.ID.LL.MLORF (longitud
completa de TPO_{332}) y pSV15.ID.LL.MLEPO-D
(truncado o TPO_{153}).
cDNA correspondiente al marco de lectura abierta
completo de TPO fue obtenido por medio de PCR. El producto PCR fue
purificado y clonado entre los puntos de restricción (ClaI y SalI)
del plásmido pSV15.ID.LL, para obtener el vector pSV15.ID.MLORF.
Una segunda construcción, correspondiente al dominio homólogo de
EPO, fue generada de la misma forma pero utilizando un cebador
inverso diferente (EPOD.Sal). La construcción final para el vector
que codifica pata el dominio homólogo EPO de TPO se denomina
pSV15.ID.LL.MLEPO-D.
Estas dos construcciones fueron linearizadas con
NotI y transfectadas en células de ovario de hámster chino (células
CHO-DP12, EP 307.247, publicada el 15 de marzo de
1989), por medio de electroporación. 10^{7} células fueron
electroporadas en un aparato de electroporación BRL (350 voltios,
330 mF, capacitancia baja), en presencia de 10, 25 0 50 mg de DNA,
tal y como se ha descrito (Andreason, G.L. J. Tissue Cult. Meth.,
15: 56 [1993]). El día siguiente a la transfección, las células
fueron separadas en medio selectivo para DHFR
(DMEM-F12 50:50 glucosa elevada, sin glicina,
glutamina 2 mM, suero de ternera fetal dializado
2-5%). Transcurridos entre 10 y 15 días, las
colonias individuales fueron transferidas a placas de 96 pocillos y
se dejaron crecer hasta confluencia. La expresión de ML_{153} o
de ML_{332} en medio acondicionado a partir de estos clones fue
valorada utilizando el ensayo de proliferación
Ba/F3-mpl.
El procedimiento para purificar y aislar TPO a
partir de fluido recogido de cultivo celular de CHO se describe en
el Ejemplo 2. Brevemente, el fluido de cultivo celular recogido
(HCCF) es aplicado a una columna Blue-Sepharose®
(Pharmacia), a una relación de aproximadamente 100L de HCCF por
litro de resina. La columna es lavada después con entre 3 y 5
volúmenes de columna de tampón, seguido de entre 3 y 5 volúmenes de
columna de un tampón que contiene urea 2.0M. La TPO es eluida
después con entre 3 y 5 volúmenes de columna de tampón conteniendo
urea 2,0M y NaCl 1,0M.
El agrupado de eluido de Bleu Sepharose que
contiene TPO es después aplicado a una columna Wheat Germ Lectin
Sepharose (Pharmacia), equilibrada en tampón de elución Bleu
Sepharose, a una relación de entre 8 y 16 ml de eluido por ml de
resina. La columna es lavada después con entre 2 y 3 volúmenes de
tampón de equilibrio. La TPO es después eluida con entre 2 y 5
volúmenes de columna de un tampón que contiene urea 2,0M y
N-acetil-D-glucosamina
0,5M.
El eluido Wheath Germ Lectin que contiene TPO es
después acidificado y se añade C_{12}E_{8,} hasta una
concentración final de 0,04%. El agrupado resultante es aplicado a
una columna C4 en fase inversa, equilibrada en TFA 0,1%,
C_{12}E_{8} 0,04%, a una carga de aproximadamente entre 0,2 y
0,5 mg de proteína por ml de resina.
La proteína es eluida en un gradiente lineal de
dos fases de acetonitrilo, que contiene TFA 0,1% y C_{12}E_{8}
0,04% y se prepara un agrupado en base a
SDS-PAGE.
El agrupado C4 es posteriormente diluido y
diafiltrado frente a aproximadamente 6 volúmenes de tampón sobre
una membrana Amicon YM o una membrana de ultrafiltración similar,
que tiene un corte comprendido entre 10.000 y 30.000 Daltons de
peso molecular. El diafiltrado resultante puede ser después
procesado directamente o concentrado nuevamente mediante
ultrafiltración. El diafiltrado/concentrado es habitualmente
ajustado hasta una concentración final de Tween® 80 0,01%.
La totalidad o una parte del
diafiltrado/concentrado equivalente a entre el 2 y el 5% del volumen
de columna calculado es después aplicada a una columna HR de
Sephacryl S-300 HR (Pharmacia), equilibrada en un
tampón que contiene Tween® 80 0,01% y es cromatografiado. Las
fracciones que contienen TPO, exentas de productos de degradación
proteolítica y de agregados, son posteriormente agrupadas en base a
SDS-PAGE. El agrupado resultante es filtrado y
almacenado a entre 2-8ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de vectores de expresión de
E. coli TPO se describe en detalle en el Ejemplo 3.
Brevemente, los plásmidos pMP121, pMP151, pMP141, pMP57 y pMP202
fueron todos ellos diseñados para expresar los primeros 155
aminoácidos de TPO, aguas debajo de un pequeño líder que varía entre
las diferentes construcciones. Los líderes proporcionan
principalmente un elevado nivel de inicio de traducción y una
purificación rápida. Los plásmidos pMP210-1, T8,
-21, -22, -24, -25 son diseñados a los efectos de expresar los
primeros 155 aminoácidos de TPO aguas debajo de una metionina de
inicio y tan solo difieren en el uso del codon para los 6 primeros
aminoácidos de TPO, mientras que el plásmido pMP251 es un derivado
de pMP210-1, en el que el extremo carboxi terminal
de la TPO es extendido en dos aminoácidos. La totalidad de los
plásmidos mencionados anteriormente generarán elevados niveles de
expresión intracelular de TPO en E. Coli, tras inducción del
promotor triptófano (Yansure, D.G. et al, Methods in
Enzymology, 185: 54- 60 (Goeddel, D.V., Ed) Academic Press, San
Diego [1990]). Los plásmidos pMP1 y pMP172 son intermedios en la
construcción de los plásmidos de expresión intracelular de TPO
mencionados anteriormente.
Los plásmidos de expresión de TPO mencionados
anteriormente fueron utilizados para transformar la E. coli
utilizando el procedimiento de choque de calor con CaCl_{2}
(Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53:
159-162, [1970]) y otros procedimientos descritos en
el Ejemplo 3. Brevemente, las células transformadas fueron
cultivadas primero a 37ºC, hasta que la densidad óptica (60 nm) del
cultivo alcanzó un valor situado aproximadamente entre
2-3. El cultivo fue entonces diluido y, después de
crecimiento con aireación, se añadió ácido. Se permitió entonces
que el cultivo continuase creciendo con aireación, durante un
período de otras 15 horas, transcurrido el cual las células fueron
recogidas por medio de centrifugación.
Los procedimientos de aislamiento, purificación
y renaturalización proporcionados más adelante para la producción
de TRO humana renaturalizada, biológicamente activa, o de fragmentos
de la misma, descritos en el Ejemplo 4, pueden ser aplicados a la
recuperación de cualquier variante de TPO, incluyendo las formas
extendidas N y C terminales. Otros procedimientos adecuados para la
renaturalización, recombinante o sintética de TPO, pueden
encontrarse en las siguientes patentes: Builder et al., USP
4.511.502; Jones et al., USP 4.512.922; Olson, USP 4.518.526
y Builder et al., USP 4.620.948; para una descripción general
de los procesos de recuperación y renaturalización relativos a una
diversidad de proteínas recombinantes expresadas en una forma
insoluble en E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad trombopoyética puede ser medida en
diversos ensayos, incluyendo el ensayo de ligando mpl Ba/F3. Un
ensayo in vivo de síntesis de rebote de plaqueta en ratón,
inducción de ensayo de antígeno de superficie celular de plaqueta,
medido a través de inmunoensayo anti-plaqueta
(anti-GPII_{b}III_{a}), para determinar una
línea celular megacarioblástica de leucemia humana (CMK) (ver Sato
et al., Brit. J. Haematol. 72: 184-190) e
inducción de poliploidización en línea celular megacarioblástica
(DAMI) (ver Ogura et al., Blood, 72/1):
49-60 [1988]). La maduración de megacariocitos a
partir de células mayoritariamente no sintetizadoras de DNA,
inmaduras, hacia megacariocitos morfológicamente identificables
conlleva un procedimiento que incluye la aparición de organelos
citoplásmicos, la adquisición de antígenos de membrana
(GPII_{b}III_{a}), la endorreplicación y liberación de
plaquetas, tal como se describe en el estado de la técnica. Cabría
esperar que un promotor específico del linaje (a saber, el ligando
mpl), de maduración magacariocita, indujera al menos algunos de
estos cambios en megacariocitos inmaduros que conducen a la
liberación de plaquetas y al alivio de la trombocitopenia. Así
pues, se diseñaron ensayos para medir la emergencia de estos
parámetros en líneas celulares de megacariocitos inmaduras, a
saber, células CMK y DAMI. El ensayo CMK mide la aparición de un
marcador de plaquetas específico, el GPII_{b}III_{a}, y la
eliminación de plaquetas. El ensayo DAMI mide la endorreplicación,
dado que los incrementos en la ploidía constituyen marcas de
identidad de los megacariocitos maduros. Los magecariocitos
reconocibles tienen valores de ploidía de 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, etc.
Finalmente, el ensayo de rebote en plaqueta de ratón in vivo
resulta de utilidad a la hora de demostrar que la administración del
compuesto de prueba (aquí, el ligando mpl) da como resultado una
elevación en los números de plaquetas.
Para medir la actividad TPO se han desarrollado
dos ensayos in vitro adicionales. El primero de ellos es una
activación del receptor quinasa (KIRA)ELISA, en el cual
células CHO son transfectadas con quimera mpl-Rse y
la fosforilización de tirosina de Rse es medida a través de ELISA,
después de la exposición de la parte mpl de la quimera al ligando
mpl. El segundo es un receptor basado en ELISA, en el cual IgG
anti-humana de conejo revestida con placa ELISA
captura el receptor quimérico humano mpl-IgG, el
cual se une al ligando mpl que está siendo ensayado. Para detectar
el ligando mpl unido se utiliza un anticuerpo policlonal biotinilado
de conejo frente al ligando mpl (TPO_{155}), procediéndose a
llevar a cabo la medición utilizando
estrepavin-peroxidasa.
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La proteína trombopoyética biológicamente activa
(TPO) puede ser utilizada en una preparación o formulación
farmacéutica estéril para estimular la actividad
megacariocitopoyética o trombopoyética, en pacientes que sufren de
trombocitopenia debido a una producción defectuosa, secuestro o a
un incremento en la destrucción de plaquetas. La hipoplasia de
médula ósea asociada a trombocitopenia (por ejemplo, anemia
aplástica subsiguiente a quimioterapia o transplante de médula
ósea) puede ser tratada de forma eficaz con los compuestos de esta
invención, al igual que trastornos tales como la coagulación
intravascular diseminada (DIC), la trombocitopenia inmune
(incluyendo ITP inducida por HIV e ITP no inducida por HIV), la
trombocitopenia idiopática crónica, la trombocitopenia congénita,
la mielodisplasia, y la trombocitopenia trombótica. Adicionalmente,
estas proteínas megacariocitopoyéticas pueden resultar de utilidad
en el tratamiento de enfermedades trombocitóticas
mieloproliferativas, al igual que en el de la trombocitosis derivada
de dolencias inflamatorias y en la deficiencia en hierro.
Entre los usos preferidos de la proteína
trombocitopoyética (TPO) de esta invención se encuentran: en
quimioterapia mielotóxica para el tratamiento de la leucemia o de
tumores sólidos, en quimioterapia mieloablativa para transplante de
médula ósea alogénico o autólogo, en mielodisplasia, en anemia
aplástica idiopática, en trombocitopenia congénita y en
trombocitopenia inmune.
En la relación de todavía otros trastornos
tratados con las proteínas trombopoyetinas de esta invención se
incluyen defectos o daños a plaquetas que resultan de fármacos,
intoxicación o activación sobre superficies artificiales. En estos
casos, los presentes compuestos pueden ser utilizados para estimular
la "eliminación" o nuevas plaquetas "no dañadas".
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Ejemplo
Un cDNA correspondiente al marco de lectura
abierta completa de TPO fue obtenido por medio de PCR, utilizando
los siguientes oligómeros como cebadores:
Se utilizó prk5-Hmpl como
plantilla para la reacción en presencia de polimerasa DNA pfu
(Stratagene). La desnaturalización inicial duró 7 minutos a 94ºC,
seguido de 25 ciclos de amplificación (1 min. a 94ºC, 1 min. a 55ºC
y 1 min. a 72ºC). La extensión final fue de 15 min. a 72ºC. El
producto PCR fue purificado y clonado entre los puntos de
restricción ClaI y XbaI del plásmido pRK5tkneo, un vector derivado
de pRK5 modificado para expresar un gen resistente a la neomicina
bajo control del promotor timidina quinasa, para obtener el vector
pRK5tkneo.ORF. Una segunda construcción correspondiente al dominio
homólogo epo fue generada del mismo modo pero utilizando Cla.FL.F
como cebador delantero y el siguiente cebador inverso:
La construcción final se denomina
pRK5-tkaneoEPO-D. La secuencia de
ambas construcciones fue verificada.
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Estas dos construcciones fueron transfectadas en
células Human Embryonic Kidney, por el procedimiento CaPO_{4}.
Transcurridas 24 horas desde la transfección, se dió inicio a la
selección de los clones resistentes a la neomicina, en presencia de
G418 0,4 mg/ml. Entre 10 y 15 días más tarde las colonias
individuales fueron transfectadas a placas de 96 pocillos y se
dejaron crecer hasta confluencia. La expresión de ML_{153} o de
ML_{332} (TPO153 o TPO332) en el medio acondicionado a partir de
estos clones fue valorada utilizando el ensayo de proliferación
Ba/F3-mpl.
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El medio acondicionado con
392-rhML_{332} fue aplicado a una columna
Blue-Sepharose® (Pharmacia) que fue equilibrada en
fosfato sódico 10 mM, pH 7,4 (tampón A). La columna fue después
lavada con 10 volúmenes de columna de tampón A y de tampón A
conteniendo urea 2M. La columna fue después eluida con tampón A
conteniendo urea 2M y NaCl 1M. El agrupado de elución
Bleu-Sepharose® fue después aplicado directamente a
una columna de WGA-Sepharose® equilibrada en tampón
A. La columna de WGA-Sepharose® fue después lavada
con 10 volúmenes de columna de tampón A conteniendo urea 2M y NaCl
1 m y eluida con el mismo tampón conteniendo
N-acetil-D-glucosamina
0,5M. El eluido WGA-Sepharose® fue aplicado a una
columna C4-HPLC (Synchrom, Inc), equilibrado en TFA
0,1%. La columna C4-HPLC fue eluida con gradiente
de propanol discontinuo (0-25%,
25-35%, 35-70%). Se averiguó que
rhML_{332} eluía en la región propanol 28-30% del
gradiente, por medio de SDS-PAGE el rhML_{332}
migra en forma de banda ancha en la región de
68-8-kDa del gel.
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Medio acondicionado con
392-rhML_{153} fue resuelto sobre
Blue-Sepharose®, tal y como se describe para
rhML_{332}. El eluido Blue-Sepharose® fue aplicado
directamente a una columna de afinidad mpl, tal y como se ha
descrito anteriormente. El eluido rhML_{153} procedente de la
columna de afinidad mpl fue purificado hasta homogeneidad,
utilizando una columna C4-HPLC, operada utilizando
las mismas condiciones que las descritas para rhML_{332}. A
través de SDS-PAGE el rhML_{153} se resuelve en
dos bandas mayores y 2 bandas menores con Mr de aproximadamente
entre 18.000 y 21.000.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han designado los vectores de expresión
utilizados en los protocolos de electroporación descritos más
adelante:
pSV15.ID.LL.MLORF (longitud completa o
hTPO_{332}), y
pSV15.ID.LL.MLEPO-D (truncado o
hTPO_{153}).
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Un cDNA correspondiente al marco de lectura
abierta completa hTPO fue obtenido por medio de PCR, utilizando los
cebadores oligonucleótido de la siguiente tabla:
Para la reacción en presencia de pfu DNA
polimerasa (Stratagene) se utilizó PRKS-hmpl como
plantilla. La desnaturalización inicial duró 7 min. a 94ºC, seguida
de 25 ciclos de amplificación (1 min. a 94ºC, 1 min. a 55ºC y 1
min. a 72ºC). La extensión final fue de 15 min. a 72C. El producto
PCR fue purificado y clonado entre los puntos de restricción ClaI y
SalI del plásmido pSV15.ID.LL para obtener el vector
pSV15.ID.LL.MOLRF. Se generó una segunda construcción,
correspondiendo al dominio homólogo EPO, haciendo lo mismo, pero
utilizando Cla.FL.F2 como cebador delantero y el siguiente cebador
inverso:
La construcción final se denomina
pSV15.ID.LL.MLEPO.D. La secuencia de ambas construcciones fue
verificada.
En esencia, las secuencias que codifican para el
ligando de longitud completa y el ligando fueron introducidas en el
punto de clonado múltiple del vector de expresión de CHO
pSVqi.ID.LL. Este vector contiene la región promotora/reforzadora
temprana SV40, una unidad de empalme que contiene el DHFR cDNA de
ratón, un punto de clonado múltiple para la introducción del gen de
interés (en este caso, las secuencias de TPO descritas), una señal
de poliadenilación de SV40 y origen de replicación y el gen
beta-lactamasa para selección de plásmido y
amplificación en bacterias.
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La línea celular CHO huésped (Ovario de Hámster
Chino) utilizada para la expresión de las moléculas TPO descritas
en el presente documento es conocida como CHO-DP12
(ver, EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989). Esta línea
celular de mamífero fue seleccionada clonalmente a partir de una
transfección de la línea padre (CHO-K1
DUX-B11 (DHFR-)-, facilitada por el Dr. Frank Lee de
la Universidad de Stanford, con la autorización del Dr. L. Chasin),
con un vector que expresa la pre-proinsulina, para
obtener clones con bajo requerimiento de insulina. Estas células
son también menos DHFR y el escaneado de los clones puede ser
seleccionado para determinar la presencia de secuencias del vector
DHFR cDNA, a través de crecimiento en medio privado de suplementos
nucleósido (glicina, hipoxantina, y timidina). Este sistema de
selección se utiliza habitualmente para líneas celulares que
expresan CHO.
expresan CHO.
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Las líneas celulares que expresan TPO_{332} y
TPO_{153} fueron generadas por medio de transfección de células
DP12 a través de electroporación (ver, por ejemplo, Andreason, G.L.
J. Tiss. Cult. Meth., 15, 56 (1993), con plásmidos
pSV15.ID.LL.MLORF o pSV15.ID.LL.MLEPO-D
linearizados, respectivamente. Se establecieron tres (3) mezclas de
reacción de enzimas para cada uno de los cortes de plásmido; 10
\mug, 25 \mug y 50 \mug del vector con el enzima NOTI, a
través de procedimientos de biología molecular estándar. Este punto
de restricción es tan solo encontrado una vez en el vector en la
región de linearización 3' y fuera de las unidades de transcripción
de ligando TPO (ver la Fig. 23). Las reacciones de 100 \mul fueron
programadas para incubación durante el transcurso de una noche a 37
grados. Al día siguiente, las mezclas fueron extraídas con
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (50:49:1) una vez y precipitadas
sobre hielo durante aproximadamente una hora. El precipitado fue
recogido después mediante microcentrifugación durante 15 minutos y
secado. El DNA linearizado fue resuspendido en 50 \mul de medio
Harm DMEM:F12 1:1, suplementado con antibióticos estándar y
glutamina 2 mM.
Las células DP12 cultivadas en suspensión fueron
recogidas, lavadas una vez en el medio descrito para la
resuspensión de DNA y, finalmente, resuspendidas en el mismo medio a
una concentración de 10^{7} células por 750 \mul. Alícuotas de
células (750 \mul) y de cada una de las mezclas de DNA linearizado
fueron incubadas conjuntamente a temperatura ambiente durante una
hora y después transferidas a una cámara de electroporación BRL.
Cada una de las mezclas de reacción fue después sometida a
electroporación en un aparato para electroporación BRL estándar, a
350 voltios, programado a 330 \muF y a baja capacitancia.
Finalizada la electroporación, se permitió que las células se
asentaran en el aparato durante un período de 5 minutos y después
sobre hielo durante un período adicional de incubación de 10
minutos. Las células electroporadas fueron transferidas a platos de
cultivo celular de 60 mm conteniendo 5 ml de medio de crecimiento
completo estándar para células CHO (glucosa elevada
DM6M-1= 12 50:50, sin suplemento de glicina con 1 X
GHT, glutamina 2 mM y suero de ternera fetal 5%) y se cultivaron
durante el transcurso de una noche en una incubadora de cultivo
celular con CO_{2} 5%.
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Al día siguiente, las células fueron
tripsinizadas fuera de las placas a través de procedimientos
estándar y transferidas a platos de cultivo tisulares de 150 mm
conteniendo medio selectivo DHFR (el medio Ham
DMEM-F12, 1:1 descrito anteriormente, suplementado
con, o bien suero de ternera fetal dializado al 2% o al 5%, pero
privado de glicina, hipoxantina y timidina, este es el medio de
selección DHFR estándar que utilizamos). Células procedentes de
cada uno de los platos de 60 mm fueron reubicadas posteriormente en
platos de 5/150 mm. Las células fueron después incubadas durante un
período de entre 10 y 15 días (con un cambio de medio) a
37ºC/CO_{2} 15%, hasta que los clones empezaron a aparecer y
alcanzar tamaños manejables para ser transferidos a platos de 96
pocillos. A los largo de un período de entre 4 y 5 días, las líneas
celulares fueron transferidas a platos de 96 pocillos utilizando
puntas amarillas estériles sobre una pipettman fijada en 50 ml. Las
células fueron dejadas crecer hasta alcanzar la confluencia
(habitualmente 3-5 días) y después las bandejas
fueron tripsinizadas y 2 copias de la bandeja original fueron
reproducidas. Dos de estas copias fueron almacenadas a corto plazo
en un congelador, con las células en cada uno de los pocillos
diluidas en 50 \mul pf de FCS al 10% en DMSO. Las muestras
acondicionadas en medio exento de suero durante 5 días fueron
sometidas a ensayo desde los pocillos confluentes en la tercera
bandeja para determinar la expresión de TPO a través de ensayo de
actividad basado en células Ba/F. Los clones de expresión más
elevada basados en este ensayo fueron revividos desde el almacenaje
y escalados hasta dos matraces T de 150 mm, confluyentes, para
transferencia al grupo de cultivo celular, con vistas a determinar
la adaptación a la suspensión, el re-ensayo y la
creación de bancos.
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Varias de las líneas celulares de título más
elevado procedentes de la selección mencionada anteriormente fueron
sometidas posteriormente a un régimen de amplificación con
metotrexato estándar, con vistas a generar clones de título más
elevado. Clones de células CHO son expandidos y colocados en placas
en platos de 10 cm a 4 diferentes concentraciones de metotrexato (a
saber, 50nM, 100nM, 200nM y 400nM), a dos o tres números de células
(105,5 x 105 y 106 células por plato). Estos cultivos son después
incubados a 37ºC /CO_{s} 5%, hasta que los clones se han
establecido y resultan manejables para ser transferidos a platos de
96 pocillos para un nuevo ensayo. Varios clones de título más
elevado procedentes de esta selección fueron sometidos de nuevo a
concentraciones más elevadas de metotrexato (a saber, 600nM, 800nM,
1000nM y 1200nM) y, al igual que antes, se permitió que los clones
resistentes se establecieran y fueran después transferidos a platos
de 96 pocillos y sometidos a ensayo.
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Células del banco fueron descongeladas y la
población celular expandida por medio de procedimientos de
crecimiento celular, ya sea en medio exento de suero o en medio que
contenía suero. Una vez lograda la expansión hasta una densidad
celular suficiente, se lavaron las células para eliminar el medio de
cultivo consumido. Las células fueron después cultivadas por medio
de cualquier procedimiento estándar, incluyendo producción por
lotes, cultivo discontinuo o cultivo continuo, a entre 25 y 40ºC, pH
neutro, con un contenido de O_{2} disuelto de al menos el 5%,
hasta que se acumuló la TPO secretada. El fluido de los cultivos
celulares fue después separado de las células a través de medios
mecánicos, tales como la centrifugación.
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Fluido de cultivo celular recogido (HCCF) es
directamente aplicado a una columna Blue Sepharose® 6 Fast Flow
(Pharmacia), equilibrada en fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, NaCl
0,15M, a una proporción de aproximadamente 100 mL de HCCF por litro
de resina y a un caudal lineal de aproximadamente 300
ml/hr/cm^{2}. La columna es después lavada con entre 3 y 5
volúmenes de columna de tampón de equilibrio, seguido de entre 3 y 5
volúmenes de fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, urea 2,0M. La TPO es
después eluida con entre 3 y 5 volúmenes de columna de fosfato
sódico 0,01M, pH 7,4, urea 2,0M, NaCl 1,0M.
El agrupado de Blue Sepharose® que contiene la
TPO es después aplicado a una columna Sepharose® 6MB, de lectina de
germen de trigo (Pharmacia), equilibrada en fosfato sódico 0,01M, pH
7,4, urea 2,0M y NaCl 1,0M, a una proporción de entre 8 y 16 ml de
agrupado de Blue Sepharose® por ml de resina, a un caudal de
aproximadamente 50 ml/hr/cm^{2}. la columna es lavada después con
entre 2 y 3 volúmenes de tampón de equilibrio. La TPO es después
eluida con entre 2 y 5 volúmenes de fosfato sódico 0,01M, pH 7,4,
urea 2,0M,
N-acetil-D-glucosamina
0,5M.
El agrupado de lectina de germen de trigo es
después ajustado hasta alcanzar una concentración final de
C_{12}E_{8} 0,04% y ácido trifluoroacético (TFA) 0,1%. El
agrupado resultante es aplicado a una columna en fase inversa C4
(Vydac 214TP1022), equilibrada en TFA 0,1%, C_{12}E_{8}, a una
carga de aproximadamente entre 0,2 y 0,5 mg de proteína por ml de
resina, a un caudal de 157 ml/hr/cm^{2}.
La proteína es eluida en un gradiente lineal de
dos fases de acetonitrilo que contiene TFA 0,1%, C_{12}E_{8}
0,04%. La primera fase está compuesta de de un gradiente lineal de
entre 0 y 30% de acetonitrilo, en 15 minutos, la segunda fase está
compuesta por un gradiente lineal de entre 30 y 60% de acetonitrilo,
en 60 minutos. La TPO es eluida a aproximadamente 50% de
acetonitrilo. Se obtiene un agrupado en base a
SDS-PAGE.
El agrupado de C4 es después diluido con 2
volúmenes de fosfato sódico 0,01M pH 7,4, NaCl 0,15M y diafiltrado
versus aproximadamente 6 volúmenes de fosfato sódico 0,01M, pH 7,4,
NaCl 0,15M, sobre una membrana de ultrafiltración Amicon YM o
similar, que tiene un corte de entre 10.000 y 30.000 daltons de peso
molecular. El diafiltrado resultante es después procesado
directamente o concentrado adicionalmente por medio de
ultrafiltración. El diafiltrado/concentrado es ajustado hasta
alcanzar una concentración final de Tween® 80 0,01%.
La totalidad o una parte del
diafiltradio/concentrado, equivalente a entre el 2 y el 5% del
volumen de columna calculado, es después aplicada a una columna
Sephacryl®S-3000 HR (Pharmacia), equilibrada en
fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15M, Tween® 80 0,01% y
cromatografiada a un caudal de aproximadamente 17 ml/hr/cm^{2}.
Las fracciones que contienen TPO que están exentas de acumulado y de
productos de degradación proteolítica son agrupados en base a
SDS-PAGE. El agrupado resultante es filtrado sobre
un filtro de 0,22\mu. Millex-GV o similar, y
almacenado a 2-8ºC.
Los plásmidos pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 y
pMP202 han sido, todos ellos, diseñados para expresar los primeros
155 aminoácidos de TPO, aguas debajo de un líder pequeño, que varía
entre diferentes construcciones. Los líderes proporcionan
primeramente un elevado nivel de inicio de traducción y una
purificación rápida. Los plásmidos pMP210-1, -T8,
-21, -22, -24, -25 son diseñados para expresar los primeros 153
aminoácidos de TPO, aguas debajo de una metionina de inicio, y
difieren tan solo en el codon utilizado para los 6 primeros
aminoácidos de TPO, mientras que el plásmido pMP251 es un derivado
de pMP210-1, en el cual la terminación carboxi
terminal de TPO es extendida en dos aminoácidos. La totalidad de
plásmidos mencionada anteriormente producirá niveles elevados de
expresión intracelular de TPO en E. coli, tras inducción del
promotor triptófano (Yansura, D.G. et al., Methods in
Enzymology (Goeddel D.V., Ed) 185: 54-60, Academic
Press, San Diego [1990]). Los plásmidos pMP1 y pMP172 son
intermedios en la construcción de los plásmidos de expresión
intracelular de TPO mencionados anteriormente.
El plásmido pMP1 es un vector de secreción para
los 155 primeros aminoácidos de TPO, y fue construido mediante la
unión conjunta de 5 fragmentos de DNA. El primero de ellos era el
vector pPho21, en el cual el fragmento pequeño de
MluI-BamHI había sido eliminado. El pPho21 es un
derivado de phGH1 (Chang, C.N. et al., Gene 55:
189-196(1987), en el cual el gen de la
hormona de crecimiento humano ha sido sustituido por el gen phoA de
E. coli, y un punto de restricción MluI ha sido introducido,
mediante ingeniería, en la secuencia de codificación para la
secuencia señal STII en el aminoácidos 20-21.
Los siguientes dos fragmentos, una pieza
HinfI-PstI de 258 pares de base de DNA procedente de
pRK5-hpml que codifica para los aminoácidos de TPO
19-103, y el siguiente DNA sintético que codifica
para los aminoácidos 1-18.
fueron preligados con
T4-DNA ligasa, y el segundo corte con PstI. El
cuarto era un fragmento PstI-HaelII de 152 pares de
base, que codifica para los aminoácidos 104-155 de
TPO. El último era un fragmento Stut-BamHI, de 412
pares de base, procedente de pdh108, que contiene el finalizador
lambda hasta el finalizador lambda a transcripcional, tal y como se
ha escrito anteriormente (Scholtissek, S. et al., NAR 15:3185
[1987]).
El plásmido pMP21 es diseñado para expresar los
primeros 155 aminoácidos de TPO, con la ayuda de un líder de 13
aminoácidos que comprende parte de la secuencia señal STII. Fue
construido uniendo conjuntamente tres (3) fragmentos de DNA, siendo
el primero de ellos el vector pVEG31, en el cual el fragmento
XbaI-SphI pequeño ha sido eliminado. El vector
pVEG31 es un derivado de pHGH207-1 (de Boer, H.A.
et al.), en Promoter Structure and Function (Rodriguez, R.L.
and Chamberlain, M.J. Ed.), 462, Praeger, New York [1982]), en el
cual el gen de la hormona de crecimiento humana ha sido sustituido
por el gen para el factor de crecimiento endotélico (este fragmento
de vector idéntico puede ser obtenido a partir de este último
plásmido).
La segunda parte en la unión era un dúplex de
DNA sintético, con la siguiente secuencia:
La última pieza era un fragmento
MluI-SphI de 1072 pares de base procedente de pMP1,
que codifica para 155 aminoácidos de TPO.
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El plásmido pMP151 es diseñado para expresar los
primeros 155 aminoácidos de TPO, aguas debajo de un líder que
comprende 7 aminoácidos de la secuencia señal STII, 8 histidinas y
un factor de punto de rotura Xa. El pMP151 fue construido uniendo
conjuntamente tres fragmentos de DNA, siendo el primero de ellos el
vector pVEG31 descrito anteriormente, a partir del cual se había
eliminado el fragmento XbaI-SphI pequeño. El segundo
era un dúplex de DAN sintético con la siguiente secuencia:
El último era un fragmento
BglI-SphI de 1064 pares de base, procedente de
pMP11, que codifica para 154 aminoácidos de TPO. El plásmido pMP11
es idéntico a pMP1, con la excepción de unos pocos cambios en la
secuencia señal STII (este fragmento puede ser obtenido en
pMP1).
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El plásmido pMP202 es muy similar al vector de
expresión pMP151, con la excepción de que el factor punto de rotura
Xa en el líder ha sido sustituido por un punto de rotura trombina.
Tal como se muestra en la Fig. 36, el pMP202 fue construido uniendo
conjuntamente tres fragmentos de DNA. El primero de ellos era el
pVEG31 descrito anteriormente, en el cual el fragmento
XbaI-SphI pequeño había sido eliminado. El segundo
era un dúplex de DNA sintético, con la siguiente secuencia:
La última pieza era un fragmento
BglI-SphI de 1064 pares de base, procedente del
plásmido pMP11 escrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pMP172 es un vector de secreción
para los 153 primeros aminoácidos de TPO, y es un intermedio para la
construcción de pMP210. Se preparó el pMP172 uniendo conjuntamente
tres fragmentos de DNA, el primero de los cueles era un vector
pLS321 amB, en el que se había eliminado la sección
EcorI-HindI pequeña. El segundo era un fragmento
pLS321 de 946 pares de base, procedente del plásmido pMP11 descrito
anteriormente. La última pieza era un dúplex de DNA sintético, con
la siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pMP210 es diseñado para expresar los
primeros 153 aminoácidos de TPO, después de un inicio metionina
traduccional. Realmente, el plásmido fue preparado como un banco de
plásmidos en el cual los primeros 6 codones de TPO fueron
aleatorizados en la tercera posición de cada uno de los codones y
construido uniendo tres fragmentos de DNA. El primero de ellos era
el descrito previamente como pVEG31, en el cual el fragmento
XbaI-SphI pequeño había sido eliminado. El segundo
era un dúplex de DNA sintético, mostrado más adelante, tratado
primero con DNA polimerasa (Klenow), seguido de digestión con XbaI e
HinI y que codifica para la metionina de inicio y los 6 primeros
codones randomizados de TPO.
El tercero era un fragmento
HinfI-SphI de 890 pares de bases, procedente de
pMP172 que codifica para los aminoácidos 19-153 de
TPO.
El banco de plásmidos pMP210, de aproximadamente
3700 clones, fue retransformado en placas LB con alto contenido en
tetraciclina (50 \mug/ml), con vistas a seleccionar clones de
inicio de traducción elevada (Yansura, D.G. et al., Methods:
A Companion to Methods in Enzymology 4: 151-158
[1992]). De las 8 colonias que aparecieron en las placas con elevado
contenido en tetraciclina, cinco de las mejores, en términos de
expresión de TPO, fueron sometidas a secuenciado de DNA.
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El plásmido pMP41 es diseñado para expresar los
primeros 155 aminoácidos de TPO fusionados a un líder de 7
aminoácidos de la secuencia señal STII, después de un punto de
rotura factor Xa. El plásmido fue construido uniendo conjuntamente
tres piezas de DNA, la primera de las cuales era el vector pVEG31
descrito previamente, en el que el fragmento
XbaI-SphI había sido eliminado. El segundo era el
siguiente dúplex de DNA:
La última pieza de la unión era el fragmento
BgII-SphI de 1064 pares de base, procedente del
plásmido pMP11 descrito anteriormente.
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El plásmido pMP57 expresa los primeros 155
aminoácidos de TPO, aguas abajo de un líder que comprende 9
aminoácidos de la secuencia señal StlI y el punto
Lys-Arg dibásico. Este punto dibásico proporciona un
medio para eliminar el líder con la proteasa ArgC. Este plásmido fue
construido uniendo conjuntamente tres piezas de DNA. La primera de
ellas era el vector pVEG31 descrito anteriormente, en el que el
fragmento XbaI-SphI pequeño había sido eliminado. El
segundo era el siguiente dúplex de DNA:
La última parte de la unión era el fragmento
BglI-SphI de 1064 pares de base, procedente del
plásmido pMP11 descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pMP251 es un derivado de
pMP210-1 en el que dos aminoácidos de TPO
adicionales son incluidos en el extremo terminal carboxilo. Este
plásmido fue construido uniendo conjuntamente dos piezas de DNA,
siendo la primera de ellas el pMP21 descrito anteriormente, en el
que el fragmento XbaI-ApaI pequeño había sido
eliminado. La segunda parte de la unión era un fragmento
XbaI-ApaI de 316 pares de base, procedente de
pM210-1.
2. Transformación e inducción de E. coli
con vectores de expresión de TPO. Para transformar la cepa 44C6
(w31 10 tonA \DeltarpoHts lon\Delta cip\Delta gaIE) de Ec.
Coli, utilizando el procedimiento de choque de calor CaCl_{2}
(Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53:
159-162, [1970]), se utilizaron los plásmidos de
expresión de TPO mencionados anteriormente. Las células
transformadas fueron primero cultivadas a 37ºC en medio LB
conteniendo carbenicilina 50 pg/ml, hasta que la densidad óptica
(600 nm) del cultivo se situó aproximadamente entre 2 y 3. El
cultivo LB fue después diluido 20x en medio M9 conteniendo
casaminoácidos 0,49% (peso/volumen) y carbenecilina aproximadamente
50 g/ml. Después del crecimiento con aireación a 30ºC durante 1
horas, se añadió ácido
indol-3-acrílico, hasta alcanzar una
concentración final de 50 11g/ml. Se dejó entonces que el medio de
cultivo continuara creciendo a 30ºC, con aireación, durante otro
período de 15 minutos, en cuyo momento se recogieron las células
mediante centrifugación.
Los procedimientos expuestos mas adelante para
la producción de TPO renaturalizada, biológicamente activa,
(Met^{-1} 1-153) pueden ser aplicados por analogía
para la recuperación de otras variantes de TPO, incluyendo las
formas extendidas N y C terminales.
Células de E. coli que expresan la TPO
(Met^{-1} 1-153) codificada por el plásmido
pMP210-1 son fermentadas tal y como se ha descrito
anteriormente. Habitualmente, aproximadamente 100 g de células son
resuspendidas en 1 (10 volúmenes) de tampón de interrupción celular
(Tris 10 mM, EDTA 5 mM, pH 8), con un homogeneizador Polytron y las
células centrifugadas a 5000xg, durante un período de 30 minutos. El
pellet celular lavado es de nuevo resuspendido en 1 L de tampón de
interrupción celular con el homogeneizador Polytron y la suspensión
celular es pasada a través de un Disrupter Cell LH (LH Inceltech,
Inc) o a través de un Microfluidizer (Microfluidics International),
de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La suspensión
es centrifugada a 5.000 x g durante un período de 30 minutos y
resuspendida y centrifugada una segunda vez, para obtener un pellet
lavado de cuerpo refráctil. El pellet lavado es utilizado
inmediatamente o almacenado congelado a -70ºC.
El pellet obtenido anteriormente es resuspendido
en 5 volúmenes en peso de Tris 20 mM, pH 8, con guanidina
6-8M, y DTT 25 mM (ditiotreitol) y sometido a
agitación durante un período de entre 1 y 3 horas, o durante el
transcurso de una noche, a 4ºC, para efectuar la solubilización de
la proteína TPO. Concentraciones elevadas de urea
(6-8M) resultan también de utilidad, pero
generalmente a rendimientos más bajos, en comparación con
guanidina. Finalizada la solubilización, la solución es centrifugada
a aproximadamente 30.000 x g, durante un período de 30 minutos,
para producir un sobrenadante claro que contiene la proteína TPO
monómera, desnaturalizada. El sobrenadante es después
cromatografiado sobre una columna de filtración en gel Superdex® 200
(Pharmacia, 2,6 x 60 cm), a un caudal de 2 ml/min y la proteína es
eluida con fosfato sódico 20 mM, pH 6,0, con DTT 10 mM. Las
fracciones que contienen la proteína TPO desnaturalizada monómera,
eluyendo a entre 160 y 200 ml, son agrupadas. La proteína TPO es
purificada adicionalmente sobre una columna en fase inversa C4
semi-preparativa (2 x 20 cm VYDAC). La muestra es
aplicada a 5 ml/min. a una columna equilibrada en TFA (ácido
trifluoroacético) al 0,1%, con acetonitrilo 30%. La proteína es
eluida con un gradiente lineal de acetonitrilo
(30-60%, en 60 minutos). La proteína reducida
purificada eluye a aproximadamente acetonitrilo 50%. Este material
es utilizado para renaturalizar, para obtener la variante TPO
biológicamente activa.
Aproximadamente 20 mg de proteína TPO
desnaturalizada y reducida, monómera, en 40 ml de TFA
0,1%/acetonitrilo 50% son diluidos en 360 ml de tampón
renaturalizado, que contiene óptimamente los siguientes
reactivos:
Tris 50 mM
NaCl 0,3M
EDTA 5 mM
Detergente CHAPS 2%
Glicerol 25%
Glutationa oxidada 5 mM
Glutationa reducida 1 mM
pH ajustado a 8,3
Después del mezclado, el tampón renaturalizador
es agitado suavemente a 4ºC, durante un período de entre 12 y 48
horas, para proporcionar los máximos rendimientos de
renaturalización de la forma de TPO unida correctamente a disulfuro
(ver más adelante). La solución es después acidificada con TFA,
hasta una concentración final del 0,2%, filtrada a través de un
filtro de 0,45 o de 0,22 micras y se le añaden 110 volúmenes de
acetonitrilo. La solución es después bombeada directamente hacia
una columna en fase inversa C4 y la TPO purificada, renaturalizada
(Met-1 1-153) es eluida con el mismo
programa de gradiente mencionado anteriormente. La TPO
biológicamente activa, renaturalizada, es eluida a aproximadamente
acetonitrilo 45%, bajo estas condiciones, las versiones de TPO no
correctamente unidas a disulfuro, son eluidas con anterioridad. La
TPO final purificada (Met-1 1-153)
resulta tener una pureza superior al 95%, valorada según los geles
de SDS y cromatografía en fase inversa analítica en C4. Para
estudios con animales, el material purificado en C4 fue sometido a
dializais en tampones fisiológicamente compatibles. Se utilizaron
tampones isotónicos (Acectato sódico 10 mM, pH 5,5, succinato sódico
10 mM, pH 5,5 ó fosfato sódico 10 mM, pH 7,4), conteniendo NaCl 150
mM y Tween® 80 0,01%.
Debido a la elevada potencia de la TPO en el
ensayo Ba/F3 (la mitad de la estimulación máxima se alcanza a
aproximadamente 3 pgml), resulta posible obtener material
biológicamente activo utilizando muchos tampones diferentes,
detergentes y condiciones redox. No obstante, bajo la mayoría de las
condiciones, tan solo se obtiene una pequeña cantidad de material
adecuadamente renaturalizado (<10%). Para procesos de fabricación
industrial, resulta deseable alcanzar rendimientos de
renaturalización de al menos el 10%, más preferiblemente de entre
el 30 y el 50% y, muy preferiblemente, > al 50%. Para determinar
la eficacia, con vistas a apoyar la obtención de elevados
rendimientos de renaturalización, se valoraron muchos detergentes
diferentes (Triton® X-100,
dodecil-beta-maltosido, CHAPS,
CHAPSO, SDS, sarcosil, Tween® 20 y Tween® 80, Zwittergent
3-14 y otros). De entre estos detergentes, tan solo
la familia CHAPS (CHAPS y CHAPSO) resultó ser generalmente útil en
esta reacción de renaturalización para limitar la acumulación de
proteína y la incorrecta formación de disulfuro. Los niveles de
CHAPS superiores al 1% resultaron ser muy útiles. Para mejorar los
rendimientos resultó necesaria la presencia de cloruro sódico,
situándose los niveles óptimos entre 0,1M y 0,5M. La presencia de
EDTA (1-5 mM) limitó la cantidad de oxidación
catalizada por metal (y acumulación) que fue observada con algunas
preparaciones. Las concentraciones de glicerol superiores a 15%
proporcionaron las mejores condiciones para la renaturalización.
Para la obtención de los rendimientos máximos, resultó esencial
disponer de la glutationa oxidada y de la glutationa reducida y de
la cisteína oxidada y reducida, como par de reactivos redox. Por
regla general, los rendimientos más elevados fueron observados
cuando la relación molar de reactivo oxidado es igual o superior al
del componente reactivo reducido del par redox, y los valores de pH
comprendidos entre 7,5 y aproximadamente 9, resultaron ser óptimos
para la renaturalización de estas variantes de TPO. Los disolventes
orgánicos (por ejemplo, etanol, acetonitrilo, metanol) fueron
tolerados a concentraciones de entre el 10 y el 15% o inferiores.
Niveles de disolventes orgánicos más elevados incrementaban la
cantidad de formas plegadas incorrectamente. Los tampones tris y
fosfato resultaron ser generalmente útiles. La incubación a 4ºC
generó también rendimientos más elevados de TPO adecuadamente
plegada.
Rendimientos de renaturalización de entre el 40
y el 60% (en base a la cantidad de TPO reducida y desnaturalizada
utilizada en la reacción de renaturalización) resultan ser
habituales para preparaciones de TPO que han sido purificadas a
través del primer paso C4. El material activo puede ser obtenido con
preparaciones menos puras (por ejemplo, directamente después de la
columna Superdex 200 o después de la extracción inicial de cuerpo
refráctil), si bien los rendimientos son inferiores debido a la
precipitación extensiva y a la interferencia de proteínas no TPO
durante el proceso de renaturalización.
Dado que la TPO (Met^{-1}
1-153) contiene 4 restos cisteína, resulta posible
generar tres diferentes versiones disulfuro de esta proteína:
Versión 1: disulfuros entre los restos cisteína
1-4 y 2-3
Versión 2: disulfuros entre los restos cisteína
1-2 y 3-4
Versión 3: disulfuros entre los restos cisteína
1-3 y 2-4
Durante la exploración inicial para la
determinación de las condiciones de renaturalización, se separaron,
por medio de cromatografía en fase inversa C4, diferentes picos que
contenían la proteína TPO. Tan solo uno de estos picos presentaba
actividad biológica significativa, tal y como se determinó por medio
del ensayo Ba/F3. Subsiguientemente, las condiciones de
renaturalización fueron optimizadas para generar, preferentemente,
esa versión. Bajo estas condiciones, las versiones plegadas
incorrectamente resultan ser inferiores en un 20-30%
del total de TPO monómero obtenida.
Por medio de espectrometría de masas y de
secuenciado de proteínas, se ha determinado que el patrón disulfuro
para la TPO biológicamente activa era 1-4 y
2-3 (a saber, la versión 1). Alícuotas de los
diversos picos resueltos en C4 (entre 5-10 nmoles)
fueron digeridos con tripsina (relación molar 1:25 de tripsina a
proteína). La mezcla de digestión fue analizada por medio de
espectroscopía de masa láser de desorpción, asistida por matriz,
antes y después de la reducción con DDT. Finalizada la reducción, se
detectaron las masas correspondientes a la mayoría de los péptidos
trípticos de TPO más voluminosos. En las muestras no reducidas,
faltaban algunas de estas masas y se detectó la presencia de otras
nuevas. La masa de los nuevos picos correspondía básicamente a la
suma de los péptidos trípticos individuales involucrados en el par
disulfuro. Por lo tanto, resultaba posible asignar, de forma
inequívoca, el patrón disulfuro del producto renaturalizado,
recombinante, biológicamente activo de TPO, a 1-4 y
2-3. Esto está de acuerdo con el conocido patrón
disulfuro de la molécula eritropoyetina relacionada.
\vskip1.000000\baselineskip
La TPO renaturalizada y purificada (Met^{-1}
1-153) presenta actividad tanto en ensayos in
vitro como en ensayos in vivo. En el ensayo Ba/F3, la
mitad de la estimulación máxima de la incorporación de timidina en
las células Ba/F3 fue alcanzada a los 3,3 pg/ml (0,3pM). En el
ensayo ELISA basado en receptor mpl, la mitad de la estimulación
máxima tenía lugar a 1,9 ng/ml (120 pM). En animales normales y en
animales que presentan mielosupresión a raíz de radiación X casi
mortal, la TPO (Met^{-1} 1-153) resultó altamente
potente (se observó actividad a dosis tan bajas como 30 ng/ratón),
para estimular la producción de nuevas plaquetas.
\vskip1.000000\baselineskip
La totalidad de los estudios fueron aprobados
por el Institutional Care and Use Committee of Genentech Inc. Con
anterioridad al inicio del experimentos, todos los animales fueron
marcados en la oreja para su identificación y se obtuvo un contaje
de sangre completa de base (CBC). Grupos de 10 ratones hembras
C57BL/6 fueron irradiados con 5,0 Gy de irradiación gamma,
procedente de una fuente ^{137}Cs. Dentro de las siguientes 6
horas, a los animales se les proporcionaron 1,2 mg de carboplatino,
en forma de inyección intraperitoneal de 200 \mul.
Se indican seguidamente los protocolos y los
resultados obtenidos utilizando trombopoyetina de múrido
recombinante (rmTPO), en un modelo de ratón estándar. Debe darse por
entendido que un experto en la materia considera que este modelo
resulta trasladable a los seres humanos. La trombopoyetina humana ha
sido objeto de prueba en el mismo modelo de ratón y se averiguó que
la misma mostraba una relevante actividad, si bien a un nivel más
bajo, debido a la especificidad de la especie. Por lo tanto, se
eligió el siguiente protocolo utilizando la contrapartida de TPO de
múrido adecuada para la especie, a los efectos de poder demostrar el
efecto relevante. De nuevo, la utilización de TPO humana en el
protocolo de ratón proporcionaría un efecto similar, difiriendo tan
solo en el grado. Obviamente, la utilización de TPO humana en seres
humanos, otro modelo adecuado de comparación, requiere de la
aprobación de las pruebas clínicas por parte de la FDA.
\vskip1.000000\baselineskip
Con anterioridad al experimento y en puntos
temporales a lo largo del estudio, 40 \mul de sangre fueron
extraídos del seno orbital e inmediatamente diluidos en 10 mL de
diluyente, con vista a evitar la coagulación. El contaje de la
sangre completa (CBC) a partir de cada una de las muestras de sangre
fue determinado en un analizador de sangre Serrono Baker system
9018, dentro de los 60 minutos posteriores a su recogida. Tan solo
se extrajo sangre a la mitad de los animales en cada grupo de dosis
en un determinado día, por lo que se extrajeron muestras de sangre
de cada uno de los animales en puntos temporales alternativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento 1: con vistas a determinar la
respuesta frente a trombopoyetina de múrido recombinante
(mTPO335aa) en animales convertidos en trombocitopénicos, grupos de
animales fueron tratados durante 1, 2, 4 u 8 días consecutivos con
0,1 \mug/día (5 \mug/kg/día, aproximadamente). El tratamiento
con rmTPO (335aa) comenzó a aplicarse 24 horas después del inicio
del modelo y se proporcionó mediante inyección diaria subcutánea de
100 \mul.
Experimento 2: con vistas a determinar la
naturaleza de la relación dosis-respuesta para la
rmTPO(335) en este modelo, se les proporcionó a los animales
una única inyección de rmTPO(335), transcurridas 24 horas
desde el inicio del modelo. Grupos de animales recibieron uno de
0,01, 0,03, 0,1 ó 0,3 \mug de rmTPO(335) en forma de
inyección subcutánea única de 100 \mul. Con vistas a comparar dos
rutas de administración, un experimento contemporáneo utilizó 4
grupos de animales que habían recibido idénticas dosis de
rmTPO(335), pero a través de una vía intravenosa (vena de
cola lateral).
Experimento 3: esta serie de experimentos fue
efectuada para comparar la eficacia de diversas moléculas rmTPO
truncadas pegiladas [(rmTPO(153)], acopladas a
polietilenglicol (PEG).
- i.
- En este experimento, animales trombocitopénicos fueron inyectados (0,1 \mug, vía subcutánea) con una de las siguientes moléculas rmTPO(153) pegiladas: sin PEG, un PEG de 20K ó un PEG de 40K.
- ii.
- En el experimento final se compararon los efectos de la administración de una única molécula rmTPO(153) PEG 40K, proporcionando 0,1 \mug, ya sea a través de vía subcutánea o de vía intravenosa, a animales convertidos en trombocitopénicos. Como control positivo se utilizó rmTPO(335)(0,1 \mug).
\vskip1.000000\baselineskip
La combinación de irradiación subletal y de
carboplatino se tradujo en una respuesta reproducible que
proporcionó una trombocitopenia consistente en el 100% de los
animales. El nadir de la trombocitopenia tuvo lugar el día 10, con
una recuperación gradual del número de plaquetas entre el día 21 y
el día 28. Acompañando a esta trombocitopenia se generó una anemia
pronunciada, con el nadir teniendo lugar ligeramente más tarde,
entre el día 14 y el 17, y la recuperación hasta contaje de glóbulos
rojos control, el día 28. Los contajes de glóbulos blancos
presentaban también reducciones durante el curso del
experimento.
Experimento 1: una dosis única de 0,1 \mug de
rmTPO(335) fue proporcionada 24 horas después del inicio del
modelo, acelerando la recuperación del número de plaquetas en este
modelo múrido. Esta administración única de rmTPO(335) elevó
el nadir de la respuesta desde 196 x 10^{3} \pm 33 x 10^{3}/
\mul el día 10, hasta 434 x 10^{3} \pm 7 x 10^{3}/\mul,
el día 7. La tasa inicial de descenso en el número de plaquetas
permanecía invariable pero la fase de recuperación resultaba mucho
más rápida con números de plaquetas que volvían a la normalidad el
día 14, lo cual ocurría el día 21 en el grupo control. Se observó
alguna mejora adicional en la velocidad de recuperación
proporcionando 0,1 \mug/día el día 1 y el día 2, pero la misma
resultaba ser marginal. No se observó ninguna mejora adicional
proporcionando rmTPO(335) durante 4 u 8 días consecutivos
(Fig. 1a). Además de la recuperación acelerada en el número de
plaquetas, la anemia que se desarrolla en estos animales resultó
también atenuada por una única dosis de rmTPO(335,
proporcionada el día 1. Al igual que ocurría con el contaje de
plaquetas, no pudo obtenerse ninguna ventaja adicional
proporcionando la rmTPO(335) más de una vez (Fig 1b). La
rmTPO(335) no generaba efecto alguno sobre la leucocitopenia
que acompaña a las caídas de plaqueta y a los contajes de glóbulos
rojos (Fig 1c).
Experimento 2: la respuesta a dosis subcutáneas
únicas de rmTPO(335), proporcionada 24 horas después del
inicio del modelo, dependía de la dosis. La dosis experimentada más
baja (0,01 \mug) no tenía efecto alguno sobre la recuperación de
plaquetas, en comparación con los controles. No obstante, la
respuesta era casi máxima cuando se administran 0,03 \mug (Fig.
2a). Esta curva dosis respuesta extremadamente escarpada se aprecia
mejor cuando los números de plaquetas en el día 14 son expresados
gráficamente sobre una gráfica logarítmica lineal (Fig. 3a). Una
dosis respuesta similarmente escarpada es observada para la
regulación de eritrocitos en este modelo (Fig 3b). La
administración intravenosa de rmTPO(335) proporcionó una
respuesta dependiente de dosis similar. No obstante, la dosis más
baja experimentada (0,01 \mug) resultaba eficaz ciando se
proporcionaba por vía iv, (Fig. 4a), sugiriendo que la curva dosis
respuesta está desplazada hacia la izquierda. Este incremento en la
potencia resulta pequeño, dado que el desplazamiento es de menos de
la mitad de un orden de magnitud /Fig. 3a). Lo que resulta más
importante es que ambas rutas de administración presentan los
máximos comparables (Fig. 3a). Las rutas de administración
subcutánea y la intravenosa aumentaron también la recuperación de
la anemia, de una manera dependiente de la dosis (Figs. 2a, 3b, 4b).
No obstante, ni la ruta de administración subcutánea ni la
intravenosa tenían efecto alguno sobre la leucocitopenia, a lo largo
de la gama de dosis experimentada (Figs, 2c, 4c).
Experimento 3
- i.
- La pegilación de la rmTPO(153) con, o bien PEG 20K o un único PEG 40K, tenía un efecto superior sobre la recuperación de plaquetas, que el de una molécula no pegilada. A diferencia de la molécula de longitud completa, ninguna de las moléculas rmTPO(153) pegiladas afectaba al nadir de la trombocitopenia, pero aceleraba en gran manera la fase de recuperación del modelo cuando se proporcionaba en forma de dosis única de 0,1 \mug sc., 24 horas antes del inicio del modelo (Fig 5a). Esto resulta muy evidente en el día 14, cuando los contajes de plaquetas son 80 x 10^{3} \pm 15 x 10^{3}/\mul. 268 x 10^{3} \pm 67 x 10^{3}/\mul, 697 x 10^{3} \pm 297 x 10^{3}/\mul y 878 x 10^{3} \pm 31 x 10^{3}/\mul para controles, rmTPO(153) no PEG, rmTPO(153) + PEG 20K y rmTPO(153) + PEG 40K, respectivamente (Fig. 5a). El mismo perfil resultaba también evidente sobre la respuesta de eritrocitos (Fig 5b). Ninguna de estas moléculas basadas en rmTPO(153) tenía efecto alguno sobre la leucocitopenia en este modelo (Fig. 5c).
- ii.
- La rmTPO(153) + PEG 40K (0,1 \mug), proporcionó una respuesta consistente cuando se administró ya sea en forma de inyección intravenosa única o de inyección subcutánea. En este experimento, la ruta subcutánea modificaba ligeramente el nadir el día 10 y devolvía a las plaquetas a los niveles control el día 14, en comparación con el día 28 del grupo control (Fig 6a). En los animales a los cuales se les había administrado el fármaco por vía intravenosa, se generaba un efecto similar sobre el nadir y la velocidad de recuperación (Fig 7a). La respuesta a la molécula rmTPO(153) truncada pegilada 40K resulta casi idéntica a la respuesta a la rmTPO(335), tanto sobre la recuperación de plaquetas como la de eritrocitos, cuando se proporciona ya sea por vía subcutánea (Fig. 6b) o por vía intravenosa (Fig. 7b). Tal como ocurre con los otros experimentos, la rmTPO(153) + PEG 40K, proporcionada o bien subcutánea o intravenosa, no tenía efecto algo sobre los niveles circulantes de glóbulos blancos (Figs. 6c y 7c). En experimentos paralelos, la utilización de versiones pegiladas 10K de esta molécula no modificaba la respuesta a rmTPO(153), tanto sobre la repoblación de plaquetas como la de eritrocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporcionan seguidamente protocolos y
resultados que utilizan terapia de dosis única con trombopoyetina
humana recombinante (rhTPO_{332}) n pacientes humanos que reciben
quimioterapia citotóxica:
Terapia de dosis única con trombopoyetina humana
recombinante (rhTPO) en pacientes que reciben quimioterapia
citotócixa.
Modelos preclínicos de quimiorradioterapia
intensiva demostraron que una dosis única de rhTPO incruenta el
nadir de plaquetas y reduce el periodo de trombocitopenia aguda. Se
presentan los resultados obtenidos en el interim de dos estudios en
Fases I, en los cuales dosis únicas de rhTPO fueron administradas a
pacientes que reciben quimioterapia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ambos estudios comenzaron con períodos de
pre-quimioterapia de 21 días (ciclo 0), para
valoración de la seguridad de rhTPO y de la respuesta de las
plaquetas después de inyecciones en bolo IV únicas de 0,3, 0,6 ó
1,2 meg/kg (3 pacientes por grupo en cada uno de los estudios). Los
pacientes recibieron después las mismas dosis de rhTPO después de
la quimioterapia, en ciclos subsiguientes seleccionados. La
población del primer estudio estaba compuesta por pacientes con
malignidades avanzadas, los cuales recibieron rhTPO al día
siguiente de la quimioterapia de rescate con tiotepa (65 mg/m^{2}
q28d), en cada uno de dos ciclos de quimioterapia consecutivos. El
segundo estudio incluía pacientes con sarcoma, sin tratamiento
previo con quimioterapia, sometidos a tratamiento con inducción con
quimioterapia Al (doxorrubicina 90 mg/m^{2}, 10 g/m^{2} q21d.
Finalizado el ciclo 0, los pacientes de este estudio fueron
monitorizados durante el primer ciclo de quimioterapia y recibieron
una única inyección de rhTPO al día siguiente de completar la
quimioterapia (d5), durante el segundo y los subsiguientes
ciclos.
\vskip1.000000\baselineskip
14 pacientes han sido tratados hasta la fecha.
La rhTPO fue bien tolerada, sin que se haya informado al respecto
de acontecimientos adversos graves atribuidos al fármaco en estudio.
No se han observado anticuerpos frente a rhTPO. En el ciclo 0 la
dosis más baja (0,3 mcg/kg) resultaba ser débilmente activa,
incrementándose la actividad a dosis más elevadas, tal y como se
muestra más adelante.
El contaje de plaquetas máximo, durante el ciclo
0, tenía lugar, en promedio, el día 11 (banda 7-14).
No se detectaron cambios significativos en WBC o HCT. Los análisis
FACS de médula ósea mostraron incrementos en todos los subgrupos
CD34+ en 2/2 pacientes, después de 0,6 mcg/kg. Se observaron también
incrementos en células CD34+ en sangre periférica en estos
pacientes, sugiriendo que la TPO podría tener actividad movilizadora
en células madre. El cálculo de la dosis y el tratamiento posterior
a la quimioterapia están en curso.
Estos estudios en fase 1 sugirieron, en
conjunto, que la administración única de dosis de rhTPO resulta
segura y bien tolerada. Los niveles de dosis 0,3, 0,6 y 1,2 mcg/kg
mostraron una creciente actividad trombopoyética. El tratamiento en
curso de pacientes a niveles de dosis más elevadas someterá a prueba
la hipótesis de que una única dosis de rhTPO resulta eficaz a la
hora de mejorar la trombocitopenia, después de un tratamiento
intenso con quimioterapia.
La descripción precedente detalla procedimientos
específicos que pueden ser utilizados para llevar a la práctica la
presente invención. Una vez detallados tales procedimientos
específicos, los expertos en la materia conocerán perfectamente
como diseñar procedimientos fiables alternativos y llegar a la misma
información utilizando los frutos de la presente invención. Por lo
tanto, con independencia del grado de detalle que aparece en las
pruebas, el mismo no debe ser construido como limitativo de su campo
de cobertura global; sino más bien que el ámbito de la presente
invención tiene que ser tan solo determinado a través de la legal
construcción de las reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el
máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
\bullet US 9414550 W [0001]
\bullet WO 9518858 A [0001] [0009]
\bullet US 9414553 W [0009] [0012] [0014]
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- \bullet WO 9521919 A [0013]
- \bullet WO 9521920 A [0013]
- \bullet US 3779919 A [0031]
- \bullet EP 58481 A [0031]
- \bullet EP 133988 A [0031]
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- \bullet EP 36676 A [0033]
- \bullet EP 88046 A [0033]
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- \bullet JP 58118008 A [0033]
- \bullet US 4485045 A [0033]
- \bullet US 4544545 A [0033]
- \bullet EP 102324 A [0033]
- \bullet US 4640835 A [0034]
- \bullet US 4496689 A [0034]
- \bullet US 4301144 A [0034]
- \bullet US 4670417 A [0034]
- \bullet US 4791192 A [0034]
- \bullet US 4179337 A [0034]
- \bullet EP 307247 A [0060] [0084]
- \bullet US 4511502 A [0069]
- \bullet US 4512922 A [0069]
- \bullet US 4518526 A [0069]
\bullet US 4620948 A [0069]
\bullet Thrombocytopenia and Disorders of
Platelet Disfunction. SCHAFNER et al. Internal Medicine.
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Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3688-3698
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Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4030-4034
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Acids. Res., 1987, vol. 15, 7155 [0051]
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Cult. Meth, 1993, vol. 15, 56 [0060]
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54-60 [0067]
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Heamatol, 1989, vol. 72, 184-190
[0070]
\bulletOGURA et al. Blood,
1988, vol. 72 (1), 49-60 [0070]
\bulletANDREASON, G.L. J. Tiss.
Cult. Meth, 1993, vol. 15, 56 [0085]
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Enzymology. Academic Press, 1990, vol. 185,
54-60 [0096]
\bulletCHANG, C. N. Gene,
1987, vol. 55, 189-196 [0097]
\bulletSCHOLTISSEK, S.NAR,
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\bulletDE BOER, H. A. Promoter
Structure and Function. Praeger, 1982, 462 [0099]
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151-158 [0109]
\bulletMANDEL, M. et al. J. Mol.
Biol., 1970, vol. 53, 159-162 [0115]
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: GENENTCH, INC.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVA ADMINISTRACIÓN DE TROMBOPOYETINA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS:22
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Flehr, Hohbach, Test, Albritton & Herbert
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Four Embarcadero Center, Suite 3400
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 94111
\vskip0.800000\baselineskip
- (V)
- FORMA LEIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentln release #1.0, Version #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi):
- DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: CON LA PRESENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii):
- DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/697.631
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 28-AGO-1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii):
- DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/641.443
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 29-ABRIL-1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii):
- DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/591.925
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 25-ENE-1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii):
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dreger, Walter H.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 24.190
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ARCHIVO: FP-62953-2
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix):
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 781-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (415) 398-3249
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 61 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGTTAAGA AGAAATGCGA TATTCTTTTT CATAATT
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCACCCTCT GCGTCAGGT
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTACCTGA CGCAGAGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGGACATG GGAGTCACGA AGCAGTTTAC TGAGAACAAA TGACTCTTG
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGACCTTC GATAAATGCG ATATTCTTTT TCATAATT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i):
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGTTTAAG AAGAAATGCG ATATTCTTTT TCATAATT
\hfill
Claims (42)
1. Uso de una trombopoyetina para la fabricación
de un medicamento destinado al tratamiento de un mamífero que padece
trombocitopenia o que está en riesgo de padecerla,
caracterizado porque el medicamento se administra en forma de
dos dosis terapéuticas en un único día, en donde la citada dosis
terapéutica oscila entre 0,5 y 1,5 \mug/kg cada una, en una
administración en dos dosis, sin tratamiento suplementario con
trombopoyetina, o en forma de una única dosis terapéutica, sin
tratamiento suplementario con trombopoyetina, en donde la
trombocitopenia es generada por quimioterapia o radioterapia.
2. Uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en donde la quimioterapia es quimioterapia
mielotóxica, destinada al tratamiento de leucemia o de tumores
sólidos, o quimioterapia mieloablativa, para transplante de médula
ósea autólogo o alogénico.
3. Uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en donde el medicamento se destina al tratamiento
del mamífero que padece o está en riesgo de padecer trombocitopenia,
por medio de administración en forma de dosis terapéutica única.
4. Uso según la reivindicación 3, en donde la
citada dosis terapéutica oscila entre 0,1 y 100 \mug/kg.
5. Uso según la reivindicación 4, en donde la
citada dosis terapéutica oscila entre 0,1 y 1 \mug/kg.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde el medicamento se destina al tratamiento del
mamífero que padece o está en riesgo de padecer trombocitopenia, en
combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente
seleccionado de entre el grupo que comprende una citoquina, un
factor estimulante de colonia e interleukina.
7. Uso según la reivindicación 6, en donde el
agente es seleccionado de entre KL, LIF, G-CSF,
GM-CSF, M-CSF, EPO,
FLR-3, IL-1, IL-2,
IL-3, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9 e
IL-11.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde el medicamento está destinado para el
tratamiento de un mamífero que padece o está en riesgo de padecer
trombocitopenia, mediante administración intra-
venosa.
venosa.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7, en donde el medicamento está destinado al tratamiento de un
mamífero que padece o esté en riesgo de padecer trombocitopenia,
mediante administración subcutánea.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde el medicamento está destinado para el
tratamiento de un mamífero que padece o está en riesgo de padecer
trombocitopenia, en combinación con un soporte o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
11. Uso según la reivindicación 10, en donde el
citado soporte o excipiente contiene un agente quelante.
12. Uso según la reivindicación 11, en donde el
citado agente quelante es EDTA.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde la trombopoyetina es seleccionada de entre el
grupo que comprende:
- a)
- un fragmento de polipéptido;
- b)
- un polipéptido variante;
- c)
- un polipéptido quimérico;
- d)
- un polipéptido pegilado.
14. Uso según la reivindicación 13, en donde el
citado polipéptido pegilado es preparado con polietilenglicol.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde la trombopoyetina es seleccionada de entre el
grupo que comprende:
- a)
- el polipéptido que es aislado procedente de un mamífero;
- b)
- el polipéptido que es obtenido mediante medios recombinantes; y
- c)
- el polipéptido que es obtenido mediante medios sintéticos.
\newpage
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde la citada trombopoyetina es seleccionada de
entre el grupo que comprende:
- a)
- el polipéptido que es humano; y
- b)
- el polipéptido que es no inmunógeno en un humano.
17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde la citada trombopoyetina está representada a
través de la fórmula:
X-hTPO(7-151)-Y
en donde
hTPO(7-151) representa la secuencia de
aminoácidos TPO(hML) humana desde Cys^{7} hasta Cys^{151}
inclusive; X representa el grupo amino de Cys^{7} o uno o más de
los restos aminoácido amino-terminales de la TPO
madura o sus extensiones de restos aminoácido, tales como Met, Lys,
Tyr o sus sustituciones de aminoácido, tales como de arginina a
lisina o trombina); e Y representa el grupo carboxi terminal de
Cys^{151} o uno o más restos aminoácido
carboxi-terminales de la TPO madura o de sus
extensiones.
18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde la citada trombopoyetina es trombopoyetina
humana.
19. Uso según la reivindicación 18, en donde la
citada trombopoyetina es trombopoyetina humana (332).
20. Uso según la reivindicación 19, en donde la
citada trombopoyetina es trombopoyetina humana (153).
21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 20, en donde la citada trombopoyetina es rhTPO_{332}.
22. Trombopoyetina para ser utilizada en un
procedimiento para el tratamiento de un mamífero que padece o está
en riesgo de padecer trombocitopenia, comprendiendo el procedimiento
la administración de la trombopoyetina en forma de dos dosis
terapéuticas en un único día, en donde la citadas dosis terapéutica
oscila entre 0,5 y 1,5 \mug/kg cada una, en una administración en
dos dosis, sin tratamiento suplementario con trombopoyetina, o en
forma de una única dosis terapéutica, sin tratamiento suplementario
con trombopoyetina, en donde la trombocitopenia es generada por
quimioterapia o radioterapia.
23. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 22, en donde la quimioterapia es quimioterapia
mielotóxica, destinada al tratamiento de leucemia o de tumores
sólidos, o quimioterapia mieloablativa, destinada al transplante de
médula ósea autólogo o alogénico.
24. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 22 o la reivindicación 23, en donde la trombopoyetina
tiene que ser administrada en forma de dosis terapéutica única.
25. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 24, en donde la citada dosis terapéutica oscila entre
0,1 y 100 \mug/kg.
26. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 25, en donde la citada dosis terapéutica oscila entre
0,1 y 1 \mug/kg.
27. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en donde la
trombopoyetina está destinada para ser administrada en combinación
con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente seleccionado
de entre el grupo que comprende una citoquina, un factor estimulante
de colonia e interleukina.
28. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 27, en donde el agente es seleccionado de entre KL,
LIF, G-CSF, GM-CSF,
M-CSF, EPO, FLR-3,
IL-1, IL-2, IL-3,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9 e
IL-11.
29. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, en donde la
trombopoyetina está destinada a ser administrada por vía
intravenosa.
30. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, en donde la
trombopoyetina está destinada a ser administrada por vía
subcutánea.
31. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, en donde la
trombopoyetina está destinada a ser administrada en combinación con
un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.
32. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 31, en donde el citado soporte o excipiente contiene
un agente quelante.
33. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 32, en donde el citado agente quelante es EDTA.
34. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 33, en donde la
trombopoyetina es seleccionada de entre el grupo que comprende:
- a)
- un fragmento de polipéptido;
- b)
- un polipéptido variante;
- c)
- un polipéptido quimérico;
- d)
- un polipéptido pegilado.
35. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 34, en donde el citado polipéptido pegilado es
obtenido con polietilenglicol.
36. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 35, en donde la
trombopoyetina es seleccionada de entre el grupo que comprende:
- a)
- el polipéptido que es aislado procedente de un mamífero;
- b)
- el polipéptido que es obtenido por medio de medios recombinantes; y
- c)
- el polipéptido que es obtenido a través de medios sintéticos.
37. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 36, en donde la
trombopoyetina es seleccionada de entre el grupo que comprende:
- a)
- el polipéptido que es humano; y
- b)
- el polipéptido que es no inmunógeno en humanos
38. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 37, en donde la citada
trombopoyetina está representada a través de la fórmula:
X-hTPO(7-151)-Y
en donde
hTPO(7-151) representa la secuencia de
aminoácidos TPO(hML) humana desde Cys^{7} hasta Cys^{151}
inclusive; X representa el grupo amino de Cys^{7} o uno o más de
los restos aminoácido amino-terminales de la TPO
madura o sus extensiones de restos aminoácido tales como Met, Lys,
Tyr o sus sustituciones de aminoácido, tales como arginina a lisina
o trombina); e Y representa el grupo carboxi terminal de Cys^{151}
o uno o más restos aminoácido carboxi-terminales de
la TPO madura o de sus
extensiones.
39. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 38, en donde la citada
trombopoyetina es trombopoyetina humana.
40. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 39, en donde la citada trombopoyetina es
trombopoyetina humana (332).
41. Trombopoyetina para ser utilizada según la
reivindicación 40, en donde la citada trombopoyetina es
trombopoyetina humana (153).
42. Trombopoyetina para ser utilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 41, en donde la citada
trombopoyetina es rhTPR_{332}.
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